Bài giảng Thực hành Vi sinh vật đại cương (Chương trình POHE)

10/21/2018

THỰC HÀNH

Bài 1: PHƯƠNG PHÁP LÀM TIÊU BẢN SOI TƯƠI
NỘI DUNG:
1. Phương pháp làm tiêu bản soi tươi

Vi sinh vật đại cương
(Chương trình POHE)

2. Quan sát tiêu bản nấm mốc
MỤC ĐÍCH:
Làm quen với cấu tạo kính hiển vi quang học. Nắm được cách
sử dụng
Học cách làm tiêu bản soi tươi (không nhuộm)
Quan sát tiêu bản nấm mốc

NỘI DUNG
BÀI 1. PHƯƠNG PHÁP LÀM TIÊU BẢN CỐ ĐỊNH VÀ
NHUỘM MÀU GRAM
BÀI 2. QUAN SÁT HÌNH THÁI VI SINH VẬT
BÀI 3. PHƯƠNG PHÁP LÀM MÔI TRƯỜNG
BÀI 4. NUÔI CẤY VI SINH VẬT
BÀI 5. ĐÁNH GIÁ SINH TRƯỞNG CỦA VSV TRÊN CÁC
MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY
BÀI 6. CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐẾM SỐ LƯỢNG TB VSV

II. Phương pháp làm tiêu bản soi tươi
- Tiêu bản soi tươi: Lấy trực tiếp mẫu đặt lên phiến kính để quan sát, không cần nhuộm
màu.

- Tiêu bản này không thể bảo quản lâu dài
- Thực hành:
+ Phương pháp làm tiêu bản giọt ép (quan sát nấm men)
+ Phương pháp làm tiêu bản nấm mốc
2.1. Các bước chuẩn bị:
- Mẫu vi sinh vật cần quan sát:
+ Mẫu lỏng: Dung dịch nuôi cấy nấm men Saccharomyces sp.
+ Mẫu rắn: Đĩa nuôi cấy nấm mốc: Aspergillus sp., Rhizopus/Niger, Penicillium
- Các dụng cụ khác: Lam kính, que cấy, ống hút Pasteur, đèn cồn, bút viết kính, panh
kẹp, lamen, dao cắt mẫu …
- Dung dịch soi tươi: Dung dịch phenol


10/21/2018

2.2. Phương pháp làm tiêu bản giọt ép
Bước 1: Tiệt trùng lam kính bằng cách hơ lam kính trên ngọn lửa đèn cồn vài lần.
Sau đó, ghi tên mẫu lên tiêu bản
Bước 2: Sử dụng ống hút Pasteur lấy một giọt mẫu, đặt lên lam kính  nhỏ 1 giọt
phenol  trộn đều.
Bước 3: Đặt lamen nghiêng 1 góc 45o, từ từ đậy lamen xuống sao cho lamen phủ kín
giọt dung dịch mẫu và khơng có bọt khí.
Bước 4: Quan sát dưới kính hiển vi với vật kính 40x

2.3. Phương pháp làm tiêu bản nấm mốc (soi tươi)
Bước 1: Tiệt trùng lam kính bằng cách hơ lam kính trên ngọn lửa đèn cồn vài lần.
Sau đó, ghi tên mẫu lên tiêu bản
Bước 2: Sử dụng que cấy đầu nhọn hoặc dao cắt mẫu cắt một phần thạch có chứa
mẫu  đặt lên lam kính
Bước 3: Quan sát dưới kính hiển vi với vật kính 4x và 10x

10/21/2018

Yêu cầu báo cáo thực hành
1. Quan sát tiêu bản làm sẵn
+ Tiêu bản nấm mốc (vật kính 4x, 10x)
2. Quan sát tiêu bản tự làm
+ Tiêu bản nấm men với vật kính 40x
+ Tiêu bản nấm mốc với vật kính 4 và 10x
3. Mơ tả hình thái (u cầu vẽ hình)
 Hình thái: Cho biết hình thái của nấm men và nấm mốc
 Đặc điểm sinh sản (nấm men, nấm mốc): nảy chồi ?, hình thành bào tử gì?

Bài 2: PHƯƠNG PHÁP LÀM TIÊU BẢN CỐ ĐỊNH VÀ
NHUỘM MÀU GRAM
NỘI DUNG:
1. Phương pháp làm tiêu bản cố định
2. Phương pháp nhuộm màu Gram
MỤC ĐÍCH:
Nắm được và thực hành cách làm tiêu bản cố định và phương
pháp nhuộm Gram

I. Phương pháp làm tiêu bản cố định
- Tiêu bản cố định được nhuộm màu dùng để nghiên cứu các đặc điểm hình thái
học vsv, kiểm tra độ thuần khiết của giống…
- Tiêu bản này có thể bảo quản lâu dài
- VSV quan sát được giết chết trong quá trình xử lý  an toàn cho người quan sát
1.1. Các bước chuẩn bị:
- Chuẩn bị mẫu vật gồm:

+ Mẫu lỏng: dung dịch nuôi cấy vi khuẩn lactic
+ Mẫu rắn: 01 ống thạch nghiêng nuôi cấy TB nấm men
- Chuẩn bị dụng cụ gồm que cấy, đèn cồn, nước cất vô trùng, bút viết kính, lam
kính sạch
- Chuẩn bị lam kính: + chọn lam kính sạch, hơ qua lại trên ngọn lửa đèn cồn để
làm sạch.
+ Sử dụng bút viết kính ghi ký hiệu mẫu tiêu bản cần nhuộm

