nghiên cứu công nghệ khử nghiễm aflatoxin trên ngô, lạc ở mức độ cao bằng một số chủng vi khuẩn và vi nấm

Khóa Luận Tốt Nghiệp Vũ Thị Phương Anh - 0402
PHẦN 1: MỞ ĐẦU
1.1.Đặt vấn đề.
Ngô, lạc là hai loại nông sản chính của ngành nông nghiệp nước ta.
Chúng không chỉ là nguồn lương thực quan trọng cho đời sống con ngưòi mà
còn là nguồn thức ăn quan trọng trong chăn nuôi gia súc gia cầm. Không
những thế lạc còn đựơc xuất khẩu với số lượng lớn ra nước ngoài. Vì vậy việc
nghiên cứu để bảo quản, nâng cao chất lượng nông sản đã thu hút các tổ chức
quốc tế cũng như các cơ quan khoa học về lương thực thực phẩm của thế giới.
Điều kiện khí hậu nhiệt đới nóng ẩm của nước ta rất thuận lợi cho
nấm mốc phát triển. Các nông sản dạng hạt như ngô, lạc là nguồn cơ chất lý
tưởng cho sự phát triển của nấm mốc. Nấm mốc phát triển không những làm
giảm giá trị dinh dưỡng của hạt mà còn sinh ra các độc tố khác nhau gọi chung
là mycotoxin. Trong những độc tố nguy hiểm phải kể đến aflatoxin. aflatoxin
là độc tố của nấm Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus, Aspergillus
nominus. Ngô, lạc là hai sản phẩm thường nhiễm aflatoxin ở mức độ cao.
Trên thế giới hiện nay việc nghiên cứu để tìm ra biện pháp làm
giảm lượng độc tố aflatoxin trong lương thực nói chung và trong ngô, lạc nói
riêng đã và đang được các nhà khoa học rất quan tâm.
Ở nước ta từ những năm 1970 Nguyễn Phùng Tiến và cộng sự [8]
đã nghiên cứu mức nhiễm nấm mốc trên thóc ở kho bảo quản lương thực miền
Bắc Việt Nam và một số lương thực như đậu, đỗ, lạc…Đặng Hồng Miên [2]
cũng đã nghiên cứu sự nhiễm nấm mốc aflatoxin trên lạc.
Nguyễn Thùy Châu và cộng sự - 1997 [11] đã nghiên cứu tình hình
nhiễm độc tố nấm mốc: aflatoxin, fumonixin, ochratoxin Alternaria,
deoxynivalenol và nivalenol… trên ngô, gạo, và các biện pháp phòng trừ.
Khoa Công nghệ Sinh học
1
Khóa Luận Tốt Nghiệp Vũ Thị Phương Anh - 0402
Một số công trình của Đậu Ngọc Hào về sự nhiễm nấm mốc và
aflatoxin trên thức ăn gia súc và các biện pháp khử độc tố aflatoxin B

1
bằng
NH
4
OH cũng đã được nghiên cứu và công bố [3].
Nguyễn Thùy Châu và cộng sự cũng đã nghiên cứu khử aflatoxin
trên ngô bằng NH
3
và Ca(OH)
2
, kết quả cho thấy NH
3
và Ca(OH)
2
có tác dụng
khử rõ rệt aflatoxin trên ngô và cho hiệu quả khử là 90%.
Tuy nhiên việc khử nhiễm aflatoxin bằng các hóa chất như NH
3
có
giá thành cao và để lại mùi khó chịu cho nông sản bị xử lý. Để khắc phục
nhược điểm này các nhà khoa học đã tập trung nghiên cứu khử nhiễm
aflatoxin bằng biện pháp sinh học.
Góp phần vào việc nghiên cứu công nghệ khử nhiễm aflatoxin trên
ngô lạc chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:
“ Nghiên cứu công nghệ khử nghiễm aflatoxin trên ngô, lạc ở
mức độ cao bằng một số chủng vi khuẩn và vi nấm”.
1.2. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu.
1.2.1. Mục tiêu nghiên cứu .
- Tìm được công nghệ khử nhiễm aflatoxin trên ngô, lạc bằng một
số chủng vi khuẩn và vi nấm.

1.2.2. Nội dung nghiên cứu.
- Nghiên cứu khả năng khử nhiễm aflatoxin của một số chủng
Rhizopusdelemar.
- Nghiên cứu khả năng khử nhiễm aflatoxin của một số chủng
Flavobacterium aurantiacum.
- Nghiên cứu một số yếu tố như nhiệt độ, độ ẩm và thời gian xử lý
cho việc khử nhiễm aflatoxin trên ngô, lạc bằng chủng Rhizopusdelemar có
hoạt tính khử nhiễm cao.
Khoa Công nghệ Sinh học
2
Khóa Luận Tốt Nghiệp Vũ Thị Phương Anh - 0402
PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1.Đại cương về độc tố nấm mốc
Độc tố nấm mốc (hay còn gọi là mycotoxin) là nhóm hợp chất có cấu
trúc đa dạng, có khối lượng nhỏ, được tạo ra bằng trao đổi chất thứ cấp của
các nấm mốc và gây ngộ độc với động vật có vú, cá và gia cầm [15]. Sự sinh
trưởng và phát triển của nó phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện sinh thái
(Moreau 1975) [6]. Những điều kiện đó là vùng sinh thái, khí hậu (nhiệt độ,
độ ẩm), lượng nước có trong cơ chất…Sự sản sinh độc tố nấm mốc là kết quả
của sự tác động qua lại giữa kiểu gen (genotype) và điều kiện phát triển của
chúng. Độc tố nấm là sản phẩm thứ cấp tiết ra trong quá trình chuyển hóa của
một số loài nấm mốc. Quá trình trao đổi chất của nấm gồm 2 giai đoạn: trao
đổi chất sơ cấp và trao đổi chất thứ cấp.
Trao đổi chất sơ cấp được hiểu là các phản ứng tạo thành các chất cần
thiết đảm bảo sự sống và sự phát triển của tế bào. Trao đổi chất thứ cấp là quá
trình tạo thành các chất mà vai trò sinh lý của chúng chưa thật cần thiết cho sự
tồn tại của chính tế bào đó. Quá trình trao đổi chất sơ cấp của tế bào nhìn
chung là giống nhau ở hệ thống sống, nhưng quá trình trao đổi chất thứ cấp thì
phụ thuộc khá chặt chẽ vào đặc tính của mỗi loài mỗi chủng nấm mốc.Thông
thường quá trình này xảy ra vào cuối giai đoạn phát triển của tế bào nấm mốc.

