nghiên cứu sử dụng trái thanh long (hylocereus undatus) để chế biến nước uống lên men

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH





LÊ THỊ KIỀU OANH





NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG TRÁI
THANH LONG (Hylocereus undatus) ĐỂ
CHẾ BIẾN NƯỚC UỐNG LÊN MEN






LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC


THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - 2005

LỜI CẢM ƠN
Em xin trân trọng bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cô Trần Thò Thanh –
cán bộ giảng dạy của trường Đại Học Sư Phạm Thành phố Hồ Chí
Minh đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn và truyền đạt cho em nhiều kinh
nghiệm quý báu trong suốt quá trình thực hiện luận văn này.
Em xin chân thành cảm ơn quý thầy cô Khoa Sinh và cán bộ giảng
dạy lớp cao học khóa 13 chuyên ngành Vi sinh vật đã tận tâm giảng dạy
và truyền đạt cho em nhiều kiến thức quý báu trong suốt khóa học.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn đến các thầy cô, cán bộ phụ trách phòng thí
nghiệm sinh lý-sinh hóa- vi sinh đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo điều kiện
thuận lợi cho em hoàn thành tốt luận văn này.
Cảm ơn các bạn cùng khóa đã đóng góp nhiều ý kiến, giúp đỡ
động viên trong suốt thời gian qua.
Con xin chân thành kính tỏ lòng biết ơn bố mẹ và anh Lê Kim
Nhật đã động viên an ủi và là chỗ dựa tinh thần cũng như vật chất tạo
điều kiện thuận lợi để hoàn thành luận văn này.
Học viên
Lê Thò Kiều Oanh



MỤC LỤC
Trang
Trang phụ bìa
Lời cam đoan I
Mục lục II
Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt VI

Danh mục các bảng VII
Danh mục các hình X
Danh mục các đồ thị XI
MỞ ĐẦU…………………………………………………………………………1
PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU…………………………………………… 3
Chương 1: Nấm men và lên men etylic 3
1.1 Đặc điểm hình thái nấm men 3
1.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 3
1.3 Phân loại nấm men 12
Chương 2:
Ứng dụng của nấm men trong công nghiệp chế tạo đồ uống
lên men 23
2.1 Đồ uống có độ rượu nhẹ 23
2.2 Đồ uống có độ rượu cao 32
2.3 Thực trạng chế biến thức uống lên men ở Việt Nam 33
Chương 3: Những hiểu biết về trái thanh long 36
3.1 Đặc điểm của cây, trái thanh long 36
3.2 Tình hình sản xuất và sử dụng trái thanh long 37
3.3 Nhữ
ng khó khăn khi sử dụng trái thanh long chế biến thành nước
uống lên men 39
PHẦN II: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU…………….40
Chương 4: Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị 40
4.1 Nguyên liệu 40
4.2 Hóa chất 41
4.3 Thiết bị 41



4.4 Các loại môi trường nghiên cứu 41

Chương 5: Các phương pháp nghiên cứu 45
5.1 Các phương pháp vi sinh vật 45
5.2 Các phương pháp hóa lý 51
5.3 Các phương pháp toán học 55
5.4 Phương pháp đánh giá cảm quan 55
PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 56
Chương 6: Kết quả xử lý và chế biến trái thanh long thành dịch quả
làm môi trường nuôi cấy nấm men 56
6.1 Khảo sát thành phần dịch trái thanh long Bình Thuận 56
6.2 Chế biến và x
ử lý trái thanh long làm môi trường nuôi cấy nấm men 58
Chương 7: Phân lập, tuyển chọn các chủng nấm men phù hợp với yêu cầu
chế biến đồ uống lên men từ dịch trái thanh long 63
7.1 Phân lập và thuần khiết các chủng nấm men có nguồn gốc khác nhau
63
7.2 Tuyển chọn các chủng nấm men phù hợp với yêu cầu chế biến đồ
uống lên men từ dịch trái thanh long 65
Chương 8: Nghiên cứu đặc điể
m hình thái, sinh lý, sinh hóa của chủng nấm
men LT
2
78
8.1 Đặc điểm hình thái 78
8.2 Nghiên cứu đặc điểm sinh lý, sinh hóa của chủng nấm men LT
2
81
8.3 Khảo sát khả năng tạo chất kháng sinh của chủng nấm men LT
2
85
8.4 Tìm hiểu khả năng kháng một số kháng sinh của chủng LT

2
88
8.5 Định danh 90
Chương 9: Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của
chủng Saccharomyces cerevisiae LT
2
trong quá trình nhân
giống 93
9.1 Xác định thời gian sinh trưởng và chế độ lắc thông khí thích hợp đối
với chủng Saccharomyces cerevisiae LT
2
trong quá trình nhân
giống 93