1.2. Các bước làm tiêu bản cố định
Bước 1: Chuẩn bị vết bôi: Lấy lam kính đã tiệt trùng; sử dụng bút viết kính vẽ lên một
vịng trịn  định vị vùng làm vết bơi.
Bước 2: Làm vết bôi
+ Đối với mẫu lỏng: Sử dụng que cấy vô trùng, lấy một giọt mẫu, đặt lên vịng trịn
trên lam kính và dàn mỏng ra.
+ Đối với mẫu rắn: Sử dụng que cấy vô trùng lấy 1-2 giọt nước cất đặt lên vòng tròn;
Tiệt trùng que cấy và tiếp tục lấy mẫu ở ống giống; hòa tan cùng với giọt nước cất 
dàn mỏng ra
Bước 3:Làm khô: để khơ tự nhiên ở nhiệt độ phịng.
Bước 4: Cố định vết bôi: kẹp chặt tiêu bản, hơ qua lại tiêu bản trên ngọn lửa đèn cồn vài
lần. Mục đích của bước cố định tiêu bản:
- Giết chết vsv an toàn cho người quan sát và giúp cho vsv bắt màu tốt hơn
- Giúp cho vsv gắn chặt vào lam kính  khi rửa khơng bị trơi đi
- Giữ ngun hình dạng và kích thước khi nhuộm
Lưu ý: + tránh đun tiêu bản còn ướt trên ngọn lửa đèn cồn
+ Tiệt trùng que cấy ngay sau khi sử dụng


10/21/2018

 Bước 1: Nhỏ dung dịch Tím gentian ngập vết bơi  để 1-2 phút. Sau đó rửa thuốc nhuộm thừa với

nước sạch: Nghiêng lam kính 45o, cho nước chảy từ đầu đến cuối lam kính, đến khi nước chảy ra
khơng cịn màu tím
 Bước 2: Cố định màu với dung dịch Lugol: nhỏ dung dịch ngập vết bôi, để 1 phút  Rửa với nước
sạch  vẩy khô
 Bước 3: Tẩy màu với cồn axeton: Nghiêng phiến kính 45o, để cồn chảy từ đầu đến cuối phiến kính
cho đến khi khơng cịn màu tím. Sau đó rửa lại ngay bằng nước sạch, vẩy khô.
Cố định tiêu bản

 Bước 4: Nhuộm màu với đỏ Fuchsin: Nhỏ thuốc nhuộm ngập vết bôi, để 1 phút  Rửa thuốc
nhuộm thừa với nước sạch làm khô, sử dụng giấy thấm hoặc hơ qua ngọn lửa đèn cồn

Tiêu bản sau khi cố định

II. Phương pháp nhuộm Gram
2.1. Lịch sử:
- Là phương pháp nhuộm màu nhằm phân biệt vi khuẩn Gram âm và
Gram dương
- Do Christian Gram (1853-1938), nhà vật lý người Đan mạch phát minh
2.2. Chuẩn bị thuốc nhuộm
- Dung dịch thuốc nhuộm thứ nhất: Tím gentian/ Crystal violet
- Dung dịch cố định màu:
Dung dịch lugol
- Dung dịch tẩy màu:
Cồn axeton
- Dung dịch thuốc nhuộm thứ hai: Đỏ phenol/ Fuchsin/ Safranin
- Nước rửa:
Nước sạch
2.3. Các bước nhuộm Gram
Gồm 4 bước

Pseudomonas (gram -)

Lactobacillus sp. (gram +)

E. coli (gram -)

Staphylococcus aureus (gram +)

Salmonella (gram -)

Bacillus cereus (gram +)


10/21/2018

Bài 3: QUAN SÁT HÌNH THÁI VI SINH VẬT
NỘI DUNG:
1. Hướng dẫn sử dụng kính hiển vi quang học
Nấm men: giả khuẩn ty (mũi tên)

Nấm men Saccharomyces

2. Quan sát tiêu bản nhuộm
MỤC ĐÍCH:
Nắm được và thực hành cách làm tiêu bản cố định và phương
pháp nhuộm Gram

nảy chồi (mũi tên)

Quan sát một số hình thái cơ bản của nấm mốc, vi khuẩn và

nấm men

Nấm men nảy chồi (mũi tên)

Yêu cầu báo cáo thực hành
1. Mô tả và thực hành được phương pháp làm tiêu bản cố định
+ Tiêu bản vi khuẩn lactic
+ Tiêu bản nấm men
2. Thực hành phương pháp nhuộm Gram với 2 tiêu bản tự làm
+ Trình bày trình tự các bước nhuộm Gram
+ Cho biết tại sao khi nhuộm màu vi khuẩn lại có tính chất bắt màu Gram khác
nhau?
+ Trong trường hợp nào, khi nhuộm Gram chỉ cần sử dụng 1 loại thuốc nhuộm?

