nghiên cứu các phương pháp phân tích cây thuốc lá chuyển gen kháng bệnh khảm lá thế hệ t1

Đề tài

"Nghiên cứu các
phương pháp phân
tích cây thuốc lá
chuyển gen kháng
bệnh khảm lá thế
hệ T1"
1

MỞ ĐẦ U
Cho tới nay đã có khoảng 2000 loại virus hại thực vật được phát hiện, trong đó
có nhiều loài gây ảnh hưởng nghiêm trọng tới năng suất và chất lượng cây trồng.
Để hạ n chế sự lây lan củ a virus thự c vậ t , nhữ ng biệ n phá p truyề n thố ng đang đượ c
áp dng hi ện nay như loạ i bỏ nhữ ng cây bị bệ nh ngay khi mớ i phá t hiệ n , phun
thuố c diệ t môi giớ i truyề n bệ nh…t ỏ ra kém hiệ u quả l ại đò i hỏ i nhiề u thờ i gian ,
công sứ c và ả nh hưở ng xấ u tớ i môi trườ ng. Việ c tì m ra cá c biệ n pháp đ ngăn chn
sự phá t triể n và lây lan củ a virus gây b ệnh trên thự c vậ t đang là mộ t vấ n đề đượ c
quan tâm nghiên cứu. Sự phát trin mạnh mẽ của công nghệ sinh học trong thời
gian gần đây thúc đẩy nhiều nghiên cứu theo hướng tạo giống cây trồng có khả
năng kháng virus gây hại bằng công nghệ gen, góp phần phát trin một xu thế mới
trong công cuộc phòng chống bệnh hại thực vật.
Cng với sự phát trin của công nghệ sinh học, đã có nhiề u ứ ng dụ ng sinh họ c

phân tử trong chọ n tạ o giố ng cây trồ ng khá ng virus , trong đó , công nghệ RNA
interference (RNAi) tỏ ra là một giải pháp hu hiệu nhất thông qua việc s dng
các vật liệu di truyền t virus gây bệnh chuyn vào cây trồng tạo cây chuyn gen
kháng chnh virus đó với hiệu quả có th lên tới 80-95%.
Ở Việt Nam gần đây đã có một số nghiên cứu theo hướng ứng dng kỹ thuật RNAi
trong tạo giống cây trồng chuyn gen chống lại các bệnh do virus gây ra. Phòng
Công nghệ tế bào thực vật – Viện Công nghệ sinh học là nhóm nghiên cứu đầu tiên
ở Việt Nam đã thành công trong việc ứng dng kỹ thuật RNAi trên mô hình cây
thuố c lá chuyn gen kháng virus khảm dưa chuột (CMV), kháng virus khảm thuốc
lá (TMV) hoc kháng đồng thời cả 2 loại virus trên. Nhằm tiếp tc phân tích các
đc tính di truyền của gen chuyn ở thế hệ sau, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề
tài: “Nghiên cứ u cá c phương phá p phân tí ch cây thuố c lá chuyể n gen khá ng
bệ nh khả m lá thế hệ T1”


2

Chƣơng 1. TỔ NG QUAN TÀ I LIỆ U
1.1. Bệ nh virus thƣ̣ c vậ t
1.1.1. Giớ i thiệ u chung về bệ nh virus hạ i thƣ̣ c vậ t
Virus thực vật được phát hiện vào cuối thế kỉ 19 và đến đầu thế kỉ 20 có rất
nhiều virus gây bệnh cho thực vật lần lượt được phát hiện như virus khảm thuốc lá,
virus thoái hóa khoai tây, virus hại cà chua,… Virus thực vật gây hại nng nề tới
năng suất và chất lượng nông sản, mức độ thiệt hại có khi lên tới 100%. Theo ước
tính thiệt hại hàng năm do bệnh virus gây ra trên thế giới vào khoảng 70 tỉ USD
(Nguyễ n Văn Tỵ , 2002).
Cho đến nay, với sự phát trin của sinh học và sự trợ giúp của trang thiết bị,
phương tiện hiện đại, trên 4 ngàn loại virus đã được phát hiện, trong đó có hơn
2000 loài là virus hại thực vật.
Virus thự c vậ t là nhữ ng vi sinh vậ t vô cù ng nhỏ bé và có nhữ n g đặ c đi m :

(PGS.TS Vũ Triệ u Mẫ n và PGS.TS Lê Lương Tề , 2002)
 Virus có cấ u tạ o rấ t đơn giả n : có hai phần chnh là li axit nucleic và vỏ protein
 Thông thườ ng virus thự c vậ t có vậ t chấ t di truyề n là RNA , mộ t số í t cò n lạ i c ó
vậ t chấ t di truyề n là DNA
 Virus là vi sinh vậ t kí sinh ở mứ c độ tế bà o . Virus thự c vậ t có thể nhiễ m bệ nh
cho mộ t hay nhiề u loà i cây , và mi loài cây có th nhim một hay nhiều loài
virus
 Virus thực vật cũng như virus động vật, sau khi xâm nhim vào tế bào chủ
chúng bắt đầu tác động đến sự trao đổi chất của tế bào, virus s dng vật chất
của tế bào đ tạo thành một số virus con mới. Do vậy cơ th thực vật bị kiệt quệ
dần dần, thoái hóa và suy tàn có khi bị chết. Khoảng thời gian t lúc virus bắt
đầu xâm nhim đến khi cây thoái hóa và chết ph thuộc vào đc đim gây bệnh
của các loài khác nhau và ph thuộc vào tng loại cây cũng như sức chống chịu
của tng cây.
3

 Virus không th phòng chống, tiêu diệt bằng x lí các chất hóa học như nhng
bệnh vi khuẩn, nấm và sâu bọ. Cách duy nhất đ loại bỏ virus là phải loại bỏ
nhng cây trồng bị bệnh.
1.1.2. Những thiệt hại của bệnh virus ở thực vật
Do virus có cấu trúc di truyền đơn giản, nên khả năng nhân lên và lây lan
trong tế bào vật chủ rất nhanh chóng và gây ra biu hiện bệnh trong thời gian ngắn.
Tác hại lớn nhất của virus là làm cho cây bị thoái hoá, giảm sức sống, dần tàn li.
Thiệt hại quan trọng thứ hai của virus là ảnh hưởng tới phẩm chất của các sản
phẩm nông nghiệp. Sản phẩm t cây bị nhim virus thường có chất lượng kém xa
so với cây trồng bình thường. Hạt lúa bị bệnh vàng li thường bị lép không cho thu
hoạch, trong trường hợp được thu hoạch hạt thường rất nhỏ và hạt gạo bị đen, khi
ăn có vị đắng. Khoai tây bị virus gây hại làm cho cây cằn ci, lá khảm loang lổ, củ
khoai nhỏ, hàm lượng tinh bột và các chất dinh dưỡng đều thấp. Citrus tristeza
virus hại cam quít rất nng tại vng bờ bin Địa Trung Hải, Trung Mỹ và Đông

