Thuc hanh CN enzyme 2020
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (474.01 KB, 20 trang )
Trường Đại Học Nông Lâm TPHCM
Khoa Công Nghệ Thực Phẩm
BỘ MƠN HĨA SINH THỰC PHẨM
GIÁO TRÌNH THỰC TẬP
CÔNG NGHỆ ENZYME
(Lưu hành nội bộ)
2020
0
Bài 1
KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA YẾU TỐ NGOẠI CẢNH
ĐẾN HOẠT TÍNH CỦA ENZYME
1. Tính Đặc Hiệu Của Enzyme
1.1. Nguyên tắc
Tính đặc hiệu của enzyme thể hiện ở điểm mỗi enzyme chỉ tác dụng lên một cơ
chất nhất định. Chẳng hạn amylase chỉ thủy phân polysaccharide mà không tác dụng lên
disaccharide.
Saccharose không cho phản ứng với Fehling vì trong phân tử không có nhóm
cetose hoặc aldehide tự do. Phản ứng này chỉ dương tính khi saccharose đã được thủy phân
thành glucose và fructose.
1.2. Hóa chất
-
dung dịch saccharose 1%
-
dung dịch tinh bột 1%
-
dung dịch Fehling A và B
-
dung dịch amylase
Cho vào hai ống nghiệm, mỗi ống 0,5 ml dung dịch amylase. Thêm 1 ml dung dịch
tinh bột 1% vào ống thứ nhất và 1 ml dung dịch saccharose 1% vào ống thứ hai. Đặt 2 ống
vào bồn ổn nhiệt ở 37 oC trong 5-10 phút.
Sau đó đem hai ống ra làm phản ứng Fehling. So sánh kết quả giữ 2 ống. Nhận xét.
2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của enzyme
2.1. Nguyên tắc
Vận tốc của phản ứng enzyme thường tăng khoảng hai lần khi nhiệt độ tăng
khoảng 100C. Ở nhiệt độ thấp, ví dụ khoảng 0 oC, vận tốc xúc tác của men rất thấp, coi như
không đáng kể. Nhưng ở nhiệt độ này, enzyme được bảo quản tốt. Ở 40-50oC, enzyme
hoạt động mạnh nhất, cao hơn 50 oC, enzyme bắt đầu biến tính, vận tốc xúc tác giảm dần.
Đến 60-80 oC, enzyme mất khả năng hoạt động. Ở 100 oC, enzyme bắt đầu mất tác dụng.
2.2. Hóa chất
-
dung dịch tinh bột 1%
-
dung dịch amylase
1
2.3. Tiến hành
Lấy 2 ống nghiệm, cho vào:
- ống 1: 1 ml dung dịch hồ tinh bột 1%
- ống 2: 0,5 ml dung dịch amylase đã pha loãng và 0,5 ml dung dịch đệm pH 7
Đặt cả 2 ống vào bình ổn nhiệt ở 30 oC trong 5 phút. Sau đó trộn 2 ống vào nhau và
tiến hành khảo sát hoạt tính của enzyme dưới ảnh hưởng của nhiệt độ bằng cách xác định thời
gian thủy giải của amylase.
Phương pháp xác định thời gian thủy giải của amylase: Cứ sau mỗi 1 phút, nhỏ 1
giọt dung dịch lugol (hoặc iod) lên mặt kiếng, sau đó nhỏ vào đó 1 giọt hỗn hợp dung dịch .
Khi nào không thấy màu xanh xuất hiện nữa là lúc tinh bột đã bị thủy phân hoàn toàn bởi
amylase.
Tương tự như vậy, khảo sát ở các mức nhiệt độ khác như: 60 oC, 90oC
Vẽ đường biểu diễn sự biến thiên của thời gian thủy giải (phút) đối với nhiệt độ. Nhận
xét. Giải thích.
3. Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của enzyme
3.1. Nguyên tắc
Hoạt tính cuûa enzyme thể hiện trong vùng pH tương đối hẹp là pH tối ưu. pH tối ưu
của một số enzyme như pepsin là 1,2-2,5; catalase 7,0; trypsin 8,0-9,0…
Mức độ ion hóa của các enzyme phụ thuộc vào mơi trường. Enzyme có thể có hoạt
tính cao khi ở dạng tích điện dương hay tích điện âm hoặc ở trạng thái đẳng điện.
3.2. Hóa chất
-
dung dịch tinh bột 1%
-
dung dịch amylase
-
dung dịch lugol (KI 2,65g; I 2 0,05g; nước cất vừa đủ 100ml)
3.3. Tiến hành
Lấy 3 ống nghiệm, cho vào:
- ống 1: 1 ml dung dịch hồ tinh bột 1% và 1 ml dung dịch đệm pH 4
- ống 2: 1 ml dung dịch hồ tinh bột 1% và 1 ml dung dịch đệm pH 6
- ống 3: 1 ml dung dịch hồ tinh bột 1% và 1 ml dung dịch đệm pH 8
Sau đó cho vào mỗi ống 1 ml dung dịch enzyme amylase đã pha loãng.
Tiến hành khảo sát hoạt tính của enzyme dưới ảnh hưởng của pH bằng cách xác định
thời gian thủy giải của amylase (tương tự thí nghiệm 2).
Vẽ đường biểu diễn sự biến thiên của thời gian thủy giải (phút) đối với pH. Nhận xét.