I. Sử dụng kính hiển vi quang học (light microscope)
1.1. Cấu tạo kính hiển vi quang học


10/21/2018

a. Phần cơ học
 Thân kính: dịch chuyển lên xuống nhờ núm điều chỉnh lớn để đưa ảnh
của vật quan sát vào đúng tiêu điểm
- Bàn xoay (mâm kính): gắn ở phía trên thân kính, nơi gắn các vật kính
- Ống kính: Gắn ở phía trên thân kính, có thể xoay quanh một trục thẳng
đứng tùy theo vị trí quan sát. Phía trên ống kính có gắn thị kính
- Bàn kính/khay kính: nơi để tiêu bản quan sát. Trên bàn kính có các kẹp
giữ tiêu bản. Dưới bàn kính có giá giữ bộ tụ quang kính.
- Đế kính (chân kính): cấu tạo vững chắc đỡ toàn bộ KHV
- Ốc điều chỉnh: gồm

+ Ốc điều chỉnh tiêu bản;
+ Ốc điều chỉnh vĩ cấp (điều chỉnh thô/điều chỉnh lớn);
+ Ốc điều chỉnh vi cấp (điều chỉnh tinh/điều chỉnh nhỏ)

b. Phần quang học
 Bộ phận chiếu sáng:
Tụ quang kính: gồm nhiều thấu kính ghép lại với
nhau hội tụ các tia sáng xuất phát từ nguồn sáng
vào tiêu bản
Có 2 loại tụ quang kính: Tụ quang kính nền sáng và
tụ quang kính nền đen

Vật kính
 gồm một hệ thống thấu kính hội tụ
có tiêu cự ngắn khoảng vài mm, đặt
trong một vỏ bọc kim loại
 Chức năng: Tạo ảnh thực ngược
chiều với vật quan sát.
 Độ phóng đại của vật nghiên cứu phụ
thuộc vào tiêu cự và độ cong của
thấu kính ngồi cùng. Độ cong càng
lớn, thì tiêu cự càng ngắn độ
phóng đại của vật kính càng lớn
 Các vật kính: 8x, 10x, 40x, 60x (vật
kính khơ), 90x, 100x (vật kính dầu)

d. Thị kính
- Gồm 2 thấu kính: thấu kính mắt phía
trên, thấu kính tụ phía dưới. Giữa hai
thấu kính có màn chắn giữ lại các

tia sáng xung quanh, chỉ để các tia
sáng gần với trục quang đi qua 
hình rõ nét hơn
- Vai trị: Phóng đại ảnh của vật kính
thu được-vai trị giống kính lúp
- Các loại thị kính: 7x, 10x, 15x, 20x
 Độ phóng đại của mẫu quan sát
bằng tích số giữa độ phóng đại của
vật kính với độ phóng đại của thị
kính


10/21/2018

Giới thiệu một số loại kính hiển vi khác

Kính HV điện tử truyền qua (TEM)

Kính hiển vi điện tử
- KHV điện tử truyền qua (Transmission electron microscope – TEM): sử
dụng chùm điện tử có năng lượng cao chiếu xuyên qua mẫu vật rắn
mỏng và sử dụng các thấu kính từ để tạo ảnh với độ phóng đại lớn
(1x106 lần). Ảnh có thể tạo ra trên màn huỳnh quang, hay trên film
quang học, hay ghi nhận bằng các máy chụp kỹ thuật số
- KHV điện tử quét (Scanning electron microscope – SEM): là một loại
kính hiển vi điện tử truyền qua nhưng khác với TEM: chùm điện tử
không truyền qua mẫu mà hội tụ thành một chùm hẹp và quét trên mẫu,
do đó cho phép ghi ảnh với độ phân giải rất cao
Nghiên cứu vi cấu trúc của vật rắn, nguyên tử, virus…
Scanning transmission electron microscope (STEM)

KHV huỳnh quang
(fluorescence microscope)

SIGMA Advanced Analytical Scanning
Electron Microscope SEM

Kính hiển soi nổi
(stereoscopic microscope)


10/21/2018

c. Quan sát với vật kính dầu (100x)

 Kính hiển vi phản pha (Phase
contrast microscopy-Nobel prize
1953): Ánh sáng xuyên qua các vật
thể trong suốt, không màutiêu
bản không cần nhuộm

C

A

B

D
A. Nấm men quan sát vơi KHV quang học

B. Nấm men quan sát dưới KHV nền đen

C. Nấm men quan sát dưới KHV phản pha

D. Nấm men quan sát dưới KHV huỳnh quang

- Nếu dùng vật kính dầu chú ý:
+ Nhỏ 1 giọt dầu soi kính vào vị trí
vùng định quan sát trên tiêu bản (Hình
A)
+ Hạ từ từ vật kính cho đến khi chạm
nhẹ vào giọt dầu (Hình B)
+ Nhìn vào thị kính, nhẹ nhàng điều
chỉnh ốc điều chỉnh vĩ cấp nâng vật
kính lên cho đến khi thấy chớp ảnh trên
vi trường
 Khi nâng vật kính lên vẫn phải đảm
bảo đầu vật kính vẫn ngập trong dầu
soi (Hình C)
+ Điều chỉnh thêm ốc chỉnh vi cấp cho
rõ nét.

