Phát hiện tần suất thiếu hụt G6PD ở dân tộc Tày và dân tộc Nùng bằng phương pháp bán định lượng Formazan

ĐẶT VẤN ĐỀ
Glucose 6 phosphatdehydrogenase (G6PD) là một enzym ôxy hoá khử, là
một enzym then chốt trong quá trình chuyển hoá Glucose theo con đường
Hexose monophosphate trong hồng cầu. Con đường này chỉ tạo ra năng lượng
không đáng kể (10%glucose tham gia vào con đường này) nhưng lại đảm nhiệm
hai chức năng quan trọng là cung cấp ribose cho quá trình sinh tổng hợp các
nucleotid, acid nucleic và đặc biệt tạo ra một chất khử vô cùng quan trọng là
NADPH. Chất này có khả năng chống lại tác nhân gây oxy hóa, loại bỏ H
2
0
2
,
giúp bảo vệ cho màng hồng cầu đựơc bền vững, bảo vệ cấu trúc của
Hemoglobin, cấu trúc của các enzym có trong hồng cầu để duy trì sự sống cho
tế bào hồng cầu.
Bệnh thiếu hụt G6PD là một trong những bệnh lý hay gặp nhất của hồng
cầu. Cơ sở di truyền học của bệnh này là đột biến gen nằm trên đầu mút tận
cùng nhiễm sắc thể X ở đoạn q với các dạng đột biến khác nhau (như
Gâoh,Viangchan...) Các dạng đột biến khác nhau có thể tạo những mức độ thiếu
hụt G6PD khác nhau và gây ra những biểu hịên lâm sàng khác nhau. Đây là
bệnh di truyền gen lặn liên kết nhiễm sắc thể giới tính X không có alen tương
ứng trên Y nên gặp nhiều ở nam hơn ở nữ,bệnh mang tính di truyền do đó biểu
hiện khác nhau ở những dân tộc khác nhau. Các nghiên cứu gần đây cho thấy
những biểu hiện lâm sàng của bệnh cũng đa số xuất hiện do sử dụng các biện
pháp điều trị như thuốc hay sử dụng thức ăn có tính oxy hoá, do vậy ở vùng
lãnh thổ khác nhau do tập quán sinh hoạt, thói quen và đặc điểm bệnh tật khác
nhau nên tỷ lệ thiếu hụt của enzym này cũng thay đổi. Việt Nam là một trong
những nước nằm trong bản đồ thiếu hụt G6PD, với tỷ lệ mắc bệnh tương đối
cao.
Thiếu G6PD thường có những biểu hiện tan máu gây vàng da, đái huyết
sắc tố, thiếu máu, suy thận cấp và trường hợp nặng là tử vong. Bệnh xuất hiện

khi tiếp xúc với các tác nhân gây oxy hoá như vi sinh vật, hoá chất (thuốc, thực
1
phẩm). Người bình thường với số lượng và chất lượng G6PD đảm bảo thì khi
tiếp xúc với hàm lượng cao chất oxy hoá thì vẫn có khả năng sản xuất ra đủ
NADPH để loại bỏ tác động của chúng và sẽ không có những biểu hiện lâm
sàng trên. Trưòng hợp thiếu hụt nặng enzym thì hay gây ra những cơn tan máu
cấp kể cả khi sử dụng rất ít chất õy hoá, nhưng cũng có trưòng hợp do sử dụng
một lượng chất oxy hoá tuy ít nhưng kéo dài sẽ dẫn đến hiện tưọng không đủ
enzym để tham gia quá trình khử, đây chính là hiện tượng thiếu enzym thứ phát.
Bởi vậy việc phát hiện ra sự thiếu hụt G6PD là rất quan trọng. Qua sự phát
hiện bằng những phưong pháp định tính, định lượng chúng ta có thể biết được
mức độ suy giảm để có được kế hoạch điều trị cũng như cách thức sinh hoạt
hợp lý nhằm hạn chế thấp nhất sự biểu hiện của bệnh. Sử dụng phương pháp
bán định lượng tạo vòng Formazan với ưu điểm nhanh chóng, đơn giản sẽ giúp
cho chúng ta phát hiện được sự thiếu hụt này một cách đồng loạt và có hiệu
quả.
Tôi tiến hành làm khoá luận tốt nghiệp về đề tài:
"Phát hiện tần suất thiếu hụt G6PD ở dân tộc Tày và dân tộc Nùng
bằng phương pháp bán định lượng Formazan."
Với hai mục tiêu sau đây:
- Đánh giá các điều kiện của phản ứng Formazan.
- Sử dụng kỹ thuật bán định lượng Formazan để phát hiện tần suất
thiếu hụt G6PD ở dân tộc Tày và Nùng.
2
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1. Những hiểu biết về G6PD:
1.1.Đại cương:
G6PD được Warburg và Christan phát hiện năm 1931 ở hồng cầu ngưạ,
động vật, vi sinh vật, men bia và hồng cầu người. Năm 1936 G6PD đã được
nghiên cứu và tiến hành chiết suất làm sạch nhưng phải 25 năm sau mới thành

