Phương pháp điện di (Tải: https://link1s.com/yHqvN)

Mng
or


1
M U
 m sinh vt, vt cht sc cu to t i phân t sinh hc,
ng nht là 
quan trng trong s  và truyt thông tin di truyn cho th h a,
các thông tin này s c biu hi thông qua s to thành các phân t
protein.        ng hp protein luôn xut hin
nhiu bin gc ca s ting ca sinh gii.
Vì vy vic tìm hiu, phân tích các phân t DNA, RNA là rt cn thit. Khi hiu rõ
cm ci phân t này, chúng ta có th kt hp vi s phát trin
các k thut, các công ngh hi tin hành lai to, chn ging mi, sn xut
các hp cht th cp dùng trong y hc, sn xut các ch
Có rt nhiu k thuc ng dng trong công ngh sinh hc  nghiên cu
vt cht sn di là mt k thut rt hu ích s dng nhm phân tích,
nh và tinh sn DNA bng cách da vào s dch chuyn ca chúng
ng.

Mng
or


2
NI DUNG
I. NGUYÊN TC CHUNG
n di là hing dch chuyn ca các phân t ng
cng, hay nói cách khác là k thut phân chia các phân t DNA, RNA,
protein dm vn tích thc ca chúng.
Khi các phân t    t trong m  ng, chúng s dch
chuyn v các cc (+) hoc (-n tích cn tích
thc hoc c âm, còn các nucleic acid có mi nh
khung phosphate ca mình và vì th ch dch chuyn c

           
polyacrylamide gel. Tuy nhiên         





-20 kb.
N DI AGAROSE GEL
Agarose có khng phân t xp x 120.000 Da, là mt trong hai thành
phn chính ca agar chim khong 70%, phn kia là agaropectin chim khong 30%.
Agarose là mt polymer mch thng không b sulphate hóa cha hai gc xen k
nhau là D-galactose và 3,6-anhydro-L-galactose.

              

o
C 
 ge-45
o


Mng
or


3
  







 
1. Nguyên tc
  

























 



























 . T dch chuyn ca các phân t trong gel ph
thu   c, cu hình phân t, n  gel, l   n di
i  nh và
tinh sn DNA
 : 















 (EtBr)




n d.
2. Các yu t ng
2.1. 
Các phân t c càng ln (khng phân t ln) thì t
dch chuyn càng chm. 


10 





.




Mng
or

4











2. 











 









2.2. 


















 

















.
1. 


(%) trong gel



 (kb) 











0,3
60-5
0,6
20-1
0,7
10-0,8
0,9
7-0,5
1,2
6-0,4
1,5
4-0,2
2,0
3-0,1



0,5%
0,9%

1,2%

1,4%
0,7%
5

4






3






2





Log
10
của các cặp nucleotide
đệm: 0,5 x TBE – 0,5 μg/mL EtBr
điện di: 1 V/cm trong 16 giờ
1 2 3 4 5 6
Mng
or

5







3. n di các mu DNA ging nhau  các n agarose khác nhau. A: 1%, B: 1,5%
và C: 2%.
Theo hình trên, s



2.3. 










,  ng

















.
DNA ca các plasmid mch vòng dch chuya plasmid
cùng long mch thng.





Hình 4. Kt qu n di vi plasmid mch vòng bên trái và plasmid cùng loi
mch thng  bên phi.


1 2 1 2 1 2
A
B
C
DNA mạch vòng

DNA mạch thẳng
Dạng vòng đứt

Dạng vòng đóng
Mng
or


6
2.4. 


























. Trong agarose gel, 
 ng t 4
o
C
n 30
o
C. , 













.
n di
3.1. Thit b n di




p: 

 
Mng
or


7


3.2. 

pH
Mt s  n di DNA thích hp là Tris-acetate-EDTA (TAE), Tris-
borate-EDTA (TBE) và Tris-phosphate-EDTA (TPE)  50 


pH 7,5-7,8.  




