Kỹ thuật tách chiết DNA Hỗ trợ và Tải tài liệu miễn phí 24/7 tại đây: https://link1s.com/yHqvN

Môn: SINH HỌC PHÂN TỬ
Đề tài: Kỹ Thuật Tách Chiết
Nucleic Acid
LỚP : ĐHSH07LT
NHÓM : 10
GVHD : Trần Hồng Bảo Quyên
Thành Viên Nhóm 2
1. Nguyễn Mậu Hòa Ân
2. Nguyễn Văn Dũng
3. Lương Văn Hải
4. Phạm Thị Bích Liên
5. Trần Thị Kim Ngân
6. Trần Quang Sơn
7. Phan Phúc Thiện
8. Trần Thiện Tuấn

Các bước cơ bản và phương pháp tách chiết
nucleic acid.

Các bước tách chiết DNA, RNA, mRNA

So sánh tách chiết DNA/ RNA/ mRNA

So sánh tách chiết DNA từ thực vật, động vật
và vi khuẩn.
3
Các bước cơ bản – phương pháp tách
chiết ACID NUCLEIC.
4
Các bước tách chiết DNA.
Phương pháp tách chiết DNA cơ bản gồm 3 bước

BƯỚC 1: Phá vỡ màng tế bào và màng nhân:
−
Nghiền tế bào và mô trong hỗn hợp tẩy : SDS, protease
thủy phân protein, enzym lysozym, EDTA, . Hỗn hợp này
sẽ phá vỡ màng tế bào và màng nhân, phóng thích DNA ra
môi trường đồng thời protein liên kết với DNA cũng tự bị
phân hủy.
5
Phá vỡ màng tế bào và màng nhân
6
Phá vỡ màng tế bào và màng nhân
7
BƯỚC 2: Loại bỏ thành phần không không phải DNA,
chủ yếu là protein.

Gây tủa protein bằng dd chloroform: phenol và
enzym protein K. Sau khi ly tâm ống nghiệm gồm 3
lớp dd: lớp phenol nằm dưới đáy ống nghiệm, giữa
là protein, trên cùng là dịch lỏng chứa DNA.
8
Các bước tách chiết DNA.
Các tách chiết DNA.
BƯỚC 3: Làm kết tủa acid nucleic 2 cách thông dụng:
−
Dùng ethanol nồng độ cao (ethanol: mẫu là 2,5: 1) và ở nhiệt độ
thấp, trong môi trường có lực ion cao (nồng độ muối cao).
−
Dùng isopropanol (isopropanol:mẫu là 1:1), không cần sự hiện
diện của muối các DNA trọng lượng phân tử thấp không bị kết
tủa, loại bỏ khỏi dịch chiết bằng cách này

9
Các bước tách chiết DNA.

Tủa thu nhận bằng 2 cách trên được thu nhận bằng ly
tâm. Sau đó, rửa kết tủa vài lần trong ethanol 70%
để loại bỏ các muối hoặc các vết isopropanol còn
dính trong mẫu, sau đó xử lý bằng RNase để loại bỏ
RNA. Thu được DNA

Làm khô và hòa tan trong dd TE hoặc nước khử ion
để tiếp tục nghiên cứu
10
Sơ đồ tách chiết DNA tổng số
11
Hình ảnh minh họa sợi DNA trong ống nghiệm
12
Các bước tách chiết RNA toàn phần và mRNA.

Các RNA đều là phân tử không bền, dễ bị phân hủy
bởi các RNase, RNase có ở khắp nơi.

Chính vì vậy, phải có nhiều biện pháp để tránh
các tạp nhiễm bởi các RNase từ môi trường: thao
tác trong điều kiện vô trùng; mọi dụng cụ, hóa
chất đều được khử trùng bằng nhiệt hay được xử lý
với DEPC hầu tránh mọi tiếp xúc với dụng cụ bằng
tay trần.
13
Các bước tách chiết RNA toàn phần và mRNA.
Ly trích RNA toàn phần cũng gồm 3 bước như trích ly DNA:

Bước 1: Nghiền tế bào mô trong dung dịch có một một chất tẩy
mạnh (SDS) ở nồng độ cao, một tác nhân gây biến tính
protein mạnh (guamidium thiocyanate), một chất khử (2-
mercaptoethanol). Các chất có tác dụng ức chế hoạt động các
RNase nội bào và tách các protein liên kết khỏi phân tử RNA.
.
14
Các bước tách chiết RNA toàn phần và mRNA.
Bước 2: Loại protein bằng xử lý phenol: chloroform và
ly tâm, RNA sẽ hòa tan trong pha nước.
Bước 3: Tủa RNA: làm tủa RNA bằng ethanol hoặc
isopropanol rồi ly tâm. Dưới dạng kết tủa trong
ethanol hoặc đông lạnh ở -70
0
C trong nước có chứa
chất ức chế Rnase là R-nasine và cuối cùng là bước
tách RNA khỏi DNA bằng enzym Dnase. Thu được
RNA toàn phần
15
Các bước tách chiết mRNA.

RNA tế bào gồm: rRNA (80-85%), tRNA(15-
20%), snRNA (<1%) mRNA chiếm khoảng 1- 5%

mRNA có một đặc điểm chung là có cấu trúc đuôi
polyA
-
Ta có thể tách mRNA ra khỏi mẫu bằng cách dựa
đặc tính liên kết bổ sung A - T của nucleic acid, sử
dụng sắc ký ái lực trên cột oligodT - cellulose.

16
Các bước tách chiết mRNA.

Tuy nhiên, mRNA đối với eukaryote có điểm
chung là cấu trúc đuôi polyA. Dựa vào cấu trúc
này và đặc tính bổ sung A – T của nucleic acid,
ta có thể tách mRNA ra khỏi mẫu bằng sắc ký ái
lực trên cột oligodT-cellulose
17
Thu hồi mRNA bằng sắc ký ái lực
18
Các bước tách chiết mRNA.

Hiện nay trên thị trường có những bộ kit sử dụng
các viên bi từ có mang oligodT trên bề mặt. Sau
khi các mRNA bám lên bề mặt các viên bi từ
thông qua liên kết bổ sung với oligodT, các viên
bi này được thu nhận lại qua ly tâm và mRNA sẽ
được tách ra khỏi các viên bi này và giữ lại. Kĩ
thuật này cho phép thu nhận mRNA cả từ những
mẫu có khối lượng rất nhỏ.
19
Các bước tách chiết mRNA.
20
Các bước tách chiết mRNA.
21
Kỹ thuật siêu ly tâm
Phương Pháp ly tâm đẳng tỷ trọng
24