XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH CHẤT BẢO QUẢN NATRI BENZOAT TRONG CHẢ LỤA BẰNG PHƯƠNG PHÁP UPLCUV

TRƯỜNG
TRƯỜNG ĐẠI
ĐẠI HỌC
HỌC Y
Y DƯỢC
DƯỢC CẦN
CẦN THƠ
THƠ
KHOA
KHOA DƯỢC
DƯỢC
LIÊN
LIÊN BỘ
BỘ MÔN
MÔN HĨA
HĨA PHÂN
PHÂN TÍCH
TÍCH –– KIỂM
KIỂM NGHIỆM
NGHIỆM –– ĐỘC
ĐỘC CHẤT
CHẤT


XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH CHẤT BẢO QUẢN
NATRI BENZOAT TRONG CHẢ LỤA BẰNG
XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH CHẤT BẢO QUẢN
PHƯƠNG PHÁP HPLC
NATRI BENZOAT TRONG CHẢ LỤA BẰNG
PHƯƠNG PHÁP UPLC/UV
GVHD: Ths. Nguyễn Mạnh Quân

GVHD:
ThS.hiện:
Nguyễn
Mạnh
Quân
Học
viên thực
Học viên
thực
hiện: Lê Văn Bẩy

Học viên
thực
hiện:– Lê
CH-CK1
Kiểm
nghiệm
ĐộcVăn
chất,Bẩy
Khóa 2020 - 2022
CH-CK1 Kiểm nghiệm – Độc chất, Khóa 2020 - 2022

Cần
2022
Cần Thơ
Thơ –- 2022


2

MỤC LỤC
MỤC LỤC..........................................................................................................i
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT........................................................................iii
DANH MỤC BẢNG........................................................................................iv
DANH MỤC HÌNH..........................................................................................v
ĐẶT VẤN ĐỀ...................................................................................................1
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU................................................................2
1.1. Tổng quan về chả lụa.................................................................................2
1.1.1. Khái quát...........................................................................................2
1.1.2. Thành phần hóa học..........................................................................2
1.2. Tổng quan về natri benzoate ....................................................................3
1.2.1. Tính chất lý hóa.................................................................................3
1.2.2. Nguồn gốc.........................................................................................3
1.2.3. Cơ chế hoạt động bảo quản của natri benzoate.................................4
1.2.4. Công dụng.........................................................................................4
1.2.5. Tác động đối với sức khỏe ...............................................................4
1.2.6. Quy định giới hạn cho phép..............................................................6
1.3. Tình hình sử dụng natri benzoate ở Việt Nam ..........................................6
1.4. Nghiên cứu liên quan ...............................................................................7
Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.....................8
2.1. Đối tượng nghiên cứu.............................................................................8
2.1.1..........................................................................................................Đối tượng
..........................................................................................................8
2.1.2............................................................... Địa điểm và thời gian nghiên cứu
..........................................................................................................8
2.1.3...................................................... Hóa chất, chất chuẩn, thiết bị, dụng cụ
..........................................................................................................8
2.1.3.1.........................................................Hóa chất, chất chuẩn, dung môi
..................................................................................................8
2.1.3.2..................................................................................... Thiết bị, dụng cụ

..................................................................................................8
2.2. Nội dung nghiên cứu..............................................................................9


3

2.2.1.....Xây dựng quy trình định lượng natri benzoate trong chả lụa bằng

phương pháp UPLC/UV..................................................................9
2.2.1.1...........................................................................................Chuẩn bị mẫu
..................................................................................................9
2.2.1.2..................................................................... Khảo sát điều kiện sắc ký
..................................................................................................9
2.2.1.3. Khảo sát xử lý mẫu..............................................................10
.................................................................................................
2.2.2...Thẩm định quy trình định lượng natri benzoate trong chả lụa bằng
phương pháp UPLC/UV ...............................................................11
2.2.2.1.................................................................... Tính tương thích hệ thống
................................................................................................11
2.2.2.2.............................................................................................. Độ đặc hiệu
................................................................................................12
2.2.2.3. Tính tuyến tính....................................................................12
2.2.2.4.......................................................................Độ chính xác trong ngày
................................................................................................13
2.2.2.5..................................................................... Độ đúng (tỷ lệ thu hồi %)
................................................................................................14
2.2.2.6. Xác định giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng
(LOQ)..................................................................................15
.................................................................................................
2.2.3.. .Ứng dụng quy trình định lượng đã thẩm định trên một số mẫu chả

lụa...................................................................................................16
Chương 3: KẾT QUẢ......................................................................................17
3.1. Khảo sát pha động và bước sóng phân tích.............................................17
3.1.1. Kết quả khảo sát pha động..............................................................17
3.1.2. Kết quả khảo sát bước sóng............................................................19
3.2. Tối ưu hóa quy trình chiết xuất natri benzoat trong chả lụa....................20
3.2.1. Khảo sát quy trình chiết xuất natri benzoat trong chả lụa...............20
3.2.2. Khảo sát số lần chiết kiệt natri benzoat trong chả lụa.....................22
3.3. Kết quả thẩm định quy trình định lượng natri benzoate trong chả lụa
bằng phương pháp UPLC/UV.................................................................24


4

Tình tương thích hệ thống...............................................................24
3.3.2. Độ đặc hiệu......................................................................................27
3.3.3. Tính tuyến tính ...............................................................................28
3.3.4. Độ chính xác trong ngày.................................................................30
3.3.5. Độ đúng...........................................................................................31
3.3.6. Giới hạn phát hiện(LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)...............34
3.4. Kết quả ứng dụng quy trình định lượng đã thẩm định trên một số mẫu
chả lụa......................................................................................................35
Chương 4: BÀN LUẬN..................................................................................37
KẾT LUẬN.....................................................................................................42
TÀI LIỆU THAM KHẢO...............................................................................43
PHỤ LỤC........................................................................................................44
3.4.1.
3.3.1.

