GIỐNG VI SINH VẬT THÚ Y - PHẦN 16: QUY TRÌNH GIỮ GIỐNG VI RÚT GUMBORO NHƯỢC ĐỘC CHỦNG 2512

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA
TCVN 8683-16:2017
GIỐNG VI SINH VẬT THÚ Y - PHẦN 16: QUY TRÌNH GIỮ GIỐNG VI RÚT GUMBORO NHƯỢC ĐỘC
CHỦNG 2512
Master seed of microorganisms for veterinary use - Part 16: The procedure for preservation of
gumboro virus, 2512 strain, living
Lời nói đầu
TCVN 8683-16 : 2017 do Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc Thú y TW1 - Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông
nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ
Khoa học và Công nghệ công bố.
Bộ TCVN 8683 Giống vi sinh vật thú y - Quy trình giữ giống gồm các phần:
- TCVN 8683-1 : 2011, Phần 1: Quy trình giữ giống vi rút dịch tả lợn qua thỏ, chủng C;
- TCVN 8683-2 : 2011, Phần 2: Quy trình giữ giống vi rút cường độc dịch tả lợn, chủng Thạch mơn;
- TCVN 8683-3 : 2011, Phần 3: Quy trình giữ giống vi rút Newcastle, chủng hệ I;
- TCVN 8683-4 : 2011, Phần 4: Quy trình giữ giống vi rút dại chủng cố định;
- TCVN 8683-5 : 2011, Phần 5: Quy trình giữ giống vi khuẩn đóng dấu lợn nhược độc, chủng VR2;
- TCVN 8683-6 : 2011, Phần 6: Quy trình giữ giống vi khuẩn nhiệt thán vơ độc, chủng 34 F2;
- TCVN 8683-7 : 2011, Phần 7: Quy trình giữ giống vi khuẩn nhiệt thán cường độc, chủng 17JB;
- TCVN 8683-8 : 2011, Phần 8: Quy trình giữ giống vi khuẩn phó thương hàn lợn, các chủng SC.1;
SC.2; SC.4 và SC.5;
- TCVN 8683-9 : 2011, Phần 9: Quy trình giữ giống vi khuẩn tụ huyết trùng trâu bò, các chủng PB.1,
PB.2, P.52, PBU.1 và PBU.2;
- TCVN 8683-10 : 2011, Phần 10: Quy trình giữ giống vi khuẩn tụ huyết trùng lợn nhược độc, chủng
AVPS3;
- TCVN 8683-11 : 2011, Phần 11: Quy trình giữ giống vi khuẩn tụ huyết trùng lợn, chủng PS1;
- TCVN 8683-12 : 2011, Phần 12: Quy trình giữ giống vi khuẩn tụ huyết trùng gà, các chủng PA.1,
PA.2;
- TCVN 8683-13 : 2011, Phần 13: Quy trình giữ giống vi khuẩn đóng dấu lợn, các chủng E.37, E.47 và
E.80;
- TCVN 8683-14 : 2011, Phần 14: Quy trình giữ giống vi khuẩn ung khí thán, các chủng CL.C1 và
CL.C2;

- TCVN 8683-15 : 2017, Phần 15: Quy trình giữ giống vi rút viêm gan vịt cường độc;
- TCVN 8683-16 : 2017, Phần 16: Quy trình giữ giống vi rút gumboro nhược độc chủng 2512;
-TCVN 8683-17 : 2017, Phần 17: Quy trình giữ giống vi khuẩn bordetella bronchiseptica.
GIỐNG VI SINH VẬT THÚ Y - PHẦN 16: QUY TRÌNH GIỮ GIỐNG VI RÚT GUMBORO NHƯỢC
ĐỘC CHỦNG 2512
Master seed of microorganisms for veterinary use - Part 16: The procedure for preservation of
gumboro virus, 2512 strain, living
CẢNH BÁO - Việc áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao
tác gây nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không thể đưa ra được hết tất cả các vấn đề an toàn liên
quan đến việc sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an
tồn sức khỏe thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định trước khi sử
dụng tiêu chuẩn.
1 Phạm vi áp dụng
Tiêu chuẩn này quy định quy trình ni giữ giống vi rút Gumbro nhược độc chủng 2512 được sử dụng
trong công tác giữ giống, đánh giá chất lượng vắc xin và chế phẩm sinh học, chẩn đoán, nghiên cứu
và giảng dạy.
2 Tài liệu viện dẫn


Tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi
năm cơng bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm cơng bố thì
áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).
TCVN 8684 : 2011, vắc xin và chế phẩm sinh học dùng trong thú y - Phép thử độ thuần khiết.
3 Ký hiệu và chữ viết tắt
AGID