 , 





 . 


















 .
Cán DNA s dch chuyn vi các t m trên.

m giúp thit lp mt giá tr pH, cung c h tr  dn.


    

1 lít)
Tris-acetate-
EDTA(TAE)
40 mM Tris
20 mM acetic acid
1 mM EDTA
(50)
242 g Tris base
57,1 mL glacial acetic acid
100 mL EDTA 0,5 M (pH 8,0)
Tris-borate-
EDTA (TBE)
89 mM Tris
89 mM boric acid
2 mM EDTA
(10)
108 g Tris base
55 g boric acid
40 mL EDTA 0,5 M (pH 8,0)
Tris-phosphate-
EDTA (TPE)
80 mM Tris- phosphate
2 mM EDTA

(10)

108 g Tris base
15,5 mL H
3
PO
4
85%
40 mL EDTA

3.3. 




3.3.1. Chuẩn bị agarose gel
 , 






 -II-





 (low-endo-
osmotic).  










 , 
















 . Tuy nhiên, type-II-






 i
sulphate polysaccharides (SP), 







 ,


 . , 





.
Mng
or


8
Cách tiến hành: Cho 1% type-II-

 100 

 0,5  

trong ni kh 





 . 


 100 mL. 






60
o






 






 

. 



 5 




. Sau 30-40 , k



, 



.
3.3.2. Đt mu DNA vo giếng



. 








:
DNA (1 g/1 µL ) : 1 L




(10 loading dye):1 L
c 2 : 9 L
Tng s : 11 L
11 



.















0,5 






gel,  



 . ng dùng micropipette loi 20-200 L
 





 n th cn di,
n DNA lng dch chuyn nh. DNA dch








 . 




 




 



.
3.3.3. Nhuô
̣
m DNA bằng EtBr


















 . Sau k












0,5 g/mL, 

30-45 , 
trên m



(

10 /). 











, 

15-20 . EtBr












5 mg/



 4
o
.







 





 . Tuy nhiên, 
(affinity) 














Mng
or


9



 . Sau khi nhum, EtBr s xen vào gia các base ca
nucleic acid và cho phép phát hin d dàng chúng  trong gel.


(0,5 g/mL) 

   phn ng nhum
xy ra trong sun di. 














 (15%), 















 
















 . Tuy nhiên, 




  








 

 . 









2


(0,5 g/mL)/45 .

Hình 6 minh hn di agarose gel
3.3.4. Quan sa
́
t va
̀
chu
̣
p a
̉
nh
 ( = 302
nm).  



       hình nh DNA (Gel

Documentation System).

a. Khuôn đổ gel
Dung dịch agarose gel
Băng dính
Lược
Giếng
b. Gắn lược và đổ agarose gel
vào khuôn
c. Lấy lược ra khỏi khuôn gel
Micropipette
Nguồn điện di
Cable
Đệm điện di
Nắp
Buồng điện di
d. Nạp mẫu DNA vào giếng
e. Chạy điện di
Vị trí gắn lược
Mng
or


10

(a) (b)
i ánh sáng t ngoi (a) và hình n di DNA
trên agarose gel (b)
3.4. Mt s 




a) Dùng agarose có nhi nóng chy thp
Mu agarose gel có nhi nóng chy thp chc ct
ra khi bm vi t l 1:1, b sung mun n 0,5 M,
c nóng chy  70
o
 m. Dung dch gel có DNA
c chit bng phenol/chloroform và kt t    c tách chit bng
p cho mc thao tác tip theo, do s hin
din ca các nhân t c ch trong agarose.