5

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
ACN

Acetonitril

ADN

Acid deoxyribonucleic

BuP

Butyl paraben

EP

Ethyl paraben

DLLME

Dispersive Liquid Liquid Micro-extraction
(Phương pháp chiết vi lượng lỏng-lỏng phân tán)

GC-MS

Gas Chromatography Mass Spectrometry
(Sắc ký khí ghép phối phổ)

UPLC/UV

Ultra Performance Liquid Chromatography/ Ultra violet

LOD

Limit of detection (Giới hạn phát hiện)

LOQ

Limit of quantitation (Giới hạn định lượng)

LC-MS/MS

Liquid Chromatography - Tandem Mass Spectrometry
(Sắc ký lỏng ghép phối phổ song song)

MP

Methyl paraben

IPP

Isopropyl palmitae

IBP

Isobutyl palmitae

MeOH

Methanol

NaCl

Natri clorid

PrP

Propyl paraben

PSA

Primary Secondary Amine

RSD

Relative standard deviation (Sai số tương đối)

SPE

Solid Phase Extraction (Chiết pha rắn)

UVB

Ultraviolet black (“Ánh sáng đen”, có bước sóng 315-20nm)

UV-VIS

Ultraviolet-visible (Quang phổ tử ngoại khả kiến)

6

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Thành phần hóa học của chả lụa
Bảng 2.1. Các hệ dung môi pha động được khảo sát
Bảng 2.2. Độ lặp lại tối đa chấp nhận tại các hàm lượng khác nhau theo phụ
lục F AOAC – trang 9 [13]
Bảng 2.3. Độ thu hồi chấp nhận ở các hàm lượng khác nhau (theo
AOAC)

Bảng 3.1. Các hệ dung mơi pha động được khảo sát
Bảng 3.2. Diện tích pic tương ứng với các nồng độ chuẩn
Bảng 3.3. Bảng phân tích tuyến tính của natri benzoate
Bảng 3.4. Kết quả thẩm định độ đúng của quy trình phân tích
Bảng 3.5. Kết quả phân tích natri benzoate trong một số mẫu chả lụa thu thập
trên thị trường TP.Cần Thơ


7

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cơng thức cấu tạo của natri benzoate
Hình 2.1. Sơ đồ quy trình xử lý mẫu dự kiến
Hình 3.1. Sắc ký đồ hệ pha động MeOH - Acid formic 0,1%; MeOH - nước;
ACN : nước (tỷ lệ 50 : 50)
Hình 3.2. Sắc ký đồ hệ pha động MeOH - Acid formic 0,1% các tỷ lệ 60 : 40;
70 : 30; 80 : 20 của Natri benzoat
Hình 3.3. Sắc ký đồ khảo sát bước sóng mẫu chuẩn natri benzoat
Hình 3.5. Sơ đồ chiết xuất natri benzoat

Hình 3.6. Dịch lọc mẫu thử vẫn còn bị tủa đục sau khi loại tạp
Hình 3.7. Sơ đồ chiết xuất natri benzoat đề xuất
Hình 3.8. Sắc ký đồ mẫu thử chiết lần thứ nhất.
Hình 3.9. Sắc ký đồ mẫu thử của 4 lần chiết.
Hình 3.10. Sơ đồ chiết xuất natri benzoat dùng trong thực nghiệm
Hình 3.11. Sắc ký đồ và kết quả sắc ký mẫu chuẩn natri benzoat sau 6 lần
tiêm liên tiếp
Hình 3.12. Sắc ký đồ và kết quả sắc ký mẫu thử sau 6 lần tiêm liên tiếp
Hình 3.13. Sắc ký đồ tính đặc hiệu của quy trình phân tích
Hình 3.14. Sắc ký đồ và kết quả tính tuyến tính của quy trình phân tích
Hình 3.15. Đồ thị tương quan giữa nồng độ và diện tích đỉnh của natri
benzoate
Hình 3.16. Sắc ký đồ và kết quả sắc ký độ chính xác mẫu thử M1 – M6
Hình 3.17. Sắc ký đồ và kết quả sắc ký độ đúng 80% (34ppm)
Hình 3.18. Sắc ký đồ và kết quả sắc ký độ đúng 100% (40ppm)
Hình 3.19. Sắc ký đồ và kết quả sắc ký độ đúng 120% (48ppm)
Hình 3.20. Sắc ký đồ và kết quả sắc ký mẫu thử khơng thêm chuẩn
Hình 3.21. Sắc ký đồ của natri benzoate ở nồng độ 0.125ppm và 0.0625ppm
Hình 3.22. Sắc ký đồ và kết quả sắc ký của 3 mẫu đem thử


8

Hình 4.1 sắc ký đồ của mẫu mẫu chuẩn natri benzoat
Hình 4.2. Sắc ký đồ mẫu thử của 4 lần chiết.