Agar gel immunodiffussion

AND

Acid deribonucleic

ARN

Acid ribonucleic

EID50

50 Egg Infective Dose

CID50

50 Chicken infective dose

SN

Serum neutralization

SPF

Specific Pathogen Free

TCID50

Tissue Culture Infectious Dose 50

PBS

Phosphate Buffered Saline

PCR

Polymerase Chain Reaction

RT-PCR

Reverce Transcription Polymerase Chain Reaction

4 Nguyên tắc
Lấy giống vi rút Gumbro nhược độc được giữ ở dạng đơng khơ để kiểm tra đặc tính sinh học của
giống bằng các phương pháp phân tích trong phịng thí nghiệm. Giống được bồi dưỡng bằng cách
cấy truyền trên tế bào xơ phôi gà 1 lớp, sau 48 h đến 72 h, giống được thu hoạch, giám định vi rút
bằng phương pháp RT-PCR, nếu giống vi rút Gumbro nhược độc đạt yêu cầu được đông khô và bảo
quản quản ở nhiệt độ âm 80 °C.
5 Vật liệu và thuốc thử
5.1 Vật liệu
5.1.1 Giống vi rút Gumbro nhược độc chủng 2512 thuộc serotype 1, họ Birnaviridae, được đông
khô với lượng giống 0,1 ml/lọ với hiệu giá vi rút là 10 3 TCID50/0,1 ml, được kiểm tra vô trùng, thuần
khiết, tính an tồn, tính miễn dịch, tính nhân lên của vi rút
5.1.2 Gà 14 ngày tuổi (gà khỏe mạnh, không có kháng thể kháng vi rút Gumboro, có nguồn gốc từ
đàn gà bố mẹ khỏe mạnh)
5.1.3 Tế bào xơ phôi gà một lớp trên đĩa nhựa đáy phẳng 96 giếng hoặc chai Flash T25 hoặc T75
5.1.4 Trứng gà SPF có phôi từ 9 ngày tuổi đến 11 ngày tuổi
5.1.5 Giống vi rút Gumboro cường độc
5.2 Thuốc thử
5.2.1 Dung dịch PBS pH 7,2 (xem phụ lục A)
5.2.2 Môi trường nuôi cấy tế bào
5.2.3 Thạch Agar
5.2.4 Huyết thanh dương tính chuẩn (với Gumboro)
5.2.5 Kháng nguyên chuẩn (với Gumboro)

5.2.6 Huyết thanh âm tính chuẩn (với Gumboro)
5.2.7 Bộ kit dùng cho phản ứng RT-PCR
5.2.8 Các loại kháng sinh Penicillin (200 Ul/ml), Streptomycin (200 μg/ml)
5.2.9 Sữa bò tách bơ 10% (xem phụ lục A)
Xem Phụ lục A về mô tả các dung dịch thuốc thử.
6 Thiết bị, dụng cụ
Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phịng thí nghiệm thơng thường và cụ thể như sau:
6.1 Tủ lạnh (có thể duy trì nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C), tủ lạnh sâu (có thể duy trì nhiệt độ âm 80 °C)
6.2 Tủ ấm CO2 có thể duy trì nhiệt độ 37 °C
6.3 Máy lắc trộn (vortex mixer) có tốc độ lắc từ 50 rpm đến 2400 rpm


6.4 Máy khuấy từ có tốc độ khuấy tới 2400 vịng/phút
6.5 Nồi cách thủy có thể duy trì ở các nhiệt độ 100 °C, 110 °C, 121 °C trong thời gian 10 min, 15
min, 20 min
6.6 BSC II màng lọc ULPA với hiệu suất lọc 99,99% đối với các hạt có kích thước 0,1 - 0,3 mm
6.7 Máy ly tâm, có thể ly tâm với gia tốc tới 12 000 g
6.8 Máy đơng khơ có nhiệt độ âm sâu tới âm 80 °C
6.9 Máy RT-PCR
6.10 Máy điện di kiểm tra sản phẩm PCR/RT-PCR của hãng Fermentas và Bio-Rad
6.11 Máy soi gel Dolphin-Doc (Wealtech, Mỹ)
6.12 Máy tính và các phần mềm sinh - tin học
6.13 Micropipet, dung tích từ 0,5 μl đến 10 μl, từ 5 μl đến 50 μl, từ 50 μl đến 200 μl, từ 100 μl đến
1000 μl
6.14 Micropipet đa kênh, dung tích từ 5 μl đến 50 μl, từ 50 μl đến 200 μl
6.15 Chai nuôi cấy tế bào T25, T75
6.16 Đầu tip phù hợp với micropipet
6.17 Đèn soi trứng
6.18 Tủ ấp trứng có thể duy trì nhiệt độ 37 °C
6.19 Cốc có mỏ, dung tích 100 ml, 200 ml, 500 ml và 1000 ml

6.20 Bộ cối chày sứ vô trùng
6.21 Lọ đông khô giống vô trùng
6.22 Đĩa Petri vô trùng
6.23 Dao, kéo, panh kẹp vô trùng
6.24 Chai Schott vô trùng 100 ml, 200 ml, 500ml
7 Yêu cầu của giống vi rút Gumboro nhược độc
7.1 Yêu cầu kỹ thuật đối với ống giống
- Lọ kín, khơng rạn nứt, đảm bảo chân không.
- Hợp chất trong ống giống xốp, màu đồng nhất, độ ẩm dưới 4% và hòa tan hoàn toàn trong nước
sinh lý sau 2 min.
7.2 Yêu cầu sinh học của giống
- Giống vi rút đảm bảo vô trùng (không bị tạp nhiễm vi khuẩn, nấm mốc), đảm bảo thuần khiết (không
bị tạp nhiễm Mycoplasma, Salmonella và vi rút ngoại lai)
- Giống vi rút được nhận dạng bằng phương pháp RT-PCR (xuất hiện vạch giống như mẫu đối chứng
dương) hoặc phản ứng kết tủa khuếch tán trên thạch (vi rút kết tủa với kháng huyết thanh đặc hiệu
tạo thành đường kết tủa màu trắng)
- Hiệu giá vi rút của giống phải đạt ít nhất 103 TCID50/0,1 ml
- Giống vi rút được kiểm tra tính an tồn trên gà (khi nhỏ giống vi rút cho gà thì gà sống khỏe, khơng
có biểu hiện triệu chứng lâm sàng của bệnh Gumboro)
- Giống vi rút được kiểm tra khả năng nhân lên của vi rút trên môi trường tế bào xơ phôi gà 1 lớp (sau
48 h đến 72 h gây nhiễm, vi rút nhân lên và phá hủy ≥ 80% diện tích tế bào)
- Giống vi rút được kiểm tra tính gây miễn dịch bằng phương pháp cơng cường độc hoặc phương
pháp trung hòa.
8 Cách tiến hành
8.1 Nhận dạng giống
Chọn 1 trong 2 phương pháp sau:
8.1.1 Nhận dạng vi rút bằng phản ứng kết tủa khuếch tán trên thạch AGID
Giống vi rút (5.1.1) được nhận dạng bằng phương pháp kết tủa khuếch tán miễn dịch trên thạch
(AGID). Vi rút (5.1.1) kết tủa với kháng huyết thanh đặc hiệu tạo thành đường kết tủa màu trắng khi
thực hiện phản ứng kết tủa khuếch tán miễn dịch trên thạch (xem phụ lục C).

