Định danh VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS bằng phương pháp hiện đại và truyền thống

BỘ CÔNG THƯƠNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM

PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH
DANH VIBRIO
PARAHAEMOLYTICUS
GVHD: Hồng Xn Thế
Nhóm thực hiện: Nhóm 11
⸙
⸙
⸙
⸙
⸙

Bế Thị Hoài Thương
Đào Vũ Thùy Trang
Trần Thị Thảo Tiên
Lê Thị Bảo Trân
Nguyễn Thị Thu Thủy


NỘI DUNG
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.

Tình hình ơ nhiễm
Đặc điểm
Cơ sở phân tích
Quy trình phân tích
Thiết bị, dụng cụ, mơi trường
Ví dụ, giải thích quy trình
An tồn trong phân tích
Kết luận


1. TÌNH HÌNH Ơ NHIỄM
Vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus là
một loại vi khuẩn trong cùng một
nhóm với những vi khuẩn gây ra bệnh
tả, vi khuẩn có hình que hơi cong như
dấu phẩy và ngắn, là vi khuẩn gram
âm, không sinh nha bào, di động nhờ
một lông ở một đầu. Chúng sinh sống,
phát triển tốt trong môi trường kiềm
và mặn, tồn tại trong nước biển và các
động vật biển như tôm, cá, ốc, sị...và
bị chết ở 650C sau 10 phút, chúng
khơng phát triển được ở nhiệt độ dưới
150C.


Tình hình trong nước và ngồi nước

Tình hình ngồi
nước

 Vibrio
parahaemolyticus
được Tsunesaburo
Fujino phát hiện lần
đầu tiên vào năm
1950.
 Ở Nhật Bản ghi
nhận 272 ca bệnh

Tình hình trong nước
 Vụ ngộ độc thức ăn tập thể
do ăn tôm rang bị nhiễm
Vibrio parahaemolylicus ở
Hải Phòng năm 1983.
 Năm 2002, ghi nhận 548
trường hợp tiêu chảy, khi
xét nghiệm có 53% dương
tính với V.parahemolyticus.


Các yếu tố nguy cơ gây nhiễm
Thói quen ăn
hải sản sống
hoặc chưa nấu
chín

Nhiễm khuẩn
trong q trình
chế biến thức
ăn và bảo quản

các loại hải sản

Lây nhiễm
chéo do vi
khuẩn phát
triển ở các thực
phẩm khác

Có tiền sử các
bệnh mãn tính.


2. ĐẶC ĐIỂM

Vibrio là vi sinh vật Gram âm,
hình que hai đầu khơng đều
nhau tạo hình dấu phẩy, di
động, sống kị khí tùy ý, có
phản ứng catalase và oxidase
(+), lên men glucose nhưng
không sinh hơi, không sinh
H2S,
nhạy
cảm
với
Vibriostaticum O/129. Vibrio
Parahaemolyticus cần muối để
tăng trưởng và thường xuyên
được phân lập từ các vùng
ven biển.

6


Phản ứng ADH (-), LDC
Vibrio
parahaemolyticus có (+) có khả năng khử
phản ứng oxidase (+), nitrate thành nitrite
phát triển được trong nhưng không lên men
sucrose…
canh trypton ở 240C.


3. CƠ SỞ PHÂN TÍCH


3.1. Phương pháp truyền thống.

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 79051:2008 ISO /TS 21872-1:2007
Vi sinh vật trong thực phẩm và thức
ăn chăn ni – phương pháp phát hiện
vibrio spp. có khả năng gây bệnh
đường ruột – phần 1: phát hiện vibrio
parahaemolyticus

9

3.2. Phương pháp hiện đại

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710
-19:2019

( xuất bản lần 1) Bệnh thủy sản – Quy
trình chuẩn đốn – Phần 19: Bệnh hoại
tử gan tụy cấp tính ở tôm.