9.2 Ảnh hưởng của pH ban đầu 95
9.3 Ảnh hưởng của hàm lượng đường 96
9.4 Sử dụng dịch ép trái thanh long làm môi trường nhân giống 98
Chương 10: Khảo sát khả năng sử dụng chủng Saccharomyces cerevisiae
LT
2
lên men tạo nước giải khát từ dịch trái thanh long 105
10.1 Ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường lên quá trình lên men
etylic ở môi trường dịch trái thanh long của chủng Saccharomyces
cerevisiae LT
2
105
10.2 Ảnh hưởng của thành phần môi trường lên quá trình lên men etylic
ở môi trường dịch trái thanh long của chủng Saccharomyces

cerevisiae LT
2
110
Chương 11: Khảo sát động thái lên men rượu của chủng Saccharomyces
cerevisiae LT
2
trong quá trình lên men tạo nước giải khát từ
dịch trái thanh long 115
11.1 Khảo sát giai đoạn lên men hiếu khí 115
11.2 Khảo sát giai đoạn lên men kị khí 117
11.3 Khảo sát lên men kị khí ở nhiệt độ thấp 120
11.4 Hoàn thiện sản phẩm 122
11.5 Xây dựng quy trình chế tạo nước uống lên men từ trái thanh long ở
quy mô phòng thí nghiệm 129
PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

132
PHỤ LỤC









DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

C: Cacbon

[C]: Nồng độ glucose
CP: Centipoise
N: Nitơ
P
thô
: Protein thô
Sac: Saccharomyces cerevisiae
TCVN: Tiêu chuẩn Việt Nam
TL: Thanh long
TL450, TL465, TL580: lượng dịch thu được lần lượt là 450, 465, 480ml/1kg
trái thanh long được trích ly bằng nhiệt độ cao.
V/p: Vòng/phút







DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 3.1 Thành phần dinh dưỡng của trái thanh long Bình Thuận 37
Bảng 6.1 Thành phần hóa học dịch trái thanh long Bình Thuận 56
Bảng 6.2 Thành phần một số dịch quả được sử dụng trong sản xuất
rượu vang 57
Bảng 6.3 Dịch trái thanh long (100ml) được xử lý bằng Ca(OH)
2
và
lòng trắng trứng gà 61
Bảng 7.1 Đặc điểm hình thái của các chủng nấm men 64

Bảng 7.2 Khả năng tạo hương thơm của các chủng nấm men 66
Bảng 7.3 Khả năng kết lắng của các chủng nấm men 67
Bảng 7.4 Hoạt lực lên men của các chủng nấm men trên môi trường
sirô (MT12) và môi trường dịch trái thanh long qua lọc
(MT13) 69
Bảng 7.5 Khảo sát hoạt lực lên men và đánh giá cảm quan sả
n phẩm
lên men của các chủng nấm men đơn lẻ và tổ hợp các
chủng nấm men trên môi trường dịch trái thanh long qua
lọc (MT13) 71
Bảng 7.6 Tuyển chọn các chủng nấm men có khả năng lên men
mạnh trên môi trường thanh long thích hợp 73
Bảng 7.7 Hoạt lực lên men của chủng nấm men LT
2
trên các loại môi
trường nước trái thanh long đã xử lý
…………… ………………… 76

Bảng 8.1 Đặc điểm hình thái của chủng nấm men LT
2
79
Bảng 8.2 Khả năng lên men các loại đường của chủng nấm men LT
2
83
Bảng 8.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự sinh trưởng của nấm men
LT
2
83
Bảng 8.4 Ảnh hưởng của pH ban đầu lên sự sinh trưởng của chủng
nấm men LT

2
84
Bảng 8.5 Khả năng chịu nồng độ cồn của chủng nấm men LT
2
85



Bảng 8.6 Khả năng tạo chất kháng sinh kháng các vi khuẩn kiểm
định của chủng nấm men LT
2
86
Bảng 8.7 Khả năng kháng một số kháng sinh của chủng nấm men
LT
2
88
Bảng 8.8 Đặc điểm sinh học và phân loại của chủng nấm men LT
2
và
chủng Saccharomyces cerevisiae 91
Bảng 9.1 Sự thay đổi mật độ tế bào theo thời gian nhân giống của
chủng Saccharomyces cerevisiae LT
2
94
Bảng 9.2 Ảnh hưởng pH ban đầu đến quá trình tăng sinh khối chủng
Saccharomyces cerevisiae LT
2
95
Bảng 9.3 Ảnh hưởng của hàm lượng đường đến quá trình tăng sinh
khối của chủng Saccharomyces cerevisiae LT

2
97
Bảng 9.4 Ảnh hưởng của hàm lượng đường đến quá trình nhân giống
trên môi trường dịch trái thanh long 99
Bảng 9.5 Ảnh hưởng của pH ban đầu đến quá trình nhân giống trên
môi trường dịch trái thanh long 100
Bảng 9.6 Ảnh hưởng của (NH
4
)
2
SO
4
đến quá trình nhân giống trên
môi trường dịch trái thanh long 101
Bảng 9.7 Ảnh hưởng của nguồn nitơ là hỗn hợp (NH
4
)
2
SO
4
và
pepton hoặc cao nấm men đến quá trình nhân giống trên
môi trường dịch trái thanh long 103
Bảng 10.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng lên men của chủng
Saccharomyces cerevisiae LT
2
106
Bảng 10.2 Ảnh hưởng của pH ban đầu đến khả năng lên men của
chủng Saccharomyces cerevisiae LT
2

