bài báo cáo công nghệ enzyme và protein
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (2.31 MB, 46 trang )
!"#!
!
$%&#'
$&(
)*+, /0-123/44
MỤC LỤC
Trang 2
4$5&67!!89
4 +:-+;-<+=>+?2@-AB2@<@CC:CDE@*+F
a. Thực hành.
- Cân 5 g CPE cho vào cốc và tách bằng nước với tỉ lệ là 1:5, tức 5 g + 25
ml nước cất.
- Khuấy đều trong thời gian 30 phút.
- Lọc lấy dịch chiết và được thể tích là 21 ml.
- Tủa bằng cồn lạnh với tỷ lệ 1:3, tức 21 ml dịch chiết + 63 ml cồn lạnh.
- Cho hỗn hợp dung dịch trên vào bình erlen và giữ lạnh 30 phút.
- Tách lấy phần tủa ở phần dưới bình với thể tích là 25 ml và cho vào ống ly
tâm 50 ml.
- Đem cân phân tích được 33.4 g.
- Ly tâm 3000 vòng trong 10 phút.
- Tách lấy protein tủa, giữ lạnh để xác định hàm lượng protein và hoạt tính
enzyme trước sắc ký.
b. Kết quả.
Hình 1: Dịch chiết trong bình erlen
Trang 3
Hình 2: Dịch tủa protein trong ống ly tâm 50 ml
3 G HIJ >KD*@L-<+:?-
a. Thực hành.
• Hóa chất
- Dung dịch mẫu protein, cụ thể trong bài này là mẫu enzyme cellulose cần xác
định.
- Dung dịch albumin 0.1mg/ml: Cân chính xác 10mg albumine pha trong 100ml
nước cất. Lắc đều cho tan. Giữ ở 20
0
C. Khi dùng pha loãng 100 lần, được dung
dich albumine có nồng độ 0,01mg/ml.
- Dung dịch thuốc thử Bradford :
Coomassie Brilliant blue : 0,001g
Ethanl tuyệt đối 4,7g
Trang 4
Acid photphoric 85%: 8,5g.
- Phẩm màu Coomassie Brilliant Blue được làm tan trong ethanol trong chai đựng
có nắp, bổ sung acid photphoric 85% và chỉnh tới 100ml bằng nước cất.
• Thiết bị : máy quang phổ.
b. Lập đồ thị chuẩn.
Để dung dich albumine chuẩn có các nồng độ từ 10-50 µg/ml ta thực hiện như sau:
- Dựng đường chuẩn protein( Albumine):
Số ống Đối
chứng
1 2 3 4 5
Nồng độ albumin (µg) 0 10 20 30 40 50
V(ml) albumin 0 1 1 1 1 1
H
2
O (ml) 1 0 0 0 0 0
Thuốc thử Coomassie 2 2 2 2 2 2
c. Kết quả.
• Quan sát bằng mắt thường, theo thứ tự từ phải sang trái ta thấy: ống đối chứng có
màu xanh nhạt nhất, và các ống thí nghiệm từ ống số 1 đến ống số 5 có màu xanh
đậm dần như hình 3.
Hình 3: Kết quả so màu.
• Kết quả đo độ hấp thụ (OD) ở bước sóng 595 nm:
Trang 5
Số ống Đối chứng 1 2 3 4 5
OD 0 0.088 0.131 0.161 0.188 0.209
• Dựng đường protein chuẩn.
Dựa vào kết quả đo độ hấp thụ (OD) ở bước sóng 595 nm, ta dựng được đường
protein chuẩn như sau:
d. Nhận xét kết
quả:
• Dựa
vào kết
quả so
màu ta
thấy, nồng độ albumin càng cao thì màu xanh càng đậm.
• Dựa vào kết quả đo độ hấp thụ (OD) ta thấy, nồng độ albumin càng cao thì
chỉ số OD càng cao.
3. G HIJ <+:?-<MNHIJ .C:<DE@.
a. Thực hành.
• Hóa chất
- Cồn 96
0
C
- Sodium acetate
- Acid acetic 1M
- Cơ chất
- Dung dich cơ chất CMC pH5
Trang 6
- Dung dịch acid 2-hydroxy-3,5-dinitrobenzoic (DNS)
- Dung dịch lactose
- Dung dịch DNS-lactose
- Dung dịch enzyme
• Dụng cụ và thiết bị
- Máy ly tâm.