8.1.2 Nhận dạng vi rút bằng phương pháp RT- PCR
Giống vi rút (5.1.1) được nhận dạng bằng phương pháp RT - PCR (tham khảo phụ lục F).
8.2 Kiểm tra vô trùng
8.2.1 Kiểm tra tạp nhiễm vi khuẩn. Theo TCVN 8684:2011
8.2.2 Kiểm tra tạp nhiễm nấm mốc. Theo TCVN 8684:2011
8.3 Kiểm tra thuần khiết
8.3.1 Kiểm tra tạp nhiễm Mycoplasma. Theo TCVN 8684:2011
8.3.2 Kiểm tra tạp nhiễm Salmonella. Theo TCVN 8684:2011
8.3.3 Kiểm tra vi rút ngoại lai
Kiểm tra tạp nhiễm vi rút Cúm gia cầm được tiến hành bằng phản ứng RT-PCR (tham khảo phụ lục
B).
8.4 Chuẩn độ vi rút
Chuẩn độ giống vi rút (5.1.1) trên môi trường nuôi cấy tế bào xơ phôi gà 1 lớp (5.1.3) được thực hiện
ở tấm nhựa 96 giếng đáy bằng (xem phụ lục D). Giống đạt yêu cầu khi hiệu giá vi rút của giống phải
đạt 103 TCID50/0,1 ml.
8.5 Kiểm tra tính an tồn
8.5.1 Chuẩn bị
- 10 gà (5.1.2).
- Giống vi rút (5.1.1) được chuyển từ nhiệt độ bảo quản âm 80 °C sang nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C
trong khoảng 5 min đến 10 min, rồi pha loãng với PBS (5.2.1) thành nồng độ 10 -3.
8.5.2 Cách tiến hành
Nhỏ mắt, mũi hoặc cho uống mỗi gà 0,1 ml giống vi rút (5.1.1) đã pha loãng ở trên. Theo dõi biểu hiện
triệu chứng lâm sàng của gà trong vòng 21 ngày.
8.5.3 Đánh giá kết quả
Giống vi rút (5.1.1) được coi là an toàn khi: Sau 21 ngày nhỏ giống vi rút (5.1.1) 10/10 gà (5.1.2) sống
khỏe, khơng có biểu hiện triệu chứng lâm sàng của bệnh Gumboro. Tồn bộ gà thí nghiệm bị giết và
kiểm tra bệnh tích, khơng có gà thí nghiệm nào có bệnh tích của bệnh Gumboro.
Ghi chú: - Triệu chứng điển hình của bệnh Gumboro: Gà quay đầu tự mổ vào hậu mơn, gà có dấu

hiệu hoảng loạn và có tiếng kêu khác thường. Sau 2 ngày đến 3 ngày gà bị ỉa chảy, phân loãng, nhiều
nước, trắng, nhớt
- Bệnh tích của bệnh Gumboro: Xuất huyết cơ đùi, cơ ngực; thận và lách sưng; túi Fabricius sưng,
xuất huyết có dịch nhày xung quanh.
8.6 Kiểm tra khả năng nhân lên của vi rút
Kiểm tra khả năng nhân lên của giống vi rút Gumboro nhược độc chủng 2512 trên môi trường tế bào
xơ phôi gà 1 lớp (5.1.3).
8.6.1 Chuẩn bị
- Tế bào xơ phôi gà 1 lớp (5.1.3) (xem phụ lục A.6).
- Giống vi rút (5.1.1) được chuyển từ nhiệt độ bảo quản âm 80 °C sang nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C
trong khoảng 5 min đến 10 min, rồi pha lỗng với mơi trường ni cấy tế bào (5.2.2) thành nồng độ
103 TCID50/0,1 ml.
8.6.2 Cách tiến hành
- Dùng pipette hút bỏ môi trường nuôi cấy (5.2.2) trong chai T25 (6.15) đã có tế bào phát triển.
- Chia huyễn dịch giống vi rút đã pha ở trên vào các chai nuôi cấy.
- Bổ sung môi trường nuôi cấy (5.2.2) sao cho lượng môi trường cho vào bằng lượng môi trường hút
ra.
- Tiếp tục nuôi cấy chai tế bào trong tủ ấm CO2 ở nhiệt độ 37 °C từ 48 h đến 72 h.
- Hàng ngày kiểm tra sự phát triển của vi rút và bệnh tích tế bào bằng kính hiển vi soi ngược.
8.6.3 Đánh giá kết quả
Giống vi rút (5.1.1) đạt yêu cầu khi: Sau 48 h đến 72 h gây nhiễm (8.6.2), vi rút nhân lên và phá hủy ≥
80% diện tích tế bào.


- Bệnh tích tế bào: Các tế bào vỡ ra, co cụm thành từng khối, bong ra khỏi thành giếng.
8.7 Kiểm tra tính gây miễn dịch
Chọn 1 trong 2 phương pháp sau:
8.7.1 Phương pháp công cường độc
8.7.1.1 Chuẩn bị
- 20 gà (5.1.2)