1.2. Cách sử dụng kính hiển vi quang học
a.Chuẩn bị:
- Kính hiển vi, dầu soi, dầu lau, sổ ghi chép, bút…
- Chuẩn bị tiêu bản quan sát
- Tư thế ngồi quan sát kính HV: ngồi ngay ngắn, đặt sổ ghi chép bên tay phải
(nếu thuận tay phải)
b. Quan sát với vật kính khơ:
- Cắm điện và bật cơng tắc đèn

- Điều khiển kính tụ quang bằng bàn tay trái: Nâng lên ở mức hợp lý;
+ Mở hệ thống chắn sáng tối đa và điều chỉnh khi có tiêu bản để được ảnh của
mẩu vật đẹp nhất theo ý muốn.
- Đặt tiêu bản quan sát lên khay kính, điều chỉnh vị trí cần quan sát trên tiêu bản
- Chọn vật kính quan sát: Ví dụ Nấm mốc 4x, 10x; Nấm men 40x
- Sử dụng ốc điều chỉnh vĩ cấp để nâng tiêu bản lên sát với vật kính; Mắt nhìn
vào thị kính, từ từ hạ vật kính xuống đến khi nhìn thấy chớp ảnh thì sử dụng ốc
điều chỉnh vi cấp để chỉnh độ nét của ảnh.

d. Bảo quản sau khi sử dụng kính
- Nâng vật kính lên lấy tiêu bản ra.
- Nếu là vật kính dầu thì dùng khăn vải/giấy mềm tẩm dầu lau kính
xylene lau nhẹ vào đầu vật kính cho thật sạch.
- Đưa vật kính nhỏ nhất vào vị trí tiêu bản.
- Tắt cơng tắc đèn, rút phích cắm khỏi ổ điện.
- Cho kính vào hộp hay đậy kính bằng bao nilon.
- Chuyển kính vào tủ lớn có hệ thống đèn bật thường xuyên để
chống mốc và bụi bẩn.


10/21/2018

2. Quan sát tiêu bản
2.1. Quan sát tiêu bản nấm mốc
- Sử dụng vật kính 4x và 10x
- Quan sát ở vật kính 4x: cho biết đặc điểm hình thái của nấm mốc, vẽ hình
- Quan sát ở vật kính 10x: Cho biết đặc điểm bào tử của nấm mốc, vẽ hình
2.2. Quan sát tiêu bản nấm men
- Sử dụng vật kính dầu 100x: Cho biết đặc điểm hình thái và hình thức sinh sản

Bài 4: CHUẨN BỊ DỤNG CỤ, MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VI
SINH VẬT
Nội dung:
3.1. Chuẩn bị dụng cụ
3.2. Phương pháp làm mơi trường ni cấy VSV
Mục đích

của nấm men. Vẽ hình

Biết cách bao gói, hấp sấy dụng cụ thí nghiệm

2.3. Quan sát tiêu bản vi khuẩn lactic

Nắm được các thao tác kỹ thuật trong pha chế môi trường ni cấy vi sinh
vật

- Sử dụng vật kính dầu 100x: Cho biết đặc điểm hình thái và tính chất sắp xếp
của vi khuẩn lactic. Vẽ hình

Yêu cầu báo cáo thực hành
1. Quan sát tiêu bản tự làm
+ Tiêu bản nấm men với vật kính 100x (vật kính dầu)
+ Tiêu bản vi khuẩn lactic với vật kính 100x (vật kính dầu)
2. Báo cáo:
- Cho biết tính chất bắt màu của vi sinh vật ở mẫu nhuộm
-Mơ tả đặc điểm hình thái của vi khuẩn lactic và nấm men. Vẽ hình minh họa
-Mơ tả tính chất sắp xếp của vi khuẩn lactic: đứng riêng rẽ, nối đôi, nối
chuỗi?
-Mô tả đặc điểm sinh sản của nấm men: tìm tế bào nảy chồi. Vẽ hình

3.1. Chuẩn bị dụng cụ, mơi trường ni cấy vi sinh vật
3.1.1. Chuẩn bị dụng cụ
Các dụng cụ thường được sử dụng để làm môi trường nuôi cấy VSV
- Hộp lồng (đĩa Petri), ống nghiệm, bình tam giác, pipet, cốc đong, đũa thủy tinh, ống
hút Pasteur ….
Vệ sinh dụng cụ:
 Dụng cụ thuỷ tinh mới chưa sử dụng: ngâm nước lã hoặc dung dịch H2SO4 loãng/ 24
giờ. Rửa lại bằng xà phòng và nước nhiều lần cho tới khi dung dịch rửa có pH trung
tính.
 Các dụng cụ đã qua sử dụng (VSV gây bệnh): trước khi rửa phải được khử trùng bằng
hơi nước cao áp giết chết các VSV  đảm bảo an tồn cho người rửa, khơng cho
mầm bệnh cũ nhiễm vào môi trường mới.
 Sử dụng dung dịch sunfocromat để ngâm tẩy các vết bẩn trên dụng cụ thuỷ tinh
 Dụng cụ sau khi rửa, cần được làm khơ trước khi bao gói


10/21/2018

Tủ sấy

Bao gói dụng cụ để khử trùng:

Nồi hấp hơi nước cao áp

 Dụng cụ trước khi khử trùng phải được rửa sạch, làm khơ và bao gói bảo đảm vô
trùng sau khi sấy.

Khử trùng dụng cụ
 Dụng cụ thủy tinh sau khi được bao gói thì được khử trùng bằng phương pháp sấy ở
nhiệt độ 160-180oC/2h.