107
Bảng 10.3 Ảnh hưởng của hàm lượng giống đến khả năng lên men
của chủng Saccharomyces cerevisiae LT
2
109
Bảng 10.4 Ảnh hưởng của hàm lượng đường đến khả năng lên men
của chủng Saccharomyces cerevisiae LT
2
111



Bảng 10.5 Ảnh hưởng của hàm lượng hỗn hợp (NH
4
)
2
SO
4
và
vitamin B
1
đến khả năng lên men của chủng
Saccharomyces cerevisiae LT
2
113
Bảng 11.1 Quá trình lên men tạo nước giải khát từ dịch trái thanh
long trong điều kiện hiếu khí 116
Bảng 11.2 Khảo sát thời gian lên men kị khí ở 30
0
C của chủng

Saccharomyces cerevisiae LT
2
trên môi trường dịch trái
thanh long 119
Bảng 11.3 Khảo sát thời gian lên men kị khí ở 10
0
C của chủng
Saccharomyces cerevisiae LT
2
trên môi trường dịch trái
thanh long 121
Bảng 11.4 Kết quả phân tích các chỉ tiêu về chất lượng sản phẩm đồ
uống lên men từ dịch trái thanh long 123
Bảng 11.5 Một số chỉ tiêu chất lượng nước thanh long lên men sau
thời gian bảo quản 124




DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 4.1 Trái thanh long ruột trắng Bình Thuận 40
Hình 8.1 Hình thái khuẩn lạc của chủng nấm men LT
2
78
Hình 8.2 Hình thái tế bào nấm men LT
2
(×100) 79
Hình 8.3 Nang bào tử của nấm men LT
2

(×100) 80
Hình 8.4 Khuẩn ty của chủng nấm men LT
2
(×40) 81
Hình 8.5 Khả năng đồng hóa các nguồn nitơ vô cơ của chủng nấm
men LT
2
82
Hình 8.6 Chủng nấm men LT
2
kháng E. coli và Bacillus pimitilis 87
Hình 8.7 Chủng nấm men LT
2
kháng Salmonella typhimurium và
Klebsiella 87
Hình 8.8 Chủng nấm men LT
2
kháng Serratia sp. và Streptococcus
sp………………………………………………………………………87
Hình 8.9 Khả năng kháng chloramphenicol và ceftazidime 89
Hình 8.10 Khả năng kháng gentamycin và kanamycin 89
Hình 8.11 Khả năng kháng neomycin và acid nalidixic 89
Hình 11.1 Sản phẩm nước thanh long lên men 127

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ
Trang
Biểu đồ 7.1 Khả năng kết lắng của các chủng nấm men 67
Biểu đồ 7.2 Hoạt lực lên men của các chủng nấm men trên môi
trường sirô (MT12) và môi trường dịch trái thanh long
qua lọc (MT13) 69
Biểu đồ 7.3 Hoạt lực lên men của chủng nấm men đơn lẻ và tổ hợp
các chủng nấm men trên môi trường dịch trái thanh
long qua lọc (MT13) 72
Biểu đồ 7.4 Hoạt lự
c lên men của chủng nấm men LT
2
trên môi
trường dịch trái thanh long qua lọc (MT13) và môi
trường dịch trái thanh long không lọc (MT14) 74
Biểu đồ 7.5 Hoạt lực lên men của chủng nấm men LT
2
trên các loại
môi trường nước trái thanh long đã xử lý 76
Biểu đồ 9.1 Động thái sinh trưởng của Saccharomyces cerevisiae
LT
2
94
Biểu đồ 9.2 Ảnh hưởng pH ban đầu đến quá trình tăng sinh khối
Saccharomyces cerevisiae LT
2

96
Biểu đồ 9.3 Ảnh hưởng của hàm lượng đường đến quá trình tăng
sinh khối của Saccharomyces cerevisiae LT
2
97
Biểu đồ 9.4 Ảnh hưởng của (NH
4
)
2
SO
4
đến quá trình nhân giống trên
môi trường dịch trái thanh long 102
Biểu đồ 9.5 Ảnh hưởng của nguồn nitơ là hỗn hợp (NH
4
)
2
SO
4
và
pepton hoặc cao nấm men đến quá trình nhân giống trên
môi trường dịch trái thanh long 103
Biểu đồ 10.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng lên men của
chủng Saccharomyces cerevisiae LT
2
106



Biểu đồ 10.2 Ảnh hưởng của pH ban đầu đến khả năng lên men của

chủng Saccharomyces cerevisiae LT
2
108
Biểu đồ 10.3 Ảnh hưởng của hàm lượng giống đến khả năng lên
men của chủng Saccharomyces cerevisiae LT
2
109
Biểu đồ 10.4 Ảnh hưởng của hàm lượng đường đến khả năng lên
men của chủng Saccharomyces cerevisiae LT
2
111
Biểu đồ 10.5 Ảnh hưởng của hàm lượng hỗn hợp (NH
4
)
2
SO
4
và
vitamin B
1
đến khả năng lên men của chủng
Saccharomyces cerevisiae LT
2
113
Biểu đồ 11.1 Động thái quá trình lên men tạo nước giải khát từ dịch
trái thanh long trong điều kiện hiếu khí 116
Biểu đồ 11.2 Hàm lượng chất khô trong giai đoạn lên men kị khí 119