Nam Á Bệnh làm cho quả cam chn ép và rng sớm, quả còn non đã úa vàng vỏ,
nước cam nhạt không mi vị.
Việt Nam có chiều dài gần 2.000 km, kh hậu nhiệt đới gió ma do vậy cây
trồng, thảm thực vật Việt Nam và hệ sinh vật ở nước ta rất phong phú. Đây là điều
kiện đ bệnh virus ở Việt Nam đa dạng về chủng loại lại d lây lan, gây thiệt hại
nghiêm trọng tới sản xuất. Gây hại nghiêm trọng nhất có th k tới các virus gây
bệnh trên cây lúa (bảng 1.1). Trong lịch s trồng lúa ở nước ta đã xảy ra rất
nhiều trận dịch lớn vào các năm 1910, 1920, 1940 -1945, 1964 -1969, 2006-2010
đã tiêu huỷ mấy chc vạn ha lúa, tốc độ lây lan rất nhanh. Cây lúa bị bệnh lúc
đầu lá sẫm màu, sau đó cây lùn thấp lá xoè ngang, thâm lâu r đen, cây chết li
nhanh chóng. Bệnh có th xuất hiện t một vài m
2
sau đó lây lan ra hàng trăm,
hàng nghìn ha. Làm cánh đồng lúa t màu xanh biến thành màu nâu và chết li
trong vòng 10 -15 ngày sau khi phát hiện bệnh. Gạo thu được t lúa bị bệnh
thường có màu sẫm, đắng không ăn được. Do đó, thiệt hại của bệnh có th tính là
100% (1964 - 1968); đc biệt dịch bệnh lúa lùn xoắn lá, lúa cỏ, lúa vàng lùn đã
4

phá hoại ở miền tây Nam bộ trên diện tích trên 500.000 ha (năm 2006 - 2007).
Gần đây (2009-2010) virus gây bệnh lùn sọc đen trên lúa cũng đã xuất
hiện ở một số tỉnh phía Bắc như Nam Định, Thái Bình,…(Bệ nh cây
chuyên khoa - Vũ Triệu Mân ). Một số virus gây bệnh khác trên cây cà
chua, khoai tây, lạc, đậu tương (bảng 1.1),… cũng có th làm ảnh hưởng đến 80%
năng suấ t cây trồng.
Bảng 1.1. Một số loại virus gây bệnh trên cây lương thự c và hoa mà u
Cây chủ
Bệnh
Virus gây hại
Lúa

Bệ nh và ng lá tungro
Rice Tungro Sperical virus-RTSV
Bệ nh lú a cỏ
Rice Grassy Stunt Virus- RGSV
Bệ nh lù n xoăn lá
Rice Ragged Stunt Virus- RRSV
Bệ nh sọ c đen lù n
Rice Black Streaked Drap Virus- RBSDV
Ngô
Bệ nh khả m lá ngô
Maize Mosaic Virus- MMV
Bệ nh khả m lù n ngô
Maize Dawrf Mosaic Virus- MDMV
Cà chua
Bệ nh xoăn và ng lá cà chua
Tomato Yellow Leafcurl Virus- TYLV
Bệ nh đố m hé o cà chua
Tomato Spotted Wilt Virus- TSWV
Bệ nh khả m lá cà chua
Tomato Mosaic Virus- ToMV
Khoai
tây
Bệ nh virus Y khoai tây
Potato Virus Y- PVY
Bệ nh virus A khoai tây
Potato Virus A- PVA
Bệ nh virus X khoai tây
Potato Virus X- PVX
Bệ nh virus S khoai tây

Potato Virus S- PVS
Bệ nh virus M khoai tây
Potato Virus M-PVM
Bệ nh cuố n lá khoai tây
Potato Leafroll Virus- PLRV
Bệ nh khả m Aucuba
Potato Aucuba Mosaic Virus- PAMV
Dưa
chuộ t
Bệ nh khả m dưa chuộ t
Cucumber Mosaic Virus- CMV



5

2.1.3 Biệ n phá p phò ng chố ng
Trên thế giới, nhiều biện pháp phòng tr bệnh virus hại thực vật đã được áp
dng như loại bỏ nguồn bệnh, tiêu diệt côn trùng trung gian, diệt cỏ dại, luân canh
cây trồng, dng giống sạch bệnh hoc giống chống bệnh, chịu bệnh. Dựa vào đc
đim của tng loại virus gây hại và đc tnh cây trồng, người ta đã đề ra nhng
biện pháp phòng tr cho tng nhóm bệnh theo khả năng truyền lan và sự tồn tại
của nguồn bệnh.
2.1.3.1 Sử dụng giống cây trồ ng có khả năng kháng bệnh virus
Phương pháp này đem lại hiệu quả cao, không gây ô nhim môi trường và tạo
được cây sạch bệnh. Tuy nhiên biệ n phá p g p nhiều hạn chế về số lượng giống
kháng bệnh cũng như nguồn vật liệu di truyền kháng virus phc v cho cho công
tác lai tạo giống. Hơn na, năng suất và chất lượng của giống kháng cũng là điều
đáng lưu tâm vì rất khó tích hợp được nhiều phẩm chất trong một giống cây trồng.
2.1.3.2 Sử dụng hạ t, giống cây trồ ng sạch bệnh

S dng nguồn vật liệu giống sạch bệnh được xem là biện pháp quan trọng
nhất đ hạn chế bệnh virus ở nhiều loại cây trồng. Có th tạo nguồn hạt giống, củ,
cây giống sạch bệnh bằng nhng biện pháp như x lý củ/hạt bằng nhiệt hoc hóa
chất hoc nhân giống in vitro tạo củ hoc cây con sạch bệnh. Nhược đim của biện
pháp này là cá c loạ i cây trồ ng có thể bị nhiễ m virus trong quá trì nh canh tá c trên
đồ ng ruộ ng.
2.1.3.3 Biệ n phá p canh tá c
Luân canh và xen canh có th giảm bớt thiệt hại do sâu bệnh gây ra so với
trồng thuần một loại cây trồng . Mặ t hạ n chế củ a biệ n phá p nà y là rấ t khó chọ n
đượ c hệ thố ng luân canh và xen canh vừ a có hiệ u quả đố i vớ i mộ t số bệ nh quan
trọng mà vẫn đem lại lợi ch cao về mt kinh tế . Ma v thch hợp giúp giảm thiệt
hại do sâu bệnh gây ra mà còn giúp gia tăng năng suất rất đáng k . Gieo trồng
tránh mùa phát trin của côn trùng trung gian truyền bệnh (còn gọi là né bệnh) có
th hạn chế được một phần thiệt hại do virus gây ra.
6