 Các dụng cụ đã khử trùng được bảo quản trong tủ chuyên dụng đựng dụng cụ hoặc
bảo quản trong túi nilon kín. Chỉ bóc giấy bao gói ngay trước khi sử dụng.
 Sau khi khử trùng, các que gạt, que cấy chỉ nên sử dụng trong vòng 24 giờ, hộp petri
trong vòng 3 ngày, ống nghiệm, bình nón khoảng 7-10 ngày nếu bảo quản tốt. Nếu
để lâu, dụng cụ phải được khử trùng lại trước khi sử dụng.
 Một số dụng cụ như que gạt, que cấy, ống hút Pasteur, chày cối, hộp đựng đầu
pipet… được khử trùng bằng phương pháp hấp hơi nước cao áp ở 121oC/1atm/30
phút.

Làm nút bông cho ống nghiệm, bình tam giác

Bao gói dụng cụ thí nghiệm để khử trùng

3.2. Giới thiệu các môi trường nuôi cấy vsv
3.2.1 Môi trường đặc (rắn)
Mơi trường có sử dụng các chất làm đông đặc môi trường: 1,5-2% thạch (agar). Một
số loại môi trường chủ yếu:
 Mơi trường dinh dưỡng:
• Mơi trường đơn giản/MT cơ sở  peptone + agar; môi trường nước thịt peptone
• Mơi trường phức tạp: có bổ sung các chất dinh dưỡng cao thịt, cao nấm men,
casein… + các chất khống hoặc các chất đặc hiệu
 Mơi trường chọn lọc: MT có chứa những thành phần ưu tiên sự sinh trưởng của
một số VSV và ức chế các VSV khác (ví dụ Mt chọn lọc VK sinh protease có bổ
sung gelatin/casein…)
 Mơi trường chẩn đốn/ phân biệt: Có các thành phần hoặc hóa chất giúp phân
biệt các vsv bằng mắt thường (Ví dụ: mơi trường MacConkey phân biệt E. coli
và Salmonella)


10/21/2018

Một số loại môi trường chọn lọc

3.2.2. Môi trường dịch thể (lỏng)
 Là môi trường không bổ sung thêm chất đông đặc (thạch)

Mannitol salt agar

MT dinh dưỡng

MacConkey agar

Sabouraud agar: MT chọn lọc cho nấm

Casein media: chọn lọc Protease

Môi trường thạch nghiêng

Một số mơi trường chẩn đốn, phân biệt

43

3.3. Phương pháp làm môi trường dịch thể
a. Môi trường dinh dưỡng dịch thể (Nutrient broth)
Sử dụng để nuôi cấy các vsv dị dưỡng.
Chuẩn bị: - 500g thịt, loại bỏ xương, mỡ, gân,
Thành phần:
xay nhỏ. Thêm 1000ml nước cất, để ở nhiệt độ
Thịt bị (lợn): 500g
phịng 12h. Sau đó đem đun sơi 30 phút. Đợi

Peptone:
10g
nguội lọc qua bông/giấy lọc.
NaCl:
5g
- Bổ sung thêm nước cất cho đủ 1lit, thêm
Nước cất:
1000ml
0,5% NaCl và 1% pepton. Điều chỉnh pH.
pH: 7.5±0.2 (25 °C)
- Hấp khử trùng ở 121o/1atm/20 phút

Thạch máu: blood agar

MT phân biệt Salmonella và Shigella với E. coli.

Sau khi hấp tiệt trùng, chia vào các ông nghiệm hoặc bình tam giác để sử dụng
b. Môi trường peptone dịch thể (Peptone Water)
• Hịa tan Peptone 1% và NaCl 0.5% với 1 lít nước.
• Mơi trường này được sử cho các MT lên men đường (bổ sung thêm 1% đường) và
MT kiểm tra phản ứng indole.


10/21/2018

3.4. Phương pháp làm môi trường rắn
Môi trường Hansen: Sử dụng để ni cấy nấm men
Thành phần:

Chuẩn bị:

- Cân chính xác thành phần của mơi trường,
hịa tan với nước cất bằng cách đun sôi.
- Chỉnh pH từ 5-6; Hấp tiệt trùng ở
121o/1atm/20 phút
- MT có màu vàng nhạt
- Khi sử dụng, nuôi cấy ở 30-35oC/24-48h

Glucose:
50g
Pepton:
10g
K2HPO4:
3g
MgSO4.7H2O: 2-5g
Agar:
15-18g
Nước cất:
1000ml
Môi trường Sabouraud: Sử dụng để nuôi cấy nấm mốc, nấm men
Thành phần:
Chuẩn bị:
Glucose:
40g/l
- Cân chính xác thành phần của mơi trường, đun cho
tan các thành phần. Chỉnh pH từ 5,6±0,2 ở 25oC;
Peptone:
10g/l
Hấp
tiệt trùng ở 121o/1atm/15 phút
Thạch:

15g/l
- MT có màu kem hoặc vàng nhạt.