9

ĐẶT VẤN ĐỀ

Cùng với sự phát triển đa dạng và phong phú của ngành công nghiệp thực
phảm nhằm đáp ứng nhu cầu ngày càng cao của con người, các loại thực phẩm
chế biến sẵn đang ngày một phổ biến rộng rãi trong cuộc sống hàng ngày bởi
tính tiện lợi và nhanh chóng của chúng. Tuy nhiên, nhiều sản phẩm này có chứa
những thành phần mà người tiêu dùng chưa hiểu hết về tác dụng của nó và natri
benzoate là một trong số chất phụ gia đó.
Natri benzoate là một loại phụ gia thực phẩm được Cơ quan Quản lý Dược
phẩm và thực phẩm Hoa Kỳ - FDA chấp thuận đưa vào sử dụng để kéo dài tuổi
thọ của sản phẩm. Nó có tác dụng ức chế sự phát triển của các loại nấm mốc và
các vi sinh vật gây thối rữa trong thực phẩm. Natri benzoate được sử dụng phổ
biến trong các sản phẩm như: Thực phẩm chế biến sẵn, các sản phẩm chăm sóc
răng miệng, mỹ phẩm, nước ngọt và nước trái cây, các loại gia vị, sirô ho và một
số thuốc khác.
Các nhà nghiên cứu cũng cho rằng natri benzoate có thể gây hại đến các
phần quan trọng của DNA. Bên cạnh đó, natri benzoate cũng được cho là một
nguyên nhân quan trọng cho vấn đề hiếu động quá mức ở trẻ em. Mặc dù những
điều trên vẫn là suy đốn và vẫn chưa có gì được chứng minh cụ thể và các
nghiên cứu vẫn đang được tiến hành, nhưng lời khuyên vẫn là nên cắt giảm các
sản phẩm thực phẩm và đồ uống có chứa natri benzoate.
Đứng trước tình hình thực tế đó, nhóm chúng tơi thực hiện chuyên đề “ Xây
dựng quy trình địng lượng chất bảo quản Natri benzoat trong chả lụa bằng
phương pháp HPLC” với hai mục tiêu như sau:
- Xây dựng và thẩm định quy trình phân tích chất bảo quản natri benzoate trong

thực phẩm (chả lụa) bằng phương pháp HPLC.
- Ứng dụng quy trình đã thẩm định để phân tích natri benzoate trong một số mẫu
chả lụa thu thập trên thị trường.


10

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.
Tổng quan về chả lụa [2]
1.1.1. Khái quát
Chả lụa (giò lụa) là sản phẩm dạng gel truyền thống ở nước ta, nó có những
tên gọi khác nhau ở miền Bắc (giò lụa) và miềnNam (chả lụa). Chả lụa là loại
thực phẩm cung cấp nhiều năng lượng, chất dinh dưỡng do thành phần có chứa
nhiều protein khơng thay thế. Có thể sử dụng chả lụa ăn trực tiếp hay ăn kèm với
các món khác như bánh tráng, bánh mì, bún, bánh ướt…tạo nên mùi vị đặc trưng
hấp dẫn. Đặc biệt vào ngày tết cổ truyền của Việt Nam, món chả lụa là thực
phẩm khơng thể thiếu trong nhà của các gia đình nhất là ở miền Bắc.
Theo tài liệu tham khảo thì chả lụa có nguồn gốc từ Tân Ước, Phúc Thụy,
Thanh Oai, Hà Tây.Ở đây làm ra các sản phẩm chả lụa ngon và nổi tiếng. Chả
lụa được làm truyền thống như sau: chọn thịt nạc mông hay bắp đùi của những
con heo vừa, không cần lớn lắm hay nhỏ quá. Thịt sử dụng phải là thịt còn nóng.
Sau khi cắt ngang thớ thịt thành những miếng nhỏ, bỏ gân, rồi bỏ vào cối đá giã,
giã nhanh tay, bao giờ thấy thịt nhuyễn quánh thì cho thêm chút nước mắm
ngon, chút muối rang đã tán nhỏ, rồi thúc (nhồi) thịt cho đều mắm muối. Cho
vào lá gói chặt, buộc lại kỹ rồi bỏ vào nồi nước lạnh mà luộc. Nước phải phủ
ngập chả, khi nào chả chín thì vớt ra, treo cho rỏ hết nước.
1.1.2. Thành phần hóa học

Bảng 1.1. Thành phần hóa học của chả lụa
Thành phần
Độ ẩm
Protein
Lipid
Tro

1.2.
Tổng quan về natri benzoate [3], [5]
1.2.1. Tính chất lý hóa
- Danh pháp quốc tế: natri benzoate

% khối lượng
72
21,5
5,5
1


11
- Tên khác: E211, muối natri của axit benzoic, benzoat của soda, thực phẩm bảo

quản 211.
- Công thức phân tử: NaC6H5CO2
- Khối lượng phân tử: 144,11 g/mol
- Công thức cấu tạo:

Hình 1.1. Cơng thức cấu tạo của natri benzoate
- Natri benzoate có dạng bột kết tinh, màu trắng, khơng mùi, hơi hút ẩm, vị mặn và

có thể làm cho thức ăn có vị đắng nếu được thêm vào với một lượng lớn.
- Đặc tính quan trọng nhất của natri benzoate là nó tiêu diệt vi khuẩn, nấm men
hoặc nấm mốc. Nó hoạt động tốt nhất với các loại thực phẩm có độ pH nhỏ hơn
3,6.
- Tan tốt trong nước và nhiệt độ nóng chảy của nó là 300oC.
1.2.2. Nguồn gốc
Natri benzoate là muối natri của axit benzoic E210 và tổng hợp bằng natri

hydroxyd phản ứng với acid benzoic. Các sản phẩm thực phẩm có tính acid
thường chứa một lượng nhỏ natri benzoate. Nó cũng được dùng như chất bảo
quản trong một số sản phẩm như đồ uống lạnh, giấm, nước trái cây và nước sốt
rau trộn.
Natri benzoate cũng có trong trái cây tự nhiên như táo, nam việt quất và
mận. Đinh hương và quế cũng có chứa một lượng natri benzoate nhất định. Mặc
dù natri benzoate được tìm thấy trong một số loại thực phẩm và gia vị tự nhiên,
nó lại khơng đóng vai trò là chất bảo quản cho các loại thực phẩm này.
1.2.3. Cơ chế hoạt động bảo quản của natri benzoate
Cơ chế hoạt động bảo quản của benzoates hoặc natri benzoat phụ thuộc vào
các phân tử không phân ly. Nó có tính ưa béo mạnh mẽ nên dễ dàng xuyên qua
màng tế bào sau đó tiến sâu vào bên trong các vi khuẩn từ đó cản trở sự hấp thụ
các axit amin của màng tế bào. Đồng thời, nó còn có khả năng thẩm thấu nấm