2.1.3.4 Kim soát côn trng trung gian truyn bệnh v loại b các loại k
chủ trung gian nhƣ c dại ,… Hiện nay phổ biến nhất là dung các loại thuốc tr
sâu và diệt cỏ đ hạn chế các trung gian này. Tuy nhiên, nhiề u loạ i virus như TMV
lây truyề n qua đườ ng cơ giớ i, virus lây lan trự c tiế p qua khí khổ ng hoặ c vế t thương
trên vậ t chủ . Hơn nữ a, việ c lạ m dụ ng thuố c trừ sâu có thể gây ô nhiễ m môi trườ ng,
gây nguy hiể m cho nông dân và ngườ i tiêu dù ng . Bên cạ nh đó , virus có thể đượ c
lây nhiễ m vớ i số lượ ng rấ t í t môi giớ i truyề n bệ nh , v d: chỉ cần 1 con rầ y nâu /
cây lú a đã có thể truyề n virus lù n lú a cỏ (RGSV).
2.1.3.5 Biện pháp công nghệ sinh học: Trong 15 năm qua một số virus đã
có th kim soát được thông qua biện pháp tạo cây trồng chuyn gen mang các gen
hoc đoạn gen có nguồn gốc t chính các virus gây bệnh (Reddy el al., 2009). Các
cấu trúc gen có nguồn gốc t virus gây bệnh được s dng chuyn vào cây trồng
đ tạo tính kháng có th là các loại khác nhau như: các cấu trúc của vius theo chiều
xuôi (sense) hay chiều ngược (antisense) (Boogaart et al., 1998), các cấu trúc dạng

kẹp tóc (inverted repeats/hairpin) (Yin et al., 2005) và các miRNA nhân tạo có
đch là các trình tự gen của virus gây bệnh (Niu et la., 2006; Qu và Fang, 2008).
Thành công trong việc ứng dng công nghệ sinh học trong tạo giống cây trồng
kháng bệnh virus được đánh dấu bởi công bố của Beachy và cộng sự năm 1986 khi
nhng cây thuốc lá chuyn gen mã hóa protein vỏ của TMV (cấu trúc dạng sense)
đã biu hiện tính kháng với virus này (Beachy, 1990; Register và Nelson, 1992).
Sau đó Beachy và cộng sự đã phát trin nhng thí nghiệm của mình thành phương
pháp CP tạo cây trồng kháng virus. Phương pháp này đã được áp dng tạo nhng
dòng cây chuyn gen kháng nhiều loại virus gây bệnh trên thực vật hai lá mầm và
sau đó là thực vật một lá mầm (xem tổng quan của Hull và Davies, 1992). Tuy vậy,
các cây chuyn gen này chỉ kháng được duy nhất một chủng virus mang gen mã
hóa protein vỏ mà nó chuyn vào. Điều này gây trở ngại trong việc phát trin các
giống cây trồng kháng virus dựa trên phương pháp CP do độ đa dạng của virus
thường khá cao (Scholthof et al., 1993). Tương tự như phương pháp CP, biu hiện
gen mã hóa cho enzyme liên quan tới quá trình tự sao chép hoc sao mã (các
replicase) cũng có th tạo các cây chuyn gen kháng virus. Cũng nghiên cứu trên
7

đối tượng TMV, Carr và cộng sự nhận thấy nhng dòng thuốc lá mang gen mã hóa
cho replicase có khối lượng phân t là 183kDa hoc 54kDa có khả năng kháng
TMV tốt hơn nhng dòng cây chuyn gen CP. Biu hiện replicase của virus khoai
tây X (potato virus X: PVX) hay virus khảm dưa chuột (cucumber mosaic virus:
CMV) chứng minh hiệu quả bảo vệ thực vật của phương pháp này (Braun và
Hemenway, 1992; Anderson và cộng sự, 1992). Tuy vậy, tương tự như phương
pháp CP, phương pháp bảo vệ qua trung gian gen replicase cũng chỉ có tác dng
trên tng chủng virus. Hơn na, gen mã hóa cho các replicase thường rất lớn, gây
trở ngại khi biu hiện trên thực vật. Nhằm khắc phc nhng hạn chế của cấu trúc
“dạng sense”, các cấu trúc dạng antisense mang một đoạn DNA có trình tự bổ sung
với RNA của virus có th ức chế sự phiên mã với nhng trình tự RNA tương đồng
đã được nghiên cứu và phát trin. Nhiều dòng thuốc lá, khoai tây, cà chua,…

kháng virus đã được tạo ra dựa trên kỹ thuật này.Việc s dng nhng đoạn DNA
thay vì cả đoạn gen mã hóa đã làm nhng dòng cây chuyn gen có khả năng kháng
với nhiều dòng virus thay vì chỉ một vài dòng nhất định (Boogart et al, 1998).
Cho tới nhng năm cuối thế kỷ 20, cấu trúc dạng kẹp tóc (ihpRNA) hay kỹ thuật
RNAi được xem là một kỹ thuật hiện đại và hu hiệu nhất trong việc chống lại các
bệnh do virus gây ra ở thực vật. Năm 2004, Baulcombe đã công bố cơ chế hoạt
động của siRNA và coi đó là một cơ chế quan trọng trong việc kháng lại virus ở
thực vật. Các bước chính trong kỹ thuật này bao gồm: (1) thiết kế các vector
chuyn gen mang cấu trúc RNAi, (2) biến nạp vector chuyn mang cấu trúc RNAi
vào cây thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens làm bất hoạt các mRNA
của virus gây bệnh, (3) sàng lọc các cây chuyn gen mang cấu trúc RNAi và kim
tra tính kháng virus của các cây chuyn gen (Tenllado et al., 2004). Tính hiệu quả
của kỹ thuật RNAi trong việc tạo cây trồng chuyn gen mã hoá protein của virus
(gen mã hóa protein vỏ CP, enzyme phiên mã RdRp,…) có khả năng kháng lại
chnh virus đó đã được chứng minh bằng thực tế trong nhng nghiên cứu tạo cây
trồng kháng các loại virus khác nhau như: Potato virus Y PVY (Waterhouse et al.,
1998; Smith et al., 2000), cucumber mosaic virus CMV (Kalantidis et al., 2002),
Plum pox potyvirus PPV (di Nicola-Negri et al., 2005), Tobacco mosaic virus
8

TMV và Potato virus Y PVY (Sun et al., 2005), , Tomato yellow leaf curl virus
TYLCV (Zrachya et al., 2007)Rice tungro bacilliform virus RTBV (Tyagi et al.,
2008) African cassava mosaic virus ACMV (Vanderschuren et al., 2009 )… Trong
nhng nghiên cứu này, cấu trúc RNAi có chứa trình tự gen của virus lp lại đảo
chiều thường được s dng đ chuyn vào cây và sẽ được biu hiện thành RNA sợi
đôi dạng kẹp tóc (hairpin RNA, hpRNA) trong cây chuyn gen t đó kch thch cơ
chế RNAi hoạt động khi có sự xâm nhập của virus vào cây. Người ta đã nhận thấy
rằng khi vng đệm của hpRNA được lp lại với một trình tự intron (ihpRNA) thì
kết quả ihpRNA tạo ra sự bất hoạt gen là cao nhất (Smith et al., 2000; Wesley et
al., 2001). Năm 2007, Bonfim và cộng sự đã tạo ra được một dòng cây đậu chuyn