Giải thích.
2
4. Ảnh hưởng của chất hoạt hóa và chất ức chế đến hoạt tính của enzyme
Chất hoạt hóa là chất có khả năng làm tăng cường tác dụng của enzyme. Chúng có bản
chất hóa học khác nhau. Thí dụ ion Cl - đối với - amylase, glutathion đối với nhiều protease
thực vật, cystein đối với nhiều loại enzyme có nhóm –SH hoạt động….
Chất ức chế là chất kìm hãm phản ứng xúc tác của enzyme, làm giảm ái lực của
enzyme đối với cơ chất hoặc làm enzyme mất khả năng kết hợp với cơ chất. Thí dụ các ion
Ag2+, Hg2+, Pb2+… là chất ức chế của hầu hết các enzyme.
4.1. Nguyên tắc
Amylase của nước bọt (- amylase) sẽ tăng hoạt động trong mơi trường có NaCl,
ngược lại CuSO4 sẽ ức chế tác dụng của enzyme này.
Trong 3 ống nghiệm có chứa - amylase và tinh bột. Nếu ta cho NaCl vào ống thứ
nhất, CuSO4 vào ống thứ hai, và nước vào ống thứ 3 thì sau cùng một thời gian tác dụng ta sẽ
thấy:
o ống 1: tinh bột được thủy giải hồn tồn
o ống 2: khơng có sự thủy phân tinh bột
o ống 3: tinh bột chỉ được thủy giải đến dextrin
4.2. Hóa chất
-
dung dịch tinh bột 1%
-
dung dịch amylase đã pha loãng
-
dung dịch NaCl 1%
-
dung dịch CuSO 4 1%
4.3. Tiến hành
Lấy 3 ống nghiệm, cho vào:
- ống 1: 0,5 ml dung dịch amylase đã pha loãng và 0,5 ml NaCl 1%
- ống 2: 0,5 ml dung dịch amylase đã pha loaõng và 0,5 ml CuSO4 1%
- ống 3: 0,5 ml dung dịch amylase đã pha loãng và 0,5 ml nước cất
Tiếp tục cho vào mỗi ống 1 ml dung dịch hồ tinh bột 1%. Để cả 3 ống ở nhiệt độ
phịng khoảng 3-5 phút. Sau đó làm phản ứng Iod với tinh bột và dextrin. Nhận xét. Giải
thích.
5. Bài tường trình:
-
Tường trình quá trình thực hiện.
-
Kết quả ghi nhận được
-
Nhận xét kết quả
-
Giải thích kết quả.
3
Baøi 2
ỨNG DỤNG ENZYME AMYLASE TRONG
SẢN XUẤT MẠCH NHA
1 ENZYME AMYLASE
1.1 Giới thiệu enzyme amylase
Amylase là hệ enzyme rất phổ biến thuộc nhóm enzyme thủy phân, xúc tác sự
phân giải các liên kết nội phân tử polysacharide với sự tham gia của nước.
Các enzyme amylase từ các nguồn khác nhau thường khác nhau về tính chất, cơ
chế tác dụng cũng như sản phẩm cuối cùng của sự thủy phân .
1.1.1 Enzyme -amylase
Enzyme -amylase thủy phân liên kết 1-4 bên trong dây amylose và
amylopectin ở bất kỳ vị trí nào để tạo ra hỗn hợp oligosaccharide ngắn hơn, phản ứng
dừng lại khi gặp liên kết -1-6 tại điểm phân nhánh.
Enzyme -amylase được phân lập từ Bacillus subtilis là loại enzyme rất chịu nhiệt.
Đặc tính này rất thuận lợi vì trong quá trình hồ hoá tinh bột để nấu bia tinh bột phải được
gia nhiệt đến 90oC nhằm mục đích gelatin hoá tinh bột, nhiệt độ này vẫn thấp hơn nhiệt
độ tới hạn của enzyme là 1100 C.
Tinh bột thường được pha loãng đến nồng độ thích hợp từ 30% đến 40% và nấu ở
1000 C trong 3 đến 7 phút sau đó làm lạnh xuống còn 90 0C và giữ yên từ 1 đến 3 giờ để
phản ứng đường hóa xảy ra hoàn toàn.
Sản phẩm được tạo thành sau phản ứn g chủ yếu là đườn g maltose và các olimer
khác, vì vậy chúng không được dùng phổ biến trong kỹ nghệ đường hóa tinh bột nhưng có
thể sử dụng để thay thế enzyme -amylase trong quá trình sản xuất sirô maltose.
1.1.2 Enzyme -amylase
-amylase là enzyme thuộc nhóm exo-acting phân cắt liên kết glycosid 1-4 của
tinh bột từ đầu không khử, sản phẩm tạo thành là maltose. -amylase không cắt được liên
kết glycosid 1-6 tại mạch nhánh, thông thường người ta hay sử dụng enzyme -amylase
kết hợp với enzyme phân cắt mạch nhánh để thủy phân triệt để tinh bột thành dung dịch
đường maltose hay còn gọi là sirô maltose. Sirô maltose có tính hút ẩm cao và ổn định
màu hơn sirô glucose, sản phẩm của chúng có dạng kết tinh và ít dính. Maltose là nguyên
liệu dùng chế biến các món tráng miệng, trang trí trên bánh hay chế biến bánh kẹo.
