ĐỒ án PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH VI SINH

MỤC LỤC
LỜI NĨI ĐẦU..............................................................................................................1
CHƯƠNG I. TỞNG QUAN VỀ VI SINH VẬT SALMONELLA..............................2
1.1 Lịch sử phát hiện .................................................................................2
1.2 Phân loại................................................................................................3
1.3 Đặc điểm................................................................................................5
1.3.1 Đặc điểm chung và đặc điểm nuôi cấy......................................5
1.3.2 Tính chất hóa sinh.......................................................................5
1.3.3 Cấu trúc của Salmonella.............................................................6
1.3.4 Cơ chế gây bệnh..........................................................................8
1.3.5 Ng̀n gớc lây bệnh.....................................................................9
1.3.6 Tình hình nhiễm Salmonella trong nước và trên thế giới......10
1.3.6.1 Trong nước.............................................................................10
1.3.6.2 Trên thế giới...........................................................................10
1.3.7 Các chỉ tiêu Salmonella trong thực phẩm................................11
CHƯƠNG II. QUY TRÌNH PHÂN TÍCH VI SINH VẬT SALMONELLA...........13
2.1 Thu và bảo quản mẫu thực phẩm......................................................13
2.1.1 Lấy mẫu theo lô hàng...............................................................13
2.1.2 Lấy mẫu theo dây chuyền sản xuất.........................................13
2.1.3 Thu mẫu vệ sinh công nghiệp...................................................13
2.1.4 Thu mẫu ở cửa hàng hoặc chợ.................................................13
2.1.5 Dụng cụ lấy mẫu.......................................................................13
2.1.6 Bảo quản và vận chuyển...........................................................13
2.1.7 Chuẩn bị mẫu thực phẩm.........................................................14
2.2 Sơ đồ phân tích tổng quát vi sinh vật Salmonella..............................15
2.3 Phương pháp truyền thống ( Phương pháp nuôi cấy )......................16
2.3.1 Nguyên tắc xác định..................................................................16


2.3.2 Mơi trường ni cấy.................................................................17
2.3.3 Quy trình xác định....................................................................19

2.3.4 Thút minh quy trình.............................................................19
2.3.4.1 Tăng sinh...............................................................................19
2.3.4.2 Tăng sinh chọn lọc................................................................20
2.3.4.3 Phân lập và nhận diện..........................................................20
2.3.4.4 Khẳng định............................................................................22
2.3.4.5 Khẳng định Salmonella bằng kháng huyết thanh..........25
2.4 Phương pháp hiện đại........................................................................26
2.4.1 Phương pháp định tính Salmonella sử dụng kit thử nhanh
3MTM PetrifilmTM Salmonella Express System.......................26
2.4.2 Phương pháp định tính Salmonella sử dụng kit thử nhanh
IRIS Salmonella........................................................................28
2.4.3 Phương pháp phát hiện Salmonella sử dụng bộ kit xét
nghiệm MCC test (Mỹ)............................................................30
2.4.4 Định tính Salmonella bằng phương pháp PCR......................31
TÀI LIỆU THAM KHẢO.........................................................................................34


LỜI NÓI ĐẦU
Vi sinh vật sống ở khắp mọi nơi trên Trái Đất, từ đỉnh núi cao đến tận đáy biển sâu,
trong đất, trong khơng khí, trong hầm mỏ, sơng ngòi, ao hồ, trên da, trong từng bộ phận cơ
thể người, động vật, thực vật, trong các sản phẩm lương thực, thực phẩm, vật liệu, hàng
hóa… Ngay cả trong những nơi mà điều kiện sống tưởng chừng hết sức khắc nghiệt vẫn
thấy sự phát triển của vi sinh vật.
Trong những năm gần đây, vấn đề ngộ độc thực phẩm ngày càng trở nên cấp thiết,
các báo cáo cho thấy phần lớn các vụ ngộ độc thực phẩm là do vi sinh vật. Đã có nhiều
cảnh báo, nhưng tình trạng ngộ độc thực phẩm vẫn đang leo thang và ngày càng nghiêm
trọng.
Có rất nhiều vi sinh vật gây ngộ độc thực phẩm, ví dụ như Clostridium butolinum,
Escherichia Coli, Listeria monocytogenes… trong đó, Salmonella là lồi vi sinh vật gây
ngộ độc rất nguy hiểm. Salmonella thuộc họ Enterobactriaceae, gây ra bệnh thương hàn,

nhiễm trùng huyết và nhiều bệnh nghiêm trọng khác.
Xuất phát từ nhu cầu tìm hiểu về độc tố, khả năng gây bệnh và cách phát hiện cũng
như cách phòng phòng chống bệnh vi khuẩn Salmonella, chúng tôi thực hiện nghiên cứu
đề tài “Xây dựng quy trình phân tích vi khuẩn Salmonella” để có cái nhìn tổng quan hơn về
vi khuẩn Salmonella và một số chủng vi sinh vật khác.

1


Chương I. Tổng quan về vi sinh vật Salmonella
1.1 Lịch sử phát hiện
Năm 1885 Slamon và Smith (Mỹ) tìm được Salmonella từ lợn mắc bệnh dịch tả và gọi
tên là Bacilus cholerasuis, hiện nay gọi là Salmonella. Nhưng sau đó Schweinittz và
Dorset 1903 đã chứng minh bệnh dịch tả là do một loại vi rút gây nên và đã xác định
S.choleraesuis là vi khuẩn gây bệnh phó thương hàn.
Năm 1888 A.Gartner phân lập được mầm bệnh từ thịt bò và lách người bệnh, ông gọi
vi khuẩn này là Bacillus enteritidis và ngày nay vi khuẩn này được gọi là S.enteritidis. Vi
khuẩn này cũng được gọi bằng nhiều tên khác như: Bacterium enteritidis, Bacillus
gartner…
Năm 1889 Klein phân lập được S.gallinarum và Rettger cũng đã phân lập được
S.pullorum năm 1909. Trước đây người ta cho rằng đây là hai loại vi khuẩn gây ra hai bệnh
khác nhau lên đã gọi chung là bệnh phó thương hàn gà (Typhus avium) và căn bệnh có tên
chung là S.gallinarum–pullorum.
Năm1896 C.Archard và Rbensauded đã phân lập được vi khuẩn S.paratyphi equi và
S.paratyphi bacilus. Ngày nay vi khuẩn này được gọi tên là S.paratyphi B và đến năm
1898, S.paratyphi A đã tìm được do N.Guynvà H Keyser.