Bệnh độc tố nấm mốc được bắt đầu nghiên cứu sâu từ khi mà cả thế giới bị
thức tỉnh bằng việc phát hiện bệnh X ở gà tây của nước Anh vào năm 1960.
Bệnh X đã làm chết hàng vạn con gà tây do ăn lạc bị nhiễm loài nấm mốc rất
phổ biến là A. flavus.
Hầu như tất cả các sản phẩm thực vật đều có thể là cơ chất cho sự phát
triển của nấm mốc và sự tạo mycotoxin tiếp theo, do đó nó có Khả năng
nhiễm trực tiếp vào thực phẩm của con người. Khi gia súc ăn các thức ăn có
Khoa Công nghệ Sinh học
3
Khóa Luận Tốt Nghiệp Vũ Thị Phương Anh - 0402
mycotoxin chúng không chỉ chịu tác dụng độc trực tiếp mà còn là nguồn mang
mycotoxin vào sữa, thịt và như vậy tạo sự nhiễm mycotoxin vào con người.
Những độc tính của mycotoxin đối với động vật thực nghiệm đã được chứng
minh là rất lớn.
Các mycotoxin đã thu hút được sự quan tâm của các nhà khoa học ở nhiều
lĩnh vực khác nhau.Nó đã được chứng tỏ bằng nhiều hội nghị quốc tế và hội thảo,
tạp chí và các bài báo nghiên cứu dành cho vấn đề có tính cấp thiết này [22].
Cho đến nay có trên 300 loại độc tố nấm đã được phát hiện và nghiên
cứu. Nhưng chỉ có 20 loại mycotoxin có trong thực phẩm ở mức độ nghiêm
trọng và thường liên quan đến an toàn thực phẩm, chúng được tạo bởi 5 chi
nấm Claviceps, Penillium, Apergilus, Fusarium, Alternaria.
Các độc tố của Aspergillus: Aflatoxin (B
1
, B
2
,

G
1
, G

2
, M
1,
M
2
),
sterimatocystin, acid cyclopianzoic.
Các độc tố của Penillium: Patulin, ochratoxin A, citrinin, penitremA, và
acid cyclopianzoic toxin, diacetocyscirpenol, fumonsin, và moniliformin.
Các độc tố của nấm Fusarium: Deoxynivalenol, nivalenol, zearelenon,
T-2 toxin.
Các độc tố của Alternaria: acid tenuazoic, alternarion,methyl ether
alternarion
Các độc tố của Claviceps: Các alkanloid Ergot [14]
2.2.Độc tố aflatoxin
Trong số các mycotoxin thì aflatoxin là độc tố được phát hiện sớm nhất
và được nghiên cứu đầy đủ nhất về mọi phương diện.
2.2.1.Tích chất hóa lý
Các aflatoxin gồm bốn hợp chất của nhóm bis-furanocoumarin, là sản
phẩm trao đổi chất tạo bởi nấm A. flavus và A. parasiticus được đặt tên là B
1,
B
2
, G
1
, G
2
.Các aflatoxin nhiễm trên các sản phẩm thực vật.
Khoa Công nghệ Sinh học
4

Khóa Luận Tốt Nghiệp Vũ Thị Phương Anh - 0402
Các công thức cấu tạo của một số aflatoxin và các chất trao đổi liên
quan đến aflatoxin B
1
,G
1
và aflatoxin B
2
, G
2
, là dẫn xuất hydro của các hợp
chất mẹ. Các aflatoxin M
1
,

M
2
là các chất trao đổi hydroxilat hóa của B
1
và B
2
theo thứ tự. Chúng có công thức cấu tạo như sau:


Aflatoxin B1 Aflatoxin B2



Aflatoxin M1 Aflatoxin M2
Aflatoxin G1 Aflatoxin G2

Bốn hợp chất được phân biệt trên cơ sở màu phát quang của chúng. B là
chữ viết tắt của Blue (màu xanh nước biển), chữ G là viết tắt của Green (màu
Khoa Công nghệ Sinh học
O
OCH
3
O
O
O
OCH
3
O
O
O
OCH
3
OH
O
O
O
OCH
3
OH
O
O
O
OCH
3
O
O

O
O
OCH
3
O
O
O
5
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
Khóa Luận Tốt Nghiệp Vũ Thị Phương Anh - 0402
xanh lá cây). Aflatoxin B
1
và B
2
trong sữa bò được chuyển hóa và gọi là
aflatoxin M
1
và aflatoxin M
2

(M là chữ viết tắt của Milk). Trong bốn loại
aflatoxin, aflatoxin M
1
được tìm thấy ở nồng độ cao nhất, sau đó là G
1
còn B
2
và G
2
tồn tại ở nồng độ thấp hơn.
Các aflatoxin phát quang mạnh khi dưới ánh sáng cực tím sóng dài.
Điều này cho phép phát hiện các hợp chất này ở nồng độ cực thấp (0.5ng hay
thấp hơn trên một vét sắc kí bản mỏng). Nó cung cấp điểm cơ bản về mặt thực
hành cho tất cả phương pháp hóa lý cho việc phát hiện và định lượng.
Aflatoxin M
1
ở nồng độ 0.02mg/l có thể phát hiện được trong sữa lỏng.
Các aflatoxin được hòa tan trong các dung môi phân cực nhẹ như
chloroform và metanol đăc biệt tan nhiều trong dimethysunfoxit (dung môi
thường được sử dụng như phương tiện trong việc áp dụng các aflatoxin vào
các động vật thực nghiệm). Tính tan của aflatoxin trong nước dao động từ 10-
20mg/l.
Vì là chất tinh khiết nên các aflatoxin rất bền ở nhiệt độ cao, khi được
làm nóng trong không khí. Tuy nhiên nó tương đối không bền khi được để
trong không khí dưới tia cực tím ở phiến sắc kí bản mỏng và đặc biệt khi hòa
tan ở các dung môi có độ phân cực cao. Các aflatoxin ít hoặc không bị phá
hủy dưới điều kiện nấu bình thường và làm nóng khi thanh trùng. Tuy nhiên,
lạc rang đã giảm đặc biệt lượng aflatoxin và nó có thể bị phá hủy hoàn toàn
bằng amoniac hay hypochlorit.
Sự có mặt của vòng lacton ở phân tử aflatoxin làm chúng nhạy cảm với

việc thủy phân trong môi trường kiềm, đặc tính này là quan trọng trong bất kỳ
quá trình chế biến thực phẩm, vì quá trình xử lý kiềm làm giảm sự nhiễm của
aflatoxin trong sản phẩm, mặc dầu sự có mặt của pH, protein trong sản phẩm
và thời gian xử lý có thể thay đổi kết quả. Tuy nhiên nếu xử lý kiềm là nhẹ thì
việc axit hóa sẽ làm phản ứng ngược trở lại để tạo aflatoxin ban đầu.
Khoa Công nghệ Sinh học
6
Khóa Luận Tốt Nghiệp Vũ Thị Phương Anh - 0402
Moreau và cộng sự [6] khi nghiên cứu tích chất của aflatoxin đã đưa ra
những kết quả sau:
Bảng 2.1.Tích chất hóa lý của một số Aflatoxin
Aflatoxin
Công thức
phân tử
Trọng
lượng
phân tử
Nhiệt độ nóng chảy
Huỳnh
quang
* ** ***
B1 C
17
H
12
O
6
312 268-269 265-270 252-266 Xanh lam
B2 C
17