Agarose gel có nhit
 nóng chy thp
Ct
n DNA quan
tâm

n DNA quan
tâm

m
vi t l 1:1

Chit bng
phenol/chloroform
và kt ta
B sung mun
n 0,5M
Dung dch gel có
DNA

70
o
C
Hình 8.  tóm tt quá trình thu hi DNA quan tâm
bng cách dùng agarose có nhi nóng chy thp
Mng
or


11
b) Ly tâm
Mu agarose gel có chc cm
chi       ch gel lên trên mt lp
bông tht trong mt ct lc nh loi 0,5 ml. Cc
cho vào mt tube vi ly tâm loc ly tâm  t cao 10.000-15.000

rpm trong 10-15 phút. DNA s liên kt vi màng còn dung dm s p
bông thm ra vào ct và ra ct vài ln bng cách
ly tâm nhanh. Thay tube vi ly tâm mm hòa tan DNA vào c
dung ly (elution) DNA ra khi màng vào tube. Dung d  c có th
c tinh sch thêm nu c nh m
 ci thin hiu sut thu hi DNA.










n di vào by
* Cách 1: Mt cái rãnh nh c c  c ca
 y b    n di
nhanh tr l chuyn DNA t gel vào trong dung dch glycerol (n di
agarose gel cha


Ct
n DNA quan
tâm

m chit,
làm nóng hòa tan
hoàn toàn

ly tâm  10.000-
15.000 rpm trong
10-15 phút.

tht trong
mt ct lc
cho vào tube ly tâm

ra ct vài ln

DNA liên kt vi
màng

dung ly DNA ra
khi màng

Hình 9.  tóm tt quá trình thu hi DNA quan tâm
bng cách dùng ly tâm
Mng
or


12
có th c kim soát bng UV). Dung dch glycerol-c chit bng
pipette.
* Cách 2: n di, mt khe nh c c
t trong khe mt mu giy loi NA-45. in di
tr l dch chuyn vào trong mu giy. Mu gi
c rm bu giy ti 70

o
C.
 c tách chit bng phenol và kt ta.












d) Dùng ht thy tinh
Mc hòa tan trong dung dch mui NaI  n khong 4
t thc b sung vào dung d liên kt hiu qu vi
c phóng thích  n a NaI. RNA, protein và các
tp cht khác không liên kt vi các ht thy tinh. Tip theo, tin hành ra và kt ta
tiu th, DNA tinh sc dung ly khi ht thm mui thp. Tuy
c dù nhanh và hiu qu i có phm vi tp.
Thu hn DNA nh (500-800 bp) là không hiu qu l n ln

Ct mt rãnh nh phía trc

Ly bng glycerol
in di nhanh tr l chuyn DNA
t gel vào trong dung dch glycerol
Chit dung dch glycerol-DNA

bng pipette
Ct mt rãnh nh c

t trong khe mt mu
giy loi NA-45
in di nhanh tr l
chuyn DNA t gel vào
mu giy
Ra mu giy và dung
m
Tách chit DNA bng
phenol
và kt ta
Hình 10.  tóm tt quá trình thu hi DNA quan tâm bng cách dùng
n di vào by. (a): cách 1, (b): cách 2
(a)
(b)
Mng
or


13
(>15 kb) có th liên kt vi các ht thy tinh khác nhau và các si DNA có th b
phá v trong sut các chu k ra.


4. ng dng cn di agarose gel
c ca các phân t DNA sau khi thc hin phn ng ct
hn ch (ví d: lp b hn ch cc t
Phân tích các sn phm PCR (ví d: trong chn phân t hoc

in du di truy
Phân tách DNA h   c ct hn ch c khi thm tích Southern,
hoc khi thm tích Northern.
m
* m cc rót d dàng, không gây bin tính
mu và bn vng v thu hi.
* m là agarose gel có th b nóng chm
có th b tiêu hao, và các dng khác nhau ca nucleic acid có th chy không nh.

