Enzyme Protease bộ môn vi sinh vật đại cương

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
KHOA MÔI TRƯỜNG VÀ TÀI NGUYÊN

TIỂU LUẬN

TÊN ĐỀ TÀI:

ENZYME PROTEASE
Môn học

: Vi sinh vật đại cương

Mã mơn học

: EN1015

Giảng viên

: PGS. TS. Đặng Vũ Bích Hạnh
ThS. Trịnh Thị Bích Huyền
Họ và tên

: …LÊ BÙI ANH…

MSSV

: …2010110…

Tp. Hồ Chí Minh, Tháng 10 năm 2021

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ..............................................................................................................1
CHƯƠNG 1: KHÁI NIỆM VÀ NGUỒN GỐC ...................................................2
I.

Khái niệm: ....................................................................................................................................2

II.

Nguồn gốc: ...................................................................................................................................2
1.

Thực vật: ..................................................................................................................................2

2.

Động vật: ..................................................................................................................................3

3.

Vi sinh vật ................................................................................................................................3

CHƯƠNG 2: PHÂN LOẠI ..................................................................................5
I.

Khái niệm EC: ..............................................................................................................................5

II.

Phân loại Protease: .......................................................................................................................5

CHƯƠNG 3: CƠ CHẾ HOẠT ĐỘNG ................................................................7
CHƯƠNG 4: CHỨC NĂNG VÀ ỨNG DỤNG.................................................10
I.

Trong y sinh: ..............................................................................................................................10

II.

Trong công nghiệp: ....................................................................................................................10
1.

Chế biến thủy sản ...................................................................................................................10

2.

Công nghiệp sữa và bánh .......................................................................................................11

3.

Sản xuất bia ............................................................................................................................11

4.

Cơng nghiệp da và dệt ............................................................................................................11

CHƯƠNG 5: QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT ENZYME .....................................12
Phương pháp thu nhận Ficin thô từ cây sung và sơ chế thành chế phẩm Enzyme Ficin ............12

I.

II.

1.

Thu nhận Ficin thô: ................................................................................................................12

2.

Sơ chế dịch nhựa tươi thành chế phẩm Enzyme Ficin: ..........................................................12
Phương pháp tinh sạch: ..............................................................................................................13

KẾT LUẬN ........................................................................................................15


MỞ ĐẦU
Thế giới xung quanh ta tồn tại vô vàn những điều kì diệu mà lồi người đã dành
nhiều thế hệ để nghiên cứu chúng và enzyme cũng là 1 trong số đó. Enzyme, như
chúng ta đã biết, đóng vai trò rất quan trọng trong cơ thể của mọi sinh vật sống trên
Trái Đất này.Trên thực tế, khi con người cịn chưa có khái niệm về enzyme, họ đã biết
sử dụng nó trong chế biến bảo quản thực phẩm lên men cổ truyền. Khoảng 5000 năm
trước công nguyên ở Jerico, người ta đã biết đến kỹ thuật làm bánh mì, nấu rượu vang,
sản xuất dấm, tương chao,… ở các mức độ khác nhau. Và Protease là 1 trong những
enzyme vô cùng thú vị: Các nghiên cứu gần đây cho thấy khoảng 2% của toàn bộ sản
phẩm của gene (gene products) chính là protease1, đủ để cho thấy tầm quan trọng của
enzyme này. Lịch sử nghiên cứu của protease đã được ghi nhận từ những năm cuối của
thế kỉ XVIII, nhưng tới gần đây mới thật sự nhận được sự quan tâm bởi các ứng dụng
rộng rãi của chúng: chúng không chỉ có ý nghĩa cho q trình sinh sản, sinh trưởng của
mọi sinh vật mà cịn đóng vai trị rất quan trọng trong công nghệ chế biến thực phẩm,
trong y học, trong công nghệ gene và bảo vệ môi trường Đây cũng là lí do vì sao đây

là đề tài được chọn cho bài tiểu luận này và sau đây chúng ta sẽ lần lượt tìm hiểu về
khái niệm, phân loại, cơ chế hoạt động cũng như ứng dụng và quy trình tách chiết của
loại enzyme đặc biệt này.