2

Hình 1.1 Vi Khuẩn Salmonella
1.2 Phân loại
Về phân loại khoa học Salmonella được xếp vào:
 Giới : Bacteria
 Ngành: Proteobacteria
 Lớp: Gramma Proteobacteria
 Bộ: Enterobacteriales
 Họ: Enterobacteriaceae
 Giống: Salmonella lignieres1900
Các lồi điển hình:


Salmonella typhi: Chỉ gây bệnh cho người. Ở nước ta bệnh thương hàn chủ
yếu do S.typhi gây ra.

Hình 1.2 Vi KhuẩnSalmonella typhi


Salmonella choleraesuis: Gây bệnh nhiễm trùng máu

Hình 1.3 Vi Khuẩn Salmonella choleraesuis
3




Salmonella entertidis: Gây rối loạn tiêu hóa

Hình 1.4 Vi Khuẩn Salmonella entertidis
Lúc đầu, các loài Salmonella được đặt tên theo hội chứng lâm sàng của chúng như

S.typhi hay S.paratyphi A, B, C (typhoid = bệnh thương hàn, para = phó), hoặc theo vật chủ
như S.typhimurium gây bệnh ở chuột,về sau người ta thấy rằng 1 lồi Salmonella có thể
gây ra nhiều hội chứng và có thể phân lập được ở nhiều lồi khác nhau. Vì những lý do đó
mà các chủng Salmonella mới phát hiện được đặt tên theo nơi mà nó được phân lập như
S.teheran,S.congo,S.london.
Hiện nay theo phân loại của hệ thống Viện Pasteur thế giới, Trung tâm Kiểm soát và
ngăn ngừa dịch bệnh của Mỹ CDC (Control and Prevent Disease Center), giống
Salmonella được chia làm hai loài: S. enterica và S. bongori. Trong đó S. bongori gồm tất
cả các kiểu huyết thanh (serotype) của loài phụ số V, và S. enterica được chia làm 6 loài
phụ đánh số: I, II, IIIa, IIIb, IV và VI .Các loài và lồi phụ này có thể phân biệt được bằng
phản ứng sinh hóa. Trong mỗi lồi phụ có nhiều kiểu huyết thanh.
Cho đến nay đã xác định được trên 2463 kiểu huyết thanh thuộc giống Salmonella.
Theo hệ thống của Kauffman White, các kiểu huyết thanh này được chia dựa trên kháng
nguyên thân O, kháng nguyên tiêm mao H và kháng nguyên bề mặt Vi. Phần lớn các kiểu
huyết thanh được đặt tên theo công thức kháng nguyên, một số khác được đặt tên riêng như
4


Enteritidis (S. enteritidis), Typhi (S. typhi), Paratyphi (S. paratyphi), Typhimurium (S.
typhimurium)…
1.3 Đặc điểm
1.3.1 Đặc điểm chung và đặc điểm nuôi cấy
Salmonella là trực khuẩn Gram âm, kỵ khí tùy nghi kích thước trung bình từ 0,5-3
µm, di chuyển bằng tiên mao trừ S. gallimarum và S. pullorum, không tạo bào tử, chúng
phát triển tốt ở nhiệt độ 60C – 45,60C, thích hợp nhất ở 370C, phát triển trong pH 4.1- 9.0.
Ở nhiệt độ từ 180C – 400C vi khuẩn có thể sống đến 15 ngày.
Salmonella phát triển được trên các mơi trường ni cấy thơng thường. Trên mơi
trường thích hợp, vi khuẩn sẽ phát triển sau 24 giờ. Có thể mọc trên những mơi trường có
chất ức chế chọn lọc như DCA (deoxycholate citrate agar) và XLD (xylose lysine
deoxycholate).Trong đó mơi trường XLD ít chất ức chế hơn nên thường được dùng để

phân lập Salmonella.
Khẩn lạc đặc trưng của Salmonella trên mơi trường này là trịn, lồi, trong suốt, có
tâm đen, đôi khi tâm đen lớn bao trùm khẩn lạc,môi trường xung quanh chuyển sang màu
đỏ.
1.3.2 Tính chất hóa sinh
Salmonella lên men glucose và mannitol sinh acid nhưng không lên men
saccharose, lactose, salicin và inositol, không sinh indole, không phân giải ure, khơng có
khả năng tách nhóm amine từ tryptophane, hầu hết các chủng đều sinh H 2S,sử dụng được
citrate ở mơn trường Simmons.
Tuy nhiên khơng phải lồi Salmonella nào cũng có những tính chất trên, các ngoại
lệ được xác định là S.typhi lên men đường glucose không sinh hơi, không sử dụng citrate
trong môi trường Simmon, hầu hết các chủng S.paratyphi và S.Cholerasuis không sinh