N DI POLYACRYLAMIDE GEL



N, N, N
'
, N
'
-tetramethylathylene-
Hòa tan gel trong dung dch
mui NaI (4 M).
B sung ht thy tinh
vào dung dch
Ra và kt ta tiu th
Tách chit DNA bng phenol
và kt ta
Dung ly DNA ra khi ht thy
m mui thp
DNA liên kt vi ht thy
tinh
Hình 11 tóm tt quá trình thu hi DNA quan tâm bng cách dùng

ht thy tinh.
CH
2
= CH C NH
2

O
Mng
or


14
 khi các acrylamide monom



Khi bisacrylamide (N, N
'
-methylene

       
phân tách các phân 





Hình 13. Hình thành polyacrylamide gel
CONH
2

CONH
2
CONH
2


S
2
O
4
2-
SO
4
-
+ nCH
2
= CH nCH
2
CH CH
2
CH
TEMED
Mng
or


15
1. Nguyên tn di polyacrylamide gel
D  protein, 


 , k c RNA và
DNA/RNA. 




















 





. 









 10-100























 .
 3,5%-
20%   protein ho

 . Nng
 thp to ra các l c l có th phân tách các phân t
lLiên kt chéo ca các monomer và các tác nhân liên kt có th u ch
kim soát m xp ca khuôn gu này cho phép t phân
tách mt phc bit ca các phân t protein.





Hình 14. Polyacrylamide gel
n di acid nucleic










 





 5-2.000 bp. N c s dng trong khong


3,5-20% .










:
- 



 




.
- 

 















.
Mng
or


16
n tính là loc s dng
nht. 

  









n tích ca DNA.
2. 








polyacrylamide gel 













Hình 15. Cu trúc thit b n di polyacrylamide gel
Acrylamide (% w/v)









(nucleotide)
3,5
1.000-2.000
5,0
80-500
8,0
60-400
12,0
40-200
15,0
25-150
20,0
6-100
Mng
or


17
2.1 n di polyacrylamide gel không bin tính
2.1.1. Chuẩn bị polyacrylamide gel không biến tính
 20 cm40 cm. 
 0,5 mm-2,0 mm. 
 ,  



 . Tuy nhiên , 







 (>1 g/) 






 .
2.1.2. Các bước tiến hành:
a) Chuẩn bị dung dịch: 30% acrylamide (-acrylamide), 1 TBE, 10%
ammonium persulphate.
b) 













KOH/

. 















.
c)   









, 





m.
3. 



















d) 

 35 




 100 




gel, 







 .  .












 


(%) 

3,5%
5,0%
8,0%
12,0%
20,0%
30% acrylamide
(-acrylamide)
11,6
16,6
26,6
40,0
66,6



67,6
62,7
52,7
39,3
12,7
5 TBE
20,0
20,0
20,0
20,0
20,0
10% ammonium persulphate

0,7
0,7
0,7
0,7
0,7
Mng
or


18




,  (). 










p gel. , 

 














.
e) 





 60 ,








.
f) Sau khi 






 



 , 


 . 

 





 


1 TBE, 


1 TBE.
g) 








 









 6 gel-loading dye.
 .
h) 





 . 




 1 V/8 V/cm. 















 . , 






.  , 








.

Hình 16. c chun b n di
Mng
or


19
2.2. Phát hin DNA trong polyacrylamide gel
2.2.1. Nhuô
̣
m bằng ethidium bromide






 (0,5 g/mL EtBr trong 1 TBE). Sau
30-45 ,  

, 






 
Kimwipe.  y nylon (Saran wrap), 




. Quan sát và chp 





.