công. Bước đầu nghiên cứu enzym đã đựơc tìm hiểu về cấu trúc phân tử, dạng
có hoạt tính sinh học, các dạng biến thể của enzym. Quá trình tách chiết enzym
ra khỏi hồng cầu cũng ngày càng đạt được độ tinh sạch cao hơn, trải qua các
bước như điện di, phương pháp sắc ký trao đổi ion, sắc ký ái lực độ tinh sạch
của enzym đã đạt đựơc tới 1448,2 lần [2]. Cùng với sự phát triển của sinh học
phân tử các dạng đột biến của G6PD ngày càng được phát hiện nhiều, các
phương pháp phát hiện thiếu hụt từ định lượng, định tính, bán định lượng, test
nhanh ngày càng được phát triển chính xác hơn và áp dụng rộng rãi hơn trong
cộng đồng.
1.2.Cấu trúc:
Cấu trúc bậc một (monomer): là chuỗi polypeptid gồm 515 acid amin liên
kết với nhau bằng những liên kết peptid (nhóm cacboxyl(-C00H) của acid amin
trước sẽ liên kết với nhóm amin (-NH
2
) của acidamin sau bằng cách chung nhau
mất đi một phân tử nước). Trọng lượng phân tử của enzym nặng 59265 Daltons.
Trình tự acid amin đã được giải mã, tính đồng nhất của trình tự này thay đổi tuỳ
theo từng vùng. Vùng có tính đồng nhất cao được cho là vùng có chức năng
quan trọng (hay còn gọi là trung tâm hoạt động) của enzym, ở người vùng này
thuộc acidamin 188-291.
Cấu trúc bậc cao hơn:
G6PD có cấu trúc không gian là pôlymer, đó là các dạng dimer, tetramer,
hexamer. Dạng cấu trúc không gian mới đảm bảo cho enzym hoạt động được.
Trong hồng cầu người thì dạng dimer chiếm ưu thế hơn. Các cấu trúc bậc 1, bậc
3
cao hơn có sự chuyển dạng lẫn nhau tuỳ vào điều kiện của môi trường, như ở
pH thấp thì chủ yếu là dạng tetramer, pH gần trung tính thì là dạng dimmer, ở
pH trung tính thì hai dạng đó gần bằng nhau. G6PD là một enzym không đồng
nhất và đa dạng phân tử, bằng phương pháp hoá sinh WHO đã mô tả có 442
dạng khác nhau [1,3].