1

MỞ ĐẦU
Đồ uống lên men đã được con người biết đến và sử dụng cách đây vài thế
kỷ. Dần dần sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật, đặc biệt khi ngành công nghệ thực
phẩm và công nghệ vi sinh ngày càng phát triển thì các sản phẩm về đồ uống
được cải tiến không ngừng về chất lượng và cả về chủng loại nhằm đáp ứng thò
hiếu người tiêu dùng. Hơn nữa, con người ngày càng hiểu rõ hơn giá trò dinh
dưỡng và hiệu quả kinh tế lớn lao của các sản phẩm về đồ uống mà giờ đây
chúng có mặt ở hầu hết các nước trên thế giới.
Đồ uống lên men thường sử dụng nguồn nguyên liệu tinh bột hoặc từ các
loại trái cây. Trong tất cả các loại đồ uống, đồ uống lên men từ trái cây rất được
quan tâm bởi ngoài hương vò thơm ngon tự nhiên nó còn chứa các chất dinh dưỡng
như các loại muối khoáng, đường, vitamin…chứa sẵn trong trái cây.
Việt Nam với đặc điểm là nước nông nghiệp nhiệt đới thích hợp cho việc
trồng các loại cây ăn quả nên có nguồn nguyên liệu rất phong phú thuận lợi cho
việc sản xuất các loại đồ uống lên men.
Trong các loại quả hiện có của Việt Nam, trái thanh long ở các tỉnh của
miền Nam có sản lượng lớn và chất lượng cao nhưng hiện nay trái thanh long chỉ
mới được sử dụng làm thức ăn tráng miệng, chế biến coctail, thờ cúng và xuất
khẩu trái tươi [17] [20]. Để góp phần làm đa dạng hóa các sản phẩm đồ uống lên
men và sử dụng có hiệu quả hơn nguồn đặc sản dồi dào là trái thanh long ở các
đòa phương, chúng tôi đề xuất một hướng mới nghiên cứu sử dụng trái thanh long
với đề tài “Nghiên Cứu Sử Dụng Trái Thanh Long (Hylocereus undatus) Để
Chế Biến Nước Uống Lên Men”.
Mục tiêu của đề tài: chế biến trái thanh long làm nước uống lên men
nhằm làm đa dạng hóa các sản phẩm từ trái thanh long vừa có giá trò giải khát,
bổ sung dinh dưỡng vừa có tác dụng trò liệu.

2

Nhiệm vụ của đề tài:

1. Phân lập các chủng nấm men để làm nguồn giống nấm men cho quá
trình tuyển chọn.
2. Tuyển chọn các chủng nấm men thích hợp với yêu cầu lên men dòch
trái thanh long.
3. Nghiên cứu một số đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của chủng nấm
men chọn được, trên cơ sở đó tiến hành đònh danh.
4. Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng, phát
triển và lên men của chủng đã chọn trên môi trường dòch trái thanh
long để tạo nước giải khát lên men đạt chất lượng cao.
5. Ứng dụng chủng nấm men chọn được để lên men tạo nước giải khát
trên môi trường dòch trái thanh long.












3

PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
CHƯƠNG 1: NẤM MEN VÀ LÊN MEN ETYLIC
1.1 Đặc điểm hình thái nấm men
Tế bào nấm men có nhiều hình dạng khác nhau: hình tròn, hình trứng như
Saccharomyces cerevisiae, hình elip như Saccharomyces ellipsoideus, hình quả

chanh như Saccharomyces apiculatus, đôi khi có hình chai như Saccharomyces
Ludwigu hoặc hình ống dài như Pichia. Một số tế bào nấm men có hình dài, nối
tiếp nhau tạo thành dạng sợi gọi là khuẩn ty giả như Endomyces, Endomycopsis,
Candida… Nhiều loài nấm men chỉ tạo khuẩn ty giả khi sống trong môi trường
thiếu oxy [32].
Nói chung hình dáng của tế bào nấm men ở các loài khác nhau thì khác
nhau, trong cùng một loài hình dáng của tế bào có thể thay đổi tùy thuộc vào
điều kiện môi trường, điều kiện nuôi cấy và tuổi của tế bào.
Tế bào nấm men có kích thước trung bình 3-5× 5-10μm, kích thước của tế
bào nấm men thay đổi nhiều tùy thuộc vào loài, giống và điều kiện của môi
trường sống …[64]. Trong môi trường lỏng có nhiều loài nấm men có khả năng
sinh ra một lớp màng bao bọc như tấm voan mỏng như ở Saccharomyces hoặc dày
ở Drojdiile micodermice. Trên môi trường đặc, khuẩn lạc nấm men có nhiều hình
dạng khác nhau, màu trắng đục, vàng hoặc hồng nhạt. Tế bào nấm men trong tự
nhiên có thể đứng riêng lẻ hoặc sau khi nảy chồi vẫn dính với nhau tạo thành
chuỗi [32].
1.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa
Nấm men là nhóm vi sinh vật có cấu tạo đơn bào, không di động và sinh
sản chủ yếu bằng cách nảy chồi [34], sống dò dưỡng [54].
Nấm men có khả năng sinh sản rất nhanh và tạo được lượng lớn sinh khối
trong thời gian ngắn. Sinh khối nấm men rất giàu protein, vitamin và lipid.