H
14
O
6
314 286-289 305-309 280-283 Xanh lam
G1 C
17
H
12
O
7
328 244-246 247-250 246-247 Xanh lục
G2 C
17
H
14
O
7
330 229-231 237-240 Xanh lục
M1 C
17
H
12
O
7
328 299
Xanh lam
tím
M2 C
17

H
14
O
7
320 293 Tím
Ghi chú: *: kết quả của Townsend
* *: kết quả của Stubblefield
* * *: kết quả của Beljaas
2.2.2. Sự tạo aflatoxin do các nấm mốc
Khả năng tạo aflatoxin thường được thấy ở hai chủng A. flavus và A.
Parasiticus.
Các chủng Aspergillus tạo aflatoxin rất phổ biến và thường được phân
lập từ những nguyên liệu khác nhau. Bảng (2.2) cho thấy các chủng A. flavus
phân lập được có khả năng tạo aflatoxin với tỷ lệ cao (từ 20-98%).
Khoa Công nghệ Sinh học
7
Khóa Luận Tốt Nghiệp Vũ Thị Phương Anh - 0402
Bảng 2.2. Các chủng tạo aflatoxin của A. flavus phân lập từ bốn loại hạt cốc
Nguồn Số chủng phân lập
Phần trăm chủng
phân lập tạo
aflatoxin (%)
Sản lượng tạo
aflatoxin (µ/kg)
Lạc 100 98 3300
Hạt bông 59 81 3200
Gạo 127 20 1100
Lúa 63 24 3300
(Số liệu Schroder và Boller 1976)
Sản lượng aflatoxin thường tỷ lệ với trọng lượng hệ sợi nấm tạo thành

khi nuôi cấy: khi số lượng hệ sợi nấm đạt giá trị tối ưu thì sản lượng aflatoxin
lớn nhất. Độc tố này sẽ giảm sút nhanh chóng khi hệ sợi nấm phân giải. Sự
sản sinh aflatoxin trong điều kiện nuôi cấy thông thường bắt đầu từ lúc hình
thành các cơ quan mang bào tử đính của A. flavus, nó tăng dần cho đến giai
đoạn sinh bào tử mạnh mẽ [6].
2.2.3. Điều kiện sinh độc tố
Các nhiệt độ cực tiểu, tối thích và cực đại cho sự tạo aflatoxin là 12
o
C,
27
o
C và 40-42
o
C theo thứ tự. Northolt đã nhiên cứu tác dụng của hoạt tính
nước và nhiệt độ lên sự phát triển và sự tạo aflatoxin của A. parasiticus và đi
đến kết luận rằng: aflatoxin được tạo ra ở hoạt độ nhỏ hơn 0.83 và nhiệt độ
dưới 10
o
C là rất ít và không phát hiện được [22]. Tóm lại, khả năng sinh độc
tố phụ thuộc vào nhiều yếu tố, đó là chủng nấm mốc, nhiệt độ và yếu tố môi
trường.
Khoa Công nghệ Sinh học
8
Khóa Luận Tốt Nghiệp Vũ Thị Phương Anh - 0402
Lượng aflatoxin sản sinh ra cũng thay đổi phụ thuộc vào các yếu tố này.
Một số chủng sinh aflatoxin có thể bị mất khả năng này sau nhiều lần cấy
truyền liên tiếp trên môi trường tổng hợp nhưng cũng có thể làm tăng tính độc
của chúng nếu cấy truyền trên các môi trường thích hợp. Khi hệ sợi nấm càng
phát nhiều thì khả năng sinh độc tố càng mạnh và ngược lại. Môi trường có bổ
sung nấm men hoặc pepton hoặc các acid amin cùng với điều kiện pH, nhiệt

độ thích hợp (pH=5-5.4, nhiệt độ 26-28
o
C) là điều kiện tốt nhất cho sự tạo
thành độc tố aflatoxin.
Hàm ẩm của cơ chất cũng là yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của
nấm mốc và sự tạo mycotoxin cho thấy rằng hàm ẩm 18.3% trên cơ sở trọng
lượng ẩm là giới hạn dưới đối với sự phát triển của A. flavus ở ngô bóc vỏ.
Các nghiên cứu sâu hơn trong điều kiện khống chế chính xác cho thấy hàm ẩm
cân bằng với độ ẩm tương đối 85% là giới hạn dưới của sự phát triển A. flavus
ở tinh bột.
Ngoài ra các vitamin nhóm B cũng kích thích sự tạo thành các aflatoxin.
Người ta đã xác định được rằng khi A. flavus phát triển trên hạt lúa mì thì hàm
lượng aflatoxin tạo ra ở giai đoạn phôi mầm nhiều hơn hẳn giai đoạn phôi
nhũ. Việc thêm nước chiết từ lúa mì, lipit hay các acid béo sẽ kích thích tốt sự
tạo thành aflatoxin. Điều này khiến người ta nghĩ rằng các chất này có vai trò
quan trọng trong việc sinh tổng hợp aflatoxin vì sự phân hủy của chúng tạo
thành các chất tiền sản phẩm tham gia vào vòng chuyển hóa sinh tổng hợp
aflatoxin.
Khoa Công nghệ Sinh học
9
Khóa Luận Tốt Nghiệp Vũ Thị Phương Anh - 0402
2.2.4. Sự nhiễm aflatoxin trên lương thực thực phẩm.
Các hạt lạc có thể bị nhiễm A. flavus trước khi thu hoạch nhưng bị
nhiễm nhanh hơn sau khi cây lạc được nhổ lên và làm khô sơ bộ trước khi củ
lạc được lấy ra khỏi cây.Thời gian sau thu hoạch này là thời gian nhiễm độc
cao đối với sự tạo thành aflatoxin. Các côn trùng gây thương tổn cho hạt cũng
là yếu tố đối với sự nhiễm A. flavus.
2.2.4.1.Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Sự gây thương tổn do côn trùng do ngô ở ngoài đồng cũng có thể đi
kèm hoặc tiếp theo sự nhiễm A. flavus và sự tạo aflatoxin trước thu hoạch.

