PHỤ lục 1

TRƯỜNG ĐẠI HỌC HÙNG VƯƠNG
KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN

PHAN THỊ TIẾN

ẢNH HƯỞNG CỦA CYTOKININ VÀ AUXIN ĐẾN
SỰ TẠO CHỒI, RỄ CỦA LỒI LAN Ý THẢO
(Dendrobium gratiosissimum)

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Ngành : Sư phạm Sinh học

Phú Thọ, 2018


TRƯỜNG ĐẠI HỌC HÙNG VƯƠNG
KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN

PHAN THỊ TIẾN

ẢNH HƯỞNG CỦA CYTOKININ VÀ AUXIN ĐẾN
SỰ TẠO CHỒI, RỄ CỦA LỒI LAN Ý THẢO
(Dendrobium gratiosissimum)

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Ngành : Sư phạm Sinh học

NGƯỜI HƯỚNG DẪN: PGS. TS. CAO PHI BẰNG

Phú Thọ, 2018

i

LỜI CẢM ƠN

Trong thời gian nghiên cứu và hoàn thành khóa luận, em xin gửi lời
cảm ơn chân thành nhất tới thầy giáo hướng dẫn PGS. TS. Cao Phi Bằng đã
tận tình hướng dẫn, quan tâm và động viên em hồn thành khóa luận.
Em xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc đến các thầy (cô) Trung tâm nghiên
cứu Công nghệ sinh học trường Đại học Hùng Vương cùng các thầy cô giáo
trong khoa Khoa học Tự nhiên, trường Đại học Hùng Vương đã tạo điều kiện
giúp đỡ để em thực hiện và hồn thành khóa luận này.
Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè, những người đã
luôn bên cạnh động viên, giúp đỡ em trong suốt q trình thực hiện và hồn
thành khóa luận tốt nghiệp.
Em xin chân thành cảm ơn!

Phú Thọ, tháng 05 năm 2018
Sinh viên

Phan Thị Tiến


ii

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan số liệu và kết quả nghiên cứu trong khóa luận này thu
được từ nghiên cứu mà tôi thực hiện, các kết quả nghiên cứu được trình bày

trong khóa luận là trung thực. Mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện khóa luận này
đã được cảm ơn và các thơng tin trích dẫn trong khóa luận đã được chỉ rõ nguồn
gốc và được phép công bố.
Phú Thọ, ngày 26 tháng 05 năm 2018
Sinh viên thực hiện

Phan Thị Tiến


iii

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................. i
LỜI CAM ĐOAN..........................................................................................................ii
MỤC LỤC .....................................................................................................................iii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ................................................................................... v
DANH MỤC BẢNG ...................................................................................................vi
DANH MỤC HÌNH ....................................................................................................vii
MỞ ĐẦU ........................................................................................................................ 1
1. Tính cấp thiết của đề tài ............................................................................................ 1
2. Mục tiêu nghiên cứu ................................................................................................. 2
3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài .................................................. 2
3.1. Ý nghĩa khoa học ................................................................................................... 2
3.2. Ý nghĩa thực tiễn .................................................................................................... 2
NỘI DUNG .................................................................................................................... 3
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU..................................................................... 3
1.1. Một vài nét giới thiệu về chi Hoàng thảo (Dendrobium) và loài lan Ý thảo
(D. gratiosissimum)........................................................................................................ 3
1.1.1. Giới thiệu về chi Hoàng thảo (Dendrobium) ................................................... 3
1.1.1.1. Phân loại ............................................................................................................ 3