12

mốc, axit hóa các tế bào, ức chế hoạt động của các enzyme hô hấp của tế bào vi
khuẩn, cản trở sự hấp thụ của màng tế bào chống lại các axit amin. Benzoates
hoặc natri benzoat truy cập vào tế bào nội bào, có thể acid hóa nội bào và ức chế
hoạt động của các enzym hô hấp tế bào vi khuẩn để cho một tác dụng bảo quản.
Các muối Benzoat là chất kháng khuẩn phổ rộng hoạt động tốt chống nấm
men, nấm mốc và một số vi khuẩn, và ức chế các vi khuẩn khác nhau ở pH 4 - 5
dưới giới hạn tối đa cho phép được sử dụng.
1.2.4. Công dụng
- Natri benzoat là một chất bảo quản thực phẩm. Nó là chất kìm hãm sự phát triển

của vi khuẩn và nấm trong mơi trường axit. Nó được dùng thịnh hành nhất trong
các thực phẩm có tính axit như rau trộn dầu giấm, đồ uống có ga (axit cacbonic),
mứt và nước trái cây (axit citric), dưa chua (giấm ăn) và các gia vị.

- Nó còn được tìm thấy trong nước súc miệng chứa cồn và xi tráng bạc.
- Nó còn có thể có trong siro trị ho.
- Nó còn được dùng trong pháo hoa như là nhiên liệu trong việc hoà hợp âm, một
chất bột phát ra tiếng nổ khi nén vào ống và đốt cháy.
- Nó được sử dụng để ngăn chặn quá trình lên men trong rượu vang
1.2.5. Tác động đối với sức khỏe
1.2.5.1. Natri benzoate và căn bệnh tự kỷ ở trẻ em
Một vài nghiên cứu đã chỉ ra mối liên hệ giữa natri benzoate và hội chứng
tăng động giảm chú ý ở trẻ em. Tuy nhiên, không phải tất cả các nghiên cứu đều
chứng minh được mối liên quan này.
Hầu hết các nghiên cứu về mối liên hệ giữa natri benzoate với chứng tăng
động cũng đều liên quan đến các chất tạo màu nhân tạo. Một nghiên cứu tiến
hành trên 1.873 trẻ em 3 tuổi nói rằng cha mẹ đã lưu ý thấy một số sự thay đổi
về hành vi ở những trẻ tiêu thụ những loại thực phẩm có chứa cả chất tạo màu
nhân tạo và natri benzoate.
Tuy nhiên, trẻ nhỏ có thể không phải là đối tượng duy nhất chịu ảnh hưởng.
Các nhà khoa học cũng đồng thời tìm ra rằng các loại nước ngọt có chứa natri
benzoate cũng góp phần gây ra những triệu chứng của bệnh tự kỷ ở sinh viên đại
học.


13

Dựa trên những bằng chứng này, Ủy ban Quản lý về độc tính tại Anh đã
khuyến cáo rằng cha mẹ nên hạn chế việc tiêu thụ các loại phẩm màu nhân tạo
và natri benzoate ở trẻ em do nguy cơ hình thành các triệu chứng tăng động.
1.2.5.2.

Natri benzoate và bệnh hen phế quản

Một số bằng chứng khác lại liên hệ giữa natri benzoate với căn bệnh hen phế
quản ở trẻ em. Ít nhất 2 nghiên cứu đã cho thấy rằng uống nhiều nước ngọt có
chứa natri benzoate sẽ có nguy cơ cao gặp phải các triệu chứng của hen phế
quản.
Một trong những nghiên cứu này đã cung cấp số liệu cho thấy 26,3% trẻ em
mắc hen từ 2-13 tuổi đã gặp phải các tác dụng phụ khi uống quá nhiều nước
ngọt có chứa phụ gia natri benzoate.
1.2.5.3.

Natri benzoate và bệnh ung thư

Nguy cơ mắc bệnh ung thư máu và một số ung thư khác sẽ tăng cao nếu sử
dụng các loại đồ uống chứa acid khi có natri benzoate trộn với acid ascorbic và
kali benzoate sẽ tạo thành benzene, một chất gây ung thư.
1.2.5.4.

Natri benzoate và nguy cơ tổn hại DNA

Giáo sư Piper thuộc trường Đại học Sheffield cho rằng chính natri benzoat
có thể phá huỷ và khử hoạt tính của các phần DNA sống trong ti thể tế bào. Ti
thể tiêu thụ ôxi để tổng hợp ATP, nguồn năng lượng của cơ thể. Nếu nó bị phá
huỷ vì bệnh tật, sự cố của tế bào có lẽ sẽ nhập thêm apoptosis. Có nhiều căn
bệnh có ràng buộc với sự phá huỷ của DNA, bao gồm hội chứng Parkinson và
các hội chứng thoái hoá thần kinh khác, nhưng trên tất cả, là q trình lão hố
của cơ thể.
1.2.6. Quy định giới hạn cho phép

Theo chương trình thế giới về an tồn hố học đã khẳng định rằng natri
benzoat sẽ khơng gây ra ảnh hưởng có hại nào cho con người nếu dùng với liều
lượng từ 647–825 mg/kg mỗi ngày. Nồng độ trong các chất phụ gia thực phẩm

cũng được quy định bởi nhà chức trách thực phẩm ở các nước khác nhau. Theo
FDA, natri benzoate là một chất được coi là an toàn cho người tiêu dùng, với


14

hàm lượng tối đa cho phép của natri benzoate trong thực phẩm tại Mỹ là 0,1%.
Ở Việt Nam, theo văn bản hợp nhất số 02/VBHN-BYT ngày 15/6/2017 của Bộ y
tế về hướng dẫn việc quản lý phụ gia thực phẩm quy định hàm lượng natri
benzoat được sử dụng trong sản phẩm chả lụa, pa tê: 1.000mg/kg).
1.3.