4

Để quan sát hình thái và đo kích thước tế bào nấm men người ta thường sử
dụng môi trường mạch nha dòch thể nuôi trong 3 ngày ở 25-30
0
C. Một số tế bào
nấm men có hình dài, nối tiếp nhau tạo thành dạng sợi gọi là khuẩn ty giả. Nhiều
loài nấm men chỉ tạo khuẩn ty giả khi sống trong môi trường thiếu O

2
. Muốn
quan sát khuẩn ty giả, người ta cấy những đường ngắn nấm men trên môi trường
thạch đóa sau đó đậy lá kính nổi lên đường cấy và nuôi ở 25-30
0
C trong 3-4 ngày.
Nhiều loài nấm men có khả năng sinh bào tử túi. Nấm men thường tạo bào tử túi
sau 5-7 ngày nuôi cấy trên môi trường thạch-mạch nha [6].
1.2.1 Lên men etylic [31] [32]
Lên men rượu là quá trình hô hấp kò khí, trong đó đường bò phân giải thành
rượu (C
2
H
5
OH) và CO
2
dưới tác dụng của vi sinh vật, đặc biệt nấm men.
Phương trình phản ứng tổng quát:
C
6
H
12
O
6


nấm men
2 C
2
H

5
OH + 2 CO
2
+ 113,4 KJ
Glucose etylic
1.2.1.1 Các giai đoạn lên men rượu
Có thể chia quá trình lên men rượu thành 2 giai đoạn:
Giai đoạn tăng sinh khối nấm men:
Giai đoạn này nấm men nảy chồi và phát triển mạnh để tăng sinh khối vì
trong môi trường đầy đủ chất dinh dưỡng và O
2
.
Giai đoạn lên men:
Khi thiếu O
2
, nấm men bắt đầu biến đổi đường thành rượu và CO
2
.
Quá trình này thực chất rất phức tạp, gồm nhiều phản ứng hoá học liên
tiếp để tạo thành etanol. Có thể chia thành 5 giai đoạn chính:
 Giai đoạn phosphorin hóa
D-glucose + ATP
Mg
2+
D-glucose 6 phosphat + ADP
hexokinase
D-glucose 6 phosphat phosphohexoizomerase D-fructose 6 phosphat

5

D-fructose 6 phosphat + ATP
phosphofructokinase D-fructose 1,6 diphosphat
 Giai đoạn cắt đôi mạch :
D-fructose 1,6 diphosphat
aldolase dioxyacetophosphat +
D-glyceraldehyd 3 phosphat
Trong tế bào dioxyacetophosphat có thể biến đổi hoàn toàn thành
glyceraldehyd 3 phosphat
Dioxyacetophosphat D-glyceraldehyd 3 phosphat
 Giai đoạn oxy hóa:
D-glyceraldehyd 3 phosphat + NAD
dehydrogenase 1,3-diphosphoglycerat +
NADH
2

1,3-diphosphoglycerat + ADP 3-phosphoglycerat + ATP

3-phosphoglycerat
phosphoglyceromatase 2-phosphoglycerat

2-phosphoglycerat
enolase phosphoenol pyruvat + H
2
O

 Giai đoạn tạo piruvat:
Phosphoenol pyruvat + ADP
pyruvatkinase pyruvat + ATP

 Giai đoạn piruvat tạo thành etanol
Pyruvat
pyruvatdecacboxylase acetaldehyd + CO
2

Acetaldehyd + NADH
2
alcoldehydrogenase etanol + NAD
Kết thúc quá trình trên ta thu được rượu etylic, ngoài ra còn thu được hỗn
hợp các sản phẩm phụ khác (nguồn gốc là amin và các chất khác). Do đó các đồ
uống lên men có giá trò dinh dưỡng cao.
1.2.1.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men etylic

6

Nấm men đòi hỏi phải có những điều kiện nhất đònh mới có thể lên men.
Trong sản xuất rượu, ngoài việc lựa chọn chủng nấm men, còn phải nghiên cứu
tạo điều kiện thích hợp để đạt hiệu suất lên men cao. Các yếu tố ảnh hưởng đến
quá trình lên men:
Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ là yếu tố ảnh hưởng rất lớn. Mỗi vi sinh vật có một yêu cầu về
nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển của mình.
Nhiệt độ càng cao lên men càng sớm bắt đầu, tốc độ nhanh và kết thúc
sớm, nhưng hàm lượng đường còn lại với một lượng khá lớn. Điều này có thể là
nguy hiểm, vì hàm lượng đường sót có thể được vi khuẩn lactic sử dụng để tạo
thành acid lactic ảnh hưởng nhiều đến chất lượng của sản phẩm.
Ngoài ra nhiệt độ còn ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp các sản
phẩm thứ cấp và các sản phẩm phụ. Nhiệt độ càng cao càng dễ sinh và tích tụ
các sản phẩm phụ ngày càng nhiều. Điều này không có lợi cho sản phẩm chính