4
-amylase cũng có nhiều trong mầm thóc, đại mạch nẩy mầm, chúng thường được
ứng dụng trong chế biến mạch nha, chế biến bia, tuy nhiên sản xuất ở quy mô côn g
nghiệp người ta thường sử dụng các enzyme có nguồn gốc từ vi sinh vật.
1.2 Trích Enzyme Amilase từ mầm lúa
Amylase là một enzyme tan trong nước.
Để trích Amylase từ mầm lúa, ta nghiền nát 10g lúa nẩy mầm với 30 ml nước cất.
Để yên 15 phút, lọc lấy nước qua lọc, thêm 5 ml cồn tuyệt đối vào lắc và để lắng lại.
Để phần cồn qua giấy lọc và giữ chất trầm hiện trong ống nghiệm. Rửa lại 3-4 lần
với cồn tuyệt đối, sau đó đổ tất cả trầm hiện qua giấy lọc. Khi tất cả nước chảy qua hết,
để ống nghiệm sạch dưới phễu và đổ trên giấy lọc 20ml nước để hòa tan chất trầm hiện,
ta có một dung dịch Amylase khá tinh sạch.
1.3 Trích Enzyme từ môi trường nuôi cấy vi sinh vật
Nghiền cẩn thận môi trường nuôi cấy bề mặt.
Cân 20g mẫu đã nghiền nhuyễn, cho vào bình tam giác hoặc bình cầu.
Thêm 500 ml dung dịch NaCl 1%, đặt vào máy lắc. Lắc liên tục từ 1-2 giờ ở nhiệt
độ trong phòng.
Lọc hoặc ly tâm ở 6000v/phút trong 5 phút để nhận được dịch trong suốt. Nếu là
môi trường lỏng, cần ly tâm để loại bỏ tế bào vi sinh vật. Dịch trong suốt lọc được dùng để
phân tích.
2 QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT MẠCH NHA
2.1 Nguyên lý
Dùng enzyme –amylase (Termamyl) tác dụng lên mạch tinh bột khoai mì. Loại
enzyme này có khả năng thủy phân nhanh tinh bột trong điều kiện nhiệt độ cao.
2.2 Sản phẩm mạch nha
Đường nha là sản phẩm ứng dụng cho nhiều ngành sản xuất thực phẩm khác nhau,
đặc biệt là ngành công nghiệp sản xuất bánh kẹo. Đường nha được sản xuất chủ yếu bằng
phương pháp axit và phương pháp enzyme.
Trong cơng nghiệp chế biến thực phẩm, các sản phẩm được chế biến từ mạch nha bao
gồm: Thực phẩm cho trẻ em; Các loại bánh mì và các loại sản phẩm khác: bánh bích quy, các
loại bánh hoặc kẹo dòn, kem lòng trắng trứng, bánh hạnh nhân, bánh quy, cookies…; Các loại
thức uống lên men như rượu, bia, thực phẩm điểm tâm, màu caramel, pho mát, kẹo
chewingum, sữa đặc, bánh kẹo, …
5
2.3 Quy trình công nghệ
Nước
Enzyme
Tinh bột
Chuẩn bị dung dịch
to = 100 – 105oC
tlưu = 5 phút
Hồ hóa
to = 95 – 100oC
tlưu = 2h
DE = 8 - 16
Dịch hóa
Enzyme
Than hoạt tính
Bột trợ lọc
pH = 6,0 - 6,5
to = 55 – 60oC; tlöu = 12h
pH = 5 – 5,5
DE = 40 - 45
Đường hóa
to = 55 – 60oC
tlưu = 30 – 45 phút
Tẩy màu
Lọc
Trao đổûi ion
Pck = 650 – 700mmHg
tos = 60 – 65oC
DE = 40 - 45
Cô đặc
Thành phẩm
(Nguồn: Công ty Đường Biên Hòa, 1997)
6
2.4 Thuyết minh quy trình
2.4.1 Chuẩn bị dung dịch
Nguyên liệu tinh bột khoai mì được hòa trộn với một lượng nước thích hợp để tạo
thành dung dịch huyền phù có hàm lượng chất khô khoảng 30 – 35%.
Để tạo điều kiện tối ưu cho hoạt động của enzyme, cần điều chỉnh pH của dung
dịch ở mức thích hợp (pH = 6,0 - 6,5) bằng cách sử dụng NaOH 30% hoặc HCl 30%.
Lượng –amylase cần thiết để dịch hóa được bổ sung vào giai đoạn này (0,6 – 0,8
kg/tấn chất khô).
2.4.2 Hồ hóa
Dưới tác động của nhiệt độ cao, liên kết giữa các hạt tinh bột sẽ bị phá vỡ, tinh bột
sẽ hút nước và trương nở, tạo điều kiện cho các phản ứng thủy phân tinh bột sau này xảy
ra dễ dàng.
Quá trình hồ hóa sử dụng hơi nước trực tiếp phun vào dung dịch huyền phù để
nâng nhiệt độ dung dịch lên 105 oC. Duy trì nhiệt độ này trong vòng 5 phút để hồ hóa hoàn
toàn tinh bột.
2.4.3 Dịch hóa
Dịch tinh bột đã được hồ hóa được làm nguội đến 90 – 95oC, dưới tác dụng của
enzyme –amylase, tinh bột được phân cắt thành đường và dextrin hòa tan.