- Bộ ổn nhiệt, máy đo quang phổ, máy Vortex, pH kế, cân phân tích.
- Bếp điện.
- Chậu nước lạnh.
- Que khuấy thủy tinh.
b. Lập đồ thị chuẩn
• Hòa tan 100 ml glucose monohydrate với 80 ml nước cất và chuyển vào bình
định mức 100 ml, thêm nước cất đến vạch và lắc đều.
• Thực hiện một loạt 6 ống nghiệm.
Ống số ĐC 1 2 3 4 5
Nộng độ glucose (mg/ml) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
ml dd glucose (1mg/ml) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
ml nước cất 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5
ml dd CMC pH5 1 1 1 1 1 1
ml dd DNS-lactose 2 2 2 2 2 2
• Lắc đều các ống nghiệm này, đem đun sôi cách thủy trong 15 phút. Làm lạnh đến
nhiệt độ phòng bằng chậu nước lạnh. Đặt độ hấp thụ của ống đối chứng ở bước
sóng 540 nm bằng 0. Đo độ hấp thụ của các ống còn lại ở bước sóng 540 nm và
ghi lại kết quả.
Trang 7
c. Kết quả:
• Quan sát bằng mắt thường, theo thứ tự từ trái sang phải ta thấy: ống đối chứng có
màu vàng, các ống thí nghiệm có màu đỏ và đậm dần từ ống thí nghiệm số 1 đến
ống thí nghiệm số 5 như hình 4.
Hình 4: Kết quả so màu.
• Kết quả đo độ hấp thụ (OD) ở bước sóng 540 nm
Ống số ĐC 1 2 3 4 5
OD 0 0.149 0.253 0.392 0.504 0.675
• Dựng đường chuẩn đường glucose
Dựa vào kết quả đo độ hấp thụ (OD) đo ở bước sóng 540 nm, ta dựng được
đường chuẩn đường glucose như sau:
Trang 8
d. Nhận xét kết quả:
• Dựa vào kết quả so màu ta thấy, nồng độ đường glucose càng cao, đồng thời
thể tích đường glucose càng cao và thể tích nước cất càng giảm thì màu đỏ càng
đậm.
• Dựa vào kết quả đo độ hấp thụ (OD) ta thấy, nồng độ đường glucose càng
cao, đồng thời thể tích đường glucose càng cao và thể tích nước cất càng giảm thì
chỉ số OD càng cao.
Trang 9
OL3$#'PQR(S!"#!
4 Q-++IT UTL-+LV*HWH=-+DX**Y-+<MN@-AB2@Z[/
/
\]/
/
^
a. Nguyên tắc
- Dựa vào sự thủy phân cơ chất CMC của enzyme, ở những nhiệt độ khác nhau
là 30
0
C, 40
0
C, 50
0
C, 60
0
C, và 70
0
C. Cho kết quả so màu và chỉ số OD, khác
nhau ở bước sóng 540 nm.
b. Thực hành
- Chuẩn bị 7 ống nghiệm: 1 ống đối chứng, 1 ống không phản ứng với enzyme,
5 ống có phản ứng với enzyme.
• Ống đối chứng :
- Hút 1 ml H
2
O cho vào ống nghiệm.
- Thêm 2ml dung dich DNS-Lastose và lắc đều.
- Thêm 1 ml dung dịch CMC pH
5
vào ống nghiệm chứa enzyme và lắc
đều.
- Đem đun sôi cách thủy trong 15 phút. Làm lạnh đến nhiệt độ phòng
trong chậu nước lạnh. Đo độ hấp thụ ở bước sóng 540 nm.
• Ống nghiệm không có phản ứng enzyme
- Hút 1 ml dung dịch enzyme cho vào ống nghiệm đun sôi 10 phút để
bất hoạt enzyme.
- Thêm 2 ml dung dịch DNS-lactose và lắc đều.
- Thêm 1 ml dung dịch CMC pH
5
vào ống nghiệm chứa enzyme và lắc
đều.