3.1. Phương pháp truyền thống.

Phạm vi áp dụng
• Tiêu chuẩn này quy định phương pháp phát hiện lồi Vibrio chính gây bệnh
đường ruột của người: V. parahaemolytius.
• Tiêu chuẩn này có thể áp dụng cho:
• Các sản phẩm thực phẩm hoặc thức ăn chăn ni.
• Các mẫu mơi trường trong khu vực chế biến và vận chuyển thực phẩm.
Thuật ngữ và định nghĩa
• Vibrio parahaemolyticus có khả năng gây bệnh đường ruột:Vi sinh vật tạo
thành các khuẩn lạc điển hình trên môi trường đặc chọn lọc và cho thấy các
đặc tính sinh hóa như đã mơ tả, khi tiến hành theo tiêu chuẩn này.
• Phát hiện Vibrio parahaemolyticus có khả năng gây bệnh đường ruột: Xác
định sự có mặt hay khơng có mặt của Vibrio parahaemolyticus trong một
lượng sản phẩm xác định, khi tiến hành thử theo tiêu chuẩn này.
10


11


3.1. Phương pháp truyền thống

12

Tài liệu viễn dẫn

Nguyên tắc

• TCVN 6263 (ISO 8261), Sữa và sản phẩm
sữa – Hướng dẫn chung về chuẩn bị mẫu
thử, huyền phù ban đầu và các dung dịch
pha loãng thập phân để kiểm tra vi sinh.
• TCVN 6404 (ISO 7218), Vi sinh vật trong
thực phẩm và thức ăn chăn nuôi – Yêu cầu
chung và hướng dẫn kiểm tra vi sinh vật.
• TCVN 6507 (ISO 6887) (tất cả các phần),
Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn
chăn nuôi – Chuẩn bị mẫu thử, dung dịch
huyền phù ban đầu và các dung dịch pha
loãng thập phân để kiểm tra vi sinh vật.

• Vibrio parahaemolyticus có thể có mặt
một lượng nhỏ và thường đi kèm với một
lượng lớn đáng kể các loài vi sinh vật khác
thuộc họ Vibrionaceae hoặc các họ khác.
• Do đó, cần phải có hai bước tăng sinh
chọn lọc liên tiếp để phát hiện các vi sinh
vật đích này.


3.1. Phương pháp hiện đại

Phạm vi áp dụng:
Tiêu chuẩn này quy định quy trình chuẩn đốn bệnh hoại tử gan tụy cấp tính ở

tơm (AHPND) do vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây ra
Tiêu chuẩn này cũng có thể áp dụng cho mẫu nước, bùn hay thức ăn cho tôm.

Thuật ngữ và định nghĩa:
Trong tiêu chuẩn này sử dụng thuật ngữ và định nghĩa như sau:
Bệnh hoại tử gan tụy cấp tính ở tôm là bệnh gây nên hội chứng chết sớm
( EMS) do vi khuẩn V.parahaemolyticus độc lực plasmid chứa gen sinh độc tố.
Vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus là vi khuẩn gram âm, hình que, họ
vibrionaceae.
13


3.1. Phương pháp hiện đại

Phản ứng PCR
Nguyên Tắc

14

Vi khuẩn V.parahaemolyticus gây bệnh
hoại tử gan tụy cấp tính ở tơm được phát
hiện thông qua kỹ thuật PCR, với ADN
được tách chiết từ canh tăng sinh hoặc từ
mẫu mô bệnh của tôm với các biểu hiện
triệu chứng điển hình nhằm rút ngắn tối đa
thời gian xét nghiệm


4. QUY TRÌNH PHÂN
TÍCH

PHƯƠNG PHÁP SỬ
DỤNG MÔI
TRƯỜNG TCBS

4.1


Quy trình
phân tích


B1. CHUẨN BỊ
Lấy một phần mẫu thử (x g hoặc x ml), đồng hóa trong vào 9x ml
(hoặc 9x g) môi trường tăng sinh.
Trường hợp đối với các lượng mẫu thử lớn hơn, thì cần làm ấm mơi
trường ASPW đến 370C trước khi cấy mẫu thử.
Để giảm bớt công đoạn kiểm tra, khi tra kiểm tra nhiều phần mẫu
thử 25g từ cùng không làm thay đổi các kết quả liên quan đến sản
phẩm cụ thể này, thì có thể trộn các phần mẫu thử.
Nếu có 10 phần mẫu thử 25g cần kiểm tra, thì có thể gộp 10 phần
đó để thu được mẫu tổng thể 250g và bổ sung 2,25 l môi trường
tăng sinh.