[22].
Trong công nghiệp rượu cồn người ta thường dùng các chủng nấm men
thích hợp cho lên men ở 30-35°C, lên men rượu vang 20-30°C và dưới 10°C trong
thời gian tàng trữ (lên men phụ).
Ảnh hưởng pH của môi trường

pH môi trường có ý nghóa quan trọng trong quá trình lên men rượu. Đối với
men rượu vang khoảng pH thích hợp là 2,8-3,8, Saccharomyces vini pH=3,5. So
với men rượu (Saccharomyces cerevisiae) và men bia (Saccharomyces
carbergensis) thì men rượu vang chòu được acid cao hơn. Các loài khuẩn làm
hỏng rượu hoạt động ở pH cao hơn 3,5 nhưng yếu hơn ở pH thấp hơn 3,5. Do đó
giữ pH trong giới hạn 3-3,5 là để ức chế hoạt động của khuẩn hại [22].
Ảnh hưởng của hàm lượng đường


7

Hàm lượng đường có ảnh hưởng rất lớn đến năng lực lên men. Hàm lượng
đường thích hợp nhất là 13-15% tương đương với nồng độ chất khô từ 16-18%.
Nếu hàm lượng đường quá cao sẽ làm tăng áp suất thẩm thấu và làm mất cân
bằng trạng thái sinh lý của nấm men. Nếu hàm lượng đường thấp sẽ không tạo
điều kiện cho quá trình lên men. Trong thực tế, ở hàm lượng đường 30-35% thì sự
lên men bò đình chỉ cho dù có loại nấm men có khả năng lên men được ở hàm
lượng đường lên đến 60% [34].
O
2

Nấm men là vi sinh vật hiếu khí tùy tiện và chỉ trong điều kiện kò khí nó
mới tiến hành lên men rượu, do đó khi muốn có rượu ta phải tạo điều kiện kò khí.
Tuy vậy, dù trong trường hợp có đầy đủ O

2
vẫn có một lượng rượu được tạo thành
[34].
Nồng độ rượu và khí CO
2

Đa số nấm men chỉ lên men được tới nồng độ rượu 13-14%, chỉ có một số
ít lên men ở nồng độ rượu 17-20%. Tuy khí CO
2
ức chế sự lên men nhưng việc
thoát khí CO
2
lại có tác dụng tốt đến quá trình lên men. Sự thoát khí CO
2
sẽ làm
cho môi trường luôn bò khuấy động, kéo dài được trạng thái lơ lững của nấm men
do đó làm tăng nhanh sự lên men. Qua đó ta thấy một điều phổ biến chính sản
phẩm của sự trao đổi chất khi đạt tới một nồng độ nào đó sẽ có tác dụng ức chế
đối với bản thân vi sinh vật đó [34].
1.2.2 Khả năng sử dụng các hợp chất cao phân tử [32]
1.2.2.1 Hydratcacbon
Đối với nấm men nguồn cacbon thích hợp nhất là các loại đường như
glucose, fructose, sacarose, maltose, rafinose, lactose, dextrin. Đối với các chủng
thuộc loài Saccharomyces cerevisiae có khả năng đồng hoá được các loại đường
hexose và nói chung không đồng hoá được đường pentose.

8

Các chủng nấm men riêng biệt sử dụng các nguồn đường rất khác nhau. Ví
dụ: các chủng nấm men rượu sử dụng nguồn đường glucose; với các giống men

bia, sử dụng đường maltose.
Các tế bào nấm men trước khi sử dụng các loại đường có trong môi trường
đều phải thực hiện một trong hai quá trình sau:
 Hấp thụ hoàn toàn các loại đường đó qua màng như maltose và
maltotriose có khả năng thấm thấu trực tiếp qua màng tế bào.
 Thuỷ phân trong môi trường rồi mới hấp thụ như sacarose cần phải
thuỷ phân trước bởi enzim ngoại bào rồi sau đó các sản phẩm thuỷ phân này mới
được hấp thu.
Như vậy nấm men chỉ sử dụng các loại đường có trong môi trường mà
không có khả năng phân giải nguồn nguyên liệu tinh bột bằng enzim. Do đó cần
giai đoạn đường hóa các nguyên liệu trước khi tiến hành các quá trình lên men.
1.2.2.2 Protein
Sự phát triển của nấm men liên quan đến sự hấp thu nitơ, chủ yếu là các
loại acid amin. Chúng được tế bào sử dụng để tổng hợp protein và các hợp chất
chứa nitơ khác. Nấm men tiêu hoá tốt các acid amin, kém hơn là pepton và hoàn
toàn không tiêu thụ được protein tự nhiên.
Đối với nấm men rượu không phải tất cả các acid amin đều sử dụng được.
Người ta chia các acid amin thành các nhóm:
 Nhóm hấp thu nhanh: izolơxin, triptophan, arginin, valin, histidin,
asparatic acid.
 Nhóm hấp thu chậm: trionin, phenylalanin, tirozin, metionin, serin,
glyxin, acid glutamic, lơxin.
 Nhóm không hấp thu: prolin [32].
1.2.2.3 Lipid