- Đem đun sôi cách thủy trong 15 phút. Làm lạnh đến nhiệt độ phòng
trong một chậu nước lạnh. Đo độ hấp thụ ở bước sóng 540 nm.
• 5 ống nghiệm có phản ứng enzyme, được đánh số từ 1 đến 5.
- Hút 1 ml dung dịch enzyme cho vào ống nghiệm 1 và ủ ở nhiệt độ
phòng (30
0
C) trong 10 phút. Đồng thời, ta cũng để chai chứa dung dịch
CMC pH
5
thích hợp ở nhiệt độ phòng.
Trang 10
- Hút 1 ml dung dịch enzyme cho vào ống nghiệm 2 và ủ ở nhiệt độ
40
0
C trong 10 phút. Đồng thời, ta cũng để chai chứa dung dịch CMC
pH
5
thích hợp ở nhiệt độ 40
0
C.
- Hút 1 ml dung dịch enzyme cho vào ống nghiệm 3 và ủ ở nhiệt độ
50
0
C trong 10 phút. Đồng thời, ta cũng để chai chứa dung dịch CMC
pH
5
thích hợp ở nhiệt độ 50
0
C.
- Hút 1 ml dung dịch enzyme cho vào ống nghiệm 4 và ủ ở nhiệt độ
60
0
C trong 10 phút. Đồng thời, ta cũng để chai chứa dung dịch CMC
pH
5
thích hợp ở nhiệt độ 60
0
C.
- Hút 1 ml dung dịch enzyme cho vào ống nghiệm 5 và ủ ở nhiệt độ
70
0
C trong 10 phút. Đồng thời, ta cũng để chai chứa dung dịch CMC
pH
5
thích hợp ở nhiệt độ 70
0
C.
- Sau đó thêm 1 ml dung dịch CMC pH
5
vào 5 ống nghiệm chứa
enzyme trên và lắc đều.
- Để phản ứng ở nhiệt độ thích hợp chính xác 10 phút.
- Thêm 2 ml dung dịch DNS-lastose và lắc đều để ngừng phản ứng
enzyme.
- Đem đun sôi cách thủy trong 15 phút. Làm lạnh đến nhiệt độ phòng trong
một chậu nước lạnh. Đo độ hấp thụ ở bước sóng 540 nm.
c. Kết quả
- Quan sát bằng mắt thường, từ phải sang trái theo thứ tự lần lượt là: ống đối
chứng và ống không phản ứng có màu vàng, từ ống thí nghiệm số 1 ở 30
0
C
đến ống nghiệm số 4 ở 60
0
C màu đỏ đậm dần, và ống nghiệm số 5 ở 70
0
C
màu đỏ nhạt dần như hình 5.
Hình 5: Kết quả so màu.
Trang 11
- Kết quả đo độ hấp thụ (OD) ở bước sóng 540 nm là:
Số ống ĐC KPƯ
30
0
C 40
0
C 50
0
C 60
0
C 70
0
C
OD 0 0.232 1.15 1.431 1.55 1.568 1.515
d. Tính toán kết quả
Dựa vào chỉ số OD ở các nhiệt độ khác nhau 30
0
C,40
0
C, 50
0
C, 60
0
C,
70
0
C và chỉ số OD của ống không phản ứng, ta tính được chỉ số OD
lần lượt là:
OD
30
= 0.918
OD
40
= 1.199
OD
50
= 1.138
OD
60
=1.336
OD
70
= 1.285
Thế vào phương trình: y = 1.303x + 0.003 ta được:
X
30
Tương tự cách tính trên ta được:
X
40
= 0.92
X
50
= 0.87
X
60
= 1.023
X
70
= 0.98
Mặt khác ta có phương trình :
U= ( A
t
– A
0
)*F *
Thế x vào phương trình U ta được:
Trang 12
U
30
= 0.702*0.75*
U
40
= 153.4
U
50
=199.9
U
60
= 222.7
U
70
= 213.8
e. Vẽ đồ thị.
Dựa vào chỉ số U và nhiệt độ ta vẽ được đồ thị:
f. Biện luận sơ đồ:
• Dựa vào đồ thị ta thấy:
- Hoạt tính eyme đạt cực đại ở nhiệt độ 60
0
C. Vì ở nhiệt độ này hoạt
tính enzyme thủy phân tốt nhất.