5


H2S, khoảng 5% các chủng Salmonella sinh độc tố sinh bacteriocin chống lại E.Coli,
Shigella và ngay cả 1 số chủng Salmonella khác.
1.3.3 Cấu trúc của Salmonella
Salmonella có ba loại kháng nguyên, đó là những chất khi xuất hiện trong cơ thể thì
tạo ra kích thích đáp ứng miễn dịch và kết hợp đặc hiệu với những sản phẩm của sự kích
thích đó, gồm: kháng ngun thân O, kháng ngun tiên mao H và kháng nguyên vỏ K. Vi
khuẩn thương hàn (S.typhi) có kháng nguyên Vi (Virulence) là yếu tố chống thực bào giúp
cho vi khuẩn thương hàn phát triển bên trong tế bào bạch cầu.
-

Kháng nguyên vách tế bào (kháng nguyên thân O).
 Thành phân cơ bản là vách tế bào có cấu trúc phức tạp gồm 2 lớp. Trong cùng là

một lớp peptidoglycan mỏng, cách một lớp không gian chu chất và tới lớp màng ngoài

(outer membrane) là phức hợp lipidpolysaccharide gồm lipoprotein và lipopolysaccharide.
 Bao bên ngoài lớp peptidoglycan là lớp phospholipid A và B (quyết định độc tố của
Nội độc tố), sau đó là hai lớp polysaccharide khơng mang tính đặc hiệu. Kháng ngun của
nội độc tố có bản chất hóa học là lypopolysaccharide (LPS). Tính đặc hiệu của kháng
nguyên O và LPS là một, nhưng tính miễn dịch thì khác nhau : kháng ngun O ngồi LPS
cịn bao gồm cả lớp peptidoglycan nên tính sinh miễn dịch của nó mạnh hơn LPS. Màng
ngồi có cấu trúc gần giống tế bào chất nhưng phospholipid hầu như chỉ gặp ở lớp trong,
cịn ở lớp ngồi là lipopolysaccharide dày khoảng 8- 10 nm gồm 3 thành phần : Lipid A,
polysaccharide lõi, kháng ngun O. Màng ngồi cịn có thêm các protein: Protein cơ chất:
porin ở vi khuẩn còn gọi là protein lỗ xuyên màng với chức năng cho phép một số loại
phân tử đi qua chúng như dipeptide, disaccharide, các ion vơ cơ. Protein màng ngồi: chức
năng vận chuyển một số phân tử riêng biệt và đưa qua màng ngồi. Lipoprotein: đóng vai
trị liên kết lớp peptidoglycan bên trong với lớp màng ngồi
Kháng ngun H: Chỉ có ở các Salmonella có lơng. Hầu hết Salmonella đều có lơng
chỉ trừ S.galilarum, S.pulorum gây bệnh cho gia cầm. Kháng nguyên H là một loại kháng
nguyên có bản chất là protit, kém bền hơn kháng nguyên O. Kháng nguyên H rất dễ bịphá
huỷở nhiệt độ cao hoặc xử lý bằng cồn, axit yếu.
 Kháng nguyên H chia làm 2 phase :
6


 Phase 1: Có tính chất đặc hiệu gồm có 28 loại kháng nguyên lông được biểu thị
bằng chữa số Latinh thường: a, b, c…
 Phase 2: Khơng có tính chất đặc hiệu, loại này có thể ngưng kết với các loại khác
đơi khi thành phần này có thể gặp ở E.coli. Pha 2 gồm có 6 loại được biểu thị bằng chữa số
Ả Rập 1-6 hay chữa số La Tinh e, n, x…
 Kháng thể kháng kháng nguyên H ngưng kết vi khuẩn bởi các roi của chúng. Sự
ngưng kết này sẽ tạo thành những mảng kết tụ, chúng có thể bị tách bởi các yếu tố có khả
năng cắt roi của vi khuẩn.
 Kháng ngun H khơng có tác dụng gây bệnh, khơng gây miễn dịch, nó đặc hiệu

cho các loài vi khuẩn dựa vào kháng nguyên H để phân loại bằng phương pháp huyết
thanh.
Kháng nguyên vỏ K
 Kháng nguyên K: là kháng nguyên nằm ngoài kháng nguyên O và là nơi biểu hiện
độc tố, được cấu tạo bởi polysaccharide của vỏ ngoài vách tế bào, thường kết hợp với tính
gây độc chun biệt cho vật chủ. Nó ức chế sự biểu hiện của kháng nguyên O khi nó phát
triển nhiều, ổn định với nhiệt độ, cồn và HCl.
 Khơng phức tạp, có một kháng ngun vỏ là kháng nguyên Vi và cũng có ở 2 type
huyết thanh S.typhi và S.paratyphi. Kháng nguyên Vi-angtigen được Felix và các cộng sự
phát hiện năm 1935. Kháng nguyên Vi gây hiện tượng ngưng kết chậm và xuất hiện các hạt
vỏ, kháng nguyên Vi là kháng nguyên vỏ bao bọc bên ngoài kháng nguyên O, khánh
nguyên Vi không tham gia vào quá trình gây bệnh.

7


Hình 1.5 Vị trí của các kháng nguyên của Salmonella
1.3.4 Cơ chế gây bệnh
Salmonella có thể gây ngộ độc thực phẩm khi hiện diện đến mức cả triệu tế bào
trong một gram thực phẩm. Các triệu chứng do Salmonella gây ra thường là tiêu chảy, ói
mửa, buồn nơn. Thời gian ủ bệnh kể từ khi tiêu thụthực phẩm bị nhiễm cho đến khi các
triệu chứng được biểu hiện là 12 – 36 giờ. Triệu chứng ngộ độc thường kéo dài từ 2 – 7
ngày. Không phải tất cả mọi người khi tiêu thụ thực phẩm bị nhiễm Salmonella đều bị ngộ
độc. Các loại thực phẩm có nguy cơ bị nhiễm Salmonella cao là thịt gia cầm, sản phẩm
thịt, trứng và các sản phẩm từ trứng, thủy sản. Nguồn gây nhiễm các loại thực phẩm này
thường là phân người và động vật, được nhiễm gián tiếp hay trực tiếp. Đặc biệt nguy hiểm
cho người là các loài Salmonella typhi, S.paratyphi A, B, C gây sốt thương hàn.