Quá trình dịch hóa diễn ra khoảng 2 giờ, sau dịch hóa dung dịch có DE = 8 – 16,
pH = 5,5 – 6,0. Ở điều kiện như vậy, enzyme bị giảm hoạt tính đáng kể, nếu tiếp tụckéo
dài thời gian dịch hóa sẽ không làm tăng hiệu suất chuyển hóa và DE của dung dịch, đồng
thời lại làm tăng màu của dung dịch do sự biến đổi của đường khử ở nhiệt độ cao.
2.4.4 Đường hóa
Dịch thủy phân sau khi dịch hóa được tiếp tục đường hóa với enzyme –amylase
để tạo thành Maltose.
Nhiệt độ của dịch thủy phân được làm nguội xuống 55 oC bằng nước và được điều
chỉnh pH khoảng 5,3 bằng dung dịch HCl.
Lượng chính xác của enzyme được bổ sung vào dịch thủy phân tại thùng đường hóa
(0,1 – 0,2 kg/tấn chất khô). Thời gian đường hóa khoảng 12 giờ.
Sau khi đường hóa xong, dịch thủy phân được gia nhiệt lên 70 oC để tiêu diệt
enzyme.
7
2.4.5 Tẩy màu và lọc
Dịch thủy phân sau khi diệt enzyme được trộn đều với than hoat tính (khoảng 1
kg/tấn chất khô) để hấp phụ tạp chất, chủ yếu là chất màu. Quá trình lấy màu diễn ra
trong khoảng 30 - 45 phút.
Sau khi tẩy màu, dịch thủy phân được cho thêm bột trợ lọc và lọc bằng thiết bị lọc
ép. Bột trợ lọc được chuẩn bị trước bằng cách hòa trộn với sirô hoặc với nước (nếu sản
xuất Maltose Dextrin), được sử dụng để làm áo cho bàn lọc trong giai đoạn chuẩn bị lọc.
Lớp bột trợ lọc giúp cho việc giữ lại các tạp chất và than để tạo thàn h dịch thủy phân
sạch.
2.4.6 Trao đổi ion
Siro sau khi lọc vẫn còn chứa các tạp chất hữu cơ và vô cơ hòa tan (chủ yếu là các
muối khoáng) có trong nguyên liệu và từ các hóa chất bổ sung vào trong các giai đoạn
trước. Phần lớn các tạp chất này tồn tại ở dạng ion cân bằng phân ly.
Để khử các tạp chất này sirô được đưa qua 3 cột trao đổi ion. Trong trao đổi cation,
phần lớn ion kim loại được loại ra khỏi sirô, các ion H + được giải phóng khỏi nhựa và
chuyển vào sirô. Trong trao đổi anion, phần lớn các anion như Cl -, SO42+, amino acid hòa
tan, chất màu được loạ i khỏi sirô, ngược lại ion OH - sẽ tách khỏi nhựa và đi vào sirô. Ion
OH- này sẽ kết hợp với ion H+ tạo thành nước. Sirô tiếp tục được dẫn qua cột nhựa hỗn
hợp để loại triệt để các tạp chất hòa tan còn sót lại. Hệ thống bao gồm hai bộ thiết bị trao
đổi ion. Một bộ hoạt động, bộ còn lại được tái sinh hoặc ở trạng thái chờ.
2.4.7 Cô đặc và thành phẩm
Sirô được cô đặc đến nồng độ chất khô khoảng 80% bằng nồi cô đặc gia nhiệt gián
tiếp buồng đốt ngoài ở điều kiện chân không (pck = 650 – 700 mmHg, t os = 60 – 65oC) để
bảo đảm chất lượng sản phẩm. Sirô sau khi cô đặc được đưa vào các thùng bán thành
phẩm hoặc can để tồn trữ hoặc xuất sản phẩm.
2.4.8 Chỉ tiêu đánh giá chất lượng sản phẩm
❖ Cảm quan
Chỉ tiêu
Yêu cầu
Trạng thái
Sánh, kéo chỉ trong suốt
Màu sắc
Màu vàng rơm hoặc vàng nâu caramen
Mùi vị
Thơm đặc trưng, vị ngọt hơi mặn (đối với nha sản xuất
bằng phương pháp thủy phân bằng acid), không có vị lạ.
Tạp chất
Không có tạp chất, cặn bẩn
8
❖ Hóa lý
Chỉ tiêu
Yêu cầu
1. Độ khô (Bx), %
82 – 84
2. Đường khử (RS), %
36 – 39
3. Độ pH
5,0 – 5,5
4. Hàm lượng tro, %
0,6
5. Kim loại nặng, %
0,001
6. Tinh bột và acid tự do
Không có
7. Hàm lượng muối, %
0,5
8. Nhiệt độ cháy xém, oC
140 - 148
3 BÀI TƯỜNG TRÌNH
-
Tường trình quá trình thực hiện.
-
Nhận xét chất lượng sản phẩm
9
Bài 3: ENZYME BROMELIN
1. Trích ly Bromeline từ dứa
Bromeline là protease có nguồn gốc thực vật. Bromeline có nhiều trong các phần
khác nhau của cây dứa: quả, chồi, thân, vỏ…
Bromeline có thể ly trích như sau: Dứa xanh đem gọt vỏ bằng dao inox, cân xác
định trọng lượng lấy phần thịt, lõi. Mắt cho vào máy xay sinh tố xay nát. Đổ ra trên vải
màng, vắt thật kỹ, đem lọc để loại bỏ chất xơ. Đo thể tích dịch chiết.