- Ở nhiệt độ 30
0
C, 40
0
C, 50
0
C, 70
0
C không đủ nhiệt độ cho enzyme thủy
phân. Vì vậy hiệu suất thủy phân giảm.
- Ở nhiệt độ 70
0
C thì enzyme dần dần bị biến tính nên hiệu suất thủy
phân giảm dần.
g. Đánh giá kết quả:
Dựa vào kết quả so màu ta thấy:
Trang 13
- Mẫu đối chứng có màu vàng là màu của thuốc thử DNS pha loãng với
1ml nước cất.
- Ống không phản ứng có màu vàng đậm, chứng tỏ ở đây hoạt tính
enzyme bị bất hoạt nên không xảy ra quá trình thủy phân giữa enzyme
và dung dịch CMC pH
5
.
- Ống có phản ứng với enzyme từ nhiệt độ 30, 40 và 50
0
c có màu đỏ
đậm dần theo thứ tự từ nhiệt độ 30, 40 đến 50
0
C. Chứng tỏ nhiệt độ
tăng dần từ 30, 40 đến 50
0
C thì hoạt tính enzyme tăng dần.
- Ở nhiệt độ 60
0
C màu đỏ đậm nhất, chứng tỏ ở nhiệt độ này hoạt tính
enzyme hoạt động mạnh nhất. Enzyme thủy phân dung dịch CMC
càng mạnh làm cho màu của dung dịch có màu đỏ đậm.
- Ở nhiệt độ 70
0
C màu đỏ nhạt dần, chứng tỏ hoạt tính enzyme giảm dần. Vì
nhiệt độ càng cao thì enzyme bị biến tính.
3 Q-++IT <MN>H=-+DX**Y-+<MN@-AB2@Z>
[
\>
_
^
a. Nguyên tắc
Dựa vào sự thủy phân cơ chất CMC của enzyme cellulose, trong dung dịch
các đệm Na-acetate có pH 3, 4, 5, 6, 7, 8. Cho kết quả so màu khác nhau ở
bước sóng 540 nm.
b. Thực hành
- Chuẩn bị 13 ống nghiệm: 1 ống đối chứng, 6 ống không phản ứng với
enzyme và 6 ống có phản ứng với enzyme.
• Ống đối chứng :
- Hút 1 ml H
2
O cho vào ống nghiệm.
- Thêm 2ml dung dich DNS-Lastose và lắc đều.
- Thêm 1ml CMC pH5 vào ống nghiệm và lắc đều.
- Đo độ hấp thụ ở bước sóng 540 nm.
• 6 ống không phản ứng được đánh số thứ tự từ 1 đến 6.
- Hút 1ml dung dịch enzyme cho vào 6 ống nghiệm và đun sôi 10 phút để bất
hoạt enzyme.
Trang 14
- Thêm 2ml dung dịch DNS-lactose vào 6 ống nghiệm và lắc đều.
- Thêm 1ml dung dịch CMC pH
3
vào ống nghiệm số 1 và lắc đều.
- Thêm 1ml dung dịch CMC pH
4
vào ống nghiệm số 2 và lắc đều.
- Thêm 1ml dung dịch CMC pH
5
vào ống nghiệm số 3 và lắc đều.
- Thêm 1ml dung dịch CMC pH
6
vào ống nghiệm số 4 và lắc đều.
- Thêm 1ml dung dịch CMC pH
7
vào ống nghiệm số 5 và lắc đều.
- Thêm 1ml dung dịch CMC pH
8
vào ống nghiệm số 6 và lắc đều.
- Đem đun sôi cách thủy tất cả 6 ống nghiệm trong 15 phút. Làm lạnh
đến nhiệt độ phòng trong chậu nước lạnh. Đo độ hấp thụ ở bước sóng
540 nm.
• 6 ống phản ứng được đánh số thứ tự từ 1 đến 6.
- Hút 1 ml dung dich enzyme cho vào ống nghiệm và ủ ở nhiệt độ 40
0
C
trong 10 phút. Đồng thời, ta cũng để chai chứa dung dịch: CMC pH
3
,
CMC pH
4
, CMC pH
5
, CMC pH
6
, CMC pH
7
, CMC pH
8
, thích hợp ở
40
0
C trong 10 phút.