8

Hình 1.6 Các chủng Salmonella và các biểu hiện bệnh thường gặp

1.3.5 Ng̀n gớc lây bệnh
Các sản phẩm thịt nói chung, nhất là thịt gia cầm và thịt lợn. Tất cả các thức ăn tươi
sống có nguồn gốc động vật đều có thể là nguồn vi khuẩn Salmonella. Vi khuẩn này sống
tự do trong ruột động vật và có trên lơng. Gia cầm có nhiều Salmonella nhất, tiếp theo là
các động vật nuôi trong nhà và động vật hoang (vẹt, rùa, chó, ếch, chim mơng biển, lồi
gặm nhấm, rắn). Vi khuẩn này có thể có trong thành phần dẫn xuất các chất từ động vật
như gelatin hoặc nước bọt động vật, bởi cơn trùng, lồi gặm nhấm, chim hoặc các sản
phẩm thịt nhiễm khuẩn gây nhiễm vào thực phẩm.
Ngoài ra có thể bị nhiễm từ người khỏe mạnh có mang vi khuẩn này. Thực phẩm có
nguồn gốc thực vật ít có nguy cơ nhiễm khuẩn. Vì lí do bị ức chế bởi pH < 4 và có mặt vi
khuẩn lactic nên các sản phẩm lên men ít bị nhiễm. Trứng và các sản phẩm trứng ví dụ như
bột nhào, nước sốt mayonnaise, protit đông tụ tách từ sữa, gia cầm là nguồn mang nhiều
Salmonella, nên trứng của nó cũng bị nhiễm vì vi khuẩn này có thể xun qua vỏ trứng và
sinh sản trong lòng đỏ trứng.
Các sản phẩm sữa như sữa không thanh trùng, phomát từ sữa tươi, kem chất béo
sữa, và các sản phẩm từ sữa nói chung được chế biến từ các nông trại, các thiết bị đều có
9


thể gây nhiễm vào nguyên liệu, tạo môi trường thuận lợi cho Salmonella, và từ đó gây
nhiễm độc cho sản phẩm sữa. Nếu tiến hành axit hóa chậm thì vi khuẩn dễ dàng sinh sản
trong phomát nhưng nó bị phá hủy với pH < 4,5. Những sản phẩm có sữa phải được giám
sát chặt chẽ bởi chúng không được thanh trùng nữa, vì vậy nếu có Salmonella trong sữa bột
thì chúng vẫn có thể sinh sản được bởi chúng có khả năng tồn tại ở điều kiện khô hạn và
lây nhiễm sang các sản phẩm khác

1.3.6 Tình hình nhiễm Salmonella trong nước và trên thế giới

1.3.6.1 Trong nước
Theo ông Nguyễn Công Khẩn, Cục trưởng Cục ATVSTP cho biết, hiện nay, mạng
lưới kiểm nghiệm ATVSTP đã được hình thành rộng khắp trong cả nước nhưng thực tế
năng lực kiểm nghiệm nhiều chỉ tiêu về an toàn thực phẩm tại các địa phương vẫn rất hạn
chế. Trong 330 mẫu hoa quả có tới 2,7% số mẫu có tỷ lệ tồn dư thuốc bảo vệ thực vật cao,
nhất là ở táo đỏ, quýt và lê. Đặc biệt, trong số 1.416 mẫu thịt và sản phẩm từ thịt đã phát
hiện tới 40,9% số mẫu nhiễm khuẩn Salmonella gây ra các bệnh về đường tiêu hóa. Hơn
nữa, khu vực TP Hồ Chí Minh và Đồng Nai là những địa phương có tỷ lệ mẫu thực phẩm
nhiễm Salmonella cao nhất, chiếm từ 84- 95% mẫu được giám sát.
1.3.6.2 Trên thế giới
Tỷ lệ nhiễm Salmonella ở châu Âu giảm đều đặn từ những năm 1990 trở lại đây,
trong năm 2007 có khoảng 152.000 ca nhiễm Salmonella trên người được phát hiện, sự sai
lệch của báo cáo này là rất lớn, số lượng thực tế rất có thể gấp 10 lần như thế. Ở Mỹ, tình
trạng có khá hơn, ổn định ở mức 15 ca trên 100.000 người từ năm 2001 do kiểm soát tốt
Salmonella trong thực phẩm từ năm 1990, bao gồm các thực phẩm sữa, trứng, nước trái
cây, sản phẩm tươi sống, rau, bánh kẹo, và đặc biệt là thịt.Một đợt dịch gần đây ở Mỹ gây
ra bởi S.typhimurium nhiễm trong bơ đậu phộng đã gây ảnh hưởng đến hơn 700 người trên
khắp nước Mỹ
10


Từ tháng 7/2009 tới nay, số ca nhiễm khuẩn Salmonella được phát hiện ở Mỹ đã
tăng lên 184 người, thuộc 38 bang khác nhau. Cơ quan y tế của nước này vẫn chưa xác
định nguyên nhân chính xác khiến số ca nhiễm khuẩn Salmonella tăng nhanh như vậy. Tuy
nhiên, mới đây các chuyên gia y tế của bang Oregon cho rằng nguồn lây lan vi khuẩn
Salmonella từ các sản phẩm xúc xích.Vừa qua, các cơ quan điều tra Mỹ đã thu hồi hơn 560
tấn xúc xích do nghi bịnhiễm vi khuẩn Salmonella, tất cả số lượng này đều do Công ty
Daniele International sản xuất.Tuy nhiên, ông Jason Maloni, phát ngôn viên của cơng ty
này khẳng định: “Chưa có bằng chứng nào chứng minh các sản phẩm xúc xích của chúng
tơi bị nhiễm vi khuẩn Salmonella”. Sự bùng nổ của số ca nhiễm khuẩn Salmonella ở khu