1

Proteases in physiology and pathology by Chakraborti Sajal-Dhalla Naranjan S
1|Page


CHƯƠNG 1: KHÁI NIỆM VÀ NGUỒN GỐC
I.

Khái niệm:

Enzyme là nhóm protein chun biệt hóa cao có vai trị và chức năng sinh học
quan trọng bậc nhất đối với tế bào cơ thể sống. Enzyme có khả năng xúc tác với tốc độ
đặc hiệu cơ chất vơ cùng hồn hảo, xúc tác đặc biệt các phản ứng hóa học mà ở điều
kiện bình thường các chất xúc tác hóa học khác khơng thể thực hiện nổi. Các q trình
sinh học xảy ra trong cơ thể của mọi sinh vật sống là các phản ứng hóa học và hầu hết
đều chịu tác động của enzyme. Nếu khơng có enzyme, phần lớn các phản ứng đó có
thể sẽ khơng thể xảy ra. Enzyme xúc tác tất cả các quá trình trao đổi chất của tế bào,
bao gồm tiêu hóa thức ăn mà ở đó các phân tử chất dinh dưỡng lớn như protein,
carbohydrate hay chất béo bị phá vỡ cấu trúc thành các phân tử nhỏ hơn.2
Điển hình trong q trình tiêu hóa thức ăn chính là enzyme protease. Protease
( hay cịn được gọi là Peptidase hoặc Proteinase) là enzyme xúc tác cho quá trình phân
giải protein thành những chuỗi polypeptide ngắn hơn hay nhiều phân tử amino acid.
Để làm được điều này, trong quá trình thủy phân, chúng cắt đứt các liên kết peptide
( -CO-NH-) của phân tử protein, ngoài ra nhiều protease cịn có khả năng thủy phân
liên kết ester và vận chuyển amino acid. Chúng khơng chỉ có ý nghĩa cho quá trình

sinh sản, sinh trưởng của mọi sinh vật mà cịn đóng vai trị rất quan trọng trong cơng
nghệ chế biến thực phẩm, trong y học, trong công nghệ gene và bảo vệ mơi trường.3

II.

Nguồn gốc4:

Protease có 3 nguồn thu chính tới từ động vật, thực vật và vi sinh vật.
1. Thực vật:
Bromelin, một glycoprotein, mỗi phân tử có glycan gồm 3 maltose, 2
glucosamine, 2 xylose và 1 fructose được tìm thấy trong quả và thân cây dứa. Loại
protease này có biên độ pH từ 3-10, pH tối thiểu 5-8 tùy thuộc cơ chất và khi nhiệt độ
thay đổi sẽ gây ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme này.
Papain, một protease-thiol với trung tâm hoạt động có nhóm –SH quyết định
hoạt tính của nó, có trong nhựa đu đủ. Loại protease này có thể chịu được nhiệt độ cao
và ở dạng ổn định (hay cấu trúc không gian ổn định) có thể chịu được pH trong
khoảng 1.5-8.5
2

/> ; />4
Protease- Nhóm 1, Trường Đại học An Giang Khoa Nơng nghiệp - Tài nguyên Thiên nhiên
3

2|Page


Ficin có trong nhựa lá và thân cây quả sung lại có thể thủy phân các liên kết
peptide của nhiều loại protein tự nhiên như protein sữa, đậu nành. Hoạt động được
trong phạm vi nhiệt độ từ 30-500C với pH thuộc khoảng 4-9.5 và hoạt động tốt tại
nhiệt độ 50-650C và pH=5 (nếu cơ chất là gelatin), pH= 9.5( nếu cơ chất là casein).