Tình hình sử dụng natri benzoate ở Việt Nam [1], [4]
Đề tài “Đánh giá tình hình sử dụng phụ gia thực phẩm (natribenzoat, hàn

the) trong sản xuất chả lụa, pa tê trên địa bàn tỉnh Bạc Liêu”, kết quả cho thấy:
Qua điều tra khảo sát và thu 23 mẫu chả lụa, 11 mẫu pa tê tại cơ sở sản xuất và
các điểm chợ trên địa bàn tỉnh Bạc Liêu, chất bảo quản natri benzoat vẫn còn sử
dụng tương đối nhiều với hàm lượng vượt ngưỡng khá cao. Đặc biệt Natri
benzoat được sử dụng phổ biến trong sản xuất chả lụa với tỷ lệ 41,57% còn sản
phẩm pa tê chỉ chiếm 25,0%. Dư lượng Natri benzoat vượt mức cho phép đối
với những mẫu bị nhiễm trong 2 sản phẩm chả lụa, pa tê.
Nghiên cứu “ Tỉ lệ sử dụng natri benzoate và kali sorbat trong bảo quản một
số thực phẩm tại các chợ tỉnh Tây Ninh”, kết quả là có đến 99% thực phẩm sử
dụng chất bảo quản trong quá trình sản xuất chế biến. Trong đó, 78% chứa natri
benzoate, chỉ có 3% thực phẩm chứa kali sorbat, 19% thực phẩm có chứa cả hai
chất này. Kết quả hàm lượng natri benzoate và kali sorbat dùng để bảo quản thực
phẩm không đạt chiếm 56%. Thực phẩm chả lụa, bò viên và chả quế chứa hàm
lượng natri benzoate trung bình cao hơn mức cho phép (1000mg/kg) trên 2,8
lần, chiếm trên 72%.

Theo kết quả giám sát mối nguy, cảnh báo nguy cơ ô nhiễm thực phẩm
những tháng cuối năm 2018 của Chi cục An toàn vệ sinh thực phẩm (ATVSTP)
Tây Ninh, tình trạng lạm dụng chất bảo quản trong chế thực phẩm, kể cả hóa
chất độc hại của một số cơ sở sản xuất, chế biến, kinh doanh vẫn còn tồn tại rất
đáng lo ngại. Loại phụ gia thường dùng để bảo quản thực phẩm vượt ngưỡng có
tên natri benzoate. Đơn cử, trong tháng 7-2018, qua 10 mẫu chả lụa (chả nạc)
được chi cục lấy mẫu kiểm nghiệm thì 8 mẫu có hàm lượng natri benzoate vượt
ngưỡng cho phép từ 1.188-5.821mg/kg (gấp gần 1,2-6 lần mức cho phép).
1.4.

Nghiên cứu liên quan [6]


15

Nghiên cứu của Yen T.H.Hoang và An T.L.Vu (năm 2016) đã tiến hành phân
tích natri benzoate và kali sorbat trong các sản phẩm từ thịt ở TPHCM bằng
phương pháp HPLC.
Điều kiện sắc ký:
- Cột sắc ký C18
- Pha động: Đệm formate – ACN (80 : 20)
- Thể tích tiêm: 20µL
- Tốc độ dòng: 1mL/phút
- Đầu dò UV phát hiện tại bước sóng 235nm

90 mẫu có nhãn hiệu và khơng có nhãn hiệu nào bao gồm chả lụa, pa-tê, dăm
bông, xúc xích và nem chua có bán tại các chợ ở thành phố Hồ Chí Minh đã
được phân tích cho hai chất bảo quản này. Kết quả cho thấy các mẫu chả lụa có
tỷ lệ mẫu cao nhất với nồng độ chất bảo quản vượt quá ML. Trong số 90 mẫu,
natri benzoate được phát hiện trong 52,2% mẫu và 17,8% trong số đó vượt q

ML, trong khi kali sorbate được tìm thấy trong 24,4% mẫu và chỉ có 2,2% trong
số đó vượt quá lượng quy định. 46,4% chả lụa, 12,5% pa tê và 9,1% nem chua
có natri benzoate vượt quá ML, trong khi mẫu giăm bơng và xúc xích có hàm
lượng chất bảo quản nằm trong giới hạn an toàn. Hơn nữa, các mẫu có nhãn hiệu
cho thấy một kết quả khác biệt đáng kể so với khơng có mẫu có nhãn hiệu.
Trong số các mẫu có nhãn hiệu, vượt quá mức natri benzoate ML đã được phát
hiện trong 10% mẫu và khơng có mẫu nào được tìm thấy vượt q lượng giới
hạn kali sorbate. Trong khi 27,5% mẫu khơng có nhãn hiệu có natri benzoate và
5% mẫu có kali sorbate cao hơn so với giới hạn cho phép.