- Giống vi rút (5.1.1) được chuyển từ nhiệt độ bảo quản âm 80 °C sang nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C
trong khoảng 5 min đến 10 min, rồi pha lỗng với mơi trường ni cấy (5.2.2) thành nồng độ 10 3
TCID50/0,1 ml.
8.7.1.2 Cách tiến hành
- 20 gà (5.1.2) được chia làm 2 nhóm:
+ Nhóm miễn dịch: 10 gà (5.1.2) được nhỏ mắt, mũi hoặc cho uống mỗi con 0,1 ml giống vi rút (5.1.1)
đã pha loãng ở trên.
+ Nhóm đối chứng: 10 gà (5.1.2) được nhỏ mắt, mũi hoặc cho uống mỗi con 0,1 ml PBS (5.2.1).
- Sau 14 ngày cả hai nhóm gà được cơng cường độc bằng giống vi rút Gumboro cường độc (5.1.5)
liều 102 CID50/0,1 ml.
- Theo dõi đàn gà từ 24 h đến 72 h sau khi cơng cường độc. Tồn bộ gà thí nghiệm bị giết và kiểm tra
bệnh tích.
8.7.1.3 Đánh giá kết quả
- Giống vi rút Gumboro (5.1.1) đạt tiêu chuẩn về tính gây miễn dịch khi:
+ Nhóm miễn dịch ít nhất 80% gà khơng có bệnh tích của bệnh Gumboro.
+ Nhóm đối chứng ít nhất 80% gà có bệnh tích của bệnh Gumboro như xuất huyết cơ đùi, sưng, xuất
huyết và có dịch ở túi Fabricius.
8.7.2 Phương pháp trung hòa (SN)
8.7.2.1 Chuẩn bị
- 20 gà (5.1.2).
- Giống vi rút (5.1.1) được chuyển từ nhiệt độ bảo quản âm 80 °C sang nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C
trong khoảng 5 min đến 10 min, rồi pha loãng với môi trường nuôi cấy (5.2.2) thành nồng độ 10 3
TCID50/0,1 ml.
8.7.2.2 Cách tiến hành
- 20 gà (5.1.2) được chia làm 2 nhóm:
+ Nhóm miễn dịch: 10 gà (5.1.2) được nhỏ mắt, mũi hoặc cho uống mỗi con 0,1 ml giống vi rút (5.1.1)
đã pha lỗng ở trên.
+ Nhóm đối chứng: 10 gà (5.1.2) được nhỏ mắt, mũi hoặc cho uống mỗi con 0,1 ml PBS (5.2.1).
- Sau 21 ngày cả hai nhóm gà được lấy máu, chắt huyết thanh kiểm tra hiệu giá kháng thể Gumboro
bằng phản ứng trung hòa (SN) (xem phụ lục E).

8.7.2.3 Đánh giá kết quả
- Giống vi rút Gumboro (5.1.1) đạt tiêu chuẩn về tính gây miễn dịch khi:
+ Nhóm miễn dịch ít nhất 80% mẫu huyết thanh kiểm tra đạt hiệu giá kháng thể trung hịa ≥ 1:256.
+ Nhóm đối chứng các mẫu huyết thanh kiểm tra âm tính.
8.8 Bồi dưỡng giống vi rút
8.8.1 Tiêm truyền giống
- Giống vi rút (5.1.1) được chuyển từ nhiệt độ bảo quản âm 80 °C sang nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C
trong khoảng 5 min đến 10 min, rồi pha lỗng với mơi trường ni cấy (5.2.2) thành nồng độ 10 3
TCID50/0,1 ml.
- Tế bào xơ phôi gà 1 lớp (5.1.3) (xem phụ lục A.6).
- Dùng pipette hút bỏ môi trường nuôi cấy (5.2.2) trong chai T75 (6.15) đã có tế bào phát triển. Lưu ý,
trong quá trình hút tránh làm bong tế bào.
- Chia huyễn dịch giống vi rút đã pha ở trên vào các chai nuôi cấy.


- Bổ sung môi trường nuôi cấy (5.2.2) sao cho lượng môi trường cho vào bằng lượng môi trường hút
ra.
- Tiếp tục nuôi cấy chai tế bào trong tủ ấm CO2 ở nhiệt độ 37 °C từ 48 h đến 72 h.
- Hàng ngày kiểm tra sự phát triển của vi rút và bệnh tích tế bào bằng kính hiển vi soi ngược.
8.8.2 Thu hoạch giống
- Sau gây nhiễm (8.8.1) 48 h đến 72 h, vi rút nhân lên và phá hủy ≥ 80% diện tích tế bào thì tiến hành
thu hoạch huyễn dịch vi rút vào các chai vô trùng (6.24).
- Chọn những chai tế bào có cấy vi rút Gumboro nhược độc chủng 2512 đạt chỉ tiêu vô trùng và có
hiệu giá vi rút ≥ 106 TCID50.
- Trước khi đông khô phải tiến hành kiểm tra huyễn dịch vi rút bằng phản ứng RT - PCR (tham khảo
phụ lục F) hoặc chuẩn độ vi rút trên môi trường tế bào (xem phụ lục D) để kiểm tra sự hiện diện của vi
rút Gumboro nhược độc chủng 2512.
- Sau khi kiểm tra sự hiện diện của vi rút, huyễn dịch vi rút được bảo quản ở nhiệt độ âm 70 °C chờ
đông khô.
8.9 Đông khô giống vi rút

- Pha huyễn dịch vi rút (8.8.2) với sữa bò tách bơ (5.2.9) và chia vào lọ đông khô (6.21). Giữ ở nhiệt
độ âm 80 °C từ 8 h đến 12 h rồi chuyển vào máy đông khô (6.8).
- Chạy đông khô theo quy trình của máy đơng khơ.
9 Kiểm tra ống giống vi rút sau đơng khơ
9.1 Kiểm tra đặc tính kỹ thuật của ống giống
- Cảm quan: Quan sát bằng mắt thường, ống giống vi rút được coi là đạt u cầu khi lọ kín, khơng rạn
nứt, chế phẩm xốp, màu đồng nhất.
- Chân không: Sử dụng máy đo chân không, ống giống vi rút được coi là đạt yêu cầu khi phát huỳnh
quang màu ánh tím.
- Độ ẩm: Sử dụng máy đo độ ẩm, ống giống vi rút được coi là đạt yêu cầu khi độ ẩm dưới 4%.
- Độ hòa tan: ống giống vi rút được coi là đạt u cầu khi hịa tan hồn tồn trong nước sinh lý sau 2
min có lắc nhẹ.
9.2 Kiểm tra đặc tính sinh học của giống vi rút
Đạt các chỉ tiêu ở mục 7
10 Bao gói, bảo quản ống giống vi rút sau đông khô
Chọn những ống giống đạt chỉ tiêu ở mục 9 để dán nhãn, bao gói và bảo quản:
10.1 Dán nhãn
- Các ống giống vi rút phải được dán nhãn
- Nhãn phải có các thơng tin sau:
+ Nơi sản xuất
+ Tên giống
+ Số lô...ngày...tháng...năm... sản xuất
+ Người thực hiện
+ Điều kiện bảo quản
10.2 Bao gói và bảo quản
Ống giống được bao gói bằng giấy, để trong túi Polyeste và được giữ ở nhiệt độ âm 80 °C trong 2
năm.
Phụ lục A
(Quy định)
Thành phần và chuẩn bị dung dịch thuốc thử