- Thêm 1 ml dung dịch CMC pH
3
vào ống nghiệm 1 chứa enzyme và lắc
đều.
- Thêm 1 ml dung dịch CMC pH
4
vào ống nghiệm 2 chứa enzyme và lắc
đều.
- Thêm 1 ml dung dịch CMC pH
5
vào ống nghiệm 3 chứa enzyme và lắc
đều.
- Thêm 1 ml dung dịch CMC pH
6
vào ống nghiệm 4 chứa enzyme và lắc
đều.
- Thêm 1 ml dung dịch CMC pH
7
vào ống nghiệm 5 chứa enzyme và lắc
đều.
- Thêm 1 ml dung dịch CMC pH
8
vào ống nghiệm 6 chứa enzyme và lắc
đều.
- Để phản ứng ở 40
0
C chính xác 10 phút.
- Thêm 2 ml dung dịch DNS-lastose vào 6 ống nghiệm và lắc đều để
ngừng phản ứng enzyme.
Trang 15
- Đem đun sôi cách thủy tất cả 6 ống nghiệm trong 15 phút. Làm lạnh
đến nhiệt độ phòng trong một chậu nước lạnh. Đo độ hấp thụ ở bước
sóng 540 nm.
c. Kết quả:
• Quan sát bằng mắt thường, theo thứ tự từ trái sang phải ta thấy: ống đối chứng có
màu vàng và 6 ống nghiệm không phản ứng với enzyme, từ ống số 1 đến ống số
2 có màu vàng đậm dần. Từ ống số 3 đến ống số 6 màu vàng nhạt dần như hình
6.
Hình 6: Kết quả so màu của ống ĐC và 6 ống nghiệm không phản ứng.
• Quan sát bằng mắt thường, theo thứ tự từ trái sang phải ta thấy: ống đối chứng có
màu vàng và 6 ống nghiệm có phản ứng với enzyme có màu đỏ. Từ ống số 1 ở
Trang 16
pH
3
đến ống số 2 ở pH
4
màu
đỏ đậm dần, từ ống số 3 ở pH
5
đến ống số 6 ở pH
8
màu đổ nhạt dần như hình 7.
Hình 7: Kết quả so màu của ống đối chứng và 6 ống nghiệm có phản ứng.
• Kết quả đo độ hấp thụ (OD) ở bước sóng 540nm:
Số ống nghiệm pH
3
pH
4
pH
5
pH
6
pH
7
pH
8
Không phản ứng 0.453 0.394 0.315 0.398 0.372 0.391
Phản ứng 0.939 0.958 0.837 0.641 0.382 0.517
d. Tính toán kết quả.
Dựa vào kết quả chỉ số OD và phương trình y = 1.303x + 0.003.
Ta có:
- Tại pH=3: ∆OD= 0.939 – 0.453 = 0.486
X
1
= 0.486
- Tại pH=4: ∆OD= 0.958 – 0.394 =0.564
X
2
= 0.564
- Tại pH=5: ∆OD= 0.837- 0.398 =0.439
X
3
=0.492
- Tại pH = 6: ∆OD = 0.641-0.398=0.243
X
4
=0.3012
- Tại pH = 7: ∆OD = 0.382-0.372=0.01
X
5
=0.21
-Tại pH = 8: ∆OD = 0.517-0.391= 0.126
X
6
=0.126
Trang 17
Từ đó ta tính được:
U
1
=81
U
2
=94
U
3
=82
U
4
=50.2
U
5
=35
U
6
=21
e. Vẽ sơ đồ:
dựa vào chỉ số u và pH ta vẽ được sơ đồ sau:
f. Biện luận sơ đồ:
- Theo đồ thị trên, ở pH=4 thì enzyme có hoạt tính cao nhất, mà pH tối ưu là pH
có hoạt tính enzyme cao nhất.
- Vượt quá pH tối ưu thì hoạt tính của enzyme sẽ giảm. Vì vậy trong môi trường
càng kiềm hay càng acid thì hoạt tính của enzyme sẽ giảm.