Theo ước tính của tổ chức Nông lương quốc tế (FAO) thì có khoảng
25% nông sản của thế giới chịu ảnh hưởng nghiêm trọng bởi mycotoxin, chủ
yếu là aflatoxin. Aflatoxin đã làm thiệt hại cho ngành trồng trọt và chăn nuôi
rất lớn [22].
Mặc dù aflatoxin được tìm thấy trong nhiều loại lương thực, thực phẩm
khác nhau nhưng hầu hết sự nhiễm tập trung ở lạc, các hạt có dầu khác như
bông, ngô, và các sản phẩm được chế biến từ chúng. Hạt dẻ Braxin là thường
nhiễm nhất. Bên cạnh đó, lúa mạch ở Ấn Độ cũng bị nhiễm aflatoxin.
Những nghiên cứu của Ablas K. và cộng sự (2004) cho thấy sự nhiễm
aflatoxin trên ngô do nấm A. flavus gây nên là một vấn đề nghiêm trọng ở các
vùng trồng ngô của đồng bằng Missisipi của Mỹ. Trong 3 năm nghiên cứu từ
2000 đến 2002, các tác giả đã nghiên cứu mức nhiễm A. flavus trong đất và đã
xác định rằng mức nhiễm A. flavus trong đất trồng ngô bị ảnh hưởng bởi các
vụ canh tác trước. Mật độ A. flavus cao nhất là 794 CFU/g, trong đất trồng ngô
vụ 2001 so với 251 CFU/g trong đất trồng bông gối vụ năm 2000 và 457
CFU/g đất trồng lúa mì gối vụ năm 2002. Sự nhiễm A. flavus trên ngô hạt năm
2000 dao động từ 0% đến 100% (trung bình là 15% hạt ngô bị nhiễm), hàm
lượng aflatoxin trong ngô dao động từ 0 đến 1590 ppb (trung bình là 57ppb).
Khoa Công nghệ Sinh học
10
Khóa Luận Tốt Nghiệp Vũ Thị Phương Anh - 0402
Ở Thái Lan 35% mẫu ngô nhiễm aflatoxin B
1
với hàm lượng trung bình
400 microgam/kg. Ở Uganda tỷ lệ này là 40% hàm lượng trung bình là 133
microgam/kg và đặc biệt ở đảo Sebu (Philippin) tỷ lệ nhiễm tới 79%, hàm
lượng phát hiện được là 231 microgam/kg. Hàm lượng các mẫu ngô ở các gia
đình đã liên quan đến sự bùng nổ của bệnh gan, độc tố gây cấp tính của Tây
bắc Ấn Độ [22].
Theo kết quả nghiên cứu của Goto và cộng sự [16] trong mùa mưa năm

1984, 1985 ở Thái Lan 85% số mẫu ngô thu thập được từ các kho bảo quản đã
nhiễm aflatoxin B
1
với hàm lượng 6.3-1310 ppb và 0.6-767 ppb theo thứ tự.
2.2.4.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam
Ở Việt Nam, Nguyễn Phùng Tiến và cộng sự [8] đã nghiên cứu mức độ
nhiễm mốc trên ngô, kết quả là 38 mẫu bảo quản trong kho lương thực của
thành phố Thanh Hóa đã nhiễm nấm mốc thuộc các chi sau: Aspergillus,
Cladosporium, Penillium, Sporotrichuro, Saccharomyces, Trichoderma,
Geotrichum. Tuy nhiên chưa có số liệu về mức nhiễm mycotoxin trong công
trình này.
Đậu Ngọc Hào và các cộng sự [5] đã nghiên cứu mức nhiễm mốc và
aflatoxin trên ngô của các tỉnh Sơn La và Thanh Hóa. Kết quả phân tích của
24 mẫu ngô hạt và 24 mẫu ngô bột cho thấy các mẫu này đã nhiễm nhiễm
A.flavus với tỷ lệ từ 50-80%. Các loài như A. glaucus, A. candidus cũng nhiễm
với tỷ lệ khá cao. Loài A .ochraceus đã phát hiện thấy ở tỷ lệ thấp. Các loài
của chi Fusarium đã nhiễm với tỷ lệ 15%. Kết quả nghiên cứu mức nhiễm
aflatoxin ở các mẫu ngô trên đã cho thấy là 33% mẫu ngô hạt đã nhiễm
aflatoxin B
1
từ 10- 40 ppb, 8.3% số mẫu nhiễm aflatoxin B
2
từ 10 - 20 ppb,
72% số mẫu ngô bột đã nhiễm aflatoxin B
1
từ 25 – 250 ppb, 9.5% số mẫu
nhiễm aflatoxin B
2
từ 10-20 ppb.
Khoa Công nghệ Sinh học

11
Khóa Luận Tốt Nghiệp Vũ Thị Phương Anh - 0402
Nguyễn Thùy Châu và cộng sự đã nghiên cứu mức độ nhiễm nấm mốc
và aflatoxin trên nông sản của Việt Nam. Mức độ nhiễm aflatoxin trên ngô và
gạo ở một số địa phương cho thấy tần xuất nhiễm aflatoxin trên ngô ở miền
Nam và miền Bắc Việt Nam là cao từ 73,3% - 95,8% trong đó hàm lượng
aflatoxin trung bình cao nhất là 63,8ppb và hàm lượng aflatoxin trung bình
thấp nhất là 16,25ppb đối với các tỉnh khác nhau .
Nguyễn Thùy Châu và cộng sự đã nghiên cứu công nghệ khử nhiễm
aflatoxin trên ngô, lạc bằng một số hóa chất như NH
3
, foocmanđehit, Ca(OH)
2
kết quả cho thấy rằng NH
3
và Ca(OH)
2
có tác dụng khử rõ rệt aflatoxin B
1
trên
ngô và cho hiệu quả đạt 90%.
2.2.5. Độc tính của Aflatoxin
Tác động lên tế bào: khả năng gây ung thư của các aflatoxin đã được
Wogan nghiên cứu [24] và được IARC đánh giá lại [25]. Ở mức độ tế bào việc
cho uống aflatoxin với liều lượng khác nhau đã nhanh chóng ức chế enzym
ADN polymeraza và ARN polymeraza ở gan, hiện tượng này được quan sát
thấy ở cả tế bào người và tế bào động vật. Quá trình sinh tổng hợp protein
cũng bị hỏng, đặc biệt khi quá trình này chịu ảnh hưởng mạnh của quá trình
sinh tổng hợp ARN thông tin. Dường như sự ức chế polymeraza là hậu quả
gián tiếp của hoạt tính mẫu bị hỏng của nhiễm sắc thể, do tương tác nhiễm sắc

thể - toxin. Sự tương tác giữa aflatoxin hay một số các dẫn xuất của nó với
ARN với thành phần khác của nhiễm sắc thể là sự nhận xét như sự việc ban
đầu ở hàng loạt các quan sát của các phản ứng.
Bằng chứng khác do sự tác động của các aflatoxin lên lưới nội chất và
do đó làm thay đổi sự gắn polysome vào thành tế bào chất. Krustev và các
cộng sự đã nghiên cứu các biến đổi về mặt siêu cấu trúc và hình thái bệnh học
của mô gan của chuột đực liên quan đến tác dụng của liều đơn độc aflatoxin
B
1
[16].
Khoa Công nghệ Sinh học
12
Khóa Luận Tốt Nghiệp Vũ Thị Phương Anh - 0402
Với liều nhiễm 6µ aflatoxin B
1
/100 g trọng lượng cơ thể chuôt đực,
những biến đổi về mặt hình thái của tế bào gan được đặc trưng bởi sự phân ly
của các thành phần hạt và sợi của nhân, sự vón nhiễm sắc thể ở ngoại biên của
nhân, một vài sự biến dạng của màng nhân, làm giảm khoảng không xung
quanh nhân và các giọt mỡ nhỉ ở một và nhân. Lưới nội chất xung quanh nhân
ít được nhìn thấy và mất sự tạo hạt của các ribosome của chúng. Từ các bộ
phận khác, đặc biệt lý thú là các ribosome, rất nhiều không chỉ ở tế bào gan
mà còn ở các tế bào Kupfer. Hoạt tính photphotaza acid cũng giảm rõ rệt [16].
Tác động ở người: nhiều nghiên cứu về các vùng dân cư khác nhau trên
thế giới cho thấy rằng các nồng độ aflatoxin thực tế ở thức ăn có liên quan đến
tai biến ung thư gan ở vùng đó.
Bảng 2.3. Tỷ lệ dân số bị ung thư gan và hàm lượng aflatoxin trung bình
có trên thực phẩm. (Số liệu của Alain Reilly, 1993).
Tên nước hoặc vùng
Hàm lượng