vực tây bắc Thái Bình Dương đã khiến các cơ quan điều tra nghi ngờ rằng nguồn gây bệnh
cho ổ dịch này là từ các sản phẩm xúc xích sau khi họ phát hiện rất nhiều người ăn xúc
xích mua tại các cửa hàng ở khu vực này bịnhiễm khuẩn Salmonella. Các nhân viên điều
tra tại bang Washington cũng cho biết 14 bệnh nhân bị nhiễm khuẩn Salmonella ở bang
này, đã từng ăn xúc xích của hãng Daniele. Ngoài ra, các chuyên gia y tế khẳng định họ đã
kiểm tra và phát hiện khuẩn Salmonella có trong các mẫu xúc xích của cơng ty này. Hiện
tại, các nhân viên điều tra liên bang Mỹ vẫn đang làm việc để tìm ra ngun nhân chính
xác gây ra dịch nhiễm khuẩn Salmonella ở nước này. Vì thế, họ vẫn chưa thể kết luận sản
phẩm xúc xích của Cơng ty Daniele có phải là nguồn lây bệnh chính hay khơng. Vì thế,
những sản phẩm xúc xích của cơng ty này bị thu hồi là do kiểm tra bịnhiễm khuẩn
Salmonella.
1.3.7 Các chỉ tiêu Salmonella trong thực phẩm
Hầu hết các tiêu chuẩn an toàn vệ sinh thực phẩm của Việt Nam cũng như các nước
trên thế giới đều không cho phép sự có mặt của Salmonella trong thực phẩm. Vì vậy các
phương pháp phân tích Salmonella là quy trình định tính trong một lượng mẫu thực phẩm
nhất định. Sự hiện diện của chúng được kiểm tra gắt gao bởi các cơ quan chức năng. Theo
tiêu chuẩn cho phép vi sinh vật hiện diện trong thực phẩm của Bộ Y tế 4/1998, quy định
không chấp nhận sự hiện diện của Salmonella trong 25 g hay 25 ml đối với tất cả các loại
thực phẩm. Theo thông tư đã ban hành số 01/2000/TT – BYT của Bộ Y tế đối với thực
11


phẩm sản xuất trong nước thì chỉ tiêu Salmonella bắt buộc phải kiểm tra đối với tất cả các
loại thực phẩm .Ủy Ban Châu Âu quy định không được phát hiện Salmonella /25 g trong
bất kỳ loại thực phẩm nào.
Theo phương pháp truyền thống việc phát hiện Salmonella bao gồm những bước
như tiền tăng sinh, tăng sinh chọn lọc, các thử nghiệm sinh hóa và cuối cùng là thử nghiệm
huyết thanh, tính chung mất khoảng 7 ngày để có kết quả.Hiện nay đã có nhiều nỗ lực để
rút ngắn thời gian phát hiện Salmonella bằng những phương pháp như thử nghiệm ELISA,
và thử nghiệm DNA. Việc khẳng định kết quả âm tính trong vịng 48 giờ đã là chuyện bình

thường. Tuy nhiên một khi mẫu có khả năng dương tính, cần tiến hành các thao tác truyền
thống để khẳng định sự có mặt của Salmonella.
Trong các yêu cầu về vi sinh đối với thực phẩm, Salmonella là một chỉ tiêu đặc biệt
nhạy cảm, do tính chất gây bệnh của một số kiểu huyết thanh của Salmonella.
Yêu cầu của kiểm tra bắt buộc đối với Salmonella trong các loại thực phẩm theo
Thông tư 01/2000/TT-BYT của Bộ Y tế

Chương II. Quy trình phân tích vi sinh vật Salmonella
2.1 Thu và bảo quản mẫu thực phẩm
12


2.1.1 Lấy mẫu theo lơ hàng :
Thơng thường vị trí lấy mẫu như sau: lô hàng  mẫu chung mẫu trung bình  mẫu
phân tích (cảm quan, kháng sinh, vi sinh)
2.1.2 Lấy mẫu theo dây chuyền sản xuất :
Khi tiến hành thu mẫu thì ở cơng đoạn ngun liệu và thành phẩm là bắt buộc, trong
khi đó giai đoạn bán thành phẩm thì tuỳ từng loại mặt hàng sản phẩm mà sẽ có các cơng
đoạn khác nhau và số lượng cơng đoạn cũng nhiều ít khác nhau. Khơng thể thu hết tất cả
các công đoạn ở giai đoạn bán thành phẩm mà chỉ thu ở 2 công đoạn liên tiếp trong một lần
thu mẫu.
2.1.3 Thu mẫu vệ sinh công nghiệp :
Là thu mẫu trong quá trình sản xuất chế biến của công nhân, các dụng cụ sản xuất cũng
như vệ sinh, đồ bảo hộ lao động của công nhân như găng tay, yếm, ủng, … các máy móc
trực tiếp sản xuất nhằm xác định có sự lây nhiễm hay khơng.
2.1.4 Thu mẫu ở cửa hàng hoặc chợ :
Chủ yếu dựa vào kinh nghiệm và sự quan sát của người thu mẫu. Khi thu mẫu cần
mang tính đại diện và đảm bảo không bị tạp nhiễm.
2.1.5 Dụng cụ lấy mẫu
Thường là thùng nhựa, sử dụng bao nylon để chứa mẫu. Không dùng các bình thuỷ tinh

vì dễ vỡ làm nhiễm mẫu hay gây tai nạn cho người thu mẫu. Các dụng cụ thu mẫu như dao,
kéo, … đã được khử trùng.
2.1.6 Bảo quản và vận chuyển :
-

Các mẫu sau khi được lấy bảo quản tách biệt nhau trong thùng chứa mẫu, được giữ lạnh
bằng các bao nước đá. Tại phòng kiểm nghiệm , mẫu được chuyển tủ đơng và được
phân tích ngay trong thời gian có thể.