[ Xác định hàm lượng protein trước sắc ký.
a. Nguyên tắc:
Các protein khi phản ứng với xanh Coomassie sẽ hình thành hợp chất màu có khả
năng hấp thục ánh sáng ở bước sóng 595nm, cường độ màu tỷ lệ với nồng độ
protein trong dung dịch. Phương pháp có độ nhạy cao cho phép phát hiện tới vài
µg protein/ml,dễ thực hiện và tiết kiệm thời gian.
b. Thực hành:
- Lấy tủa protein thu được ở bài 1, hòa trong đệm và pha loãng 100 lần,
sau đó tiến hành xác định hàm lượng protein trước sắc ký.
- Chuẩn bị 2 ống nghiệm gồm: 1 ống đối chứng và 1 ống thực nghiệm
• Ống nghiệm đối chứng: chỉnh quang phổ kế về độ hấp thụ bằng 0.
- Hút 1 ml nước cất cho vào ống nghiệm.
Trang 18
- Thêm 2 ml thuốc thử Coomassie.
- Đo độ hấp thụ ở bước sóng 595 nm.
• Ống thực nghiệm: phản ứng enzyme.
- Hút 1ml dung dịch enzyme cho vào ống nghiệm.
- Thêm 2 ml thuốc thử Coomassie.
- Đo độ hấp thụ ở bước sóng 595 nm.
c. Kết quả:
- Quan sát bằng mắt thường, theo thứ tự từ trái sang ta thấy, ống đối
chứng có màu xanh nhạt và ống thực nghiệm có màu xanh như ở hình
8.
Hình 8: Kết quả so màu
- Kết quả đo độ hấp thụ ở bước sóng 595 nm có OD = 0.25
d. Tính toán kết quả thu được:
Đường chuẩn protein có dạng y = Ax + B
Ta có đường chuẩn protein là: y = 0.003x + 0.0657
Ta lại có: OD = 0.25
Trang 19
Suy ra: x = = 61.4 ( µg/ml )
Vì được pha loãng 100 lần nên:
x = 61.4 (µg/ml)* 100 * 10 (ml) = 61400 ( µg ) = 61.4 (mg)
Vậy tổng hàm lượng protein là: = 61.4 (mg)
0 5,<H`-++DX**Y-+@-AB2@*KIa<Eb<cd
i. Nguyên tắc:
Phương pháp này dựa vào sự thủy phân cơ chất carboxymethyl cellulose bởi
enzyme carboxymethyl cellulose ở pH
5
và 40
0
C. Lượng đường khử sinh ra
được cho phản ứng với acid 2-hydroxy-3,5-dinitrobeenzoic, màu sinh ra sau
phản ứng được xác định bằng phương pháp so màu trên quang phổ kế ở bước
sóng 540nm.
ii. Thực hành:
- Lấy tủa protein thu được ở bài 1, hòa trong đệm và pha loãng 100 lần,
sau đó tiến hành xác định hoạt tính enzyme trước sắc ký.
- Chuẩn bị 3 ống nghiệm: 1 ống đối chứng, 1 ống không phản ứng, 1
ống phản ứng.
• Ống nghiệm đối chứng: chỉnh quang phổ kế về độ hấp thụ bằng 0.
- Hút 1 ml nước cho vào ống nghiệm.
- Thêm 2 ml dung dịch DNS-lastose và lắc đều.
- Thêm 1 ml dung dịch CMC pH
5
vào ống nghiệm chứa enzyme và lắc
đều.
- Đem đun sôi cách thủy trong 15 phút. Làm lạnh đến nhiệt độ phòng
trong cốc nước mát. Đo độ hấp thụ ở bước song 540 nm.
• Ống nghiệm không có phản ứng enzyme
- Hút 1 ml dung dịch enzyme cho vào ống nghiệm đun sôi 10 phút để
bất hoạt enzyme.
Trang 20
- Thêm 2 ml dung dịch DNS-lactose và lắc đều.
- Thêm 1 ml dung dịch CMC pH
5
vào ống nghiệm chứa enzyme và lắc
đều.
- Đem đun sôi cách thủy trong 15 phút. Làm lạnh đến nhiệt độ phòng
trong một cốc nước lạnh. Đo độ hấp thụ ở bước song 540 nm.
• Ống nghiệm có phản ứng enzyme.