aflatoxin trong
thực phẩm(µ/kg)
Tỷ lệ người mắc
ung thư gan trên
10
5
người/năm
Vùng cao Kenya 0,1 1,2
Songkha (Thái Lan) 0,2 2,0
Thảo nguyên vùng cao (Thụy sỹ)
0,2 2,2
Vùng cao trung bình Kenya 0,2 2,5
Thảo nguyên trung bình (Thụy Sỹ) 0,3 3,8
Vùng thấp Kenya 0,3 4,0
Ratbải (Thái Lan) 1,6 4,0
Thảo nguyên vùng thấp (Thụy Sỹ) 1,5 9,2
Môzămbic 7,8 13,0
Ba trẻ em ở Đài Loan và một trẻ em ở Uganđa đã bị hoại tử gan cấp tính
liên quan đến việc ăn phải gạo và sắn nhiễm aflatoxin ở liều 200 microgam/kg
Khoa Công nghệ Sinh học
13
Khóa Luận Tốt Nghiệp Vũ Thị Phương Anh - 0402
và 1700 microgam/kg là bằng chứng thuyết phục nhất về mối liên quan giữa
aflatoxin với bệnh gan cấp tính. Ở vùng Tây bắc Ấn Độ năm 1974, trong một
dịch vụ vài trăm dân làng ăn ngô bị nhiễm aflatoxin ở mức 15μ/kg có dấu hiệu
ngộ độc và trên 100 người đã bị chết.
Các aflatoxin tác động lên gan theo trình tự như sau: đầu tiên là hoại tử
mô gan, tăng sinh biểu mô, sau đó là xâm nhiễm tế bào lympho để nhằm
chống đỡ tạm thời rồi đến sơ gan, nếu thời gian kéo dài sẽ dẫn đến ung thư
gan. Nhưng bản chất aflatoxin không gây ung thư mà do nó gắn vào một

enzym dẫn đến ung thư, khả năng này phụ thuộc vào sự tồn tại của nhân
dihydrofuran và phần 5 lacton chứa nó, do đó nó đổi phần tận cùng difuran
quan trọng trong tính độc và tính gây độc.
2.2.6. Giới hạn Aflatoxin cho phép
Nhiều nước đã quy định giới hạn aflatoxin bị nhiễm trong lương thực,
thực phẩm ở mức 5-20 microgam/kg. Tổ chức tiêu chuẩn hóa thực phẩm thế
giới (Codex) quy định là 10 microgam/kg. Tại Việt Nam Bộ Nông Nghiệp và
phát triển nông thôn cũng đã đưa ra quy định về hàm lượng tối đa aflatoxin B
1
và hàm lượng tổng số các aflatoxin (B
1
+B
2
+G
1
+G
2
) được tính bằng mg trong
1 kg thức ăn hỗn hợp hoàn chỉnh cho gia cầm gia súc (ppb) [22].
Bảng 2.4. Quy định về độc tố aflatoxin B
1
và aflatoxin tổng số của Việt Nam
Loại vật nuôi Aflatoxin B
1
(ppb)
Tổng số các aflatoxin
(ppb)
Gà con từ 1-28 ngày tuổi ≤ 20 ≤ 30
Nhóm gà còn lại ≤ 30 ≤ 50
Vịt con từ 1-28 ngày tuổi Không có ≤ 10

Nhóm vịt còn lại ≤ 10 ≤ 20
Heo con theo mẹ 1-20 ngày tu ≤ 10 ≤ 30
Nhóm heo còn lại ≤ 100 ≤ 200
Bò nuôi lấy sữa ≤ 20 ≤ 50
Khoa Công nghệ Sinh học
14
Khóa Luận Tốt Nghiệp Vũ Thị Phương Anh - 0402
Bảng 2.5. Những quy định mức cho phép aflatoxin trong thức ăn ở Mỹ
(FAO,1995)
Loại thực liệu
Loại aflatoxin Mức cho
phép (ppb)
Mọi thức ăn (người) trừ sữa B
1
+B
2
+G
1
+G
2
20
Sữa (làm thức ăn cho người) M
1
0.5
Nguyên liệu thức ăn gia súc B
1
+B
2
+G
1

+G
2
20
Hạt bông vải làm nguyên liệu thức ăn
cho bò thịt, heo, gia cầm
B
1
+B
2
+G
1
+G
2
300
Bắp và khô dầu phộng (cho bò,heo,gia
cầm trưởng thành vỗ béo)
B
1
+B
2
+G
1
+G
2
200
Bắp cho thú non và bò sữa B
1
+B
2
+G

1
+G
2
20
Bắp cho thú ,bò thịt, heo,gà giống B
1
+B
2
+G
1
+G
2
100
Bắp cho bò thịt vỗ béo B
1
+B
2
+G
1
+G
2
300
Bắp cho heo vỗ béo B
1
+B
2
+G
1
+G
2