-

Nếu khơng phân tích ngay được, mẫu phải được bảo quản ở -20 0C cho đến khi phân
tích. Nếu mẫu khơng thể bảo quản đơng, có thể bảo quản ở 4 0C nhưng khơng q 36h.
Các loại đồ hợp, thực phẩm có độ ẩm thấp hay khó hư có thể bảo quản ở nhiệt độ
phịng.

2.1.7 Chuẩn bị mẫu thực phẩm :

13


-

Rã đơng trong điều kiện vơ trùng, nhiệt độ có thể là 2 – 5°C trong 18h, nếu cần nhanh
có thể ở nhiệt độ phòng trong 2h hoặc 45°C trong 15phút.

-

Cân một lượng mẫu xác định để phân tích tuỳ theo từng chỉ tiêu yêu cầu, sai số cho
phép là ± 0,1g. Lượng mẫu phân tích cho vào các bình chứ bằng nhựa hoặc bao nylon

vô trùng.

-

Sau khi cân mẫu và cho dung dịch pha loãng vào mẫu, tiến hành đồng nhất mẫu để đảm
bảo sự phân phối của vi sinh vật vào dịch pha loãng thật đồng đều.

2.2 Sơ đồ phân tích tổng quát vi sinh vật Salmonella
14


2ỦHú5ởgt mẫn0 h,1iumệ+tl2mẫ5 um tlăBPn g Wsin-h> cđhồon vgànohốấnt gmẫ u
ỦCấtCấroởyyn gnvchhà3iuo0ệytmơgểinâ yista-rn>ưgờđnmơộgptihtaửrưlnoờgãhnigệm1 0sin h h ó a: T S I, L D C, Man ito l
đCấKLnđ ộgộ hy34iđ72ệcặmhcucyhểứn a 1 0 m l mô i trư ờ n g R V S
ỦpXLKếĐọhởetcDnlko,uếlủậtrneởq:dun,PảhUrtirệáêetnađh,ộicáệ3ann7môhh atryiytprưtoờn ,gMR-th ử V P
ts3ra7ưnnggTcSủAa
nkghhôinệgm pshináht hh ióệan
2.3 Phương pháp trùn thớng ( Phương pháp ni cấy )
15


2.3.1 Nguyên tắc xác định
Phương pháp truyền thống mất khá nhiều thời gian (5 ngày) để cho ra kết quả, do đó
người ta đã phát triển rất nhiều phương pháp thử nhanh để phát hiện Salmonella trong các
mẫu thực phẩm và mẫu nước trong thời gian ngắn, từ đó có biện pháp xử lý kịp thời đối
với các mẫu nhiễm. Xu hướng sử dụng PCR và IMS thường được sử dụng. Phương pháp
PCR giúp phát hiện nhanh; tuy nhiên dễ xảy ra hiện tượng âm tính giả, địi hỏi các thao tác
phải thành thạo. Multiplex PCR giúp tiết kiệm thời gian, số lượng mẫu và chi phí; tuy
nhiên lại có độ nhạy kém hơn. Người ta đã phát triển thêm phương pháp Real Time PCR từ
PCR truyền thống. Phương pháp này có độ nhạy rất cao, cho kết quả sớm hơn, không cần

phải chạy điện di sau phản ứng khuếch đại. Phương pháp miễn dịch từ phân tách là một lựa
chọn tốt hơn. Nó có độ nhạy cao (< 104 CFU/ml), thời gian ngắn (thí nghiệm được thực
hiện trong 4-5 giờ).
Bên cạnh những kỹ thuật Sinh học phân tử cơ bản để phát hiện và định danh
Salmonella, cịn có những phương pháp khác, như: phương pháp miễn dịch (huyết thanh
học, kỹ thuật ELISA, Western blot). Và đôi khi để tăng hiệu quả, độ tin cậy cho xét nghiệm
người ta còn kết hợp nhiều phương pháp với nhau, ví dụ: IMS-PCR assay
(Immunomagnetic Separation and Polymerase Chain Reaction) để phát hiện Salmonella
trong thực phẩm.
Salmonella có thể được phát hiện ( phân tích định tính ) bằng một quy trình bao
gồm 4 bước là tăng sinh, tăng sinh chọn lọc, phân lập và khẳng định. Salmonella thường có
mặt trong mẫu với một số lượng nhỏ, bị tổn thương và cùng hiện diện chung với một số
lượng lớn vi sinh vật thuộc họ Enterobacteriaceae có tính cạnh tranh mạnh vàức chế sự
tăng trưởng của Salmonella.

2.3.2 Môi trường nuôi cấy
16


Bao gồm những loại môi trường thông dụng để nuôi cấy, phân lập và khẳng định
Salmonella trong thực phẩm:
 Môi trường Buffered Pepton Water (BPW): được sử dụng để tiền tăng sinh
Salmonella hiện diện trong mẫu. Thành phần môi trường gồm: peptone 10 g/l, NaCl 5 g/l,
Na2HPO4.12H2O 9 g/l, KH2PO4 1,5 g/l, hấp khử trùng ở 1210C trong 15 phút, pH sau khi
khử trùng là 7.
 Môi trường Rapparport Vassiliadis broth (RV): được sử dụng để tăng sinh chọn lọc
cho Salmonella. Thành phần môi trường như sau: peptone đậu nành 4,5 g/l, MgCl2.6H2O
29 g/l, NaCl 8 g/l, K2HPO4 0,6 g/l, malachite green oxalate 0,036 g/l, pH 5,5 0,2. Phân
phối 10ml môi trường vào ống nghiệm. Hấp khử trùng ở 1150C trong 15 phút.
 Môi trường Xylose Lysine Desoxycholate agar (XLD): được dùng để phân lập