1.1.1.2. Đặc điểm hình thái ........................................................................................... 3
1.1.2. Giới thiệu về loài lan Ý thảo (D. gratiosissimum)............................................ 5
1.2. Kĩ thuật nhân giống bằng nuôi cấy mô - tế bào thực vật .................................. 6
1.2.1. Giới thiệu chung.................................................................................................. 6
1.2.2. Lịch sử phát triển của kỹ thuật nhân giống bằng nuôi cấy mô - tế bào thực
vật..................................................................................................................................... 7
1.2.3. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô - tế bào thực vật ......................................... 9
1.2.4. Các giai đoạn trong kỹ thuật nhân giống in vitro............................................ 9


iv

1.2.5. Phytohormon trong nuôi cấy in vitro..............................................................10
1.2.6. Tầm quan trọng của phương pháp nuôi cấy mô - tế bào thực vật ..............11
1.3. Tình hình nghiên cứu............................................................................................12
1.3.1. Tình hình nghiên cứu nhân giống in vitro lan Hoàng thảo ............................12
1.3.2. Nghiên cứu sử du ̣ng cytokinin và auxin trong nhân giống in vitro lan Hoàng
thảo ................................................................................................................................14
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..16
2.1. Đố i tượng và phạm vi nghiên cứu.....................................................................16
2.2. Nô ̣i dung nghiên cứu ..........................................................................................16
2.3. Phương pháp nghiên cứu.....................................................................................16
2.3.1. Phương pháp bố trí thí nghiê ̣m .........................................................................16
2.3.2. Phương pháp thu thâ ̣p số liê ̣u [11] ...................................................................20
2.3.3 Phương pháp phân tích và xử lý số liê ̣u [11] ...................................................21
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ..............................22
3.1. Ảnh hưởng của cytokinin đến sự tạo chồi của cây Lan Ý thảo .......................22
3.1.1. Ảnh hưởng của BAP đến sự tạo chồi của cây Lan Ý thảo...........................22
3.1.2. Ảnh hưởng của Kinetin đến sự tạo chồi của cây Lan Ý thảo ......................26
3.2. Ảnh hưởng của auxin đến sự tạo rễ của cây lan Ý thảo ...................................29

3.2.1. Ảnh hưởng của IBA đến sự tạo rễ của cây lan Ý thảo ..................................29
3.2.2. Ảnh hưởng của NAA đến sự tạo rễ của cây lan Ý thảo ................................31
3.3. Ảnh hưởng của giá thể tới sự phát triển của cây lan Ý thảo giai đoạn ra cây .32
3.3.1. Hàm lượng sắc tố quang hợp ............................................................................32
3.3.2. Hoạt tính enzym catalase ..................................................................................34
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ....................................................................................36
1. Kết luận .....................................................................................................................36
2. Kiến nghị...................................................................................................................36
TÀI LIỆU THAM KHẢO ..........................................................................................37


v

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

AC

: Than hoạt tính

BAP

: Benzylamino purine

ĐC

: Đối chứng

GA3

: Gibberellic acid

IAA

: Indole acetic acid

IBA

: Indole butyric acid

MS

: Murashige & Skoog

NAA : Naphthalene acetic acid
NOA : Naphthoxy acetic acid
TDZ

: Thidiazuzon


vi

DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Các công thức thí nghiê ̣m nghiên cứu ảnh hưởng của BAP, Kinetin
đến hệ số nhân, chiều cao và chất lượng chồi cây in vitro loài lan Ý Thảo .........16
Bảng 2.2. Các công thức thí nghiê ̣m nghiên cứu ảnh hưởng của NAA và IBA
đến khả năng ra rễ của cây chồi cây in vitro loài lan Ý Thảo ................................17
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của BAP đến hệ số nhân và sự phát triển chồi của cây lan
Ý thảo ............................................................................................................................22
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của BAP đến số lá của chồi in vitro của loài Ý thảo...........24

Bảng 3.3. Ảnh hưởng của Kinetin đến hệ số nhân và sự phát triển thân của cây in
vitro loài lan Ý thảo......................................................................................................26
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của Kinetin đến số lá của cây in vitro loài lan Ý thảo ........28
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ của cây Lan Ý thảo.................29
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của NAA đến khả năng ra rễ của cây lan Ý thảo ................31
Bảng 3.7. Hàm lượng sắc tố quang hợp của cây lan Ý thảo giai đoạn ra cây ..........33
Bảng 3.8. Hoạt độ catalase cây lan Ý thảo giai đoạn ra cây ....................................34