200
2.3. Vấn đề khử nhiễm các mycotoxin
Sự nhiễm aflatoxin trong thực phẩm và thức ăn gia súc có thể gây nguy
hiểm đến sức khỏe con người và động vật. Vì vậy các nhà khoa học đã cố
gắng tìm kiếm các phương pháp để loại trừ hay phá hủy các aflatoxin trong
các sản phẩm bị nhiễm. Phương pháp giải quyết tốt nhất là kiềm chế aflatoxin
và phòng ngừa. Tuy nhiên sự nhiễm aflatoxin đôi khi là không thể tránh được,
và nếu phòng ngừa thất bại thì phải xem tới các biện pháp khác. Các kỹ thuật
dùng để khử aflatoxin trong các mặt hàng khác nhau bao gồm phòng trừ bằng
phương pháp vật lý, hóa học và sinh học.
Khoa Công nghệ Sinh học
15
Khóa Luận Tốt Nghiệp Vũ Thị Phương Anh - 0402
2.3.1. Vấn đề phòng ngừa
Vấn đề phòng ngừa sự nhiễm Aspergillus sản sinh aflatoxin có thể đưa
ra những biện pháp kiềm chế có lợi và hiệu quả nhất. Nó có thể làm giảm phần
lớn những tổn thất lương thực do nấm mốc gây hại. Sau đây là một số biện
pháp phòng chống nấm mốc cho lương thực trong quá trình bảo quản:
- Làm khô bằng nhiệt: Làm khô tự nhiên ( phơi dưới ánh nắng mặt trời).
Sấy khô ( hàn, điện) làm cho các cơ chất đạt lượng nước cho phép. Ví dụ ngô
cần làm khô tới ≤ 13% trước khi bảo quản. Phần lớn các loại nấm mốc phát
triển tốt ở hàm lượng cơ chất 18-25%.
- Chiếu xạ: Chiếu xạ tia cực tím, tia λ với mục đích tiêu diệt các loại vi
khuẩn, nấm mốc để làm giảm thiệt hại do chúng gây ra, các tia này làm biến
đổi cấu trúc chủ yếu của các axit amin, axit nucleic, protein làm tác động
chuyển hóa tế bào, tác dụng diệt nấm, diệt vi khuẩn. Phần lớn các loài nấm
mốc bị diệt ở liều 4.5 kgy (1kgy = 100 Krad = 1kJ/kg).
- Sử dụng các loại khí: Metylbromid ở liều 129 mg/l/Penillium hoặc
40mg/l/Penillium có thể diệt được nhiều loại nấm mốc. Khí ozon ở liều
10mg/m

3
không khí được xác định liên tục trong nhiều ngày có thể ngăn cản
sự phát triển của nấm mốc. Khí CO
2
được ứng dụng trong bảo quản lương
thực trong túi PE kín có thể chống được nấm mốc.
- Hoá học : Được ứng dụng và nghiên cứu do tích chất an toàn của một
số hoá chất, đặc biệt là các axit hữu cơ: axit sorbic, axit propionic, axit acetic,
axit benzoic các muối Na và Ca của chúng như canxipropionat hay natripionat
ở liều 1-3% các axit hoặc muối của axit trên có thể ức chế sự phát triển của
nấm mốc trong thời gian dài. Một số hợp chất hữu cơ khác thiosulfit, Na
2
SO
3
,
KHSO
2
, NaHSO
3
, Na
2
S
2
O
5
thiabendazon diphing, tinh dầu thực vật( tinh dầu
cam ở liều 0.2%) có thể ức chế được nhiều loại nấm mốc, mentho liều 1.1%
Khoa Công nghệ Sinh học
16
Khóa Luận Tốt Nghiệp Vũ Thị Phương Anh - 0402

một số tinh dầu khác: tinh dầu hôi tinh dầu được chiết từ cây tỏi có tác dụng
ức chế nấm mốc.
- Sinh học: Dùng các loại cây có sẵn trong thiên nhiên để chống nấm
mốc thực phẩm. Ví dụ dùng lá cây xoan hoặc lá hoa cúc vàng để xông vì cả
hai loại lá cây này đều có tinh dầu, axit focmic. Đó là những chất sát khuẩn,
kháng khuẩn. Khi xông bằng hai loại lá này thì ngô có độ ẩm 10-13% có thể
kéo dài thời gian bảo quản 30 ngày.
- Vô hoạt hay mất hoạt tính bằng phương pháp vật lý: ít có hiệu quả vì
aflatoxin có thể chịu nhiệt được nhiệt độ >100-105
o
C. Nếu chiếu xạ 10kgy thì
sẽ gây ảnh hưởng tới nguyên liệu. Dùng hấp ướt (autoclve) 1.5at trong 60 phút
nhưng lại ít có giá trị ứng dụng trong thực tế.
- Phương pháp hấp thụ: Các chất hấp thụ như silicagel, axit nhân silic,
than hoạt tính… có tác dụng rất tốt để hấp thụ aflatoxin trong quá trình tiêu
hóa, các aflatoxin được hấp thụ sẽ được thải ra ngòai qua phân.
- Làm mất hoạt tính bằng các hợp chất oxi hóa khử Na
2
SO
4
, NaHSO
3
,
1% hoặc 2% có tác dụng vô hoạt aflatoxin. Hiện nay người ta sử dụng NH
3
ở
dạng khí nén được bơm tuần hoàn vào các thùng chứa ngô bằng thép (Metal
silo) hoặc trong các túi PE có thể chứa đến 2030 tấn ngô. Ngô có hàm lượng
aflatoxin 750ppb sau 13 ngày xử lý, với 1.5 % NH
3

ở nhiệt độ 32
o
C đã làm
giảm xuống còn 7 ppb.
2 .3.2 . Các phương pháp khử độc tố bằng hóa chất
Nhiều hóa chất có thể phá hủy aflatoxin tinh khiết hayaaflatoxin trong
các nguyên liệu nhiễm tự nhiên. Những hóa chất này bao gồm: chlorine, ozon,
acid hydrochloric, peroxit benzoic, amoniac, natri hydrochlorit và etanolamin.
Các hóa chất dùng cho việc khử độc tố aflatoxin phải thỏa mãn các tiêu chuẩn
sau: - Phải phá hủy hay khử aflatoxin
Khoa Công nghệ Sinh học
17
Khóa Luận Tốt Nghiệp Vũ Thị Phương Anh - 0402
- Không được tạo hay giải phóng ra bất kỳ các dư lượng độc hay gây
ung thư ở sản phẩm cuối cùng.
Phải phá hủy các bào tử và sợi nấm mà dưới điều kiện thuận lợi, chúng
có thể tái nhiễm lại ở sản phẩm.
Phải giữ được giá trị dinh dưỡng và tính ăn được của nguyên liệu ban
đầu.
Nhiều hóa chất khảo sát đã không thỏa mãn tất cả các tiêu chuẩn trên.
Mặc dù chúng phá hủy các aflatoxin nhưng lại làm giảm đáng kể giá trị dinh
dưỡng của nguyên liệu xử lý tạo nên các sản phẩm độc hay các sản phẩm có
tác dụng phụ không mong muốn.
Một số quá trình xử lý bằng hóa chất có hiệu quả trong việc phá hủy các
afatoxin thỏa mãn những tiêu chuẩn trên. Trong số này hydrogen peroxit, natri
hydroxit và natri hydroclorit dường như có khả năng trong việc khử afltaoxin
từ các sản phẩm giàu protein hay các sản phẩm dùng cho người ăn, trong khi
đó dimetylamin hay amoniac có thể áp dụng cho việc khử độc tố các hạt có
dầu.
2.3.3. Giảm hàm lượng aflatoxin bằng biện pháp sinh học