Hình 1: cấu trúc bậc bốn của G6PD
1.3.Chức năng:
G6PD là một enzym oxy hoá khử xúc tác phản ứng chuyển hoá đầu tiên
của chu trình Pentose( chu trình Hexomonophosphate), có ký hiệu quốc tế là:
1.1.49. Chức năng quan trọng của nó là tạo ra NADPH để chống lại các tác
nhân oxy hoá và vì vậy trong hồng cầu nó ý nghĩa lớn trong việc bảo vệ màng
hồng cầu đươc bền vững, đảm bảo thời gian tồn tại trong máu ngoại vi của hồng
cầu là khoảng 120 ngày nhằm đáp ứng nhu cầu ôxy của cơ thể.
Chu trình Hexomonophosphate ( pentosephosphat)
Sự oxy hóa glucose theo con đường Hexomonophosphate xảy ra ở các
mô song song với con đường đương phân song chiếm tỉ lệ thấp hơn nhiều (7%-
10%). Tuy nhiên ở một số tế bào như: hồng cầu, gan, tuyến mỡ, tuyến sữa thời
kì hoạt động ... Sự thoái hóa glucose theo con đường này chiếm ưu thế xảy ra
trong phần dịch bào của tế bào.
+ G6P được tạo ra qua sự phosphorin hóa Glutathion dưới tác dụng của enzym
Hexokinase
4
+ G6P bước vào con đường Pentose qua 2 giai đoạn:
Giai đọan 1: khử cacboxyl oxy hóa G6P thành pentose phosphat, quá trình này
tạo ra NADPH
2
ở một số tổ chức con đường pentose dừng tại đây và phương
trình tổng quát là:
G6P + 2NADP
+
+ H
2
O --> R5P + CO

2
+ 2NADPH + 2H
NADPH dùng cho các phản ứng sinh tổng hợp, còn R5P là tiền chất tổng hợp
Nucleotid.
Giai đoạn 2: biến hóa tiếp tục của pentose phosphat có sự vận chuyển các đơn
vị 2C hoặc 3C dưới tác dụng của các enzym tương ứng là fructose 6 phosphat
và 1 phân tử phospho glyconat:
6 G6P + 12NADP
+
+ 6 H
2
O --> 5G6P +12 NADPHH
+
+ 6CO
2
+ Pi
Đây là giai đoạn oxy hóa ở những tổ chức cần nhiều NADPH hơn R5P
thì các pentose phosphat được đi vào chu trình biến hóa thành G6P để tiếp tục
oxy hóa nhờ sắp xếp lại khung C mà 6 phân tử pentosephosphat trở thành 5
Hexo phosphat.
Glucose-6-phosphate
dehydrogenase
Glucose-6-phosphat 6-phosphogluconolacton
Mg
2+

NADP
+
NAPDH +H
+

Lactonase
6-phosphogluconat
NADP
+
Mg
2+
6-phosphogluconate
dehydrogenase
NADPH+ H
+
Ribulose-5-phosphat
Phosphopentose
isomerase
D-Ribose-5-phosphat ( 5C)
5
Hình 2: giai đoạn 1 của chu trình Hexomonophosphate
5C 7C 6C
5C 3C 4C 6C
5C 3C
6C
5C 3C
5C 3C 4C 6C
5C 7C 6C
Hình 3: giai đoạn 2 của chu trình Hexomonophosphate
Glutathion
reductase
6
Glucose
Glucose 6
phosphate

ATP
ADP
6phosphogluconat
G6PD
NADP+
NADPH
+
+hHHHH
Glutathion dạng
OXH(G-S-S-G)
Glutathion dạng
khử (2G-SH)
Hexokinase
Glutathion peroxydase
MetHb
Hb
Hình 4: Sơ đồ hoạt động của G6PD
Thông qua quá trình photphoryl hóa tạo thành G6P qua xúc tác của G6PD để
tạo ra sản phẩm 6PG đồng thời tạo thành NADPH từ NADP
+
là chất cung cấp
H
+
để khử Glutathion dạng oxy hóa thành dạng khử thông qua enzym
Glutathion reductase để từ đó trực tiếp bảo vệ hồng cầu chống lại các tác nhân
gây oxy hóa ngoài ra còn khử MetHb thành Hb do đó tránh được sự biến tính
Hb.Nếu không đủ G6PD thì lượng NADPH không đủ dẫn đến màng hồng cầu
diễn ra quá trình peroxy hóa lipit dẫn đến hiện tượng vỡ hồng cầu gây ra tan
máu và Hemoglobin sẽ bị kết tủa thành thể Heinz
1.4.Các yếu tố ảnh hưởng đến cấu trúc và hoạt động sinh lý của G6PD:

Một số tính chất chung của enzym:
Enzym là những chất xúc tác sinh học bản chất là prôtêin do cơ thể sống
sinh ra nhờ đó mà các phản ứng hóa học trong cơ thể sống xảy ra với tốc độ rất
nhanh trong điều kiện sinh lý bình thường: nhiệt độ, áp suất không cao, pH môi
trường gần như trung tính. Có những enzym chỉ là những prôtêin đơn thuần
nhưng cũng có những enzym có thành phần cấu tạo gồm có 1 thành phần là
prôtêin đơn thuần (Apoenzym) và một thành phần là chất hữu cơ đặc biệt (chất
cộng tác cofactor hay coenzym).
Ngoài ra còn cần đến sự có mặt của các ion kim loại trong cấu trúc của
enzyme, là thành phần để liên kết enzym và cơ chất, liên kết apoenzym và
coenzym. Vị trí diễn ra phản ứng của enzym là trung tâm hoạt động có tính chất
đặc hiệu đối với từng cơ chất cấu trức và hoạt tính của enzym chịu tác động của
rất nhiều yếu tố khác như: nhiệt độ, pH muối kim loại nặng, chất hoạt hóa và ức
chế hay các dung môi hữu cơ như rượu, axeton... Mỗi một cơ chất enzym có
một Km xác định, đây chính là hằng số Michailis-Menten: là nồng độ của cơ
chất (mol/lit) đủ làm cho tốc độ phản ứng enzym đạt tới một nửa tốc độ cực đại
7
(Vmax). Km thể hiện ái lực của enzym tới cơ chất Km càng nhỏ thì ái lực càng
lớn và ngược lại.
Có 6 loại enzym: enzym oxy hoá -khử (oxidoreductase), enzym vận
chuyển nhóm (Transferase), enzym thuỷ phân (Hydrolase), enzym phân cắt
(lyase), enzym chuyển đồng phân (Isomerase), enzym tổng hợp (Ligase). G6PD
là enzym oxy hoá khử.
Những điều kiện ảnh hưởng đến hoạt động của G6PD:
+ Nhiệt độ: enzym bắt đầu biến tính nhẹ từ 40C, đến 60C thì hoạt tính của
enzym còn lại không đáng kể.
+ Độ pH: pH kiềm nhẹ sẽ làm cho nồng độ dạng dimer nhiêù và enzym
sẽ hoạt động tốt nhất, bởi vậy có mặt một lượng nhỏ NaHCO
3
sẽ giúp enzym