2. Động vật:
Pepsin, 1 polypeptide cấu tạo bởi 329 amino acid, đầu C là alanin và đầu N là
isoleucine với pH tối hảo (pH phù hợp nhất) = 1.5-2.4, được tìm thấy trong dịch vị của
động vật có vú, chim…
Rennin, hay cịn được gọi là Chymosin được hình thành trong dạ dày con non
của các loại nhai lại (như bê) có khả năng đơng tụ sữa giúp những con non này hấp thụ
chất dinh dưỡng từ sữa tốt hơn ,và hoạt động ở pH= 2.3-6.8
Trypsin là một loại enzyme tiêu hóa quan trọng, được tìm thấy trong hệ tiêu hóa
của rất nhiều lồi động vật có xương sống, cũng là nơi enzyme trypsin thực hiện vai
trò thủy phân protein
3. Vi sinh vật5
Vi sinh vật là nguồn thu nhận enzyme khổng lồ do protease chúng sản xuất có
tính đặc hiệu cơ chất cao, protease phân bố chủ yếu ở vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn.

5

Enzyme Protease_Trần Anh Đào_48K_Hóa Thực Phẩm_Đại học Vinh

3|Page


Subtilisin là một protease ban đầu thu được từ Bacillus subtilis, vi khuẩn có khả
năng tổng hợp protease mạnh nhất. Các vi khuẩn thường tổng hợp các protease hoạt
động thích hợp ở vùng pH trung tính và kiếm yếu (5-8) và có khả năng chịu nhiệt thấp

Bacillus

Nấm mốc đen tổng hợp chủ yếu các protease acid, có khả năng thủy phân
protein ở pH = 2.5-3. Một số nấm mốc như A.candidatus,P. camemberti,.. cũng có khả

năng tổng hợp protease có khả năng đông tụ sữa.

Nấm mốc

4|Page


CHƯƠNG 2: PHÂN LOẠI
I.

Khái niệm EC:

Để phân loại đầu tiên ta phải tìm hiểu về Enzyme Commission number (tạm
dịch số EC). Đây là 1 cách phân loại enzyme bằng phương pháp đánh số dựa trên các
phản ứng hóa học mà chúng tham gia xúc tác. Mọi mã Enzyme (Enzyme code) đều
chứa cụm “ EC” và 4 số ngăn cách nhau bởi dấu chấm. Những con số này đại diện cho
những cách phân loại cụ thể và chi tiết hơn cho từng enzyme.6

II.

Phân loại Protease:

7

Protease thuộc phân lớp 4 của lớp thứ 3 ( EC.3.4) : chỉ những enzyme thủy
phân ( Hydrolases) tác động lên liên kết peptide. Protease được chia thành 2 loại dựa
vào vị trí cắt mạch peptide: Endopeptidase và Exopeptidase. Endopeptidase cắt liên
kết peptide ở ngay trong phân tử protein, kết quả tạo ra nhiều mạch peptide còn
Exopeptidase lại cắt ở cuối mạch của phân tử protein dẫn đến việc tách ra các amino
acid.

Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptide, Exopeptidase được phân thành 2
loại:
- Aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu N tự do của
chuỗi polypeptide để giải phóng ra một amino acid, một dipeptide hoặc
tripeptide.
- Carboxypeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu C của
chuỗi polypeptide và giải phóng ra một amino acid hoặc một dipeptide.
Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, Endopeptidase được chia thành 4 nhóm:
-Serine Protease: là những protease chứa nhóm -OH của gốc serine
trong trung tâm hoạt động và có vai trị đặc biệt quan trọng đối với hoạt động
xúc tác của enzyme. Nhóm này bao gồm 2 nhóm nhỏ: Chymotrypsin và
Subtilisin. Chymotrypsin bao gồm các enzyme động vật như Chymotrypsin,
Elastase; còn Subtilisin bao gồm 2 loại enzyme vi khuẩn như Subtilisin
Carlsberg, Subtilisin BPN. Các Serine protease thường hoạt động mạnh ở vùng
kiềm và thể hiến tính đặc hiệu cơ chất tương đối rộng.
-Cysteine Protease: các Protease chứa nhóm -SH trong trung tâm hoạt
động; bao gồm các Protease thực vật như Papain, Bromelin, một vài Protease

6
7

/> />
5|Page


động vật và Protease kí sinh trùng. Các Cysteine Protease thường hoạt động ở
vùng pH trung tính và có tính đặc hiệu cơ chất rộng.
-Aspartic Protease: hầu hết các Aspartic Protease đều thuộc nhóm
Pepsin, bao gồm các enzyme tiêu hóa như: Pepsin, Chymosin, Cathepsin,
Renin. Các Aspartic Protease có chứa nhóm Carboxyl trong trung tâm hoạt

động và thường hoạt động mạnh ở pH trung tính.
-Metallo proteinase: là nhóm proteinase được tìm thấy ở vi khuẩn, nấm
mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn. Các Metallo Proteinase thường hoạt
động ở vùng PH trung tính và giảm hoạt động mạnh dưới tác dụng của EDTA.