B2. Tăng sinh chọn lọc lần thứ nhất:
Ủ huyền phù ban đầu ở 370C trong 6h ± 1h đối với các sản
phẩm đông lạnh sâu hoặc ở 41,50C trong 6h ± 1h đối với
sản phẩm tươi, khô hoặc sản phẩm đã ướp muối.

B3. Tăng sinh chọn lọc lần thứ hai:
Chuyển 1 ml dịch cấy thu được trong tăng sinh chọn lọc lần
thứ nhất được lấy từ bề mặt cho vào ống nghiệm chứa 10
ml môi trường ASPW.
Ủ trong môi trường ASPW trong 18h ± 1h ở nhiệt độ 41,50C


B4. PHÂN LẬP
-

Dùng vòng lấy mẫu lấy dịch cấy thu được trong ASPW cấy lên bề mặt
thạch TCBS.
- Tiến hành tương tự với môi trường phân lập chọn lọc thứ hai sử dụng
vòng lấy mẫu mới.
- Lật ngược các đĩa thạch. Trong trường hợp các đĩa thạch TCBS (lần tăng
sinh thứ nhất và thứ hai) thì đặt chúng vào tủ ấm ở 37 0C. Đối với môi
trường phân lập thứ hai thì theo chỉ dẫn của nhà sản xuất.
- Các
Saukhuẩn
khi ủ 24h
± 3h,nhẵn,
kiểm tra
lạc trơn
có các
màuđĩa về sự có mặt các khuẩn lạc điển
hình(âm
của tính
V. parahaemolyticus
định gây bệnh. Đánh dấu các vị trí này

xanh
sacaroza), đườnggiả
kính
đáy
đĩa.
từdưới
2 mm
đến
3 mm

20


B5. KHẲNG
ĐỊNH
Cấy ria các khuẩn lạc đã chọn lên bề mặt các đĩa thạch TSA chứa 1% NaCl
hoặc mặt nghiêng của thạch để thu được các khuẩn lạc tách biệt.
Ủ ấm các đĩa đã cấy ở 370C trong 24h ± 3h.
Thử nghiệm sinh hố: trên thạch TSI
Dùng que cấy vịng, cấy từng dịch cấy thu được từ các khuẩn lạc
được giữ lại vào môi trường TSI.
Cấy đâm sâu xuống đáy ống thạch và cấy ria theo mặt nghiêng của
thạch.
Ủ ở 370C trong 24h ± 3h.

21


Thử nghiệm H2S

Thử nghiệm khả năng lên men đường

22

Thử nghiệm Decarboxylase

Phát hiện indol


Thử nghiệm kháng huyết thanh
Nhỏ một giọt kháng huyết thanh lên lam kính
sạch và một giọi nước muối sinh lý lên một vị
trí khác của lam. Dùng que cấy vơ trùng
khác nhau chuyển vi khuẩn từ TSA lên hai
giọt dung dịch trên rồi phân tán đều vi
khuẩn. Kết luận dương tính khi có hiện tượng
ngưng kết ở giọt kháng huyết thanh và
khơng có hiện tượng ngưng kết ở giọt nước
muối. sử dụng chủng chứng dương và chủng
chứng âm trong qua trình thực hiện

23


B6. BIỂU THỊ KẾT
QUẢ

Theo diễn giải các kết quả, ghi lại sự có mặt hay khơng có mặt V.
parahaemolyticus có khả năng gây bệnh đường ruột có trong x g
hoặc x ml sản phẩm.

Cần lưu ý Vibrio là nhóm chứa các dòng gây bệnh nên cần tuân thủ
triệt để các biện pháp an toàn khi làm việc với các chủng Vibrio dùng
làm đối chứng (+) cũng như thao tác trên các chủng phân lập được.
Các môi trường hay mẫu vật sau nuôi cấy cần phải hấp khử trùng cẩn
thận trước khi rửa.

24


Phương pháp PCR điện di

4.2