gen kháng virus BGMV (Bean golden mosaic virus) với tnh kháng lên đến 93%.
Cũng năm này, Shinichiro Kamachi và cộng sự đã công bố kết quả tạo ra được một
số dòng thuốc lá chuyn gen CP trong cấu trúc ihpRNA có khả năng kháng cao với
virus cucumber green mottle mosaic virus CGMMV đến thế hệ T2 (12/14 số cây
kim tra) và nhng siRNA đã được phát hiện trong nhng dòng cây chuyn gen
này. Nói chung, hầu hết các cây chuyn gen làm chậm sự tch lũy virus và làm
chậm hoc giảm nhẹ các triệu chứng bệnh (Gottula et al, 2009)
Cho đến nay đã có các loại cây trồng chuyn gen kháng bệnh virus được
công nhận và trồng thương mại như: Đu đủ chuyn gen kháng bệnh đốm vòng
(papaya ringspot virus, PRSV) đã được công nhận và trồng ở Mỹ, Trung Quốc,
Philippine; B đao chuyn gen kháng ba loại vi rút Cucumber mosaic virus,
Watermelon mosaic virus, Zucchini yellow mosaic virus, đã được công nhận và
trồng ở Mỹ; Ớt và cà chua chuyn gen kháng Cucumber mosaic virus, được công
nhận và trồng ở Trung Quốc … Ngoài ra rất nhiều các loại cây trồng chuyn gen
kháng bệnh virus khác đang trong giai đoạn khảo nghiệm đ được công nhận là
giống cây trồng thương mại như: Sắn chuyn gen kháng African cassava mosaic
virus (Begomovirus); Ngô chuyn gen kháng Maize steak virus (Mastrevirus);
Khoai tây chuyn gen kháng đồng thời 3 loại virus Potato virus X (Potexvirus),
Potato virus Y (Potyvirus), Potato leafroll virus (Polerovirus); Lúa chuyn gen
kháng Rice Tungro viruses (Tungrovirus); Khoai lang chuyn gen kháng Sweet
9

potato feathery mottle virus (Potyvirus)…. (Reddy et al, 2009).
2.1.4. RNAi v cơ ch kháng bệnh bng phƣơng pháp chuyn gen virus
RNAi là một cơ chế căn bản đ kim soát chui thông tin di truyền hay cách
vô hiệu hoá hoạt động của các gen xác định do hai nhà khoa học Andrew Z. Fire và
Craig C. Mello khám phá ra và công bố trên tạp chí Nature vào ngày 19/12/1998
RNAi (RNA interference) được coi như một phương thức min dịch tự nhiên
giúp sinh vật chống lại sự xâm nhập của virus RNA bằng cách phân huỷ các trình
tự nucleotide tương đồng của chúng. Nó làm trung gian kháng lại cả acid nucleic

ngoại bào và nội bào, cũng nhờ điều khin sự biu hiện gen mã hóa protein. Nó
được thực hiện khi có sự xuất hiện của phân t RNA mạch kép trong cơ th sinh
vật gây nên ức chế sự biu hiện gen của một loại trình tự đc hiệu.

Hình 1.1: Cơ chế gây bất hoạt gen của RNAi
Cơ chế RNAi được bắt đầu bằng việc phân cắt phân t RNA chui kép
(dsRNA) bởi enzyme Dicer - một trong nhng enzyme thuộc họ RNase III, tạo
thành các phân t RNA ức chế nhỏ (siRNA) có kích thước khoảng 21 - 26
nucleotide. Các siRNA này được giải xoắn và một mạch gắn kết với một phức hợp
protein một cách chọn lọc gọi là phức hợp cảm ứng sự bất hoạt RNA (RISC –
RNA Induced Silencing Complex). Argonaute (protein Argonaute) trong RISC có
10

chứa RNase-H hoạt động nhờ một endonuclease sẽ tách siRNA thành nhng chui
RNA đơn, trong đó chỉ có một chui đơn RNA có đầu 5‟ có lực bắt cp base (base
pairing) nhỏ nhất được chọn đ tiếp tc đi vào phức hệ RISC. Sau đó, RISC sẽ thu
nhận các phân t phiên mã mRNA nội sinh của tế bào có trình tự tương đồng với
trình tự của chui siRNA đang có mt trong phức hệ bằng cách bắt cp với các
base theo nguyên tắc bổ sung. Khi đã được nhận diện các mRNA nhanh chóng bị
cắt đứt ở khoảng gia của chui xoắn kép siRNA-mRNA và bị tiêu hủy bởi các
RNA nuclease (Helicase) có trong RISC. Sợi RNA bị phân cắt, tiếp tc hình thành
các siRNA. Quá trình tiếp din liên tc nhờ vậy sẽ phân hủy các bản mã sao hình
thành, kết quả là ức chế biu hiện của gen mong muốn.
2.1.5. Mộ t số thnh tựu của cây trng chuyn gen kháng virus ở Việt Nam
Virus là nguyên nhân gây hạ i tớ i nhiề u loạ i cây trồ ng trên thế giớ i cũ ng như ở
Việ t Nam. Hầ u hế t cá c bệ nh thự c vậ t do virus gây ra cho tớ i nay chưa có thuố c đặ c
trị, do vậy tạo giống cây trồng kháng bệnh virus là mc tiêu nhiều nghiên cứu tại
nướ c ta. Từ năm 1999, phòng Công nghệ tế bào thực vật, việ n Công nghệ sinh họ c
phố i hợ p vớ i 5 nướ c trong khu vự c ASEAN tham gia và o chương trì nh nghiên cứ u
phát trin cây đu đủ chuyn gen kháng virus đốm vòng (Papaya ringspot virus :

PRSV) do tổ chứ c ISAAA (International Service for Acquisition of Agri -biotech
Application) tài trợ. Trong khuôn khổ đề tà i nhó m thự c hiệ n đã phân lậ p đượ c g en
CP củ a mộ t số chủ ng virus tạ i miề n Bắ c và Nam Trung Bộ . Gen CP đượ c sử dụ ng
đ thiết kế các cấu trúc chuyn gen vào cây đu đủ nhằm tạo cây chuyn gen kháng
virus đố m vò ng. Mộ t số dò ng cây đu đủ chuyể n gen đã biể u hiệ n tnh kháng virus
sau khi thử nhiễ m bệ nh nhân tạ o (Lâm Đạ i Nhân, 2000; Lê Trầ n Bì nh, 2008)
Thờ i gian gần đây đã có một số nghiên cứu theo hướng ứng dng kỹ thuật
RNAi trong tạo giống cây trồng chuyn gen chống lại các bệnh do virus gây ra.
Phòng Công nghệ tế bào thực vật – Viện Công nghệ sinh học do GS. Lê Trần Bình
và TS. Chu Hoàng Hà đứng đầu là nhóm nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam đã thành
công trong việc ứng dng kỹ thuật RNAi trong tạo cây chuyn gen kháng virus .
Một trong nhng kết quả của đề tài cấp Viện KH &CN Việ t Nam đượ c tiế n hà nh
11

trong 2 năm 2007-2008: “Nghiên cứ u ứ ng dụ ng kỹ thuậ t RNAi trong tạ o giố ng cây
trồ ng chuyể n gen khá ng bệ nh virus” là đã tạo được các cây thuốc lá chuyn gen
kháng virus khảm dưa chuột (CMV), kháng virus khảm thuốc lá (TMV) và kháng
đồng thời cả 2 loại virus trên.