2. Ứng dụng enzyme bromelin trong làm mềm thịt
Thịt nạc được cắt ra thành từng lát mỏng giống nhau theo chiều dọc để có thể quan sát được
sớ thịt. Chia thịt ra làm 4 phần:
Dĩa 1: bổ sung 20 ml nước dứa, ngâm trong ít nhất 2 giờ
Dĩa 2: bổ sung 20 ml enzyme protease đã pha loãng 100 lần, ngâm trong ít nhất 2 giờ
Dĩa 3: khơng xử lý (đối chứng)
Sau 2 giờ, đun nóng thịt trong các dĩa trên trong 5 phút ở 100oC. Quan sát, đánh giá và so
sánh mùi vị, cấu trúc của thịt giữa các mẫu.
3. Bài tường trình
-
Tường trình quá trình thực hiện.
-
Tính toán hiệu suất thu hồi dung dịch enzyme thơ (%)
-
Kết quả so sánh ứng dụng enzyme bromelin trong làm mềm thịt
10
Bài 4: ENZYME PECTINASE
1. Giới thiệu chung
Pectinase là tên gọi chung một nhóm Enzyme có khả năng phân giải pectin, một
dạng glucid cao phân tử có nhiều ở thực vật.
Pectinase là Enzyme có nhiều ứng dụng lớn thứ ba sau amylase và protease. Trong
công nghiệp, đặc biệt là trong công nghiệp thực phẩm, nó được dùng nhiều để tăng hiệu
suất ép, làm trong nước quả, rượu quả. Pectinase cũng được dùng trong sản xuất bột cà
phê hòa tan, để tách lớp nhớt chứa nhiều pectin ở hạt. Pectinase do vi sinh vật tổng hợp có
tác dụng trong quá trình ngâm đay, gai để tách các sợi xellose nhưng không phá huỷ sơ ïi.
Enzyme pectinase được sử dụng rộng rãi trong sản xuất nước quả để làm tăng tốc độ lọc
và hiệu suất ép, đồng thời trong quá trình tồn trữ nước quả sẽ không bị đục do pectin bị
lắng trở lại. Ngoài ra dùng Enzyme pectinase trích ly dược liệu với tỉ lệ thích hợp đã khắc
phục được các nhược điểm như tốn nhiều nguyên liệu và thời gian, tách không kiệt được
các chất trong bã thuốc, dược liệu bị keo nhầy không chiết được, sau một thời gian thuo ác
đục trở lại.
❖ Pectin:
Pectin là cơ chất của Enzyme pectinase. Trong thực vật, pectin có vai trò quan
trọng tạo thành vách tế bào thực vật, gắn kết các tế bào vào nhau và hiện diện trong phức
với cellulose, đóng vai trò là thành phần chủ yếu của lớp xơ trong cơ cấu vách tế bào thực
vật thượng đẳng.
Trong thực vật pectin tồn tại 2 dạng:
-
Dạng protopectin không tan trong nước, tồn tại chủ yếu ở thành tế bào, thường
ở dạng liên kết với polysacharide khác như arabane, tinh bột, cellulose.
-
Dạng pectin hòa tan chủ yếu ở dịch tế bào.
Cấu tạo pectin chủ yếu là một mạch chính, gồm các gốc acide –galacturonic liên
kết với nhau bằng liên kết 1,4-glucoside, còn gọi là acide polygalacturonic hay acid
pectic. Pectin hòa tan trong tự nhiên là ester metylic của acid pectic.
Pectin hay pectin hòa tan là ester metilic của acid polygalacturonic cao phân tử.
Acid pectinic là acid polygalacturonic trong đó có một phần nhỏ nhóm cacboxy được ester
hóa bởi metanol. Acid pectic là acid polygalacturonic cao phân tử đã hoàn toàn giải phóng
khỏi nhoùm methoxy.
11
2. Xác định hoạt tính pectinase bằng phương pháp so màu
2.1. Nguyên tắc
Là phương pháp dựa trên việc so sánh cường độ màu của dung dịch nghiên cứu với
cường độ màu của dung dịch tiêu chuẩn có nồng độ xác định. Dùng phương pháp so màu
chủ yếu để xác định lượng nhỏ các chấ t phân tích. Phương pháp này mất ít thời gian so với
các phương pháp hóa học khác. Nguyên tắc của phương pháp này là xác định lượng acid
galacturonic được tạo ra bởi quá trình thủy phân bằng pectinase. Cơ chất pectin không kết
tủa bởi ZnSO4.
Định nghóa đơn vị hoạt tính:
Một đơn vị hoạt tính pectinase là lượng Enzyme trong điều kiện tiêu chuẩn (ở nhiệt
độ 30 C pH 3,9 – 4,1, thời gian phản ứng là 60 phút với nồng độ pectin trong môi trường
phản ứng là 0,66%, mức độ thủy phân pectin là 30%) có khả năng xúc tác, làm biến đổi
1g pectin sau 60 phút thành acid galacturonic.
0
2.2. Hóa chất
- Dung dịch pectin 1%
- Dung dòch ZnSO4 15%
- Dung dòch Enzyme 1%
- Dung dòch Anthrone 0,2% (C6 H4 CO C6 H4 CH2) trong acid sulfuric đậm đặc
2.3. Tiến hành
Cho 2ml dung dịch pectin 1% vào ống nghiệm rồi tiếp theo cho 1ml dung dịch Enzyme
1%, lắc đều cho vào tủ ấm ở nhiệt độ 30 0C (dung dịch pectin có pH = 3,9-4,1).