16

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
2.1.1. Đối tượng
Mẫu chả lụa được chọn để xây dựng quy trình phân tích là một loại chả lụa
mua ngẫu nhiên trên thị trường thành phố cần Thơ.
2.1.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
Địa điểm: Liên bộ mơn Hóa phân tích – Kiểm nghiệm – Độc chất
Thời gian: Từ ngày 07/03/2022 – 12/03/2022
2.1.3. Hóa chất, chất chuẩn, thiết bị, dụng cụ
2.1.3.1. Hóa chất, chất chuẩn, dung mơi
- Chuẩn natri benzoate
- Methanol, acetonitrile (HPLC)
- Acid formic
- Dietyl ether
- Thuốc thử Carrez 1, Carrez 2
- Nước cất 2 lần
2.1.3.2. Thiết bị, dụng cụ

Các thiết bị dụng cụ dùng trong thực nghiệm được hiệu chuần theo
ISO/IEC 17025 và GLP gồm có:
+ Máy siêu âm.
+ Cân phân tích điện tử (độ nhạy 0,01 mg).
+ Máy đo pH.
+ Máy ly tâm.
+ Máy sắc ký lỏng siêu hiệu năng Thermo-dionex.
+ Cột sắc ký Phenomenex Gemini RP-C18 (200 mm x 4,6 mm; 5 µm).
+ Dụng cụ thủy tinh các loại:
- Bình erlen: 6 bình
- Bình định mức 50 ml: 6 binh
- Bình định mức 100 ml. 6 bình
- Bình định mức 10 ml. 2 bình
- Phễu lọc: 6 cái
- Bercher 250 ml: 5 cái
- Bercher 100 ml: 5 cái
- Đũa thủy tinh: 5 cái


17
- Ống đong 100 ml: 5 cái
- Bình lăng gạn 100 ml 5 cái
- Giấy lọc, màng lọc 0,45 µm.

- Kim tiêm, đầu lọc 0,45µm, vial.
2.2. Nội dung nghiên cứu
2.2.1. Xây dựng quy trình phân tích natri benzoate trong chả lụa bằng
phương pháp UPLC/UV
2.2.1.1. Chuẩn bị mẫu
- Dung dịch chuẩn gốc natri benzoate nồng độ 1000ppm: Cân chính xác 10mg

chuẩn natri benzoate cho vào bình định mức 10mL, thêm MeOH vào hòa tan, bổ
sung vừa đủ đến vạch.
- Mẫu chuẩn làm việc natri benzoate 100ppm: Hút chính xác 1ml dung dịch
chuẩn gốc natri benzoate nồng độ 1000ppm cho vào bình định mức 10mL, thêm
pha động vừa đủ đến vạch.
- Mẫu chuẩn làm việc natri benzoate 40ppm: Hút chính xác 0.4ml dung dịch
chuẩn gốc natri benzoate nồng độ 1000ppm cho vào bình định mức 10mL, thêm
pha động vừa đủ đến vạch.
- Mẫu thử: Xay nhuyễn chả lụa rồi xử lý theo quy trình xử lý mẫu dự kiến
- Mẫu thử thêm chuẩn: Mẫu thử sau khi được xử lý theo phương pháp thích hợp
và thêm một lượng chuẩn xác định.
2.2.1.2. Khảo sát điều kiện sắc ký
- Qua nghiên cứu các tài liệu tham khảo, các hệ pha động dùng để khảo sát gồm:
Acetonitrile – nước, MeOH - nước và MeOH – acid formic 0,1%.
- Các tỷ lệ dung môi pha động khảo sát được trình bày tại bảng 2.1:

Bảng 2.1. Các hệ dung môi pha động được khảo sát
STT

Pha động

Tỷ lệ (v/v)

1

ACN - H2O

50 : 50

2

MeOH - H2O

50 : 50


18

3

50 : 50

4

MeOH - Acid formic 0,1%

5

60 : 40
70 : 30

6
2.2.1.3. Khảo sát quy trình xử lý mẫu

80 :20

Quy trình xử lý mẫu dự kiến:
2g mẫu + 20mL (MeOH-H2O) (20:80)
Siêu âm 30 phút,
Chiết lần 2

Gộp dịch chiết vào BĐM 50 ml

Loại tạp bằng TT Carrez II

Loại tạp bằng TT Carrez I

Bổ sung MeOH-H2O (20:80) BĐM 50ml
Lọc qua giấy lọc, loại bỏ 10ml dịch lọc đầu
Lọc 1ml qua màng lọc 0,45µm vào vial
Hình 2.1. Sơ đồ quy trình xử lý mẫu dự kiến

2.2.2. Thẩm định quy trình phân tích natri benzoate trong chả lụa bằng
phương pháp HPLC
2.2.2.1. Tính tương thích hệ thống
* Mục đích:

Đánh giá tính tương thích hệ thống nhằm chứng minh sự thích hợp của hệ
thống phân tích sắc ký với quy trình định lượng đã xây dựng. Tính tương thích

Bỏ 10ml dịch đầu


19

hệ thống được xác định dựa trên giá trị và độ lặp lại của các thông số sắc ký, bao
gồm: thời gian lưu (tR); diện tích đỉnh (S); độ phân giải (R S); hệ số bất đối (As);
số đĩa lý thuyết (N).
* Cách tiến hành:

Tiến hành sắc ký với các dung dịch chuẩn natri benzoat với 6 lần tiêm liên

tiếp theo điều kiện sắc ký tối ưu đã xác định, ghi lại các sắc ký đồ và xác định
giá trị thời gian lưu, diện tích đỉnh, độ phân giải, hệ số đối xứng, số đĩa lý
thuyết.
Xử lý thống kê số liệu các giá trị thu được:
Giá trị trung bình:
Độ lệch chuẩn:
Độ lệch chuẩn tương đối:
Xác định RSD% của thông số sắc ký: thời gian lưu, diện tích đỉnh.
* Đánh giá kết quả:

Quy trình đạt tính tương thích hệ thống khi: hệ số bất đối (As) phải nằm
trong khoảng 0,8 – 1,5; độ phân giải (Rs) > 1,5; giá trị RSD% của thời gian lưu
và diện tích đỉnh của các paraben sau 6 lần tiêm ≤ 2,0%.