Hnh 1.2: Dng thuốc l T-CMV-49 biể u hiệ n khá ng bệ nh hoà n toà n và cây đố i
chứ ng WT2-1 sau 3 lầ n lây nhiễ m

Tiế p đó , đề tài cấp nhà nước “Nghiên cứu tạo giống cây ăn quả khá ng bệ nh
virus phổ rộ ng bằ ng chuyể n gen đa đoạ n” (KC.04.03/06-10) đã thiế t kế thà nh công
2 đoạ n gen nhân tạ o mang đa đoạ n gen CP , Nib và HC -pro củ a PRSV gây bệnh
đốm vòng trên cây đu đủ và 2 đoạ n gen đa đoạ n RdRp -CP-p20-p23 của virus tàn
li (Citrus tristeza virus, CTV) và thiết kế thành công nhng cấu trúc RNAi mang
các gen đa đoạn này . Thử nghiệ m tí nh khá ng vớ i cá c dò ng đu đủ và cam chuyể n
gen mang cấ u trúc RNAi trên cho thấy sự có mt của vir us gây bệ nh trên cá c dò ng
cây chuyể n gen nhưng không thấ y cây có biể u hiệ n bệ nh (Chu Hoà ng Hà , 2010).

12


Hnh 1.3: Dng đu đủ biể u hiệ n khá ng bệ nh hoà n toà n(hình A) v cây đối
chứ ng (hình B) sau 2 tháng lây nhiễm
Đây là cơ sở quan trọng chứng tỏ khả năng làm chủ công nghệ RNAi của các nhà
khoa họ c Việ t Nam và mở ra khả năng ứ ng dụ ng công nghệ RNAi đố i vớ i cá c đố i
tượ ng cây trồ ng khá c.
2.2. Cây thuố c lá - mô hì nh nghiên cƣ́ u tạ o cây trồ ng chuyể n gen khá ng virus
2.2.1 Giớ i thiệ u chung về cây thuố c lá
Cây thuốc lá có tên khoa học là: Nicotiana sp; thuộc họ (Family) : Solanaceae
(họ cà), chi (Genus): Nicotiana, loài (Species): Nicotiana tabacum L.
Các nhà khoa học đã phân chia Nicotiana thành 3 chi phụ , 14 phân chi và 65
loài. Trong số 65 loài là cây bản địa Bắc và Nam Mỹ , 15 loài bản địa Australia
trong đó loài N. tabacum thuộ c phân chi Genuinae là đượ c gieo trồ ng thương mạ i
trên khắ p thế giớ i. Ở Việt Nam, cây thuốc lá đem lại hiệu quả kinh tế cao cho nông
dân và thu nhập quốc gia. Theo thống kê của Tổng công ty thuốc lá Việt Nam
(Vinataba) trong 3 năm (2006-2008) tổng doanh thu đạt 47.656 tỷ đồng, nộp ngân
sách nhà nước được 9.653 tỷ đồng, kim ngạch xuất khẩu đạt 192,136 triệu USD,
việc làm của người lao động được đảm bảo, đời sống tng bước được nâng cao với
thu nhập bình quân đầu người tăng 15,59%/ năm. Thuốc lá có giá trị kinh tế cao,
ngoài việc tiêu dng trong nước nó còn là mt hàng xuất khẩu có giá trị. Ngoài ra,
13

cây thuố c lá cò n đượ c coi là mô hì nh để tiế n hà nh nhiề u nghiên cứ u sinh họ c cơ
bản về chức năng , vai trò cũ ng như cơ chế hoạ t độ ng củ a cá c gen cũ ng như đượ c
sử dụ ng là m mô hì nh thử nghiệ m và phá t triể n nhữ ng nghiên cứ u ứng dng như
biể u hiệ n cá c protein tá i tổ hợ p có giá trị.
2.2.2. Tnh hnh bệnh virus hại thuốc lá
Hiệ n nay, bệ nh virus là mộ t trong nhữ ng nguyên nhân làm gi ảm năng suấ t và

chấ t lượ ng cây thu ốc lá nguyên liệu. Trong đó , virus khảm thuốc lá (TMV) và
virus khảm dưa chuột (CMV) là hai virus gây bệnh phổ biến và nghiêm trọng nhất
(Nguyễ n Văn Chí n và Nguyễ n Ngọ c Bí ch, Tổ ng công ty thuố c lá Việ t Nam).
Bệ nh khả m lá xuấ t hiệ n khá sớ m ngay sau khi cây phụ c hồ i ho àn toàn với tỷ lệ
thấ p (2,3-5,2%) và tăng dần hoc tăng nhanh sau 20-50 ngày ty theo vng , từ
18,5-26,5% thậ m chí lên tớ i 100% như ở xã Lâu Thượ ng, tỉnh Thái Nguyên; trong
đó giố ng thuố c lá rấ t mẫ n cả m vớ i TMV và CMV chủ yế u là K326. Thiệ t hạ i do
virus gây ra ở cây thuố c lá lên đế n hà ng chụ c tỷ đồ ng (Nguyễ n Văn Chí n và
Nguyễ n Ngọ c Bí ch, 2008)
Đối với bệnh do virus nói chung và bệnh khảm lá do hai virus TMV và CMV
gây ra nó i riêng hiệ n vẫ n chưa có loại thuốc hóa học nào khả d có th phòng trị
đượ c mộ t cá ch hữ u hiệ u , do đó cá c biệ n phá p phò ng bệ nh tố t nhấ t là sử dụ ng cá c
hạt giống sạch bệnh đ trồng , không sử dụ ng cá c hạ t giố ng từ cá c ruộ ng trướ c đó
đã bị bệnh nói trên đ làm giống cho v sau . Thườ ng xuyên kiể m tra đồ ng ruộ ng
đ phát hiện và phun thuốc diệt tr các loại côn trng chch hút như bọ cách tơ , bọ
phấ n, rệ p muộ i…bằ ng cá c loạ i thuố c trừ sâu để trá nh lây lan . Khi phá t hiệ n cá c
triệ u chứ ng bệ nh trên đồ ng ruộ ng cầ n tậ p trung nhổ cây , đem ra khỏ i ruộ ng tiêu
hủy đ tránh lây lan.
2.2.3. Virus gây bệ nh khả m thuố c lá (Tobacco mosaic virus, TMV)
TMV thuộc loại Tobamovirus là một trong nhng virus gây hại trên thực vật
được mô tả sớm nhất bởi Mayer (1886), Iwanowski (1892), Allard (1914) và
Stanley (1935) (Kung and Yang, 1998).
14

TMV là virus hình que có chiều dài 300 A
0
, đường kính t 150-170 A
0

có cấu tạohình ống rng và protein sắp xếp cuộn xoắn xung quanh lõi trung tâm.