a. Môi trường thạch nghiêng (thạch ống)
Bước 1: Đổ ống nghiệm
- MT thạch Hansen sau khi chuẩn bị xong, tiến hành đổ ống nghiệm.
- Lượng MT từ 8-10ml/ống tùy vào đường kính của ống
- Đậy nút bơng, bao gói, ghi tên mơi trường và thời gian làm bên ngồi
Bước 2: Hấp tiệt trùng
- Cho môi trường vào nồi hấp, hấp ở 121oC/1atm/15-20 phút.
Bước 3: Nghiêng môi trường
- Lấy môi trường từ nồi hấp ra, bỏ bao gói và nghiêng trên mặt bàn đến khi thạch
đơng hồn tồn. Để MT vào tủ ấm ở 37oC/24h để kiểm tra tạp nhiễm

b. Môi trường thạch đĩa
Bước 1: Hấp tiệt trùng
- MT thạch Hansen sau khi chuẩn bị xong, tiến hành đổ vào bình tam giác loại
100ml
- Lượng MT từ 50-80ml/bình, khơng đổ đầy bình để tránh trào ra ngồi khi hấp
- Đậy nút bơng, bao gói, ghi tên mơi trường và thời gian làm bên ngồi
- Cho mơi trường vào nồi hấp, hấp ở 121oC/1atm/15-20 phút
Bước 2: Đổ môi trường ra đĩa
- Lấy các bình mơi trường từ nồi hấp ra, để nguội đến 45-50oC tiến hành đổ vào
đĩa
- Mỗi đĩa đổ từ 15-20ml tùy theo đường kính của đĩa. Tuy nhiên cần phải đảm
bảo mơi trường phủ kín đĩa.
- Lưu ý:
+Q trình đổ đĩa phải được tiến hành trong buồng cấy đã được khử trùng
+ Thao tác nhanh và đảm bảo vô trùng
- Các đĩa môi trường sau khi đổ xong để cho thạch đơng hồn tồn, sau đó bao

gói và để vào tủ ấm ở 37oC/24h để kiểm tra tạp nhiễm.


10/21/2018

Yêu cầu báo cáo thực hành
1. Thực hành phương pháp làm nút bơng, bao gói, sấy dụng cụ thí
nghiệm
2. Thực hành làm môi trường Hansen dịch thể và Hansen rắn
- MT thạch nghiêng
- MT thạch đĩa
3. Đánh giá chất lượng môi trường:
- Màu sắc, trạng thái
- Độ tạp nhiễm

I. Kỹ thuật ria cấy
1.1. Kỹ thuật ria cấy trên thạch ống (Agar slant culture)
Mục đích: sử dụng kỹ thuật này trong cấy truyền giống, nhân giống,
giữ giống, phân lập/chọn lọc giống
a. Chuẩn bị
- Môi trường thạch nghiêng Hansen
- Dụng cụ: que cấy, đèn cồn, bút viết kính…
- Ống giống: Nấm men Saccharomyces sp.
- Tiệt trùng buồng cấy, tay, dụng cụ trước khi tiến hành
- Ghi tên giống, thời gian nuôi cấy lên ống môi trường mới

Bài 5: Kỹ thuật ria cấy vi sinh vật
Nội dung:
Kỹ thuật ria cấy trên thạch đĩa và thạch ống
Quan sát hình thái khuẩn lạc

Đánh giá sinh trưởng của vi sinh vật trên môi trường dịch thể
Mục đích:
- Nắm được và thực hiện tốt các kỹ thuật ria cấy sử dụng trong
nuôi cấy vi sinh vật
- Nắm được các tiêu chí đánh giá sự sinh trưởng của vi sinh vật
trên các môi trường dịch thể và môi trường rắn

b. Các bước tiến hành:
Bước 1: Lấy giống cần cấy
+ Đốt đèn cồn  tiệt trùng que cấy bằng cách hơ que cấy thẳng đứng trên ngọn
lửa đèn cồn đến khi đầu que cấy nóng đỏ  để nguội
+ Lấy ống giống cần cấy: sử dụng ngón tay út + má lịng bàn tay lấy nút bơng,
tiệt trùng miệng ống  Lấy một lượng giống cần cấy  tiệt trùng miệng ống,
đậy nút bông
Bước 2: Cấy truyền sang môi trường mới:
+ Đưa que cấy đã lấy giống xuống đáy ống môi trường mới. Ria que cấy từ trái
sang phải theo đường zich zắc chữ chi về phía miệng ống
+ Tiệt trùng miệng ống  đậy nút bông đem nuôi cấy
Lưu ý: + Tiến hành ria cấy giống trong buồng cấy/phịng vơ trùng
+ Mọi thao tác kỹ thuật cần được tiến hành xung quanh ngọn lửa đèn cồn


10/21/2018

Các bước ria cấy trên thạch ống

Ria zic zắc

Ria Xoắn ốc

Các bước kỹ thuật ria trên thạch đĩa (ria 3 lần đốt que cấy)

Ria ngang

1.2. Kỹ thuật ria cấy trên thạch đĩa
(Streaking culture plates)
Mục đích: sử dụng kỹ thuật này trong nghiên cứu phân
lập, chọn lọc giống nhằm tách thuần khuẩn lạc.
a. Chuẩn bị
Các bước chuẩn bị như phương pháp ria trên ống. Chỉ khác phần kỹ thuật ria
b. Kỹ thuật ria 2-3 lần đốt que cấy:

Ria đúng kỹ thuật

Bước 1: Sử dụng que cấy vơ trùng, lấy 1 ít giống cần cấy
- Vô trùng miệng đĩa, hé mở nắp hộp lồng, đưa que cấy đã lấy giống vào, ria ở 1/3
đĩa  dừng lại, đốt que cấy lần 1
Bước 2: Đợi que cấy nguội; Xoay đĩa sang trái1 góc 45o; Đặt que cấy vào đường ria
cuối cùng của lần ria thứ nhất ria ngang tiếp 1/3 đĩa  đốt que cấy lần 2
Bước 3: Làm tiếp tục như bước 2, ria nốt 1/3 đĩa cịn lại  vơ trùng miệng đĩa, nuôi
cấy trong tủ ấm ở trạng thái úp ngược