Nhiều loại hóa chất có thể phá hủy aflatoxin tinh khiết hoặc các
aflatoxin trong các nguyên liệu tự nhiễm tự nhiên khác như: chlorin, ozon,
acid hydrôchloric…Các hóa chất này mặc dầu phá hủy aflatoxin nhưng lại làm
giảm đáng kể giá trị dinh dưỡng của nguyên liệu xử lý và tạo nên các sản
phẩm độc hay các sản phẩm phụ có tác dụng không mong muốn. Do vậy việc
sử dụng các biện pháp sinh học không có hại cho con người và thực phẩm mà
lại có khả năng làm giảm sự tạo độc tố hoặc ức chế hoàn toàn việc tạo độc tố
là biện pháp lý tưởng.
Một số chủng nấm mốc và vi khuẩn có khả năng giảm sự tạo độc tố thì
ngoài việc đảm bảo tính an toàn không độc hại đối với con người và thực
Khoa Công nghệ Sinh học
18
Khóa Luận Tốt Nghiệp Vũ Thị Phương Anh - 0402
phẩm được xử lý, đôi khi cần phải thỏa mãn một số yêu cầu khác, chẳng hạn
Streptorocus lactic đòi hỏi nuôi trên môi trường dinh dưỡng đặc biệt nên
không thể thích hợp đối với việc xử lý trên ngũ cốc và thực phẩm.
Mặc dù các biện pháp phòng chống nấm mốc sinh độc tố đã được
khuyến cáo áp dụng, nhưng sự nhiễm aflatoxin trên ngô, lạc ở mức độ cao quá
giới hạn cho phép sử dụng là không thể tránh được trong những điều kiện bảo
quản bất lợi. Vấn đề khử nhiễm aflatoxin bằng con đường sinh học nhằm thay
thế cho biện pháp khử nhiễm aflatoxin bằng các hoá chất có giá thành cao và
làm biến đổi phẩm chất lương thực nên khó áp dụng vào thực tiễn bảo quản.
Khử độc tố bằng biện pháp sinh học có thể được định nghĩa như sự phân giải
bằng enzym hay chuyển hoá sinh học của các độc tố nấm.
2.3.3.1. Khử nhiễm aflatoxin bằng chủng Flavobacteroum aurantiacum
Flavobacterium aurantiacum là vi khuẩn Gram âm, hiếu khí tế bào hình
que, dạng thuôn dài, kích thước chiều dài 2-5 µm, rộng 0.3-0.5 µm, jhông có
khả năng di động. Khuẩn lạc trên thạch có màu từ vàng kem đến màu vàng
cam.
Nhiều công trình nghiên cứu của các tác giả như Claude Morro (1970),

Cotty Pitter (1992) đã cho thấy vi khuẩn Flavobacterium aurantiacum có khả
năng phân huỷ aflatoxin. Nó có khả năng phân hủy aflatoxin một cách không
trở lại cả từ môi trường rắn và môi trường lỏng. Khả năng loại trừ aflatoxin B
1
của vi khuẩn này từ các thực phẩm đã được chứng minh ở các loại dầu thực
vật lạc, ngô, bơ lạc và sữa lạc. Các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng yếu tố
có vai trò quan trọng trong việc phân giải aflatoxin B
1
bằng chất chiết của
Flavobacterium aurantiacum có thể là protein với các tính chất enzym. Khả
năng sử dụng chất chiết protein thô từ Flavobacterium aurantiacum được tinh
chế trong công nghiệp thực phẩm đã được Cộng đồng Châu Âu và cơ quan
Khoa Công nghệ Sinh học
19
Khóa Luận Tốt Nghiệp Vũ Thị Phương Anh - 0402
Quản lý thực phẩm và thuốc của Mỹ đề nghị như các biện pháp loại trừ
aflatoxin từ các thực phẩm bị nhiễm.
2.3.3.2. Khử nhiễm aflatoxin bằng chủng Rhizopus delemar.
Theo Larone Rhizopus delemar là lòai phổ biến trong thiên nhiên như
trong đất, không khí, hoa quả thối, trong xác động thực vật và trong bánh mì
để lâu ngày.
Rhizopus delemar thường phát triển khuẩn ty bao phủ phần bên ngoài cở
chất. Khuẩn ty của Rhizopus delemar không có vách ngăn. Khi còn non sợi
khuẩn ty có dạng sợi bông vải màu trắng. Khi trưởng thành sợi khuẩn ty có
màu xám, khi già chuyển thành màu xám hơi vàng. Khuẩn lạc Rhizopus
delemar phát triển rất nhanh trên môi trừơng PDA. Mặt trắng của khuẩn lạc có
màu trắng nhợt.
Cuống sinh bào tử hình tròn hoặc hình trứng, đường kính 4-11µm, bề mặt
trơn. Nhiệt độ là 25
o

C và pH tối ưu của Rhizopus delemar là 5.5-5.8.
Zhu C.R. và cộng sự (1989) đã nghiên cứu tác dụng khử nhiễm aflatoxin
của Rhizopus delemar bằng thực nghiệm trên chuột nhắt có nhiễm aflatoxin.
aflatoxin B
1
đã được đưa vào nước uống cho chuột nhắt cái ở liều 126 µg
trong một tuần và toàn thể liều thử là 3,40 mg trong thời gian 27 tuần. Chất
chiết của Rhizopus delemar đã được đưa đồng thời vào nhóm chuột này bằng
việc trộn dung dịch aflatoxin B
1
. Chuột được giết riêng biệt vào các tuần tuổi
18. 30, 38, và 52. Các ổ bệnh thay đổi tế bào gan và các mô ung thư đã được
định lượng bằng kính hiển vi quang học và kính hiển vi điện tử và bằng các
phản ứng enzym. Ở nhóm chuột ăn thức ăn nhiễm aflatoxin B
1
, tai biến ung
thư gan là 71%. Ở nhóm chuột ăn thức ăn có Rhizopus delemar cùng với
aflatoxin B
1
, các ổ bệnh phát triển quá mức và các ổ bệnh có triệu chứng bệnh
học enzym đã giảm ở tất cả các thời gian lấy mẫu chuột để thử và không có
Khoa Công nghệ Sinh học
20
Khóa Luận Tốt Nghiệp Vũ Thị Phương Anh - 0402
con chuột nào xuất hiện triệu chứng ung thư gan. Kết quả thực nghiệm này
cho thấy rằng Rhizopus delemar có khả năng ức chế mạnh tác dụng độc và
tính gây ung thư gan của aflatoxin B
1
. Nấm Rhizopus delemar có thể được sử
dụng như biện pháp tiện lợi và hiệu quả để kiểm soát sự nhiễm độc do