TMV là virus đơn dương (ssRNA) có hình cuộn xoắn. Dạng que hoàn chỉnh của
TMV có 2130 đơn vị hợp thành capsid (capsomeres), cứ 6 capsomer tạo thành
một vòng xoắn. (Stryer Lubert, 1988). Genome của TMV gồm 6400 nucleotide
được chia thành 4 khung đọc mở (open reading frames- ORFs). RNA của TMV
có cấu trúc mũ 7-methylguanosine ở cuối đầu 5‟ (Zamore et al., 2000), nối tiếp
68 nucleotide không mã hóa trợ giúp quá trình dịch mã (Gallie et al., 1987). Tiếp
theo vùng này là hai vùng mã hóa cho các protein với kch thước tương ứng là
183kDa và 126 kDa (Goelet et al., 1982). Đây là protein có vai trò quan trọng
trong quá trình sao chép của virus. Vùng mã hóa thứ 3 mã hoá cho protein cần
thiết cho sự di chuyn qua gian bào của virus (Meishi et al., 1987) có khối lượng
phân t khoảng 30 kDa. Protein vỏ (CP) có khối lượng phân t 17,5kDa nằm
trong vùng mã hóa thứ 4.

Hình 1.4. Cấu trúc TMV và tổ chức hệ gen (Chapman, 1998)
Vị trí của các ORF của hệ gen RNA được biểu thị bởi các hình chữ nhật. Kích thước
của protein (kDa) tương ứng với các ORF trên được chỉ ra trong ngoặc. Vỏ protein với
kích thước 17,5 kDa được mã hoá bởi ORF thứ 4. Các đặc điểm của hệ gen và các
subgenomic được chú thích ở phía trên và bên dưới.
Gen CP của TMV theo sau vùng không dịch mã có chứa vài trình tự pseudoknot,
trình tự này liên quan đến sự tăng cường dịch mã (Leather et al., 1993). Tại đầu 3‟
của hệ gen RNA mang cấu trúc giống RNA vận chuyn (tRNA) có th được
aminoacyl hóa. CP là protein cần thiết cho quá trình hình thành virion và có th
điều khin sự lan truyền t tế bào này sang tế bào khác của virus (Saito et al.,
15

1990; Kawakami et al., 2004). Vai trò của gen CP cũng cho phép s dng gen CP
làm nguyên liệu cho tạo cây trồng chuyn gen kháng virus TMV bằng cơ chế bất
hoạt RNA (RNA interference) (Yan et al., 2007)
TMV có th gây bệnh ít nhất 199 loài trong 35 họ (Shew and Lucas,
1991) thực vật khác nhau nhưng nhiều nhất là trên cây thuốc lá. Khi cây bị bệ nh

các lá non đều biến màu thành dạng khảm bao gồm các vng xanh nhạt xanh đậm
không đồ ng đề u xen lẫ n nhau , hình loang lổ như da ếch , hay cò n gọ i là dạ ng
khảm. TMV được lan truyền bằng đường cơ giới do tiếp xúc virus thâm nhập vào
các tế bào qua các vết thương và qua kh khổng lá, thân hoc r. TMV rất bền
như ở dạng kết tủa cồn, ở lá khô virus vẫn còn hoạt tính gây bệnh sau một năm.
Trong nhiều trường hợp TMV phối hợp với virus X khoai tây (PVX) cùng gây
hại trên cà chua gây ra bệnh đốm sọc đôi (double virus streak hay là Mixed virus
streak). Bệnh nng làm đầu lá bị khô và ngọn cà chua bị chết (Gibbs, 1999).


















16

Chƣơng 2. VẬ T LIỆ U VÀ PHƢƠNG PHÁ P NGHIÊN CƢ́ U
2.1 Vậ t liệ u

2.1.1. Vậ t liệ u thƣ̣ c vậ t:
Hạt thuố c lá Nicotiana tabacum L. (giống K326) thế hệ T1 chuyể n gen mang cấ u
trúc TMV_RNAi do phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học
cung cấp
2.1.2. Ha cht, máy mc, thiế t bị
- Hóa chất: Yeast extract, Agarose, K
2
PO
4
, KH
2
PO
4
, SiC, HCl, NaOH, MgCl
2,
Etanol 70%, nướ c Javen, nướ c khử ion, kháng sinh kanamycin, Taq DNA
polymerase và cá c hó a chấ t thông dụ ng khá c
- Máy móc, thiế t bị : Máy PCR System 9700 (Appied Biosystem, Mỹ), máy điện di
Powerpac300 (Bio-Rad, Mỹ), máy soi DNA (Mini-transllumminatior, Bio-Rad,
Mỹ), máy chp ảnh (Amersham Pharmacia Biotech, Thy Đin), máy Vortex
(Mimishaker, IKA, Đức), máy hút chân không Speed-Vac 110A (Savant, Mỹ),
máy ly tâm , cng với các trang thiết bị khác của Phòng Công nghệ Tế bào Thực
vậ t, Việ n Công nghệ Sinh họ c
2.2. Phƣơng phá p nghiên cứu
2.2.1. Khử trùng hạt thuốc lá
2.2.1.1. Khử trùng hạt bằng dung dịch Javel
Ngâm hạt trong cồn 70% khoảng 20‟‟, lắc nhẹ sau đó loại bỏ cồn bằng
pippet kh trùng. Ngâm hạt trong dung dịch tẩy (Javel thương phẩm 10-30% có bổ
sung Tween20 0,05-0,1%) khoảng 20‟ có lắc nhẹ. Sau khi loại bỏ dung dịch tẩy
bằng pippet, ra hạt 4-5 lần bằng nước cất kh trùng.

2.2.1.2. Khử trùng hạt bằng khí Clo
17

Hạt thuốc lá được cho vào tng ống eppendorf, mở nắp và cho vào bình
Pyrex dung tích 250ml. Mở hé ¼ nắp bình Pyrex có chứa hạt thuốc lá và đt bên
cạnh cốc thủy tinh chứa 100ml dung dịch Javel. Dùng pipet thủy tinh hút lấy 3ml
HCl đc cho vào cốc thủy tinh đựng Javel đ tạo khí Clo sau đó đậy kín bình kh
trùng và dán parafin. Sau 3-9h tháo parafin và mở hé ¼ nắ p bình kh trùng trong
khoảng 2 phút đ bay hết khí, sau đó vn cht nắp bình Pyrex và lấy ra ngoài. Mở
nắp bình Pyrex trong box cấy 30 phút đ bay hết khí và cấy hạt trên môi trường.
2.2.2. Phân tí ch sƣ̣ phân ly của gen chuyn
Gieo hạt và đánh giá tỉ lệ kháng kanamycine
- Gieo hạt trên đa nhựa chứa môi trường MS
- Sau khi cây con mọc cao khoảng 1cm thì chuyn sang bình tam giác 250ml
chứa môi trường MS + kanamycine 50mg/l. Mi dòng chuyn 80 cây và đt
10 cây/ bình tam giác
- Sau 3-4 tuần quan sát, đánh giá số lượng cây sống sót trên môi trường có
kanamycine
2.2.3. Phân tích sự có mặt của gen chuyn bng phƣơng pháp PCR
2.2.3.1. Tách ADN tổng số:
- Nghiền mẫu lá (khoảng 50 mg) trong ống eppendorf 2 ml bằng nitơ lỏng
- Thêm 500 l “Shorty Buffer” (0,2 M Tris-HCl pH9; 0,4 M LiCl; 25 mM
EDTA; 1% SDS và nước đề ion kh trùng )
- Ly tâm 13000 v/p
- Hút 350 l dịch nổi chuyn sang ống eppendorf 1,5 ml có sẵn 350 l
isopropanol
- Đảo nhẹ và ly tâm 13000 v/p
- Loại dịch nổi, làm khô cn
- Bổ sung 50-100 l nước đề ion kh trng đ hòa tan cn.
- DNA được kim tra bằng cách điện di trên gel agarose 0,8%.