Ngồi ra, Protease có thể được phân loại theo vùng pH tối ưu tương ứng:
Protease acid: Pepsin, Renin, … vùng pH acid 2-4.
Protease base: Trypsin, Chymotrypsin, … vùng pH kiềm 9-11.
Protease trung tính: như Papain từ quả đu đủ, Bromelin từ quả dứa, …
hoạt động ở vùng pH trung tính 7-8

6|Page


CHƯƠNG 3: CƠ CHẾ HOẠT ĐỘNG
Ta đã biết rằng Protease có vai trị xúc tác cho phương trình thủy phân và thủy
phân chính là sử dụng nước để phá vỡ liên kết cộng hóa trị. Trong trường hợp này, liên
kết cộng hóa trị mà ta muốn phá chính là liên kết amide ở trong protein. Hình dưới đây
mơ ta phân tử nước ( màu đỏ) và liên kết peptide (màu xanh) và bảng màu này sẽ được
sử dụng xuyên suốt chương này nhằm giải thích cơ chế hoạt động của Protease.
8

Sau khi nước phản ứng với liên kết amide, ta được kết quả là một amine và một
acid carboxylic.

Tác dụng của Enzyme Protease là giúp phản ứng này xảy ra nhanh hơn nhiều
do bản chất nước không phải là một nucleophile đủ tốt để q trình này diễn ra nhanh
chóng. Và ta nên nhớ rằng ta cần một nucleophile để bắt đầu loại phản ứng trên. Và
Protease có thể biến nước thành một nucleophile tốt hơn bằng cách như sau:
ở trong các hình sau. Trung tâm hoạt động của enzyme sẽ được vẽ bằng màu

trắng và dòng electron màu vàng để ta có thể dễ dàng theo dõi.

8

/>
7|Page


Bước đầu tiên trong phản ứng này là biến nước thành một nucleophile tốt hơn
và enzyme làm điều đó bằng cách lấy prtoton của nước và tạo ra anion hydroxide.
Enzyme có thể lấy cặp electron tự do trên aspartic acid của Trung tâm hoạt động để lấy
đi proton từ nước, tạo ra Hydroxide

Sau đó nước đã trở thành 1 nucleophile đủ mạnh để tác dụng với electrophile
(tạo ra Oxyanion). Và khi điều này xảy ra đã tạo điều kiện cho nguyên tử N ở trong
liên kết peptide có thể lấy proton của ngun tử H (của nhóm -OH). Chính vì vậy
khiến cho N trở thành điện tích dương (positive charge) nên khi nhóm carbonyl hình
thành thì các electron sẽ hấp dẫn bởi nguyên tử N trong liên kết peptide chứ khơng
phải liên kết CO vừa được tạo ra.

Khi hồn thành giai đoạn này cũng là lúc ta đã cắt được liên kết peptide và về
cơ bản thì quá trinh thủy phân đã kết thúc nhưng ta vẫn còn giai đoạn hồi phục Trung
tâm hoạt đông của Enzyme bằng cách lấy đi proton của Aspartic acid.

8|Page


Và ta có thể làm điều này bằng cách dùng cặp electron tự do trên amine hoặc
trên Carboxylate và tùy vào điều kiện pH thích hợp mà phân tử nào sẽ nhường cặp
electron tự do của mình. Và cụ thể trong điều kiện sinh học, amine thường lấy proton

(protonated)

Vậy là ta đã khôi phục được Trung tâm hoạt động của enzyme để có thể tiếp tục
xúc tác cho các phản ứng tiếp theo.