Sau 60 phút lấy ra thêm 2ml ZnSO4 15%, đem lọc qua giấy lọc, dung dịch lọc được
đem pha loãng 5 lần dùng cho phản ứng với Anthrone.
Lấy 2,5 ml dung dịch lọc đã pha loãng cho vào ống nghiệm rồi cho 5ml Anthrone vào,
lắc mạnh trong thời gian 10 phút. Sau đó đặt trong nồi thủy ở nhiệt độ 70 0C trong thời gian
12 phút rồi lấy ra làm nguội đến nhiệt độ phòng và tiến hành đo giá trị OD ở bước sóng X =
584 nm.
Thực hiện tương tự đối với ống đối chứng (thay enzyme bằng nước).
Sau đó, tính giá trị OD = ODTN – ODĐC để sử dụng vào công thức tính hoạt tính.
ODTN : Giá trị đo OD của thí nghiệm
ODĐC : giá trị đo OD của đối chứng
2.4. Tính hoạt độ
Hoạt tính enzyme pectinase =
0,34 x OD – 0,0104
m
Trong đó: m là lượng enzyme lấy để tiến hành phản ứng (g hay ml)
12
3. Ứng dụng enzyme pectinase làm trong nước trái cây ép
3.1. Nguyên liệu - Hóa chất
- Trái cây theo mùa (táo / ổi / xồi)
- Dung dịch pectinase 1%
3.2. Tiến hành
- Cân 50 g nguyên liệu quả, ép lấy dịch quả, pha loãng thành 100 ml với nước cất.
- Hút 18 ml dung dịch trên cho vào mỗi ống nghiệm của 5 ống nghiệm khác nhau.
- Thêm dung dịch pectinase 1% vào từng ống nghiệm với thể tích tuần tự trong các
ống là 0; 0,5; 1; 1.5; và 2 ml.
- Sau đó thêm nước cất vào sao cho mỗi ống có đủ 20 ml.
- Để tất cả các ống nghiệm ở 50-55 oC trong 60 phút.
- Sau đó lọc qua giấy lọc, ngâm ống nghiệm đựng dịch sau lọc trong nước lạnh
trong 10 phút và so sánh độ trong của các mẫu. Giải thích.
4. Bài tường trình
-
Tường trình quá trình thực hiện.
-
Kết quả xác định hoạt độ Enzyme pectinase
-
Kết quả ứng dụng enzyme pectinase làm trong nước trái cây ép .
13
Bài 5: XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ENZYME AMYLASE
1. Giới thiệu
Enzyme Amylase là Enzyme thủy phân tinh bột gồm: -Amylase, -Amylase, -Amylase…
-
Amylase xúc tác phản ứng cắt liên kết glycosid của amylose và Amylose pectin ở
bất kỳ vị trí nào, kết quả ta được các phân tử dextrin. Tiếp đến dextrin lại tiếp tục bị
phân giải để cuối cùng ta có đường maltose và glucose.
-
Amylase thủy phân liên kết glycosid 1-4, bắt đầu từ đầu không khử để tạo sản
phẩm cuối cùng là đường maltose.
Các loại Amylase đều có ở thực vật, động vật và vi sinh vật. Khi hạt nảy mầm, hàm
lượng Enzyme Amylase tăng lên để thủy phân tinh bột ở phôi nhũ thàn h đường cung cấp
cho sự phát triển của phôi.
Một số loại vi sinh vật cũng có khả năng tạo Enzyme Amylase để thủy phân
hydratcarbon phức tạp ở dạn g tinh bột như khoai mì, cám, bắp thành hydratcarbon đơn
giản hơn như maltose, glucose.
Các Enzyme được ly trích từ mầm lúa hay từ môi trường nuôi cấy vi sinh vật được sử
dụng để chế biến các sản phẩm như mạch nha, glucose, syrup.
2. Phương pháp xác định hoạt lực Enzyme Amylase bằng phương pháp Heinkel
2.1. Nguyên tắc
Xác định lượng tinh bột bị phân giải dựa trên cơ sở xác định mức độ giảm cường độ
màu của hỗn hợp phản ứng với dung dịch iốt.
Đơn vị hoạt động Enzyme là lượng Enzyme có khả năng phân giải 1mg tinh bột sau 30
phút ở 300C.
2.2. Dụng cụ
-
Ống nghiệm.
-
Pipette 1ml.
-
Bếp đun cách thủy có điều chỉnh nhiệt độ.
-
Máy so màu spectronic 20D+
2.3. Hoá chất
-
Dung dịch NaCl 0,1%
-
Dung dòch acid sulfosalisilic 20%
14
-
Dung dịch iod: Hoà tan 1g iod trong 5ml dung dịch có chứa 2g KI, thêm nước cất
vào đến 300ml. Khi dùng pha loãng dung dịch này 150 lần.
-
Dung dịch đệm phosphate 0,05M, pH = 6.
-
Dung dịch amylase 1%.