A.1

Dung dịch PBS pH 7,2

Natri clorua (NaCl)

8g


Kali clorua (KCI)

2g

Natri hiđrophotphat (Na2HPO4)

1,15 g

Mono kaliphotphat (KH2PO4)

0,2 g

Nước

1000 ml

Chỉnh pH đến 7,2 bằng dung dịch NaOH 1N hoặc dung dịch HCl 1N. Hấp tiệt trùng ở nhiệt độ 121 °C
trong 1 h. Bảo quản ở nhiệt độ 4 °C.
A.2 Dung dịch sữa bò tách bơ 10%
Sữa bò tách bơ PBS

10 g

PBS 90 ml

90 ml

Đun sôi PBS rồi để nguội đến nhiệt độ 50 °C đến 70 °C rồi cho sữa bò tách bơ vào, lắc đều cho sữa
tan hết.
A.3 Kháng nguyên chuẩn
- Gây nhiễm giống cường độc Gumboro cho gà mẫn cảm (3 tuần tuổi đến 5 tuần tuổi) nhỏ vào mắt và
mũi gà mỗi con 200 μl (102CID50).
- Sau 03 ngày gây nhiễm thu hoạch túi Fabricius, nghiền túi Fabricius có bệnh tích điển hình trong
nước sinh lý với tỷ lệ 1:10 (1g túi Fabricius : 9 ml PBS pH 7,2).
- Ly tâm 1500 r/min trong 5 min.
- Giải đông tan 3 lần đến 5 lần.
- Ly tâm 3000 r/min trong 15 min thu lấy nước trong ở trên, bỏ cặn. Chia ống nhỏ, bảo quản âm 70 °C.
- Cũng có thể dùng giống Gumboro cường độc tiêm vào màng niệu nang phôi gà 9 ngày đến 10 ngày
thu hoạch phôi và nước niệu nang của các phôi chết trong vòng 48 h đến 96 h sau khi tiêm, trộn và xử
lý như trên.
A.4 Chế tạo huyết thanh dương tính chuẩn
- Dùng gà trống choai khỏe mạnh (4 tuần tuổi đến 5 tuần tuổi, khơng có kháng thể kháng vi rút
Gumboro).
- Nhỏ mắt mũi cho mỗi gà 200 μl giống Gumboro cường độc (nồng độ 10 -1).
- Sau 7 ngày nhỏ tiếp 200 μl giống Gumboro cường độc (nồng độ 10 -1) lần 2.
- Nhỏ tiếp lần 3 và lần 4 cách 7 ngày.
- Sau lần nhỏ lần 4, 28 ngày lấy máu gà để lấy huyết thanh, chia ống bảo quản ở nhiệt độ âm 20 °C
dùng dần (thời gian bảo quản 1 năm).
A.5 Huyết thanh âm tính chuẩn
- Lấy huyết thanh của gà khỏe mạnh chưa tiêm phòng vắc xin Gumboro.
- Dùng kháng nguyên Gumboro chuẩn: Để xác định kháng thể trong huyết thanh của đàn gà cần kiểm

tra (xác định mức độ kháng thể trong đàn gà miễn dịch).
- Chuẩn bị đĩa thạch: Dùng dung dịch PBS 0.01 M (pH7.2) cho thêm 8% muối NaCI, 1% thạch Agar,
0.5 ml phenol đun cho tan thạch, đổ ra đĩa lồng mỗi đĩa 10 ml (thực hiện vô trùng), để nguội cho đơng
lại, đục lỗ trịn trên đĩa thạch, 1 lỗ giữa đĩa và 6 lỗ xung quanh, đường kính lỗ là 3 mm, các lỗ cách
nhau 3 mm.
- Cho thành phần phản ứng vào các lỗ: Lỗ chính giữa cho Kháng nguyên chuẩn, các lỗ xung quanh lỗ
1-4 cho huyết thanh cần kiểm tra và lỗ 5 cho huyết thanh đối chứng dương và lỗ 6 cho huyết thanh
đối chứng âm. Cho đĩa vào hộp để ở nhiệt độ 37 °C, quan sát trong 3 ngày.
- Kết quả: Sau khi quan sát đối chứng dương và đối chứng âm rõ ràng, quan sát các lỗ thí nghiệm
nếu thấy giữa lỗ thí nghiệm và lỗ kháng nguyên dương tính có vạch ngưng kết thì kết luận phản ứng
dương tính, khơng có vạch ngưng kết giống đối chứng âm thì phản ứng âm tính.
A.6 Phương pháp ni cấy tế bào xơ phôi gà một lớp
Phương pháp nuôi cấy tế bào xơ phôi gà 1 lớp được tiến hành theo các bước sau:
-Trứng gà SPF có phơi đã ấp được 9 ngày.
- Soi để chọn những quả có phơi sống, khỏe.
- Giết chết phôi bằng nhiệt lạnh để làm co mạch máu, sát trùng vỏ trứng, mổ trứng.
- Gắp phôi ra đĩa Petri có chứa PBS khơng bổ sung calcium, magnesium và được làm ấm ở nhiệt độ


