BÀI 2 DNA REPLICATION

BÀI 2

SAO CHÉP DNA
(DNA replication)


Thí nghiệm Meselson và Stahl
Vi khuẩn Escherichia coli cung cấp nguồn nitơ duy

nhất là amoni sẽ tạo nên các nucleotide thuộc nhóm purine
và pyrimidine

 Tiến hành
- Ni vi khuẩn Escherichia coli trong mơi trường có N15

(nitơ nặng)
- Chuyển vi khuẩn sang mơi trường có N14 (nitơ nhẹ)

+ Ly trích ADN và ly tâm trong CsCl sau 20 phút (lần 1)
+ Ly trích ADN và ly tâm trong CsCl sau 40 phút (lần 2)
2
+ Ly trích ADN và ly tâm trong CsCl sau 60 phút (lần 3)


Thí nghiệm Meselson và Stahl

3


 Kết quả
- Ly tâm lần 1 (20 phút đầu) trong ống chỉ có 1

vạch ở đáy ống nghiệm ứng với N15
- Ly tâm lần 2 trong ống tạo 1 vạch có tỉ trọng trung
gian giữa N15 và N14

N14.5 (ADN lai)

- Ly tâm lần 3 tạo 2 vạch (vạch N14.5 và vạch N14)

4


5


Chiều sao chép DNA
- Trên cả 2 mạch của DNA (mạch khuôn 3’-5’ và mạch bổ sung 5’-3’)

- DNA polymerase xúc tác cho q trình polymer hóa gắn Nu vào nhóm
3’-OH



CƠ CHẾ SAO CHÉP DNA
- ADN khuôn mẫu (DNA template)

- 4 loại dNTP (A, T, G, C) có trong tế bào
- Enzyme ADN polymerase: xúc tát thêm các nucleotide vào mạch ADN

theo hướng 3’ – 5’
- Ion Mg2+ cần thiết cho sự hoạt động của enzyme ADN polymerase.

DNA sao chép theo 2 kiểu: sao chép 2 chiều (DNA vòng, DNA thẳng,
phage T7) và sao chép kiểu vòng xoay (virus)
8


3.1. Cơ chế sự sao chép ADN ở prokaryote
3.1.1. Cơ chế sự sao chép ADN ở E.coli gồm 7 bước

Khởi đầu

Kéo dài

Kết thúc

- Vị trí khởi đầu (origin) lan dần theo 2 hướng đến khi đụng nhau tại điểm đối
diện của ori
- Vùng DNA được sao chép từ 1 origin gọi là đơn vị sao chép (replicon)
9


ADN polymerase cần có ARN primer để hoạt động
10


ADN polymerase tế bào nhân sơ
TÊN

LOẠI

CHỨC NĂNG

ADN polymerase

I

Sửa chữa ADN hư hỏng

ADN polymerase

II

Tái khởi động chạc ba sao chép
khi nó bị tổn thương trong ADN

ADN polymerase

III

Là enzyme replicase có vai trò sao
chép

11


ADN polymerase tế bào nhân thật

Polymerase

α

β

γ

ε

Mr (kDa)
Đơn vị nhỏ

350
4

39
1

200
2

350
4

Vị trí
Chức năng

Nhân
Khởi đầu sao
chép ADN
nhân

Nhân
Sửa chữa

Ty thể
Sao chép
ADN ty thể

Nhân
Sao chép
ADN nhân

12


Khởi đầu
- Xảy ra theo hướng 3’ – 5’ (sợi khuôn)
B1: Protein B nhận ra điểm khởi đầu sao chép (Ori)

B2
- Enzyme topoisomerase tháo xoắn tách rời

- Enzyme helicase cắt đứt liên kết H tách rời 2 mạch,
tạo chạc sao chép hình chữ Y.