-
Dung dịch tinh bột 1% trong dung dịch đệm phosphate 0,05M, pH = 6. Cân 1g tinh
bột trộn với khoảng 10ml dung dịch đệm, thêm vào 80ml dung dịch đệm đang sôi,
để nguội thêm dung dịch đệm đến 100ml. Để bảo quản dung dịch tinh bột có thể
thêm 1g natri benzoat.
-
Dung dịch tinh bột 1%: Cân 1g tinh bột trộn với 10ml nước cất, thêm 80ml nước cất
đang sôi khuấy đều và nếu cần tiếp tục đun để nhận được dung dịch trong suốt, để
nguội, cho vào bình định mức 100ml và thêm nước cất vào cho đến vạch.
2.4. Lập đồ thị chuẩn
Từ dung dịch tinh bột 1%, chuẩn bị các dung dịch có chứa 0, 2, 4, 6, 8, 10mg tinh bột
trong 1ml bằng cách lấy 0, 2, 4, 6, 8, 10ml tinh bột 1% và thêm nước cất vào cho ñeán
10ml như trong bảng sau:
Ống
1
2
3
4
5
6
Số ml tinh bột 1%
0
2
4
6
8
10
Số ml nước cất
10
8
6
4
2
0
Nồng độ tinh bột (mg/ml)
0
2
4
6
8
10
Tiếp tục lấy 6 ống nghiệm khác, lấy 0,1ml của từng ống dung dịch tinh bột đã chuẩn bị
như trên thêm 0,1ml dung dịch NaCl 0,1%, 0,2ml dung dịch đệm, 0,1ml nước cất, 0,5ml
dung dịch acid sulfosalisilic 20% lắc đều, thêm 9ml dịch iod đã pha loãn g 150 lần. So màu
trên bước sóng 560mm. Vẽ đồ thị đường chuẩn. Trên trục hoành ghi số mg tinh bột, trục
tung ghi số OD đọc được trên máy tương ứng.
Ống
1’
2’
3’
4’
5’
6’
Số mg tinh bột
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
A1
A2
A3
A4
A5
A6
OD560nm
2.5 Cách tiến hành
Cho vào ống nghiệm 1ml dung dịch tinh bột 1%, 1ml dung dịch NaCl 0,1% và 2ml dung
dịch đệm phosphate 0,05M, pH = 6, lắc đều, giữ ở 30 0C trong 15-20 phút để dung dịch đạt
300C. Thêm vào dung dịch 1ml dung dịch Enzyme đã đạt đến 300C, lắc đều, tiếp tục giữ ở
300C trong 30 phút. Sau đó, lấy ống nghiệm ra khỏi tủ ấm cho ngay vào 5ml dung dòch
15
acid sulfosalisilic 20% để làm ngừng phản ứng sau vài phút lọc. Song song với mẫu thí
nghiệm làm mẫu kiểm tra cũng tương tự như trê n nhưng cho dung dịch sulfosalisilic vào
trước rồi mới cho dung dịch Enzyme.
Lấy 1ml dịch lọc của mẫu thí nghiệm cũng như mẫu kiểm tra cho vào ống nghiệm,
thêm 9ml dung dịch iod pha loãng 150 lần so màu ở bước sóng 560nm, lấy hiệu số số đọc
trên máy giữa mẫu kiểm tra và mẫu thí nghiệm. Đối chiếu trên đường cong chuẩn, tính ra
số mg tinh bột đã bị phân giải.
3. Bài tường trình
-
Tường trình quá trình thực hiện.
-
Tính toán hiệu suất thu hồi Enzyme.
-
Hoạt tính Enzyme: Tính bằng số đơn vị hoạt động (ĐVHĐ)/1ml dịch Enzyme.
Đơn vị hoạt động/g nguyên liệu thô =
ĐVHĐ x V
m
V : Tổng thể tích dịch Enzyme.
m : Trọng lượng nguyên liệu dùng trích Enzym.
16
Bài 6: ENZYME PROTEASE
1. Đại cương
Pepsin là một protease acid có trong dịch vị và màng nhầy dạ dày động vật và người.
Pepsin được Spaleazani phát hiện năm 1983. Theo bảng phân loại quốc tế pepsin thuộc
loại hydrolase được mã hoá là EC.3.4.23.1. Pepsin hoạt động tốt ở pH acid từ 1.5 đến 2.2.
Pepsin phân giải không hoàn toàn protein thành các peptid ngắn từ 5 đến 8 acid amin gọi
là pepton. Pepsin được ứng dụng trong nhiều lónh vực: y dược, chăn nuôi, công nghệ thực
phẩm. Ví dụ pepsin làm thuốc trợ tiêu hoá, sản xuất dịch đạm thủy phân , sản xuất pepton
làm môi trường nuôi cấy vi sinh, làm mềm thịt…
2. Phương pháp thu nhận pepsin
Khi tiến hành thí nghiệm chiết tách pepsin từ dạ dày heo luôn luôn phải giữ mẫu ở điều
kiện lạnh 0 - 40C.
•
Dạ dày tươi mới mổ lộn ngược lại, nhẹ tay bỏ thức ăn dư, rửa nhẹ bằng nước, tác h
bỏ mỡ, đem cân trọng lượng dạ dày.
•
Nạo hết dịch nhầy trên bề mặt và bóc niêm mạc ra khỏi dạ dày, gồm 2 vùng: vùng
niêm mạc 1 (thực quản và thượng vị) dày màu trắng; vùng niêm mạc 2 (thân vị và
hạ vị) mỏng hơn màu sậm tiết nhiều Enzym pepsinozen và HCl.