9|Page


CHƯƠNG 4: CHỨC NĂNG VÀ ỨNG DỤNG
I.

9

Trong y sinh:

Protease gắn liền với nhiều khía cạnh của sinh học con người. Ví dụ, trong ruột
non, Protease giúp tiêu hóa các protein và giúp ta hấp thụ các amino acid. Các quá
trình cần có Protease làm trung gian như sự đơng tụ của máu, giúp phát hệ miễn dịch
hoạt động, sự phát triển của các prohormone, sự hình thành của xương, sự chết theo
chương trình của tế bào ( Programmed cell death). Protease không nhất thiết phải gắn
liền tới chức năng tiêu hóa và tái tạo chất nền và mơ ngoại bào, mà cịn là yếu tố chính
để “hướng dẫn” (induction) các phản ứng miễn dịch sinh lý (Physiological immune
responses). Sự hướng dẫn này có thể là trực tiếp, thơng qua sự phân hủy của mầm
bệnh bên trong Phagolysosomes hoặc gián tiếp,thông qua sự kích hoạt của các PRRs
(Pattern recognition receptors) chủ chốt như TLRs (toll-like receptors). Nhưng thật
đáng tiếc rằng sự sản xuất dư thừa của Protease có thể dẫn đến phản ứng có hại cho vật
chủ và gây viêm và tổn thương cho các mơ dư thừa.
Protease cịn đóng vai trò quan trọng trong nhiều cơ sở để điều trị bệnh như
bệnh Alzheimer’s, ung thư và nhiễm trùng do vi rút (viral infection). MMP-9, một ma
trận metallopeptidase, đóng vai trị quan trọng trong quá trình hình thành các mạch

máu (angiogenesis) và là một mục tiêu để chữa trị cho ung thư (therapeutic target for
cancer). Chính vì tầm quan trọng của chúng trong bệnh lý học (pathology of disease)
mà Protease là một nhóm thuốc mục tiêu hướng tới ( drug target class).

II.

10

Trong công nghiệp:
1. Chế biến thủy sản

Nước mắm truyền thống là kết quả của quá trình thủy phân protein thịt cá dưới
sự tác động của hệ protease nội tại trong cá với điều kiện có muối. Khi sản xuất nước
mắm thì thời gian chế biến thường là dài nhất, hiệu suất thủy phân (độ đạm) lại phụ
thuộc rất nhiều vào địa phương, phương pháp gài nén ( một phương pháp để sản xuất
nước mắm), nguyên liệu cá. Nên việc sử dụng chế phẩm Enzyme Protease trong quy
trình sản xuất nước mắm ngắn ngày đã dần được hoàn thiện. Phương pháp sử dụng
Protease trong sản xuất nước mắm:
Trong 24 tiếng đầu tiên, dưới tác động của hệ Protease nội tại của cá,
một phần protein thịt cá bị phân hủy thành peptide, polypeptide hịa tan trong
nước bồi. Sau đó, protein thịt cá, peptide và các polypeptide được tạo thành này

9

/>Enzyme Protease_Trần Anh Đào_48K_Hóa Thực Phẩm_Đại học Vinh

10

10 | P a g e

tiếp tục bị thủy phân bởi các Protease tạo thành các amino acid tự do, peptide
ngắn và sự hình thành hương vị của nước mắm.

2. Công nghiệp sữa và bánh
Protease được dùng trong sản xuất phomat nhờ hoạt tính làm đơng tụ sữa của
chúng và đó là các Protease từ các sinh vật như A. Candidus, P.Roquerti, B.
mesentericus. Trong công nghiệp sản xuất bánh mỳ, bánh quy,… Protease làm giảm
thời gian trộn, tăng độ dẻo và làm nhuyễn bột, tạo độ xốp, giúp bánh có độ nở tốt hơn.

3. Sản xuất bia
Chế phẩm Protease có ý nghĩa quan trọng trong việc làm tăng độ bền của bia và
rút ngắn thời gian lọc. Protease của Aps.oryzae có thể tạo điều kiện xử lý bia tốt hơn
bằng cách thủy phân Protein trong hạt ngũ cốc ( hạt này sau khi lên men để nấu bia thì
được gọi là bã bia).
Ứng dụng Protease để làm trong và ổn định nước quả và rượu vang do tác nhân
gây đục và gây khó khăn cho việc này chính là protein.