Ria bị tạp

Ria không đúng kỹ thuật


10/21/2018

II. Đánh giá sinh trưởng của VSV

2.1. Trên môi trường rắn

Một số dạng khuẩn lạc của vsv

 VSV sinh trưởng trên mơi trường đặc (rắn) sẽ hình thành khuẩn lạc
 Khuẩn lạc là sự tập trung một số lượng lớn tế bào ở cùng một nơi, được hình
thành từ một tế bào ban đầu.
 Sự sinh trưởng được đánh giá thơng qua các tiêu chí:
- Số lượng khuẩn lạc (đếm bằng phương pháp pha lỗng nồng độ)
- Hình thái, kích thước của khuẩn lạc
- Rìa, bề mặt, trạng thái, kết cấu khuân lạc
- Màu sắc của khuẩn lạc;
- Mùi của môi trường
 Hai dạng khuẩn lạc thường gặp:
- Khuẩn lạc láng bóng (dạng S): thường có bề mặt cong lồi, rìa gọn mịn, mặt láng
bóng, nhẵn.
- Khuẩn lạc nhám (dạng R): bề mặt nhám xù xì, rìa nhọn hay có góc cạnh.

Mơ tả đặc điểm của khuẩn lạc

Bề mặt

khuẩn lạc trực khuẩn Bacillus

khuẩn lạc Staphylococcus

khuẩn lạc nấm men Saccharomyces cerevisiae

Rìa/ bờ viền

TS. Nguyễn Thị Tuyết Lê

khuẩn lạc nấm mốc

khuẩn lạc vi khuẩn Lactobacillus

khuẩn lạc nấm men


10/21/2018

2.2. Đánh giá sinh trưởng của VSV trên môi trường dịch thể (lỏng)
Đánh giá sinh trưởng qua các tiêu chí:
 Đếm số lượng tế bào qua phương pháp so màu hoặc pha lỗng nồng độ
 Độ đục của mơi trường (so màu): đục đều hay ở dạng bông, dạng vẩn mây
 Sự lắng căn hay kết tủa: dày hay mỏng, xốp hay kết chặt, dạng hạt hay keo
 Hình thành màng: màng trịn hay màng kín, bề mặt màng thơ hay mịn, dày
hay mỏng
 Sự đổi màu của môi trường
 Sinh khí; Mùi

Bài 6. ĐẾM SỐ LƯỢNG TẾ BÀO VI SINH VẬT
1. MỤC ĐÍCH
Nắm được và vận dụng tốt phương pháp xác định số lượng TB vi sinh
vật qua phương pháp đếm trực tiếp dưới kính hiển vi bằng buồng đếm
hồng cầu và đếm gián tiếp bằng phương pháp pha loãng nồng độ.
2. NỘI DUNG

Tạo
màng

- Thực hành phương pháp đếm số lượng nấm men bằng buồng đếm hồng
cầu Neubauer
- Đếm số lượng TB bằng phương pháp pha loãng nồng độ
Đục, đổi màu

Sinh khí (CO2)

Yêu cầu báo cáo
1. Thực hành phương pháp ria cấy trên thạch đĩa và thạch nghiêng
2. Đánh giá sinh trưởng của nấm men trên môi trường Hansen dịch thể
3. Quan sát và mô tả đặc điểm của khuẩn lạc ở các đĩa ni cấy:
- Hình thái khuẩn lạc
- Màu sắc, mùi
- Trạng thái
- Rìa
- Bề mặt
- Kích thước: sử dụng thước đo (đơn vị tính mm)

I. Phương pháp đếm trực tiếp dưới kính hiển vi
 Là phương pháp đếm trực tiếp dưới kính hiển vi sử dụng buồng đếm hồng cầu
Neubauer. Ứng dụng cho các vi sinh vật có kích thước lớn như nấm men, vi tảo,
vi khuẩn lam. Còn gọi là phương pháp đếm nhanh.
 Ưu điểm: Cho phép xác đinh nhanh chóng số lượng tế bào có trong mẫu
 Nhược điểm: khơng phân biệt được các tế bào sống và chết; độ chính xác khơng
cao với mật độ <106
 Sai số: Sai số thường thấy đối với phương pháp này nằm trong khoảng 20-30%
do lỗi pha lỗng mẫu hay lỗi tính tốn hoặc lỗi khi nhỏ dung dịch lên buồng
đếm.

1.1. Chuẩn bị nguyên vật liệu gồm:
 Mẫu cần đếm số lượng tế bào: Dung dịch nuôi cấy nấm men Saccharomyces
cerevisiae 24 giờ
 Buồng đếm đã được làm sạch
 Kính hiển vi, dung dịch pha lỗng, pipet loại 20, 200 và 2000µl, lamen để đậy