•
Đem cắt xay nhỏ niêm mạc và cân một lượng xác định đem hoà với HCl 0,8% chỉnh
về pH = 1,5 – 2 theo tỷ ệ 1:2 thể tích. Đặt mẫu vào tủ ấm 40 0C trong vòng 24 giờ
để mẫu tự phân.
•
Đem hỗn hợp lọc qua vải màn và sau đó vải mịn nhiều lần để dịch lọc được trong.
•
Đo thể tích dịch lọc: Tủa bằng NaCl theo tỷ lệ 25% muối, khuấy cho tan muối. Để
yên dịch lọc trong tủ lạnh cho sự kết tủa xảy ra nhanh chóng, sau 30 phút lấy ra
đem ly tâm tốc độ 4000v/phút trong vòng 15 phút. Thu kết tủa và loại bỏ dung dịch.
Thêm một lượng xác định chất độn là tinh bột hòa tan để sấy cho mau khô. Để hạn chế
sự giảm hoạt tính Enzyme cần sấy mẫu ở 350C - 400C kèm quạt gió ta thu được pepsin thô
dạng bột.
-
Cân trọng lượng pepsin thô thu được.
-
Bảo quản Enzyme ở bình hút ẩm có Silicagel.
17
3. Xác định hoạt tính pepsin thô bằng phương pháp Anson cải tiến
3.1. Nguyên tắc
Casein được pepsin phân giải trong môi trường acid tạo các đoạn peptid ngắn không tủa
bởi T.C.A (trichloro acetic acid) trong đó lượng tyrosin, tryptophan được xác định bởi phản
ứng màu với thuốc thử folin. Đo mật độ quang của dung dịch này suy ra nồng độ sản phẩm
và tính hoạt tính protein.
3.2. Hóa chất
•
Casein 2%.
•
Acid trichloro acetic acid 5%.
•
NaOH 0,5N
•
Thuốc thử Folin pha loãng 3 lần bằn g nước cốt.
•
Dung dịch Tyrosin chuẩn 1m (181,19mg Tyrosin trong 1l HCL 0,2N)
3.3. Xây dựng đường chuẩn Tyrosin
Để xác định được lượng Tyrosin trong dung dịch nghiên cứu ta phải xây dựng đường
chuẩn với Tyrosin nguyên chất.
Cho vào các ống nghiệm lần lượt dung dịch Tyrosin chuẩn theo thứ tự sau đây.
Ống nghiệm
1
2
3
4
5
6
Thể tích Tyrosin (ml)
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
HCl 0,2 N (ml)
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
NaOH 0,5 N (ml)
2
2
2
2
2
2
0,6
0,6
0,6
0,6
0,6
0,6
Folin (ml)
Để yên dung dịch 15 phút, đem đo mật độ quang ở bước sóng 660mm.
Vẽ đường chuẩn Tyrosin.
Một đơn vị Anson là lượng Enzyme cần thiết để thủy phân cơ chất trong một phút tạo
sản phẩm (không kết tủa bởi TCA) tương đương 1 mol tyrosin.
3.4. Tiến hành thí nghiệm xác định hoạt độ
Cho vào 2 ống nghiệm A (1 & 2) và ống B (đối chứng) mỗi ống 5ml dung dịch casein
2%, cân 0,1g Enzyme pepsin pha loãng bằng nước cất. Độ pha loãng tùy thuộc vào hoạt
tính Enzyme mạnh hay yếu. Lấy 1ml dịch Enzyme pha loãng cho vào 2 ống nghiệm A giữ
chính xác trong 10 phút ở nhiệt độ bình thường, sau đó cho 10ml TCA 5%. Ống B cũng
thực hiện như ống A nhưng cho TCA vào trước sau đó mới cho Enzyme.
18
Để yên các ống 30 phút rồi đem lọc. Lấy 1ml dịch lọc thêm 2ml NaOH 0,5N và 0,6ml
thuốc thử Folin. Sau 15 phút đo OD ở bước sóng 660nm. Từ giá trị OD, dựa vào đường
chuẩn Tyrosin mà xác định hàm lượng tyrosin của mẫu thí nghiệm. Theo công thức tính
toán sẽ tính được số đơn vị hoạt tính.
3.5. Tính kết quả
1. Tính hiệu số giá trị OD mẫu thí nghiệm và mẫu kiểm tra.
OD = ODTN – ODĐC
2. Từ OD dựa theo đồ thị chuẩn tính lượng mol tyrosin tương ứng.
3. Tính hoạt tính protease của pepsin biểu thị bằng số đơn vị Protease/1g chế phẩm
theo công thức.
Hoạt độ protease/1ml enzyme =
mol Tyr x V
t
Hoạt độ trên 1ml x V1
Hoạt độ protease/1g chế phẩm =
m
V : Thể tích toàn bộ hỗn hợp (Cơ chất + Enzyme + TCA)
t : Thời gian thủy giải 10 phút
V1: Thể tích toàn bộ Enzyme đã pha loãng.
m : Trọng lượng Enzyme đem thí nghiệm (0,1g)
4. Bài tường trình
-
Tường trình quá trình thực hiện.
-
Tính toán hiệu suất kết tủa (%)
-
Xác định hoạt tính Enzyme thô (đơn vị hoạt động/ml Enzyme)
19