2.2.2.2.
Tính đặc hiệu
* Mục đích:

Tính đặc hiệu của một quy trình phân tích nhằm chứng minh quy trình phân
tích cho phép xác định chính xác và đặc hiệu chất cần phân tích mà khơng bị ảnh
hưởng bởi sự có mặt của các chất khác có trong mẫu thử, phân biệt chất phân
tích với nền mẫu và với các chất khác.
* Cách tiến hành:


20

Tiến hành sắc ký các loại mẫu sau đây theo các điều kiện sắc ký tối ưu đã xác
định:
- Mẫu trắng: Dung môi pha động/dung môi hòa tan mẫu hay pha loãng mẫu.

- Mẫu chuẩn: dung dịch chuẩn natri benzoat
- Mẫu thử: mẫu chả lụa được xử lý theo quy trình xử lý mẫu tối ưu đã xác định.
- Mẫu thử thêm chuẩn: mẫu chả lụa đã được cho thêm chuẩn natri benzoat nồng độ

xác định, được xử lý theo quy trình xử lý mẫu tối ưu đã xác định.
Ghi lại các sắc ký đồ, xác định thời gian lưu, độ tinh khiết của pic natri benzoat.
* Đánh giá kết quả
- Sắc ký đồ mẫu trắng không xuất hiện các pic có thời gian lưu tương ứng với thời

gian lưu của pic natri benzoat trong sắc ký đồ của mẫu chuẩn.
- Sắc ký đồ mẫu thử nếu có natri benzoate thì pic natri benzoat có thời gian lưu
tương ứng như trong sắc ký đồ của mẫu chuẩn.
- Sắc ký đồ mẫu thử thêm chuẩn phải có các pic tại thời gian lưu tương ứng với
thời gian lưu của pic natri benzoat trong mẫu chuẩn, đối với mẫu thử có chứa
natri benzoate thì pic của natri benzoate phải có sự tăng lên về diện tích, chiều
cao pic.
2.2.2.3. Tính tuyến tính
* Mục đích:

Tính tuyến tính của quy trình phân tích giúp luận ra các kết quả phân tích
dựa vào đường biểu diễn sự phụ thuộc giữa độ đáp ứng của đại lượng đo được
và nồng độ (trong khoảng nhất định).
* Cách tiến hành:

Tiến hành sắc ký với những điều kiện tối ưu đã xác định với dung dịch chuẩn
natri benzoat ở các nồng độ từ 1 – 20ppm.
Xây dựng đường thẳng biểu diễn tương quan giữa diện tích đỉnh theo nồng
độ chất phân tích.
Dùng phần mềm Microsoft Excel xác định hệ số a (độ dốc), b (tung độ gốc),
R2 (bình phương của hệ số tương quan) của phương trình hồi quy

(y = ax + b).
* Đánh giá kết quả:


21

Hệ số tương quan (r) ≥ 0,997 (hay R2 ≥ 0,995).
Kiểm tra tính tương thích của phương trình hồi quy bằng trắc nghiệm F (phân
phối Fisher) và ý nghĩa của các hệ số trong phương trình bằng kiểm định T
(phân phối Student).
Độ chính xác
* Mục đích: Độ chính xác của một quy trình phân tích diễn tả sự thống nhất

2.2.2.4.

(mức độ phân tán) kết quả giữa một loạt phép đo từ nhiều lần lấy mẫu trên cùng
một mẫu thử đồng nhất dưới những điều kiện mơ tả.
Độ chính xác có thể chia thành 3 cấp: độ lặp lại, độ chính xác trung gian và
độ tái lặp. Độ chính xác nên được thử trên một mẫu thử thực, đồng nhất. Tuy
nhiên, nếu khơng có mẫu đồng nhất thì có thể dùng mẫu tự tạo hoặc một dung
dịch mẫu thử. Độ chính xác thường được biểu thị dưới dạng độ dao động, độ
lệch chuẩn hoặc hệ số độ dao động của một loạt phép đo.
Độ chính xác trong ngày (Độ lặp lại - Repeatability):

Độ lặp lại diễn

tả độ chính xác của một quy trình phân tích trong cùng điều kiện thí nghiệm
trong khoảng thời gian ngắn. Độ lặp lại còn được gọi là độ chính xác trong cùng
điều kiện định lượng.
* Tiến hành: Tiến hành sắc ký 6 mẫu thử độc lập (hoặc có thể dùng mẫu tự

tạo hoặc một dung dịch mẫu thử) trong cùng điều kiện sắc ký tối ưu đã khảo sát.
Độ chính xác trong ngày (intra-day) được thể hiện bởi giá trị độ lệch chuẩn
tương đối của nồng độ chất phân tích.
* Đánh giá: Phương pháp có độ chính xác khi độ lệch chuẩn tương đối
RSD của diện tích pic natri benzoate có giá trị khơng vượt q quy định trong
bảng 2.2
Bảng 2.2. Độ lặp lại tối đa chấp nhận tại các hàm lượng khác nhau theo phụ lục
F AOAC – trang 9 [13]
T
T
1
2
3
4
5
6

Hàm lượng %
100
10
1
0,1
0,01
0,001

Tỷ lệ chất

Đơn vị

RSD (%)