4. Cơng nghiệp da và dệt
Trong công nghiệp da, Protease được sử dụng làm mềm da nhờ sự thủy phân
một phần protein của da, chủ yếu là collagel, thành phần chính khiến cho da bị cứng.
Kết quả cho việc này là loại bỏ khỏi da các chất nhớt và làm cho da có độ mềm dẻo
nhất định, tính chất đó được hồn thiện hơn sau khi thuộc da. Trước đây, để làm mềm
da người ta dùng Protease được phân lập từ cơ quan tiêu hóa của động vật. Ngày nay,
việc đưa các Protease tách từ vi khuẩn (B.mesentericus, B.subtilis), nấm mốc
(A.Oryzae, A.flavus) vào công nghiệp thuộc da đã đem lại nhiều kết quả quan trọng.
Protease vi sinh vật được sử dụng để làm sạch tơ tằm, tẩy tơ nhân tạo để được
sợi bóng, dễ nhuộm do Protease có tác dụng thủy phân lớp protein serisin đã làm dính
bết các sợi tơ tự nhiên, làm bong và tách rời các loại tơ tằm để từ đó giảm lượng hóa
chất cần để tẩy trắng.

11 | P a g e


CHƯƠNG 5: QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT
ENZYME
Bây giờ chúng ta sẽ tìm hiểu quy trình tách chiết của một Protease cụ thể: Ficin
Ficin là 1 protease được tìm thấy trong nhựa của cây thuộc họ Ficus (sung, vả),
thuộc họ Moraceae, bộ Urticales.
Hầu hết các bộ phận của cây có chứa nhựa bao gồm cao su 2,4%, Resin,
Albumin, Cerin, đường, Malic acid, Rennin, Proteae, Diatase,… Người ta nhận thấy
rằng hoạt tính của enzyme Ficin cao khi nhựa được thu nhận vào buổi sáng sớm. Do
đó, nhựa sung thường được thu vào sáng sớm, sấy khô để dùng trong công nghệ thực
phẩm.

I.

Phương pháp thu nhận Ficin thô từ cây sung và sơ chế thành
chế phẩm Enzyme Ficin
1. Thu nhận Ficin thô:
11

Từ lá và quả: lá và quả sau khi hái về được rửa sơ, cắt nhỏ và ngâm trong nước
rồi xay nhuyễn.Lọc qua vải thường, loại bỏ xác và thu lấy dịch lọc. Dịch lọc được xác
định đem đi xác định hoạt tính enzyme bằng phương pháp Kunitz, từ đó xác định hoạt
tính của enzyme Ficin chứa trong dịch lọc.
Từ nhựa thân: nhựa sung được thu vào buổi sáng từ 6-8 giờ. Nhựa sung được
bảo quản lạnh ở ngăn đơng có nhiệt độ thấp hơn 00C. Hoạt tính của Protease trong
nhựa tươi được xác định bằng phương pháp Kunitz.

2. Sơ chế dịch nhựa tươi thành chế phẩm Enzyme Ficin:
- Dịch nhựa sung sau khi thu được pha theo tỷ lệ 1g dịch nhựa trong 2ml nước
cất.
-Khuấy đều dung dịch bằng máy khuấy từ trong 5 phút để enzyme hoà tan hoàn
toàn trong nước.
-Ly tâm hỗn hợp với tốc độ 3000 vòng /phút trong thời gian 10 phút để cao su
đông đặc lại và lắng xuống. Loại bỏ phần lắng ở phía dưới, thu dịch nổi bên trên.
-Dùng phương pháp tủa phân đoạn enzyme bằng ethanol 96% để thu lấy các
phân đoạn và xác định hoạt tính enzyme trong các phân đoạn.