- Hút 1 ml dung dich enzyme cho vào ống nghiệm và ủ ở nhiệt độ 40
0
C
trong 10 phút. Đồng thời, ta cũng để chai chứa dung dịch CMC pH
5
thích hợp ở 40
0
C trong 10 phút.
- Thêm 1 ml dung dịch CMC pH
5
vào ống nghiệm chứa enzyme và lắc
đều.
- Để phản ứng ở 40
0
C chính xác 10 phút.
- Thêm 2 ml dung dịch DNS-lastose và lắc đều để ngừng phản ứng
enzyme.
- Đem đun sôi cách thủy trong 15 phút. Làm lạnh đến nhiệt độ phòng
trong một cốc nước lạnh. Đo độ hấp thụ ở bước sóng 540 nm.
iii. Kết quả:
- Quan sát bằng mắt thường ta thấy: ống đối chứng có màu vàng là màu
của dung dịch DNS-lastose pha loãng với 1 ml nước cất. Ống không
có phản ứng có màu vàng là màu vàng của DNS-lastose, chứng tỏ ở
đây enzyme bị bất hoạt nên không xảy ra quá trình thủy phân giữa
enzyme và dung dịch CMC pH
5
. Ống có phản ứng có màu đỏ, chứng
tỏ ở đây có xảy ra quá trình thủy phân giữa enzyme và dung dịch CMC
pH
5,
như hình 9.
Trang 21
Hình 9: Kết quả so màu
- Kết quả đo độ hấp thụ ở bước sóng 540 nm:
+ Ống không phản ứng có OD = 0.036
+ Ống phản ứng có OD = 1.541
iv. Tính toán kết quả thu được:
Dựa vào phương trình: y = 1.303x + 0.003
Ta có: OD
kpư
= 0.036
OD
pư
= 1.541
Suy ra OD = 1.505
Ta có phương trình: u = A
t
– A
0
* F * * * *
Trang 22
Tính F:
F = = 0.75
Thay vào phương trình ta có:
x = = 1.15
Thế vào phương trình u ta được:
U = 1.15 * 0.75 * * * * 100 * 10 = 645.8
Vậy tổng hoạt tính của enzyme là: = 645.8
Ta có hoạt tính riêng là:
Hoạt tính riêng = = = 10.52
Trang 23
Trang 24
OL[$ ef6!6 !5gh/
4 Ia<Hi:*L-+EX<+@-AB2@<@CC:CDE@Uj Eb<cdCk<.@C
a. Nguyên tắc
Kỷ thuật sắc ký lọc gel dùng để tách những phân tử có kích thước,
trọng lượng phân tử khác nhau bằng cách cho chúng đi qua cột gel.
Những phân tử có kích thước đủ nhỏ để lọt vào bên trong lỗ gel sẽ
bị trì hoãn và di chuyển chaamjqua cột, trong khi những phân tử
lớn hơn di chuyển bên ngoài các hạt gel nên sẽ di chuyển nhanh và
được giải hấp ra khỏi cột sớm hơn các phân tử nhỏ.
b. Thực hành
• Dụng cụ và thiết bị
- Phễu đổ gel
- Bình hút chân không
- Cột sắc ký Bio-Rad, kích thước 30*1.5 cm, thể tích: 53 ml.
- Bình đựng dung dịch đệm
- Ống nghiệm 20 cái vòi hút chân không để khử bọt khí cho các dung
dịch.
• Hóa chất
- Gel “Sephadex G-100”.
- Đệm Acetate 50 mM pH
5
, đuổi bọt khí để tách enzyme tốt hơn.
• Chuẩn bị gel
- Cân 5g gel “Sephadex G-100” khô, cho bột gel từ từ vào dung dịch
đệm acetate 50Mm, pH 5.0 đựng trong cốc. Dùng dung dịch đệm
acetate pH 5.0 nhiều gấp 2 lần so với thể tích lớp nền gel cần cho trong
cột. Cụ thể dùng ít nhất 53*2=106 ml dung dịch đệm.
- Sau khi quá trình hydrat hóa xãy ra hoàn toàn, gạn lớp nổi trên bề mặt.
Chuyển dung dịch vào một bình nút hút chân không có gắn với vòi hút
chân không. Khử khí của dung dịch trong khoảng từ 5 phút-10 phút,
Trang 25