phản ứng tốt hơn. pH tối ưu của G6PD là 8,0 [2]
+ Nồng độ của của các chất nội bào như cơ chất, cofactor, chất tạo thành:
tuân theo quy luật của các phản ứng hoá học khác. Sự trùng hợp của enzym từ
dạng monomer sang dạng dimer và các cấu trúc bậc cao hơn cần có sự có mặt
của NAPD+, chất vừa là cơ chất vừa là cofator. Mỗi dimer có 2 vị trí gắn
NADP+, đó là NADP+ xúc tác, gắn lỏng lẻo và dễ dàng bị khử thành NADPH,
còn lại là NAPD+ chức năng gắn chặt chẽ hơn cần thiết để duy trì cấu trúc hoạt
động của enzym.
+Khi ở ngoài cơ thể thì để đảm bảo cho enzym hoạt động được tốt thì vấn
đề bảo quản là hết sức quan trọng G6PD là một enzym mất nhạy cảm, không
bền vững, nhưng nếu hồng cầu được rửa và bảo quản nguyên vẹn trong dung
dịch NaCl 0,9% ở nhiệt dộ lạnh (4
0
C) ngay sau 24h thì hoạt độ enzym chưa bị
thay đổi. Trái lại chỉ bảo quản theo tiêu chuẩn máu thì sau 24h sẽ giảm 17%
hoạt tính.
+Ion Mg
2+
là ion đặc hiệu cho hồng cầu người, với nồng độ 0,01 mol/l thì
hoạt độ enzym là 100%[2], theo nghiên cứu thì ion kim loại này đóng vai trò
tạo phức hợp giữa enzym và cơ chất.
8
1.5 Cơ sở di truyền học của G6PD
Gen quy định cấu trúc của G6PD nằm trên nhánh dài, locus q28 của nhiễm
sắc thể X (vùng 2, băng 8) không có alen tương ứng trên Y. Vùng 2 là vùng
mang thông tin di truyền mã hóa khá nhiều tính trạng khác như: nhìn màu,
hemophilia A.
Gen G6PD gồm có 13 exon và 12 intron. Dài khoảng 18,5 kilobases. Chức
năng của từng exon khác nhau, và kích thước của các exon mã hóa thay đổi rất
nhiều từ 38 - 236 bp. Trong đó exon 1 không mã hoá [12], exon 6 mã hoá sản

phẩm là nơi gắn cơ chất G6P [6]. mARN G6PD gồm 2269 ribonucleotid, m
RNA của G6PD có một đoạn đầu 3' không mã hóa dài 655 bp và đoạn đầu 5'
không mã hóa dài 69 bp.
Gen G6PD có sự điều hòa và kiểm soát chặt chẽ. Vùng promotor của G6PD
kéo dài khoảng 300 nucleotid giầu GC và nhiều GC không bị methyl hóa.
2. Bệnh lý thiếu hụt G6PD.
2.1.Cơ chế bệnh sinh và cơ sở di truyền học:
2.1.1. Cơ chế bệnh sinh :
Giảm G6PD sẽ giảm lượng Glutathione dạng khử không đủ để khử HbH
2
O
2
tạo thành Met Hemoglobin và Choleglobin do đó Hemoglobin bị biến tính
và kết tủa thành thể Heinz [2][9].
Cơ chất tạo ra là NADPH còn có tác dụng bảo vệ nhóm -SH (nhóm chức
năng hoạt động) của enzym phosphoglyceral-dehydrogenase, đây là 1 enzym
quan trọng trong chuỗi phản ứng xúc tác NAD
+
thành NADH (một chất khử
quan trọng chống lại sự ôxy hóa của hồng cầu [2]).
Ngoài ra giảm NADPH dẫn đến hồng cầu phải sử dụng nhiều NADH
2
làm
giảm lượng ATP cần thiết và lượng Na
+
trong tế bào bị ứ đọng, nước vào trong
hồng cầu nhiều cộng với sự bền vững của màng hồng cầu bị yếu dẫn đến hồng
cầu bị hủy hoại.
2.1.2 Bệnh lý gen học của thiếu hụt G6PD:
9

Giảm G6PD là bệnh di truyền gen hoặc nằm trên nhiễm sắc thể X không
alen tương ứng trên Y do vậy tỷ lệ bị bệnh gặp ở nam giới là nhiều hơn và
thường nặng hơn.
Nam giới XY: giả sử a là gen quy định tính trạng giảm G6PD sẽ có kiểu
gen là X
a
Y: ở nam giới chỉ cần người alen a ở X là có biểu hiện bị bệnh.
Nữ giới XX: có 3 dạng
X
A
X
A
: bình thường.
X
A
X
a
: có thể bình thường hoặc thiếu hụt G6PD từ nhẹ đến trung bình,
hiếm khi thiếu hụt nặng (trừ phi ở vùng trung tâm hoạt động). Nguyên nhân là
do sự bất hoạt nhiễm sắc thể từ trong bào thai, trong quá trình phát triển của
phôi tạo ra thể khảm giữa dòng tế bào lành và dòng tế bào bệnh, tỷ lệ giữa 2
loại tế bào này thay đổi rất lớn: tế bào giảm G6PD chiếm từ 1% -> 90%.
X
a
X
a
: biểu hiện kiểu hình thiếu nặng nhưng tần suất gặp kiểu gen này rất
nhỏ.
Gen cấu trúc đột biến sẽ bây biến đổi về mặt chất lượng ngược lại gen điều
hòa bị đột biến gây thiếu G6PD về mặt số lượng, nhưng biến đổi ở intron không