 , 























10 ng.
2.2.2. Nhuộm bằng thuốc nhuộm bạc:
Thuc nhum bc s dng hiu qu  phát hin cho phép phát hin mt
ng protein  dng vt trong polyacrylamide gel và mng nh nucleic acid
(pg), nhy gp 1.000-10.000 lm bng EtBr.
  m b  c s dng là: 1) Dùng các dung
dch diamine silver hay ammoniacal silver cho thm vào gel và pha loãng các dung
dch acid ca formaldehyde. 2) Thm dung dch silver nitrate vào gel trong môi
ng acid yu và dùng formaldehyde kh có chn lc các ion bc thành bc kim

lo u kin kim. Pm kém nh hích
hi vt màu ti
vi các gel mng.
Quá trình nhum bao gc sau:
- C nh nucleic acid trong acetic acid 7,5% ti thi n s
khuch tán ca các phân t nucleic   c phân tách trong gel, loi b và
trung hòa các hóa cht không mong mum).
- Rc kh ion ti thi loi b acetic acid, các cht
bn dng vt và phn tha ca các thành phn gel hòa tan sau khi c nh.
- Nhum gel trong dung dch bc vi s có mt c   ci
thi nh n. Thi gian nhum tng 20 phút. Tuy nhiên,
i vi loi gel có t  polyester (8×10 cm) ch c có chng
hình nh cao mà không làm gi nhy.
- Ra gel sau khi nhum b loi b thuc nhum tha có th gây ra kt
ta màu nâu trong quá trình phát trin màu.
Mng
or


20
- Phát trin màu ca gel bng hn hp dung dch sodium carbonate (4g/L),
sodium thiosulfate (4 µM) và formaldehyde  gim c hiu
mt cách hiu qu. Nhi ra thích hp t 8-10
o
C, thi gian ri tùy vào
thành phn ca dung dch phát trin màu trong khong t n vài phút.
- Dng phn ng phát tri c hình nh tng nhanh
càng tt bng cách dùng acetic acid lnh 7,5%.

2.2.3. Phóng xạ tự ghi:
DNA có th c phát hin bng v phóng x
32
P. C nh nucleic acid
trong acetic acid 7,5% n hành ra gel 



 . 




 . Tiánh du phóng x và sy gel 
80
o
C u kin chân không t 1-2 gi.  phim phóng x khong 24 

. Quan
sát kt qu.
Hình 17. Phát hin DNA bng thuc nhum bc
Mng
or


21

Hình 18. Hình ánh du
32
P trên polyacrylamide gel  phim X-quang.

2.3. 

























Maxam và Gilbert (1977). m c:
+ 









+ 
















không bi



n tính.

















(1977):
-  gel. 
.
-  . 




kh

 , 

 



.
- 

 

 -tube (eppendorf tube), 
.
- 1-2 t








-tube.
- 







 37
o







. 



 (<500 bp)




3-4 

, 





12-16 


- Ly tâm 12.000 vòng trong 1 4
o
C. 








-

.
Mng
or


22
- 

 0,5 







 -






gel, 


. 









.
- 







4
o
C,  30 ph.


12.000 vòng trong 10 4
o
C.
- 




200 

(pH 7,6) 25 

3 M
sodium acetate .
- 











 70%  


(pH 7,6) 










10 L.
- 














gel. 

  



10 L TE (pH 7,6), 

 2 L
gel-loading dye. .

Hình 19.  tóm tt pci tin t k thut ca Maxam và Gilbert (1977)

Chn di
polyacrylamide gel
nh v trí DNA
C ra khi gel,
chuyn vào eppendorf tube
B m chit
  37ºC kèm lc nh
Ly tâm 12.000 vòng/phút
 4ºC, ly th ni
Kt ta DNA bng ethanol 
4ºC trong 30 phút
Ly tâm 12.000 vòng trong
10 phút  4º thu hi
DNA
Hòa tan tr li DNA trong
200 m TE (pH 7,6)
Mng
or


23
KT LUN
  n di giúp nhn bit, phân tích và tinh sch DNA. Nh
i ta ng d phân tích gii trình t DNA, ng dng
trong các nghiên cu v DNA rt hiu qu.
Có nhiu lo c áp dng cho k thui loi phân
t khác nhau s phù hi vi lo khn di agarose gel là
     i vi DNA còn polyacrylamide gel   c c
nucleic acid và protein. Nói chung m u có nh  c
m riêng, tùy vào tng h tin di theo cách nào là tt nht.