11

Các phương pháp tinh sạch Enzyme_ GVHD Ths Đặng Thị Ngọc Dung_ Hóa Thực Phẩm

12 | P a g e


-Những phân đoạn có hoạt tính enzyme được pha lọc gel để loại bỏ các tạp chất
trong các phân đoạn enzyme.
-Các phân đoạn sau khi qua cột gel sẽ được xác định lại hoạt tính, trộn với tinh
bột với tỷ lệ 1:1 rồi sấy khô ở nhiệt độ 400C. Chế phẩm enzyme thu được ở dạng bột
sẽ bảo quản ở nhiệt độ 0-40C.
Ta có thể biểu diễn việc thu nhận theo sơ đồ sau:

II.

12

Phương pháp tinh sạch:

Việc làm sạch enzyme chính là việc loại protein khơng phải là enzyme,
nước,các thành phần khác của tế bào khỏi enzyme. Công việc này hồn tồn khơng dễ
dàng. Do đó, việc làm sạch enzyme địi hỏi người làm nghiên cứu về enzyme, ngồi sự
hiểu biết về enzyme ra còn phải nắm vững rất nhiều thao tác kỹ thuật khác nhau để
tránh gây mất tính hoạt động của enzyme. Trong dịch chiết, ngồi enzyme cịn chứa
các protein tạp và nhiều chất khác chính vì vậy cần phải tinh sạch.
12

Các phương pháp tinh sạch Enzyme_ GVHD Ths Đặng Thị Ngọc Dung_ Hóa Thực Phẩm

13 | P a g e


Để loại bỏ các protein tạp và các tạp chất có phân tử lượng cao khác, thường
dùng kết hợp nhiều biện pháp khác nhau: phương pháp biện tính chọn lọc nhờ tác
dụng của nhiệt độ hoặc pH của môi trường, phương pháp kết tủa phân đoạn bằng muối
trung tính hoặc các dung môi hữu cơ, các phương pháp sắc ký (sắc ký hấp phụ, sắc ký
trao đổi ion),điện di, phương pháp lọc gel.
Ở đây chúng ta sẽ đi sâu về quy trình của phương pháp lọc gel trong việc tinh
sạch Ficin:
Cách làm:
+ Nhồi cột: ngâm gel sephadex G75 trong dung dịch NaN3 0,02% trong 24 giờ
để gel trương nở hoàn toàn.
- Cho dung dịch đệm vào cột.
- Cho một lớp gòn thủy tinh vào cột, đổ gel từ từ vào cột đến chiều cao cần
thiết. Trong quá trình đổ gel vào cột phải khuấy đều để gel được đồng nhất và phải chú
ý là ln ln có một lớp dung dịch đệm trên mặt để ngăn cản hiện tượng khô gel. Đặt
lên gel một lớp giấy lọc.
- Để cột ổn định trong vài giờ, rửa cột bằng dung dịch đệm phosphate.
+ Nạp mẫu: cân mẫu và hoà tan mẫu vào 3-5 ml dung dịch đệm pH 6,1 sao cho

nồng độ protein khoảng 10 mg/ml.
- Nạp mẫu vào cột, sau khi hết mẫu vẫn tiếp tục cho dung dịch đệm qua cột.
- Thu mẫu vào ống nghiệm, mỗi ống nghiệm chứa 2,5ml. Mỗi phân đoạn được
thu trong thời gian 5-10 phút, đem các phân đoạn đi đo OD 280nm. Dồn chung những
phân đoạn nào có sự hiện diện của enzyme để đo hoạt tính và xác định hàm lượng
enzyme.

14 | P a g e


KẾT LUẬN
Tóm lại, Protease là một loại enzyme xúc tác quá trình thủy phân liên kết
peptide (-CO-NH)n trong phân tử protein hay polypeptide, có nguồn gốc đa dạng từ
thực vật, động vật cho đến vi sinh vật. Sự đa dạng khơng chỉ dừng lại ở nguồn gốc mà
cịn ở chức năng và tính biệt hóa cao của chúng, chính vì vậy tính ứng dụng của chúng
trong các ngành cơng nghiệp và y học là vô cùng to lớn mặc cho quy trình tách chiết
và cơ chế hoạt động phức tạp của chúng.

15 | P a g e