37 °C.
- Rửa phôi 3 lần bằng PBS, cắt đầu, chân, và loại bỏ nội tạng.
- Sau đó cắt nhỏ phôi và rửa trên máy khuấy từ 2 lần.
- Rửa tiếp bằng dung dịch Trypsin 0,125%.
- Hút bỏ phần nước trong ở trên.
- Tiêu hóa tế bào bằng dung dịch Trypsin 0,25% trên máy khuấy từ trong phòng ấm 37 °C từ 30 - 60
min.
- Lọc tế bào qua lưới lọc và ly tâm lạnh với tốc độ 2000 r/min.
- Chắt bỏ nước trong, dùng môi trường phát triển để pha loãng tế bào.
- Đếm tế bào trên buồng đếm hồng cầu, định lượng tế bào.
- Pha tế bào thành nồng độ 0,5% (tương đương 75 x 104 tế bào /ml), chia tế bào ra các chai nuôi T25,

T75 hoặc đĩa nhựa 96 giếng đáy phẳng và đặt nuôi trong phịng ấm 37 °C .
Kích cỡ chai

Lượng tế bào ni cấy (tế bào)

Tổng lượng môi trường nuôi cấy (ml)

T25

2.0 - 6,0 x 105

5 - 8 ml

5

T75

9.0 - 15.0 x 10

15 - 30 ml

Cơng thức tính lượng tế bào trong diện nuôi cấy là: 1,0 - 1,4 x 104 tế bào/ 1cm2.
- Hàng ngày quan sát sự phát triển của tế bào xơ phôi gà trong các chai tế bào bằng kính hiển vi soi
ngược.
Phụ lục B
(Tham khâo)
Phản ứng RT-PCR kiểm tra tạp nhiễm với vi rút cúm gia cầm
B.1 Chiết tách ARN
Chiết tách ARN bằng bộ kít, khi sử dụng theo hướng dẫn của nhả sản xuất.
B.2 Tiến hành phản ứng RT-PCR

Áp dụng cho bộ Maxime RT-PCR PreMix kit (iNtRON

Biotechnology)

Nguyên liệu

Thể tích (μl)

H2O

9

Dung dịch đệm RT- PCR (Tris/HCl và KCl)

1

OptiScript reverse transcriptase

2

dNTP

1

i-StarTaq DN A polymerase

1

Mồi xuôi (10pmole/ μl)

1

Mồi ngược (10pmole/ μl)

1

Mẫu ARN

4

Tổng cộng

20

Danh sách các cặp mồi dùng cho phản ứng kiểm tra tạp nhiễm với vi rút Cúm gia
cầm
Mồi

Trình tự chuỗi mối (5’ → 3’)

H5-155F

5'-ACACATGCYCARGACATACT-3'

H5-699R

5'-CTYTGRTTYAGTGTTGATGT-3'

N1-F

5'-AGRCCTTGYTTCTGGGTTGA-3'

N1-R

5'-ACCGTCTGGCCAAGACCA-3'

Kích thước sản phẩm
545bp
126bp

B.3 Chu trình nhân gen
Bước

Chu kỳ

Thời gian

Nhiệt độ (°C)


Bước 1

1 chu kỳ

30 min

45

Bước 2

1 chu kỳ

5 min

94

30 s

52

30 s

72

20 s

94

Bước 3

40 chu kỳ

Bước 4

1 chu kỳ

5 min

72

Bước 5

1 chu kỳ

∞

4

B.4 Chạy điện di
Chuẩn bị thạch agaroze 2% pha trong dung dịch TAE 1X hoặc TBE 1X có ethidi bromua (10 μg/μl).
Đổ thạch vào khn điện di (có lược).
Thạch khô, rút lược ra và cho mẫu vào các giếng (8 μl sản phẩm PCR + 2 μl dung dịch tải).
Sử dụng thang chuẩn (Marker), trọng lượng phân tử thang 100 bp trở lên.
Chú ý khi chạy PCR phải có mẫu đối chứng dương và mẫu đối chứng âm đi kèm (mẫu đối chứng âm
có thể là nước cất sạch).
B.5 Đọc kết quả
Mẫu dương tính: Xuất hiện vạch giống với mẫu đối chứng dương tính.
Mẫu âm tính: Khơng có vạch.
B.6 Đánh giá kết quả
Có vi rút Cúm gia cầm trong mẫu chạy nếu kết quả RT-PCR dương tính.
Phụ lục C
(Quy định)
Phương pháp kết tủa khuếch tán miễn dịch trên thạch AGID
(Agar gel immunoffusion)
C.1 Mục đích
Sử dụng phản ứng AGID dùng để phát hiện kháng nguyên Gumboro nhược độc chủng 2512.
C.2 Nguyên tắc của phản ứng AGID
Phản ứng dương tính khi một kháng nguyên và một kháng thể tương ứng, nằm cách nhau một
khoảng trong thạch, chúng sẽ khuếch tán và tại chỗ gặp nhau sẽ hình thành đường kết tủa màu trắng.
Sự kết tủa này xảy ra ở vùng mà tỷ lệ kháng nguyên và kháng thể tương ứng đồng đều.