10/21/2018

1.2. Cách tiến hành
Bước 1: Pha loãng mẫu: sao cho mật độ tế bào nằm trong khoảng 250.000 TB/ml
– 2,5 triệu TB/ml. Tốt nhất nên nằm ở khoảng 1 triệu tế bào/ml.
- Nếu mật độ tế bào <250000/ml thì số lượng tế bào khơng đủ để xác định chính
xác số lượng tế bào có trong dung dịch mẫu.
- Mật độ tế bào khi pha lỗng >2,5 triệu/ml thì sẽ làm tăng sai sót trong q
trình đếm do mật độ q dày.
Bước 2: Nhỏ 10µl dung dịch mẫu lên buồng đếm, đậy lamen lên trên sao cho dung
dịch được dàn mỏng tồn bộ mặt buồng đếm và khơng tạo thành bọt khí. Nếu lấy
q nhiều dung dịch mẫu thì sử dụng giấy thấm thấm bớt dung dịch thừa.
Bước 3: Đặt buồng đếm lên kính hiển vi, sử dụng vật kính 10x-40x để điều chỉnh
đến khi rõ nét. Tiến hành đếm số lượng tế bào ở 5 ô vuông lớn (4 ô ở 4 góc và 1 ơ
vng ở giữa). Cách đếm: Đếm lần lượt từng ô lớn, bắt đầu từ trái qua phải, từ
trên xuống dưới theo hình zig- zac. Các tế bào nằm ở đường viền trên và bên trái
thì đếm. Ngược lại, tế bào nằm ở đường viền dưới và bên phải thì khơng đếm.

1.3. Tính kết quả

• Đếm ở ô vuông trung tâm buồng đếm, gồm 25 ô vuông nhỏ. Đếm 5 ô vuông nhỏ.
Mỗi ô vuông nhỏ có kích thước 1mm/ 5 = 0,2mm
• Thể tích ơ vng nhỏ được tính như sau:

• Diện tích của 1 ô vuông: 0,2 mm x 0,2mm = 0,04mm2
• Chiều sâu của buồng đếm tính từ lamen là 0,1mm hay 0,01cm
• Thể tích của 1 ơ vng = 0,04mm2 x 0,1mm = 0,004mm3 = 4x 10-6 ml
• Độ pha lỗng: Nếu pha loãng 1:10  Độ pha loãng là 0,1 hay 10-1
• Nếu pha lỗng 1:100  độ pha lỗng là 0,01 hay 10-2
• Ví dụ: Số lượng tế bào đếm được ở 5 ô vuông nhỏ là 250, biết độ pha lỗng là 10-2.
Tính số lượng tế bào trong 1ml dung dịch mẫu?
• Số lượng tế bào/ml dung dịch = 250 /(5 x 4x 10-6 x 10-2) = 12,5 x 108 tế bào/ml

2. Phương pháp pha loãng nồng độ (đếm khuẩn lạc trên thạch
đĩa)

 Là phương pháp đếm số lượng khuẩn lạc trên thạch đĩa dựa trên nguyên tắc:
Mỗi một tế bào vi sinh vật sống sẽ phát triển thành 1 đơn vị khuẩn lạc (colony
forming unit – CFU)
 Ưu điểm: Phương pháp này chỉ xác định số lượng tế bào cịn sống và có độ
chính xác cao
 Nhược điểm:
- Tốn thời gian: Cần thời gian cho chuẩn bị môi trường, pha lỗng mẫu, cấy
mẫu và ni cấy
- Chỉ đếm được các tế bào còn sống
- Các tế bào dạng chuỗi hay cụm lại thành đám cũng chỉ phát triển thành 1
khuẩn lạc, vì vậy khơng xác định được chính xác số lượng tế bào thực có trong
mẫu
- Khuẩn lạc chỉ phát triển trong điều kiện nuôi cấy phù hợp với đặc tính của
VSV đó


10/21/2018

2.1. Chuẩn bị
 Pha loãng mẫu: Chuẩn bị 1 dãy ống nghiệm gồm 6 ống vô trùng, số lượng ống có
thể >6 tùy thuộc vào mẫu cần đếm. Cho vào tất cả các ống 9ml dung dịch nước
muối sinh lý 0,9% vô trùng. Hút 1ml dung dịch mẫu cho vào ống thứ nhất, trộn
đều và tiếp tục hút 1ml cho sang ống thứ 2. Làm như vậy đến hết. Nồng độ pha
loãng mẫu lần lượt là 10-1, 10-2, 10-3 … 10-6.

Yêu cầu báo cáo
1. Thực hành phương pháp đếm số lượng TB nấm men bằng buồng đếm
hồng cầu Neubauer
- Tính số lượng tế bào nấm men có trong 1ml dung dịch ni cấy
- Tính số lượng tế bào nảy chồi/tổng số tế bào nấm men
2. Đếm số lượng khuẩn lạc trên các đĩa thạch và tính số lượng TB vi sinh vật
có trong 1g mẫu ban đầu trước khi ni cấy. Biết rằng:
- Nồng độ pha lỗng khi ni cấy là 10-4, 10-5, 10-6
- Lượng mẫu cấy vào mỗi đĩa là 0,1ml

Cấy mẫu:
Cấy mẫu ở 3 nồng độ pha loãng cuối cùng. Mỗi nồng độ cấy 3 đĩa thạch, mỗi
đĩa 0,1ml dung dịch pha lỗng. Ni cấy các đĩa thạch trong tủ ấm từ 24-48 giờ,
sau đó đếm số lượng khuẩn lạc ở đĩa có số lượng khuẩn lạc dao động từ 30-200.
Các đĩa có số lượng >200 dễ dẫn đến sai sót khi đếm. Các đĩa có số lượng khuẩn lạc
<30 thì chưa đủ độ tin cậy về mặt thống kê và thường do sai sót trong q trình
pha lỗng mẫu
Cách tính kết quả: Số lượng tế bào ban đầu có trong 1ml hay 1g mẫu được tính như
sau