9

Trong suốt quá trình lên men, nấm men hấp thụ các acid béo tự do, phần
lớn chúng được kết hợp lại thành các lipid cấu trúc trong thành tế bào nấm men.
Nấm men Saccharomyces cerevisiae và những loài gần với chúng có nhu

cầu acid béo không no trong quá trình phát triển ở điều kiện hiếu khí và kò khí,
thì trong quá trình hô hấp nấm men có nhu cầu tiêu thụ acid béo không no gấp 4
lần so với bình thường do tham gia vào quá trình phosphoryl hoá để tổng hợp
ATP [32].
1.2.3 Khả năng tạo chất kháng sinh của chủng nấm men
1.2.3.1 Kháng sinh và các con đường tổng hợp
Theo Waksman đònh nghóa rằng: Kháng sinh là những chất hóa học có
nguồn gốc từ cơ thể sống có tác dụng ức chế sự sinh trưởng hay tiêu diệt một số
vi sinh vật khác một cách một chọn lọc ngay khi ở nồng độ thấp [59].
Có nhiều quan điểm khác nhau về khả năng hình thành chất kháng sinh từ
vi sinh vật:
9 Sự hình thành chất kháng sinh là cơ chế giúp vi sinh vật tồn tại.
9 Sự hình thành chất kháng sinh là do sự cạnh tranh môi trường dinh
dưỡng, thường chất kháng sinh không có một vai trò rõ rệt đối với tế bào sinh ra
chúng.
9 Chất kháng sinh chỉ là sản phẩm thải ra môi trường của quá trình trao
đổi chất, do đó mà sự mất khả năng hình thành chất kháng sinh không làm mất
khả năng sinh trưởng.
Chất kháng sinh có cấu trúc khác nhau và vi sinh vật sinh ra chúng cũng đa
dạng như: vi khuẩn Staphylococcus aureus 209 P hoặc Bac. mycoides HB (loại
nhẵn) và nấm Penicillium notatum cho chất kháng sinh penicilline, kháng sinh
streptomycine thu nhận từ xạ khuẩn Streptomyces griseus, kháng sinh kanamycin
thu nhận từ xạ khuẩn Streptomyces fradie [59].

10

Mặc dù chất kháng sinh có cấu trúc khác nhau nhưng quá trình tổng hợp
gần như theo một số con đường nhất đònh. Cơ chế sinh tổng hợp chất kháng sinh
từ vi sinh vật có thể qua một số con đường sau:
9 Chất kháng sinh được tổng hợp từ một chất trao đổi chất sơ cấp duy

nhất. Ví dụ chloramphenicol, chất kháng sinh thuộc nhóm nucleozit.
9 Chất kháng sinh được hình thành từ 2, 3 chất trao đổi bậc 1 khác nhau,
ví dụ lincomycin.
9 Chất kháng sinh được tổng hợp bằng cách polymer hóa các chất trao
đổi chất bậc một sau đó có thể tiếp tục biến đổi qua các phản ứng enzym khác;
có thể phân biệt thành bốn dạng:
o Chất kháng sinh nhóm polypeptit theo con đường trùng hợp các axit
amin.
o Chất kháng sinh amyloglucozid được tạo thành từ các phản ứng trùng
hợp polymersaccarit: neomicine, streptomycine.
o Chất kháng sinh được tạo thành nhờ phản ứng polymer hóa các đơn vò
acetat, propionat.
o Chất kháng sinh được hình thành theo con đường tổng hợp các chất
izopreonit từ các đơn vò acetat [25].
1.2.3.2 Chất kháng sinh có từ nấm men
Ketler toxin hay còn gọi là zymocine: là loại chất kháng sinh được một số
chủng nấm men và vi nấm tiết ra nhằm chống lại sự cạnh tranh giữa các chủng
cùng loài hoặc chủng thuộc họ gần. Hiện tượng này lần đầu tiên được Bevan và
Macower phát hiện năm 1936 trên chủng nấm men Saccharomyces. Cho đến nay
khả năng sinh zymocine đã được tìm thấy ở nhiều chủng nấm men thuộc họ khác
nhau như: Pichia, Kluyveromyces, Debaryomyces, Hanseniaspora,
Zygosaccharomyces, Candida, Sporidiobolus, Cryptcoccus (Schmitt và

11

Neuhansen, 1994, Magliani et al., 1997, Vondrejs và Palkova, 1997). Tất cả các
zymocine được biết đến đều là những polypeptid hoặc glycoprotein. Đặc tính sinh
học có thể được mã hóa trên ARN mạch kép, DNA plasmid và mạch thẳng trên
chromosome. Do tính chất chọn lọc rất cao, zymocine có tiềm năng như những
chất kháng sinh hữu hiệu chống lại một số bệnh nang y [45]. Khả năng tạo chất