Salmonella. Thành phần XLD bao gồm: cao nấm men 3 g/l, L – Lysine HCl 5 g/l, xylose
3,75 g/l, lactose 7,5 g/l, sucrose 7,5 g/l, sodium desoxycholate 1 g/l, NaCl 5 g/l, Na2S2O5
6,8 g/l, ammonium ferrous (II) citrate 0,8 g/l, phenol red 0,8 g/l, agar 18 g/l, pH cuối là 7,4
0,2. Đun sôi môi trường, không hấp. Để nguội đến 50 0C. Môi trường đỗ trên đĩa petri và để
khô trước khi cấy.
 Môi trường Tryptic Soya Agar (TSA): được sử dụng để bảo quản và phục hồi giống
vi sinh vật trong q trình thí nghiệm. Thành phần TSA gồm: tryptone 15 g/l, peptone đậu
nành 5 g/l, agar 15 g/l. Đun nóng để hịa tan agar trong cốc bercher, phân phối vào các ống
nghiệm khoảng 5 – 7 ml. Hấp khử trùng ở 121 0C trong 15 phút, pH sau khi khử trùng là
7,3. Sau đó để nguội khoảng 50 – 600C rồi để thạch nghiêng.
 Môi trường Triple Sugar Iron Agar (TSI) gồm môi trường 1 có thành phần như sau:
peptone 20 g/l, NaCl 5 g/l, lactose 10 g/l, sucrose 10 g/l, glucose 1 g/l,
Fe(NH4)2(SO4)2.6H2O 0,2 g/l, Na2S2O3 0,2 g/l, phenol red 0,025 g/l, agar 13 g/l và môi
trường 2 gồm các thành phần như sau: cao thịt 3g/l, cao nấm men 3g/l, peptone 15g/l,
proteose peptone 5 g/l, glucose 1 g/l, lactose 10 g/l, sucrose 10 g/l, FeSO4 0,2 g/l, NaCl 5
g/l, Na2S2O3 0,3 g/l, phenol red 0,024 g/l, agar 12 g/l. Phân phối vào các ống nghiệm, mỗi
ống 7 ml. Hấp khử trùng ở 121 0C trong 15 phút, sau đó đợi nguội khoảng 50 – 60 0C để
nghiêng phần thạch sâu ở đáy ống cao 2,5 cm.
17


 Môi trường Lysine Decarboxylate broth (LDC): được sử dụng để thử nghiệm khả
năng sinh enzyme lysine decarboxylase của Salmonella. Thành phần môi trường như sau:
peptone 5 g/l, cao nấm men 3 g/l, dextrose 1 g/l, L-Lysine HCl 10 g/l, ferric (II)
ammonium citrate 0,5 g/l, Na2S2O5 0,04 g/l, bromocresol purple 0,016g/l, pH 6,7.
 Môi trường Urea broth: được dùng để thử nghiệm khả năng thủy phân urea của
Salmonella. Thành phần môi trường như sau: cao nấm men 0,1 g/l, KH2PO4 9,1 g/l,
Na2HPO4 9,5 g/l, urea 20 g/l, phenol red 0,08 g/l, pH 6,8.
 Môi trường Dulcitol phenol red broth: được sử dụng để thử nghiệm khả năng lên
men đường dulcitol của Salmonella. Thành phần mơi trường gồm có: peptone thịt 5 g/l,

peptone đậu nành 5 g/l, dulcitol 10 g/l, NaCl 5 g/l, phenol red 0,018 g/l, pH sau khi thanh
trùng là 7,4.
 Môi trường Lactose agar 1%: được sử dụng để cảm ứng tạo ra enzyme β galactosidase dùng trong thử nghiệm ONPG. Thành phần môi trường như sau: lactose 10
g/l, peptone 5 g/l, cao thịt 3 g/l, NaCl 10 g/l, agar 15 g/l. Đĩa giấy ONPG: được sử dụng để
thử nghiệm ONPG về khả năng tổng hợp enzyme - galactosidase. Mỗi đĩa được phân phối
vào mỗi ống nghiệm chứa 0,5ml nước cất đã vô trùng. Đĩa giấy ONPG. được sản xuất bởi
hãng Biorad dạng thương phẩm.

2.3.3 Quy trình xác định

18


TPK
nSslẳ
sbcnđ
hldh

hă h nâ ẳ ng n
ậ i n g a n p gl h m v
i hằhị n n ọnậ gn
ọ ui cệ y n ế

ào

g
k

t

đ ị n
n e l l
h á n
t h a n

h
a
g
h

2.3.4 Thuyết minh quy trình
2.3.4.1 Tăng sinh
Đối với các loại mẫu thông thường, tiến hành cân 25g mẫu vào túi PE vô trùng, bổ
sung 225ml dung dịch BPW và đồng nhất mẫu trong 15 hoặc 30 giây. Ủ ở 370C trong 18 24 giờ. Đối với một số loại mẫu có chứa các chất gây độc hoặc ức chế sự phát triển của
Salmonella cần tiến hành quy trình đặc biệt :
-

Đối với thịt gia cầm tươi sống : Đặt gia cầm vào một túi PE lớn, cho thêm 1 lít

BPW, lắc bằng máy lắc 30 giây để mơi trường thấm vào tồn bộ mẫu
Đối với mẫu sữa khô : Cân 25g mẫu vào túi PE vô trùng, cho thêm 225ml BPW, để
yên ở nhiệt độ phịng khoảng 60 phút. Sau đó lắc cho tan hồn toàn.
Đối với các mẫu gia vị hay các loại thực phẩm chứa nhiều gia vị : đồng nhất mẫu
với tỷ lệ 1/100 trong BPW ( thay vì 1/10 như bình thường ) trước khi tăng sinh. Biện pháp
này nhằm giảm nồng độ các chất ức chế sự tăng trưởng của Salmonella trong bước tăng
sinh
-