18

2.2.3.2. Phản ứng PCR
Phản ứng PCR được tiến hành với cp mồi TMV-Fi/ TMV-Ri với trình tự như sau:
TMV-Fi: 5‟- CACCATGAAACCTTCACCACA-3‟
TMV-Ri: 5‟- CTAGGTCCAAACCAAACCAG-3‟
Bảng 2.1. Thành phần phản ứng PCR
STT Thành phần Thể tích (µl)
1 Nước cất khử ion, khử trùng 10,1
2 Buffer PCR (NH
+
4
) 2
3 MgCl
2
2
4 dNTPs 1,6
5 Primer – Fi 0,8
6 Primer – Ri 0,8
7 Taq polymerase 0,2
8 Template 2,5
Tổng 20

Bảng 2.2. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR
Bước Phản ứng Nhiệt độ (
O
C) Thời gian Chu kì
1 Biến tính 94 3 phút 1
2 Biến tính 94 1 phút
3 Gắn mồi 50 1 phút 25

4 Kéo dài chuỗi 72 1 phút
5 Hoàn tất kéo dài 72 10 phút 1
6 Kết thúc phản ứng 4 ∞

2.2.4. Phƣơng phá p lây nhiễ m virus nhân tạ o
19

Các cây chuyn gen sau khi trồng ngoài nhà lưới cao khoảng 10-30 cm đượ c kiể m
tra tí nh khá ng virus nhân tạ o củ a Herbers và cá c cộ ng sự (1996) có cải tiến. Các
bướ c tiế n hà nh như sau:
- Mẫu lá bị bệnh được nghiền trong đệm phosphat 100 mM (~1g mẫu lá trong
20 ml buffer) với pH = 7.
- Lá lây nhim được gây tổn thương nhẹ bằng SiC.
- Cho dịch virus lên phần lá đã gây xước, sau vài phút ra lá bằng nước.
- 10-20 ngày sau khi lây nhim, triệu chứng sẽ xuất hiện trên cây.
- Có th lây nhim thêm nếu sau khi lây nhim lần 1 không thấy bệnh biu
hiện trên cây WT.
- Đánh giá kiu hình của các cây lây nhim nhân tạo sau 10-20 ngày
2.2.5. Phƣơng phá p ELISA
- Lấy 200 mg lá non (lá thứ 3 hoc thứ 4 t trên xuống) nghiền thành dịch
đồng nhất với 2 ml đệm PBST (16 mM Na
2
HPO
4
, 3,9 mM Na H
2
PO
4
, 127
mM NaCl và 0,05 % Tween 20 (pH 7,2)) có chứa 0,1 % albumin bò

(Sigma).
- Dịch nghiền được ly tâm ở 5000 v/p, 4
o
C, 10 phút.
- Thu dịch nổi (gọi là kháng nguyên). T đa 96 giếng, bổ sung 200 l kháng
nguyên vào mi giếng và ủ 37
o
C khoảng 1 h.
- Sau khi, ra 3 lần với đệm PBST, kháng th (IgG) kháng CMV, TMV và
PVY được hòa tan vào đệm PBST theo tỷ lệ thch hợp, sẽ được bổ sung vào
nhng giếng có kháng nguyên và ủ 37
o
C trong 1 h.
- Đa được ra lại 3 lần trước khi thêm 200 l alkaline phosphatse-kết hợp
đoạn F(ab‟)
2
đã tinh sạch t IgG thỏ hòa tan 1:2000 trong bệm PBST chứa
0,1 % albumin bò.
20

- Đa được ủ một lần na ở 37
o
C trong 1 h. Sau khi ra, đệm nền (10 %
diethaolamine, 3 mM NaN
3
, pH 9,6) chứa 0,1 % disodium p-nitrophenyl
phosphate, được bổ sung vào các giếng và ủ ở nhiệt độ phòng 30-40 phút.
- Giá trị OD được đo ở 405 nm bởi một microplate reader. Phản ứng màu
được tạo ra bằng việc các mẫu kim tra được so sánh với giếng đối chứng
âm đã biết.

- Một cây kim tra được xác định là dương tnh khi giá trị OD trung bình lớn
hơn hai lần giá trị trung bình của đối chứng âm

















21

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Nhằm ứng dng công nghệ RNAi trong nghiên cứu tạo giống cây trồng kháng
virus tại Việt Nam, các nhà khoa học thuộc Viện Công nghệ Sinh học đã tiến hành
phân lập gen CP mã hóa cho protein vỏ của virus gây bệnh khảm lá (TMV), thiết
kế vector RNAi mang chnh đoạn gen CP đó theo cả 2 chiều xuôi-ngược rồi
chuyn vào cây thuốc lá. Ở thế hệ ban đầu (T0) đã thu được 17dòng cây chuyn
gen có tính kháng TMV lớn hơn 90%. Tiếp tc phát trin nhng nghiên cứu trên,
đề tài đã tiến hành nhng nghiên cứu ở thế hệ T1 với mc đch:
- Phân tí ch sự phân ly củ a dò ng thuố c lá chuyể n gen TMV_RNAi ở thế hệ T1

- Phân tí ch khả năng khá ng virus củ a cá c dò ng thuố c lá chuyể n gen ở thế hệ T1
bằ ng phương phá p lây nhiễ m nhân tạ o
- Đá nh giá sự tồ n tạ i củ a TMV trong dò ng thuố c lá chuyể n gen bằ ng phương
pháp ELISA
3.1. Phƣơng pháp khử trùng hạt thuốc lá
17 dòng T0 có tnh kháng virus cao được gi lại trồng trong nhà lưới sau khoảng 4
tháng tiến hành thu hoạch hạt t các dòng cây này và cho nảy mầm trong điều kiện
in vitro phc v cho nhng phân tích tiếp theo. Kh trùng hạt thuốc lá trước khi
đưa vào nuôi cấy in vitro gp một số khó khăn sau:
- Hạt thu trong điều kiện nhà lưới mang nhiều nấm mốc
- Kch thước hạt nhỏ nên khó thao tác, rất d mất một lượng lớn hạt trong quá
trình kh trùng
Do vậy lựa chọn phương pháp kh trùng thích hợp cho hạt không bi nhim nấm
mốc trở lại nhưng tỉ lệ nảy mầm cao là yêu cầu đầu tiên trong thí nghiệm của đề
tài. Dung dịch Javel thương phẩm và kh clo được s dng như 2 loại chất tẩy ra
22

khác nhau nhằm tìm kiếm phương pháp kh trùng cho tỉ lệ nhim thấp, tỉ lệ hạt
nảy mầm cao đồng thời không tốn thời gian thao tác thí nghiệm.
Bảng 3.1 Hiệu quả khử trùng hạt thuốc lá
Phƣơng pháp
Tỉ lệ nảy
mầm (%)
Tỉ lệ nhiễm
(%)
Tổng thời gian
khử trùng (h)
Thời gian
thao tác (h)
10%Javel /20ph