kháng sinh của một loài nấm men được nhiều công trình nghiên cứu, ứng dụng
nhắc tới đó là chủng nấm men Saccharomyces boulardii với công trình nghiên
cứu “Xây dựng quy trình nuôi cấy và thử tác dụng trò loạn khuẩn của chủng nấm
men Saccharomyces boulardii”. Thạc só Nguyễn Kim Minh Tâm cho thấy khả
năng có thể sản xuất một loại thuốc trò loạn khuẩn đường ruột mới với ưu điểm
vượt trội so với các loại thuốc trò loạn khuẩn khác: có khả năng đề kháng các
chất kháng sinh. Trong tương lai có thể sản xuất loại thuốc nói trên với chi phí
thấp. Bên cạnh đó các kết quả nghiên cứu cũng cho thấy nấm men
Saccharomyces boulardii còn có khả năng tiết ra protease tiêu giải độc tố của
Clostridium difficile, vi khuẩn gây viêm ruột kết màng giả cũng như trung hòa
được nội độc tố E. coli và Vibrio cholerae nên có thể dùng trong dự phòng tiêu
chảy cấp tính [37].
Hiện nay công ty dược của Mỹ đã chế tạo kháng sinh từ nấm men
Saccharomyces boulardii ở dạng viên nén, lọ 50 viên [69].
1.3 Phân loại nấm men
1.3.1 Phương pháp phân loại nấm men
Để phân loại nấm men, người ta sử dụng phương pháp phân loại cổ điển
(dựa vào các đặc điểm hình thái học, sinh lý sinh hóa) và phương pháp phân loại
dựa vào kết quả của phân tích kỹ thuật di truyền [27] [32].
1.3.1.1 Phương pháp dựa vào đặc điểm hình thái học, đặc điểm sinh lý
sinh hóa

12

Chủng nấm men được cấy vào các đóa petri chứa môi trường Hansen để
quan sát hình thái khuẩn lạc (hình dạng, kích thước, màu sắc), hình dạng tế bào,
kích thước tế bào, hình thức nảy chồi, xác đònh khả năng sinh bào tử của các
chủng nấm men, quan sát khuẩn ty, khả năng lên men các nguồn hydratcacbon,
thử khả năng sinh trưởng trên môi trường agar chứa muối nitrat, ảnh hưởng của
nhiệt độ, pH, khả năng phân giải urê…[6] [27].

1.3.1.2 Phương pháp phân loại dựa vào kỹ thuật di truyền
Phân loại theo phương pháp cổ điển có độ chính xác không cao và bò hạn
chế khi xác đònh các chủng có đặc điểm gần giống nhau. Mặc khác thời gian
kiểm tra thường bò kéo dài [32].
Ngày nay cùng với sự tiến bộ của sinh học phân tử nhiều phương pháp
phân loại mới với độ chính xác cao đã được nghiên cứu và ứng dụng. Trong đó
phương pháp phân tích trình tự chuỗi RNA ribosom của tế bào nấm men đã được
biết đến như một phương pháp phân loại hiện đại, nhanh chóng và có độ tin cậy
cao [27].
Phương pháp này dựa vào trình tự chuỗi RNA của các gen r18S, 26S và
ITS.
 Các gen này được khuếch đại bằng phản ứng PCR (Polymerase Chain
Reaction)
 Các cặp mồi (primers) được sử dụng và có trình tự acid nucleic như
sau:
Mồi cho khuếch đại gen 18S rRNA:
NS1: GTAGTCATATGCTTGTCTC
NS8: TCCGCAGGTTCACCTACGGA
Mồi cho khuếch đại gen ITS rRNA:
ITS1: TCCGTAGGTGAACCTGCGG

13

ITS4: TCCTCCGCTTATTGATATGC
Mồi cho khuếch đại một phần gen 26S rRNA vùng D1/D2:
NC1: GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG
NC4: GGTCCGTGTTTCAAGAAGG
Chu kỳ nhiệt phân của phản ứng được áp dụng: 98
0
C/giây, 58

0
C/60giây,
72
0
C/120giây với 35 chu kỳ và một thời gian mở rộng 72
0
C/15phút trên máy
PCR.
Sản phẩm được tinh sạch bằng kít Wizard PCR Preps DNA purification
system (Promega, Southampton, United Kingdom) theo hướng dẫn sử dụng của
hãng.
 Xác đònh trực tiếp bằng trình tự các gen 18S rRNA, ITS rRNA, 26S
rRNA được tiến hành bằng việc sử dụng các kít phản ứng Applied Biosystem ABI
PRISM
TM
Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit. Các cặp mồi
được sử dụng cho xác đònh trình tự chuỗi của gen 18S rRNA là:
NS1: GTAGTCATATGCTTGTCTC
NS2: GGCTGCTGGCACCAGCTTGC
NS3: GCAAGTCTGGTGCCAGCAGCC
NS4: CTTCCGTCAATTCCTTTAAG
NS5: AACTTAAGGAATTGACGGAAG
NS6: GCATCACAGACCTGTTATTGCCTC
NS7: GAGGCAATAACAGGTCTGTGATGC
NS8: TCCGCAGGTTCACCTACGGA
Các cặp mồi được sử dụng cho xác đònh trực tiếp trình tự chuỗi của gen
ITS1 rRNA là:
ITS1: TCCGTAGGTGAACCTGCGG
ITS2: GCTGCGTTCTTCATCGATGC