1
10-1
10-2
10-3
10-4
10-5

100%
10%
1%
0,1 %
100 ppm
10 ppm

1,3
1,8
2,7
3,7
5,3
7,3


22

7
8
9
10

0,0001
0,00001
0,000001
0,0000001

10-6
10-7
10-8
10-9

1 ppm
100 ppb
10 ppb
1 ppb

11
15
21
30

2.2.2.5. Độ đúng (tỷ lệ thu hồi %)
* Mục đích: Xác định độ đúng của quy trình phân tích nhằm xác định giá
trị tìm thấy so với giá trị thực khi áp dụng quy trình phân tích trên cùng một mẫu
thử trong cùng điều kiện xác định. Độ đúng biểu thị tỷ lệ thu hồi (%) giá trị tìm
thấy so với giá trị thực của chất chuẩn thêm vào mẫu thử, đồng thời đánh giá
hiệu suất của q trình chiết mẫu phân tích.
* Cách tiến hành: Tiền hành phân tích mẫu thử thêm chuẩn rutin ở 3 mức
nông độ 80%, 100% và 120% nồng độ được chọn nằm trong khoảng tuyến tính,
mỗi nồng độ được phân tích lặp lại 3 lần. Dựa vào diện tích đỉnh thu được để
xác định hàm lượng mẫu thử thêm chuẩn bằng phương trình hồi quy tuyến tính,

từ đó tính ra tỉ lệ thu hồi của phương pháp định lượng theo cơng thức:
Tỷ lệ thu hồi (%):
Trong đó:
R% : Tỷ lệ thu hồi (%)
µ: Lượng chuẩn tìm thấy thực tế.
: Lượng chuẩn thêm vào.
* Đánh giá kết quả: Phương pháp có độ đúng khi độ thu hồi của natri
benzoate có giá trị không vượt quá quy định trong bảng 2.3
Bảng 2.3. Độ thu hồi chấp nhận ở các hàm lượng khác nhau (theo
AOAC)

T
T
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10

Hàm lượng (%)
100
≥ 10
≥1
≥ 0,1
0,01

0,001
0,0001
0,00001
0,000001
0,0000001

Tỷ lệ chất

Đơn vị

Độ thu hồi (%)

1
10-1
10-2
10-3
10-4
10-5
10-6
10-7
10-8
10-9

100%
10%
1%
0,1 %
100 ppm
10 ppm
1 ppm

100 ppb
10 ppb
1 ppb

98-102
98-102
97-103
95-105
90-107
80-110
80-110
80-110
60-115
40-120


23

2.2.2.6. Xác định giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ):
* Mục đích:

Xác định giới hạn phát hiện của quy trình phân tích nhằm xác định lượng nhỏ
nhất của chất phân tích trong mẫu thử mà quy trình có thể phát hiện được.
Xác định giới định lượng của quy trình phân tích nhằm xác định được lượng
nhỏ nhất cuả chất phân tích trong mẫu thử mà quy trình phân tích có thể định
lượng được với độ đúng và độ chính xác thích hợp.
* Cách tiến hành:

Trong nghiên cứu này, giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng
(LOQ) được xác định dựa việc phân tích các mẫu pha loãng dần . Tiến hành sắc

ký mẫu chuẩn Natri benzoat được pha loãng dần đến khi tỷ số S/N đạt u cầu
hoặc tín hiệu thiết bị khơng còn đáp ứng.
* Đánh giá kết quả:

- LOD là nồng độ mà tại đó tỷ số tín hiệu lớn gấp 3 lần nhiễu (S/N ≥ 3) hoặc là
nồng độ thấp nhất mà tại đó hình dạng pic và các thơng số sắc ký còn đạt yêu
cầu,
- LOQ là nồng độ mà tại đó tỷ số tín hiệu lớn gấp 10 lần nhiễu (S/N ≥ 10) hoặc
LOQ = LOD x 3.3

- Dựa vào đường chuẩn:
* Giới hạn phát hiện (LOD) có thể được tính như sau:
* Giới hạn định lượng (LOQ) có thể được tính như sau:
Trong đó:

σ là độ lệch chuẩn của đáp ứng
S là độ dốc của đường chuẩn

2.2.3. Ứng dụng quy trình đã thẩm định phân tích natri benzoate trong một số
mẫu chả lụa trên thị trường
Ứng dụng quy trình đã xây dựng định lượng 3 mẫu chả lụa trên thị trường.


24

Chương 3: KẾT QUẢ
3.1. Khảo sát pha động và bước sóng phân tích
3.1.1. Khảo sát pha động
Tiến hành khảo sát pha động với các thành phần và tỉ lệ như sau:
Bảng 3.1. Các hệ dung môi pha động được khảo sát

STT

Pha động

Tỷ lệ (v/v)

1

ACN - H2O

50 : 50

2

MeOH - H2O

50 : 50

3

MeOH - Acid formic 0,1%

50 : 50

4

60 : 40

5

70 : 30


25

6

80 :20

Hình 3.1. Sắc ký đồ hệ pha động MeOH - Acid formic 0,1%; MeOH - nước;
ACN : nước (tỷ lệ 50 : 50)
Nhận xét:
- Ở tỷ lệ 50 : 50, sắc ký đồ của các hệ pha động MeOH - nước và ACN :
nước cho pic Natri benzoat có thời gian lưu khoảng 2 phút, trùng với pic dung
môi.
- Ở tỷ lệ 50 : 50, sắc ký đồ của các hệ pha động MeOH - Acid formic 0,1%
cho pic Natri benzoat có thời gian lưu khoảng 10 phút và pic Natri benzoat chưa
tách hoàn toàn.
Hệ pha động MeOH - Acid formic 0,1% cho tín hiệu pic Natri benzoat cao
hơn các hệ khác. Do đó sử dụng hệ pha động này để tiếp tục khảo sát.