95
95
3
3
20%Javel /20ph
95
95
3
3
30%Javel /20ph
90
6
3.5
3.5
Khí Clo/3h
91
35
3.5
0.5
Khí Clo/6h
88
3
6.5
0.5
Khí Clo/9h
24
1
9.5
0.5
Tiến hành th nghiệm kh trùng mi lô 100 hạt thuốc lá bằng các dung dịch Javel

10%, 20% và 30% trong 20 phút cho thấy dung dịch 10% và 20% Javel thương
phẩm không th kh trùng hạt thuốc lá, tỉ lệ nhim lại đạt tới hơn 90%. Dung dịch
Javel 30% tỉ lệ nảy mầm hạt cao nhưng tỉ lệ mẫu bị nhim lại cũng giảm đáng k
(bảng 3.1). Thí nghiệm kh trùng bằng kh clo được tiến hành tương tự, 100 hạt
thuốc lá mi lô được đem vào kh trùng bằng luồng khí clo trong 3h, 6h và 9h. Đối
với thời gian kh trùng khí Clo 3h hạt vẫn nảy mầm nhưng không diệt được nấm
mốc, còn ở thời gian 9h nấm mốc không còn mọc trên môi trường nảy mầm na
nhưng hiệu quả nảy mầm khá thấp, chỉ còn t hơn 10%. X lí hạt bằng luồng khí
clo trong 6h cho hiệu suất nảy mầm cao nhất với 88%, tỉ lệ hạt nhim lại thấp nhất
(bảng 3.1). Cây con phát trin tốt sau khi kh trùng (hình 3.1). Như vậy, hạt thuốc
lá có th kh trùng hoàn toàn bằng dung dịch Javel 30% trong 15 phút hoc luồng
khí clo trong 6h. Tuy nhiên, x lí hat bằng kh clo có ưu thế về thời gian thao tác
khi chỉ mất khoảng na tiếng (bảng 3.1) mà vẫn đảm bảo lượng hạt còn lại sau kh
trùng tốt hơn.
23



A B
Hình 3.1: Hình ảnh hạt thuốc l (A) v cây con (B) trên môi trường nảy mầm theo phương
pháp khử trùng khí clo trong 6h.
3.2. Phân tích khả năng phân ly của gen chuyn
Trong qúa trình tái sinh cây chuyn gen, việc s dng các gen có khả năng chọn
lọc đi kèm với gen đch là hết sức cần thiết nhằm tách ra được số lượng ít ỏi các tế
bào chuyn gen trong vô số các tế bào không mang gen chuyn. Các gen kháng các
loại kháng sinh như kanamycine, hygromycine; kháng thuốc tr sâu, thuốc diệt cỏ
hoc mã hóa cho khả năng s dng một số loại đường như manose thường đươc s
dng làm gen chọn lọc trong quá trình chuyn gen ở thực vật. Trong nhng nghiên
cứu trước đây, vector RNAi TMV-CPi có bộ khung chứa gen nptII mã hóa cho gen
kháng kanamycin đã được chuyn vào giống thuốc lá K326 và thu được nhng

dòng cây T0 kháng virus. Kim tra bằng phương pháp PCR đã cho thấy nhng
dòng T0 này mang cả gen nptII và gen đch TMV-CPi. Do vậy, đối với nhng
dòng cây ở thế hệ T1 tiếp theo, nhng dòng cây thuốc lá sinh trưởng được trên môi
trường có kanamycine được coi là mang gen đch và có th đánh giá khả năng di
truyền ở thế hệ tiếp theo của gen đch thông qua hoạt động của gen nptII. Thí
nghiệm đã được tiến hành bằng cách gieo các hạt của 17 dòng thuốc lá T1chuyn
gen trên môi trường MS cơ bản có bổ sung 50mg/l kanamycine và đánh giá khả
năng nảy mầm và phát trin cây sau 4 tuần. Kanamycine có vai trò ức chế hoạt
24

động của ribosome trong tế bào thực vật, kiu hình thường thấy của các cây mẫn
cảm với kanamycine là vàng lá, r không phát trin và chết (hình 3.2).


Hình 3.2: Sàng lọc thuốc lá chuyển gen T1 RNAi TMV-CPi.
TMV2.6: Cây thuốc lá chuyển gen T1 trên môi trường có Kan 50mg/l; WT-1: Cây thuốc lá không chuyển
gen trên môi trường có Kan 50mg/l; WT-2: Cây thuốc lá không chuyển gen trên môi trường không có
Kan. Mũi tên chỉ hình ảnh một số cây không kháng kanamycine trên môi trường chọn lọc.
Trong các phương pháp được s dng hiện nay, chuyn gen thông qua vi khuẩn
Agrobacterium tumafaciens được coi là biện pháp d áp dng với chi phí thấp mà
lại rất hiệu quả. Do được thiết kế gắn vào đoạn Ti plasmid nên gen đch phần lớn
sẽ được gắn vào genome của thực vật tại một hoc vài đim. Số đim gắn này
thường được định ngha là số lượng bản sao hay bản copy của gen đch. Nếu cây
chuyn gen có 1 bản copy, gen đch sẽ được di truyền theo định luận Menđen theo
tỷ lệ phân ly 3:1 và có khả năng chọn lọc nhng dòng cây đồng hơp t của gen
đch ở thế hệ tiếp theo. Chọn lọc cây đồng hợp t nhằm tạo cơ sở gen đch được di
truyền và hoạt động một cách ổn định qua nhiều thế hệ là một trong nhng yêu cầu
quan trọng trong nghiên cứu phát trin cây chuyn gen thành giống. Vì nhng lí do
đó, trong nghiên cứu tiếp theo của đề tài đánh giá tỷ lệ phân ly của gen nptII trong
17 dòng cây chuyn gen RNAi TMV-CPi. Gieo 80 hạt của mi dòng cây trên môi

trường có bổ sung 50mg/l kanamycine và đánh giá tỷ lệ cây kháng/cây mẫn cảm
sau 4 tuần. Hai lô thí nghiệm đối chứng cũng được tiến hành song song. Lô thứ
nhất (WT-1) hạt thuốc lá K326 không chuyn gen được gieo trên môi trường MS
có bổ sung 50mg/l kanamycine và lô thứ 2 (WT-2) hạt được gieo trên môi trường
MS không có kháng sinh. Lô WT-1 vàng dần và chết sau 4 tuần ngược lại lô WT-2
cây con sinh trưởng và phát trin tốt. Nhng cây chuyn gen cũng có kiu hình
WT-2
WT-1
TMV2.6