Đối với các loại mẫu như casein, phomat, bơ và các sản phẩm tương tự khác : thực

hiện đồng nhất mẫu trong môi trường tăng sinh đã được làm ấm đến 400C
Đối với các sản phẩm chứa coca: đồng nhất mẫu trong môi
19


-

trường Skim Milk Broth được làm ấm đến 400C
Đối với dừa, các sản phẩm từ dừa và các mẫu có hàm lượng chất béo cao: đồng nhất

mẫu trong môi trường BPW, sau đó cho thêm 2– 3 giọt Triton X –100 trước khi ủ tăng
sinh.
2.3.4.2 Tăng sinh chọn lọc
Lắc để trộn đều dịch tăng sinh, sau đó chuyển 0,1ml sang 10ml môi trường tăng
sinh chọn lọc RV đã được ủ ấm đến 420C. Ủ ở 420C trong 18 – 24 giờ, khi cần thiết có thể
kéo dài ủ thêm 24 giờ
Một số môi trường tăng sinh chọn lọc khác cũng được sử dụng, mỗi loại mơi trường
chỉ có tác dụng chọn lọc dựa trên một đặc điểm phát triển của Salmonella, một số dịng chỉ
có thể tăng trưởng trong mơi trường này mà không thể tăng trưởng trong môi trường khác.
Do vậy, để tăng khả năng phát hiện tất cả các dòng Salmonella hiện diện trong thực phẩm
cần phải dùng ít nhất hai loại tăng sinh chọn lọckhác nhau cho cùng một mẫu. Ngồi ra
mỗi mơi trường cần được ủ ở các nhiệt độ khác nhau
2.3.4.3 Phân lập và nhận diện
Dùng que cấy vòng thực hiện kỹ thuật cấy phân lập khuẩn lạc đơn với giống từ dịch
tăng sinh chọn lọc trên đĩa môi trường phân lập đặc trưng cho Salmonella như XLD, HE,
BS… Cường độ chọn lọc và mức độ phân biệt thể hiện ở hình thái của khuẩn lạc
Salmonella trên từng môi trường cũng khác nhau. Để chọn lọc và nhận dạng tất cả các
dòng Salmonella cần sử dụng ít nhất hai loại mơi trường chọn lọc phân biệt khác nhau cho
cùng một mẫu. Các biểu hiện của Salmonella trên từng môi trường khác nhau như sau:
Môi trường XLD: khuẩn lạc trịn, lồi, trong suốt, có hay khơng có tâm đen, đơi khi

tâm đen q lớn bao trùm khuẩn lạc, môitrường xung quanh chuyển sang màu hồng.

20


-

Mơi trường HE: khuẩn lạc có màu thay đổi từ xanh dương đến xanh lục, có hay

khơng có tâm đen, đôi khi tâm đén quá lớn bao trùm khuẩn lạc.

-

Môi trường BS: khuẩn lạc có màu nâu xám hay màu đen, thỉnh thoảng có ánh kim

tím, mơi trường chuyển thành màu nâu và sau đó chuyển sang màu đen nếu kéo dài thời
gian ủ.

21


2.3.4.4 Khẳng định
Từ mỗi môi trường phân lập cấy chuyển ít nhất 5 khuẩn lạc đặc trưng qua môi
trường không chọn lọc như TSA. Ủ ở 370C trong 18 – 24 giờ. Các khuẩn lạc đặc trưng trên
môi trường này được sử dụng cho các test sinh hóa và huyết thanh
Các thử nghiệm sinh hóa chính cần thực hiện cho Salmonella là: lên men glucose,
urea, manitol, indol, H2S, VP, ODC, LDC, saccharose, sorbitol.
Các chủng Salmonella cho kết quả thử nghiệm như sau :
 Thử nghiệm H2S (KIA hay TSI): Thử nghiệm khả năng lên men lactose, glucose và


sinh khí H2S.
Về nguồn carbon, môi trường KIA chứa 2 loại đường là 1% lactose và 0.1%

glucose. Khi cấy chủng vi sinh vật lên mơi trường này có 3 trường hợp xảy ra đối với sự
tăng trưởng của VSV: chỉ sử dụng glucose, sử dụng glucose và lactose, không sử dụng cả
hai đường này. Salmonella chỉ lên men được đường glucose vì thế phần nghiêng của mơi
trường có màu đỏ, phần sâu có màu vàng. Thời gian ủ từ 18-24 giờ.
 Về sinh hơi: đa số các dịng Salmonella đều có khả năng sinh H2S nên có xuất hiện
các vệt màu đen trong mơi trường này. Có thể thấy hiện tượng sinh hơi qua hiện tượng làm
vỡ thạch môi trường hoặc môi trường bị đẩy lên trên tạo một khoảng không bên dưới đáy
ống nghiệm.

22


Hình 2.1 Thử nghiệm KIA.
Ống 1: môi trường KIA không có VSV.
Ống 2: xuất hiện màu vàng chứng tỏ VSV lên men lactose tốt (lên men glucose cũng tốt).
Ống 3: có sinh khí, chứng tỏ lên men có sinh khí.
Ống 4: màu đỏ trên phần thạch nghiêng, màu vàng dưới đáy chứng tỏ VSV chỉ lên men
glucose.
Ống 5: màu đen xuất hiện chứng tỏ có q trình khử lưu huỳnh và sinh H2S.

Thử nghiệm khả năng tổng hợp enzyme lysine decarboxylase (thử nghiệm LDC):
dùng que cấy vòng chuyển sinh khối từ môi trường TSA sang môi trường LDC broth. Ủ ở
37oC trong 24 giờ, Salmonella cho phản ứng kiềm có biểu hiện LDC dương tính khi mơi
trường có sinh khối và chuyển sang màu tím hoặc màu xanh.

23