- Protein SSB làm căng mạch
13


Kéo dài
B3: Cần có đoạn mồi (ARN primer)

B4 và 5
- Enzyme ADN polymerase III xúc tác gắn từng nucleotide bổ
sung với nucleotide trên sợi khuôn (3’ – 5’) làm sợi này dài ra
và sự tổng hợp diễn ra liên tục theo hướng 5’ – 3’
sợi liên tục (leading strand)
- Sợi cịn lại được tổng hợp từ phía trong chạc chữ Y ra ngoài
(3’ – 5’). Sự tổng hợp này tạo các đoạn okazaki

sợi

không liên tục (lagging strand)
14


Kết thúc
B6: ADN polymerase I cắt bỏ mồi
B7: Enzyme ligase nối các đoạn okazaki thành sợi liên tục
Chú ý
+ Tổng hợp sợi liên tục được chỉ cần 1 đoạn mồi
+ Sợi khơng liên tục mỗi đoạn okazaki cần có 1 đoạn
mồi.

15


Cấu trúc theta (θ)

16

Sao chép ADN vịng tạo ra cấu trúc theta, hình
thành bởi hai chạc ba sao chép xuất phát từ một vị trí Ori.
Sự tổng hợp ADN được tiến hành theo cả hai chiều thuận
và ngược kim đồng hồ cùng một lúc.
Để tạo ra các sợi đơn ADN, hai sợi ADN gốc phải vặn xoắn
(quay). Cứ mỗi 10 base được sao chép thì phân tử ADN
phải vặn xoắn 1 vịng.

Siêu xoắn âm và siêu xoắn dương
17


Vai trị các enzyme trong q trình sao chép DNA
+ Protein B: nhận dạng điểm khởi đầu sao chép
+ Topoisomerase: tháo xoắn DNA
+ Helicase (gyrase): cắt đứt liên kết hidro, tách rời 2 mạch
+ SSB: làm căng mạch
+ primase: tổng hợp RNA mồi (primer)
+ DNA polymerase III: liên kết nucleotide vào mạch khuôn
+ DNA polymerase I: cắt bỏ mồi, bổ sung nucleotide
+ Ligase: nối các nucleotide
18


3.1.2. Sự sao chép DNA ở tế bào nhân thật (eukaryote)

Có nhiều điểm khởi đầu sao chép. Sự sao chép DNA xảy ra đồng thời tại nhiều điểm
19

20


Các bước sao chép DNA ở eukaryote
- DNA polymerase δ tổng hợp mạch nhanh

- DNA polymerase α tổng hợp mạch chậm
- DNA polymerase α liên kết primase hình thành phức hợp DNA poly α
–primase. Mạch chậm thắt nút tại chạc ba sao chép giúp polymerase di
chuyển theo hướng của chạc ba giống prokaryote.


(PCNA = proliferating cell nuclear antigen = kháng nguyên tăng sinh nhân tế bào)


4. Sự sao chép DNA tại đầu mút NST Eukaryote
Telomere: tận cùng DNA ở 2 đầu 3’ (DNA cũ) vẫn còn tồn tại 1 mồi
chưa được thay thế. Mồi được loại bỏ mà không được thay thế do sự
khiếm khuyết của DNA polymerase khi khơng có khả năng tạo đầu 3’OH.
2 đầu DNA bị ngắn lại 1 đoạn tương ứng với chiều dài của mồi sau
mỗi lần nhân đơi.

“Trình tự lặp lại của DNA ở các đầu mút NST không mã hóa protein”


Đặc điểm telomere
- Trên DNA mạch thẳng telomere tạo thành từ những trình tự giàu G.

- Ở người và động vật có xương sống mang những đoạn lặp lại nhiều
lần của trình tự gồm 6 base là 5’-TTAGGG-3’ trên một mạch và mạch

bổ sung 3’-AATCCC-5’ (chiều dài 10-15kb)
- Cuối telomere đầu nhô 3’-G. Ngay sau vùng lặp lại TTAGGG thêm 1
đoạn gồm 150-200 nu giàu G nhô ra ở đầu mạch 3’. Phần này gấp lại
và lk với vùng mạch kép của đoạn trình tự lặp lại tạo thành vịng
telomere lớn gọi là T-loop và D-loop.