aflatoxin.
2.3.6 Biện pháp phân tách vật lý
a. Các qui trình phân loại
Vì biện pháp phòng ngừa rất khó thực hiện trong thực tế, cho nên người
ta tìm các biện pháp khác để kiềm chế. Các phương pháp sử dụng rộng rãi
nhất bao gồm loại trừ chọn lọc các phần đã nhiễm của sản phẩm. Nói rộng ra,
vấn đề này là khả năng áp dụng phụ thuộc chủ yếu vào tích chất vật lý của sản
phẩm. Các qui trình phân loại dựa trên các đặc tính như màu và kích thước
của hạt… đã được sử dụng thành công đối với lạc ăn. Những phương pháp
này dựa trên sự định vị aflatoxin ở phần tương đối nhỏ của hạt, với sự thiếu
hụt rất dễ nhận ra ở kích thước và hình dạng của hạt.
b. Các quy trình chiết xuất bằng dung môi
Việc chiết xuất bằng dung môi có một số thuận lợi:
- Aflatoxin có thể bị loại trừ hoàn toàn một cách cơ bản trong điều kiện
thuận lợi .
- Ít có khả năng tạo từ aflatoxin những sản phẩm khác có hoạt tính sinh lý
đa dạng.
- Việc chiết xuất có thể tiến hành với việc thu hồi dung môi mà không bị
mất chất dinh dưỡng trong nhiều trường hợp.
Những điều bất lợi:
- Cần phải có chiết xuất dung môi đặc biệt
- Sẽ chiết xuất luôn một số thành phần hòa tan cùng aflatoxin
Khoa Công nghệ Sinh học
21
Khóa Luận Tốt Nghiệp Vũ Thị Phương Anh - 0402
- Giá thành của việc chiết xuất cao
- Có thể bị mất mùi của sản phẩm xử lý
Để tìm được dung môi có thể thích hợp cho tất cả các sản phẩm là một
nhiệm vụ khó. Các yếu tố khác như giá của dung môi và biện pháp thu hồi
chúng cũng là vấn đề. Thêm nữa là độc tính của dung môi và dư lượng của

chúng, cuối cùng là tính an toàn của quá trình xử lý vì tính dễ cháy, dễ nổ và
điểm sôi của dung môi.
Các aflatoxin có thể được chiết xuất bằng các dung môi như
cloroform/nước, axeton/nước. Những hệ dung môi này chỉ loại trừ aflatoxin
đơn độc mà không loại trừ dầu.Còn các nhóm dung môi như hidrocacbon dầu
hỏa/nước loại trừ chủ yếu dầu nhưng cũng có khả năng loại trừ aflatoxin.
Những kết quả có nhiều hứa hẹn nhất đã thu được bằng việc dùng hệ
thống chiết xuất bao gồm hỗn hợp hexan – metanol, hexan – etanol, hexan –
etanol - nước, và hexan –axeton - nước.Hệ thống bao gồm 54% axeton, 44%
hexan và 2% nước ( tính theo trọng lượng ) đã tìm thấy một trong những hệ
thống thành công nhất có thể đồng thời loại trừ dầu từ các bánh ép khô của lạc
gồm 12-15% dầu và dư lượng lipit gần bằng 1% và mức aflatoxin thấp hơn 40
microgam/kg.
Khoa Công nghệ Sinh học
22
Khóa Luận Tốt Nghiệp Vũ Thị Phương Anh - 0402
PHẦN 3:
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1.Đối tượng nghiên cứu
3.1.1 . Vật liệu
Các chủng Flavobacterium aurantiacum và Rhizopus delemar do phòng vi
sinh Viện cơ điện nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch cung cấp
3.1.2. Các hóa chất dùng cho phân tích độc tố aflatoxin B
1
* Na
2
SO
4
khan ( Trung Quốc ).
* NaCl nhà máy hóa chất Việt Trì.

* Các dung môi cloroform, hexan, aceton, chì axetat (Trung Quốc).
* Các chuẩn độc tố aflatoxin B
1
(Sigma, Mỹ).
* Silicagel 60 F
245
, Merck, Cộng hòa liên bang Đức, cho sắc ký lớp mỏng.
3.1.3. Dụng cụ thí nghiệm
* Buồng sắc lý lớp mỏng (chromatography tank ), Thụy Sỹ.
* Máy nghiền đồng thể polytron, Cộng hòa liên bang Đức.
* Giấy lọc Whatman N
o
1, Chemapoli, Tiệp Khắc.
* Kính hiển vi Olympus có gắn máy chụp ảnh Nhật.
* Phễu chiết.
* Ống hút tự động 0,2ml và 0,1ml Trung Quốc.
* Bơm tiêm vi lượng Hamilton.
* Máy cô chân không.
* Đèn cực tím 254 nm – 366nm Camag (Thụy Sỹ ).
* Máy đánh sóng siêu âm.
* Các dụng cụ dùng cho nuôi cấy vi sinh vật.
* Máy cất quay chân không ( Đức).
* Tủ cấy vô trùng ( Đức).
Khoa Công nghệ Sinh học
23
Khóa Luận Tốt Nghiệp Vũ Thị Phương Anh - 0402
* Nồi hấp tự động ( Đài Loan).
* Máy lắc.
3.2. Phương pháp chiết xuất aflatoxin.
Chúng tôi tiến hành phân tích aflatoxin bằng phương pháp sắc kí bản

mỏng do Doronina và Maksimenko [17] mô tả. Dựa trên cơ sở của phương
pháp CB (AOAC) [13] có cải tiến gồm những giai đoạn sau:
25 gam mẫu được nuôi A. flavus, chiết xuất aflatoxin bằng hỗn hợp
aceton (100ml) và dung dịch NaCl 10% (25ml). Mẫu được nghiền trên máy
nghiền đồng thể Polytron. Lọc qua giấy lọc Whatman N
o
1. Lấy 50ml dịch lọc
và kết tủa bằng Pb(CH
3
COO)
2
10% (50ml) để loại bỏ protein, tiếp tục lọc qua
giấy lọc để thu 80ml dịch lọc. 80 ml dịch lọc đó chuyển vào phễu chiết và
được bổ sung 2 lần hexan (40ml ) để chiết xuất bằng hai pha lỏng-lỏng. Bỏ
phần dịch nổi phía trên. Phần dịch trong ở phía dưới lại tiếp tục đưa trở lại
phễu chiết và được bổ sung cloroform 40ml (3lần). Lớp nước aceton nhẹ hơn
sẽ nổi lên trên, loại bỏ lớp aceton. Lớp clorofrom có aflatoxin được giữ lại.
Làm bay hơi toàn bộ lượng clorofrom có aflatoxin ở máy cất quay cô chân
không. Phần cặn được hòa tan vào 100 µl clorofrom, giữ ở 4
0
C cho đến khi
tiến hành định lượng và định tính aflatoxin.
Khoa Công nghệ Sinh học
24
Khóa Luận Tốt Nghiệp Vũ Thị Phương Anh - 0402
Quy trình chiết tách Aflatoxin
Khoa Công nghệ Sinh học
Mẫu ngô, lạc
Nghiền nhỏ
25

Nghiền 5 phút trên máy
nghiền đồng thể
Lọc lấy 50 ml dịch
Lấy pha trên cho vào
Bình cầu
Lấy phần dịch trong
Phiễu chiết
Chloroform
(Nhắc lại 3 lần)
Lọc 80 ml dịch
Cất quay (cô chân
không) lấy 3 ml cặn
Ống nhót để bay hơi
lấy cặn
Bọc giấy bạc
bảo quản lạnh 4
o
C
40 ml n-hexan (nhắc
lại 2 lần)
Bỏ phần dịch nổi
trên
50 ml chì axetat 10%
Na
2
SO
4
khan
25ml NaCl 10%
100ml aceton