gây biến đổi cấu trúc và sản lượng G6PD. Hoạt tính G6PD phụ thuộc vào cả
chất lượng và số lượng.
Ngày nay đã phát hiện được hơn 140 dạng đột biến khác nhau đại diện cho
442 biến thể khác nhau có tính chất đặc hiệu và phân biệt bằng các chỉ số sinh
hóa. Do 1 axit amin có thể được quy định bởi người bộ ba nên có khi 2 biến đổi
khác nhau trên AND chỉ gây nên một loại đột biến. Ví dụ như:
- Dạng đột biến Aaches: đột biến nucleotid 1089C -> G
- Dạng đột biến Loma Linda: 1089C -> A hai loại này đều làm thay đổi
acid amin 363 Asn -> Lys.
Dựa vào hoạt độ của enzym trong hồng cầu và những bệnh nhân lâm sàng
của chúng, WHO đã chia các biến thể của thiếu hụt G6PD ra làm 4 lớp:
+ Lớp 1: thiếu enzym nặng với biểu hiện thiếu máu tan máu, hồng cầu
hình không trò người mạn tính.
10
+ Lớp 2: Thiếu G6PD nặng (hoạt độ enzym < 10% so với bình thường
+ Lớp 3: Thiếu G6PD vừa đến nhẹ.
(Hoạt độ từ 10 - 60% so với bình thường).
+ Lớp 4: thiếu rất nhẹ hoặc không thiếu G6PD (60 - 100%).
Tuy vậy nhưng sự phân biệt này là không rõ ràng giữa các phân lớp.
Lớp 1, lớp 2 là gây nguy hiểm nhất vì thường có tan máu cấp diễn.
Hiện nay ở Việt Nam đã tìm thấy được các dạng đột biến khác nhau, trong
đó có một dạng không làm ảnh hưởng đến sự mã hóa acid amin trong cấu trúc
G6PD đó là dạng Silent tồn tại dạng còn lại đều là những dạng hay gặp ở các
dân tộc châu Á. Dạng Silent xuất hiện là do đột biến thay nucleotid C thành
nucleotid T dẫn đến bộ ba mã hoá TAC chuyển thành TAT vẫn mã hoá acid
amin Tyrosin, đây cũng chính là một ví dụ cụ thể biểu thị tính bảo thủ của
thông tin di truyền.
Bảng 1: Một số dạng đột biến G6PD gặp ở Châu Á
STT
Dạng đột

biến
Vị trí biến đổi
Acid amin
tương ứng
Exon Nucleocid
1 Gaoha 2 95A - G 32 His -> Arg
2 Viangchan 9 871G -> A 291 Val -> Met
3 Chatham 9 1003G -> A 335 Sla -> Thr
4 Chinese - 5 9 1024 C -> T 342 leu - > Phe
5 Union 11 1360 -> T 454 Arg -> Cys
6 Canton 12 1376 G -> C 459 Arg -> Leu
7 Kaiping 12 1388 G -> A 463 Arg -> His
8 Silent 11 1311 C -> T TAC -> ATA -> Tyrosil
2.2. Dịch tế học.
Năm 1996 Blood Ernest Beutler đã phát hiện có 400 triệu người thiếu máu
G6PG gặp ở tất cả các dân tộc. Việt Nam nằm trong vùng có tỉ lệ thiếu hụt
G6PD khác nhau tùy từng vùng và tùy từng dân tộc.
Theo nghiên cứu của tác giả Đoàn Hạnh Nhân thiếu G6PD hồng cầu, có tỉ
11