C.3 Chuẩn bị kháng nguyên
Giống vi rút Gumboro nhược độc chủng 2512 được chuyển từ nhiệt độ bảo quản âm 70 °C sang nhiệt
độ từ 2 °C đến 8 °C trong khoảng 5 min đến 10 min, rồi pha loãng với PBS thành các nồng độ từ 10 -2
đến 10-4.
C.4 Chuẩn bị thạch làm phản ứng
+ Hòa tan NaCl (8,0 g) và Phenol (0,5 ml) vào nước cất. Chú ý cho NaCl vào trước, sau đó cho
Phenol.
+ Chỉnh pH: 7,2 - 7,4 (dùng NaOH N/1).
+ Cho thạch Agar vào hấp.
+ Lọc qua 8 lần vải gạc.
+ Chia ra đĩa làm phản ứng (chia 15 ml 1 đĩa to đường kính 9 cm, độ dày thạch 3 mm).
+ Sau khi đổ ra đĩa để tủ lạnh 4 h rồi mới tiến hành đục lỗ thạch.
C.5 Cách tiến hành phản ứng phát hiện kháng nguyên
+ Lỗ giữa nhỏ kháng huyết thanh dương tính chuẩn 0,025 ml.
+ Các lỗ xung quanh lần lượt nhỏ huyễn dịch giống đã pha ở các nồng độ (C.3), trong đó có một lỗ
cho kháng ngun dương tính chuẩn và một lỗ cho PBS, mỗi lỗ nhỏ 0,025 ml.
+ Để đĩa thạch làm phản ứng ở nhiệt độ phịng thí nghiệm và trong hộp giữ ẩm.


+ Đọc kết quả trong vòng từ 24 h đến 48 h (có thể cho phản ứng giả).
C.6 Đọc kết quả
Phản ứng dương tính có một vạch kết tủa màu trắng đục, gọn, sắc nét, khơng có đường phụ.
Phụ lục D
(Quy định)
Phương pháp chuẩn độ vi rút
D.1 Chuẩn bị
- Chuẩn bị đĩa nhựa 96 giếng đáy bằng có 1 lớp tế bào xơ phôi gà.
- Môi trường tế bào DMEM.
- Giống vi rút Gumboro nhược độc chủng 2512.
D.2 Cách tiến hành

- Giống vi rút Gumboro nhược độc chủng 2512 được chuyển từ nhiệt độ bảo quản âm 70 °C sang
nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C trong khoảng 5 min đến 10 min, rồi được hoàn nguyên trở lại với mơi trường
ni cấy thành 1ml.
- Pha lỗng giống vi rút trong ống nghiệm theo cơ số 10 bằng môi trường nuôi cấy tế bào từ 10 -1 đến
10-8.
- Lấy đĩa tế bào xơ phôi gà đã nuôi, loại bỏ môi trường cũ.
- Rửa tế bào bằng môi trường nuôi cấy, 200 μl/giếng, sau đó loại bỏ mơi trường ni cấy.
- Hút 100 μl huyễn dịch vi rút đã pha loãng lần lượt vào các giếng tương ứng trên đĩa tế bào (từ A1
đến H5), dãy đối chứng tế bào (từ A6 đến H6),cho 100 μl mơi trường duy trì vào mỗi giếng.
Sơ đồ bố trí phản ứng chuẩn độ vi rút trên tế bào
1

2

3

4

5

6

A

10-1

10-1

10-1

10-1

10-1

ĐCTB

B

10-2

10-2

10-2

10-2

10-2

ĐCTB

C

10-3

10-3

10-3

10-3

10-3

ĐCTB

D

10-4

10-4

10-4

10-4

10-4

ĐCTB

E

10-5

10-5

10-5

10-5

10-5

ĐCTB

F

10-6

10-6

10-6

10-6

10-6

ĐCTB

G

10-7

10-7

10-7

10-7

10-7

ĐCTB

H

10-8

10-8

10-8

10-8

10-8

ĐCTB

7

8

9

10

11

12

- Ủ tế bào ở nhiệt độ 37 °C có 5% CO2 trong 30 min.
- Loại bỏ huyễn dịch trong các giếng.
- Rửa tế bào bằng môi trường nuôi cấy, 200 μl/giếng, loại bỏ môi trường ni cấy.
- Cho 200 μl mơi trường duy trì vào mỗi giếng.

- Nuôi tế bào ở nhiệt độ 37 °C có 5% CO2, theo dõi hàng ngày, trong 5 ngày.
D.3 Đánh giá kết quả
Giếng có bệnh tích tế bào là dương tính.
- Bệnh tích tế bào: Các tế bào vỡ ra, co cụm thành từng khối, bong ra khỏi thành giếng (hoặc chai
ni cấy).
- Tính tốn liều gây nhiễm 50% (TCID50) theo phương pháp của Reed Muench, 1938:
λ.TCID50 (0,1 ml) = X + 1/2- (Nx/n)
Trong đó:
X là logarit cơ số 10 của độ pha lỗng vi rút có 100% giếng xuất hiện bệnh tích tế bào.
Nx là tổng số giếng có bệnh tích tế bào trong thí nghiệm.
n là số giếng của mỗi độ pha loãng.


λ là độ pha loãng vi rút.
- Kết quả: Giống vi rút được coi là đạt nếu mỗi liều vắc xin có ít nhất 10 3TCID50.
Phụ lục E
(Quy định)
Phản ứng trung hịa
E.1 Chuẩn bị tế bào xơ phơi gà trên đĩa 96 giếng đáy bằng
Xem phụ lục A.6.
E.2 Chuẩn bị vi rút
Giống vi rút Gumboro nhược độc chủng 2512 được chuyển từ nhiệt độ bảo quản âm 70 °C sang nhiệt
độ từ 2 °C đến 8 °C trong khoảng 5 min đến 10 min, rồi pha lỗng với mơi trường ni cấy thành nồng
độ 103TCID50/0,1 ml.
E.3 Chuẩn bị huyết thanh
Tồn bộ gà thí nghiệm được lấy máu để chắt huyết thanh, huyết thanh chắt xong được bảo quản ở
nhiệt độ âm 20 °C.
E.4 Cách tiến hành
- Pha loãng các mẫu huyết thanh miễn dịch theo cơ số 2, từ 1/2 đến 1/1028 trong mơi trường ni cấy
tế bào.

- Trung hịa: Lấy 100 μl huyết thanh đã được pha loãng ở các nồng độ bổ sung 100 μl huyễn dịch vi
rút có chứa 103 TCID50, ủ 30 min ở nhiệt độ phịng.
- Hút bỏ dịch ni trong dĩa tế bào: Hút 100 μl huyễn dịch huyết thanh - vi rút đã được trung hòa vào
các giếng trong đĩa tế bào tương ứng theo sơ đồ:

Sơ đồ bố trí phản ứng trung hịa
1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

Huyết thanh
pha lỗng

A ĐCTB Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3 Mẫu 4 Mẫu 5 Mẫu 6 Mẫu 7 Mẫu 8 Mẫu 9 Mẫu 10 ĐCVR

1/8

B ĐCTB

ĐCVR

1/16

C ĐCTB

ĐCVR

1/32

D ĐCTB

ĐCVR

1/64

E ĐCTB

ĐCVR

1/128

F ĐCTB

ĐCVR

1/256

G ĐCTB

ĐCVR

1/512

H ĐCTB

ĐCVR

1/1028

ĐCTB: Đối chứng tế bào

ĐCVR: Đối chứng vi rút

- Ủ tế bào ở nhiệt độ 37 °C có 5% CO2 trong 60 min.
- Loại bỏ huyễn dịch trong các giếng.
- Rửa tế bào bằng môi trường nuôi cấy, 200 μl/giếng, loại bỏ môi trường nuôi cấy.
- Cho 200 μl mơi trường duy trì vào mỗi giếng.
- Ni tế bào trong tủ ấm CO2 ở nhiệt độ 37 °C, theo dõi trong 5 ngày.
E.5 Đọc kết quả
Giếng có bệnh tích tế bào là dương tính (khơng có kháng thể kháng Gumboro).

Giếng khơng có bệnh tích tế bào là âm tính (có kháng thể kháng Gumboro).
- Bệnh tích tế bào: Các tế bào vỡ ra, co cụm thành từng khối, bong ra khỏi thành giếng (hoặc chai
nuôi cấy).
- Kết quả: Huyết thanh đạt hiệu giá ít nhất 1/256.
Phụ lục F


(Tham khảo)
Phản ứng RT-PCR phát hiện vi rút Gumboro nhược độc chủng 2512
F.1 Chiết tách ARN
Chiết tách ARN bằng bộ kít, khi sử dụng theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
F.2 Tiến hành phản ứng RT-PCR

Áp dụng cho bộ Maxime RT-PCR PreMix kit (iNtRON Biotechnology)
Nguyên liệu

Thể tích (μl)

H2O

9

Dung dịch đệm RT- PCR (Tris/HCI và KCI)

1

OptiScript reverse transcriptase

2

dNTP

1

i-StarTaq DN A polymerase

1

Mồi xuôi (10pmole/ μl)

1

Mồi ngược (10pmole/ μl)

1

Mẫu ARN

4

Tổng cộng

20

Danh sách các cặp mồi dùng cho phản ứng RT-PCR phát hiện vi rút Gumboro nhược độc
chủng 2512
Tên mồi

Nồng độ
sử dụng

Trình tự chuỗi mồi (5’ → 3’)

GVF(Kz2) CCGGAATTCGCCGCCGCCATGACAAACCTGCAAGA
GKZF

10pM

CCGGAATTCGCCGCCGCCATGACAAACCTGCAAGAT

10pM

GSALR

GAATCCCGTCGACTACAGGATTCTG

10pM

GSALF

CAGAATCCYGTAGTCGACGGGATTC

10pM

GNOR

ATAAGAATGCGGCCGCTTATCACTCAAGGTCCTCA

10pM

G908F

GCCAATCACATCCATCAAACTG

10pM

GV2R

ATAAGAATGCGGCCGCTCATTACCTCCTTATGGCCCGGATTATGTC

10pM

F.3 Chu trình nhân gen
Bước

Chu kỳ

Thời gian

Nhiệt độ (°C)

Bước 1

1 chu kỳ

30 min

45

Bước 2

1 chu kỳ

5 min

94

30 s

52

30 s

72

20 s

94

Bước 3

40 chu kỳ

Bước 4

1 chu kỳ

5 min

72

Bước 5

1 chu kỳ

∞

4

F.4 Chạy điện di
Chuẩn bị thạch agaroze 2% pha trong dung dịch TAE 1X hoặc TBE 1X có ethidi bromua (10 μg/μl).
Đổ thạch vào khn điện di (có lược).
Thạch khơ, rút lược ra và cho mẫu vào các giếng (8 μl sản phẩm PCR + 2 μl dung dịch tải).
Sử dụng thang chuẩn (Marker), trọng lượng phân tử thang 100 bp trở lên.
Chú ý khi chạy PCR phải có mẫu đối chứng dương và mẫu đối chứng âm đi kèm (mẫu đối chứng âm
có thể là nước cất sạch).
F.5 Đọc kết quả
Mẫu dương tính: Xuất hiện vạch giống với mẫu đối chứng dương tính.


Mẫu âm tính: Khơng có vạch.
F.6 Đánh giá kết quả
Có vi rút Gumboro nhược độc chủng 2512 trong mẫu chạy nếu kết quả RT-PCR dương tính.
Thư mục tài liệu tham khảo
[1] OIE 2015: Chapter 2.3.12: Infectious Bursal Disease (Gumboro disease)
[2] Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử để xây dựng danh mục giống vi rút gia cầm Quốc gia - Mục
3.3 - Phương pháp nghiên cứu - Mục 3.1.3 - Nguyên liệu và hóa chất - Mục 3.3.4 - Phương pháp nuôi
cấy tế bào xơ phôi gà một lớp, Mục 3.3.5 Phương pháp gây nhiễm vi rút, Mục 3.3.6 - Phương pháp
chuẩn độ vi rút, Mục 3.3.18 Phương pháp giải trình tự gen của vi rút
[3] Bệnh truyền nhiễm của động vật nuôi và biện pháp khống chế - Nhà xuất bản nông nghiệp - Bệnh

Gumboro (Gumboro disease, Infectious Bursal Disease) - Trang 387-395