vii

DANH MỤC HÌNH

Hình 3.1. Ảnh hưởng của BAP đến hệ số nhân chồi in vitro của lồi Ý thảo ......23
Hình 3.2 Chồi cây in vitro trên mơi trường có bổ sung BAP và trên mơi trường
đối chứng.......................................................................................................................23
Hình 3.3. Ảnh hưởng của BAP đến chiều cao chồi in vitro của loài Ý thảo ........24
Hình 3.4. Ảnh hưởng của BAP đến số lá của chồi in vitro của lồi Ý thảo .........25
Hình 3.5. Ảnh hưởng của Kinetin đến hệ số nhân chồi của cây in vitro lồi lan Ý
thảo ................................................................................................................................26
Hình 3.6. Chồi cây in vitro trên các mơi trường có bổ sung Kinetin và trên mơi
trường đối chứng ..........................................................................................................27
Hình 3.7. Ảnh hưởng của Kinetin đến chiều cao của cây in vitro loài lan Ý thảo.27
Hình 3.8. Ảnh hưởng của Kinetin đến số lá của cây in vitro lồi............................28
lan Ý thảo ......................................................................................................................28
Hình 3.9. Ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ của cây lan Ý thảo...................30
Hình 3.10. Ảnh hưởng của IBA đến khối lượng tươi của cây lan Ý thảo ..............30
Hình 3.11. Ảnh hưởng của NAA đến khả năng ra rễ của cây lan Ý thảo...............31
Hình 3.12. Ảnh hưởng của NAA đến khối lượng tươi của cây lan Ý thảo ............32
Hình 3.13. Hàm lượng sắc tố quang hợp của cây lan Ý thảo giai đoạn ra cây ......33

Hình 3.14. Hoạt độ catalase cây lan Ý thảo giai đoạn ra cây...................................35


1

MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Phong lan gồm nhóm cây có hoa mang vẻ đẹp sang trọng, có giá trị kinh
tế lại mang nhiều ý nghĩa nên được mọi người ưa chuộng. Từ trước tới nay,
phong lan thường được dùng làm cảnh , trang trí. Bên cạnh đó, một số lồi
cịn đươ ̣c sử du ̣ng làm dươ ̣c liêụ [16].
Họ Lan có số lượng lồi rấ t lớn và đa dạng trong tự nhiên, và ngày càng
phong phú do các loài lan được lai tạo. Hiện nay có khoảng hơn 25.000 lồi Lan
khác nhau. Ở Việt Nam, do yếu tố khi hậu phù hợp nên số lượng lan khá lớn,
theo cuốn Phong lan Việt Nam của Trần Hợp thì Việt Nam có 137 đến 140 chi
gồm trên 800 loài lan rừng [5].
Hoàng thảo (Dendrobium) là một chi lớn trong họ Phong lan
(Orchidaceae), chi này có khoảng 1400 lồi, ở Việt Nam có 107 lồi và một
thứ phân bố ở các vùng núi từ Bắc vào Nam và trên một số đảo ven biển [19].
Trong chi này, có nhiều lồi có hoa đẹp và được nhiều người u thích . Tuy
nhiên do nhiều nguyên nhân tác động khác nhau mà hiện nay nhiều lồi có số
lượng suy giảm, bị đe dọa biến mất [7].
Lan Ý thảo (D. gratiosissimum) là một trong những lồi lan thuộc nhóm
Hoàng thảo (Dendrobium), hoa thường nở vào mùa xuân, khoảng từ tháng 3
đến tháng 5, cánh có màu trắng cịn chóp có màu tím nhạt ở giữa có một đốm
màu vàng, hoa rất đẹp nên được nhiều người yêu thích và ưa chuộng. Tuy nhiên
hiện nay số lượng loài này trong tự nhiên cịn khá ít và đặc biệt là khó nhân
giống [18].
Ngày nay nuôi cấy in vitro đã được chứng minh mang lại hiệu quả cao
trong việc nhân giống cũng như bảo tồn các loài lan quý hiếm [11]. Sử dụng

phương pháp nhân giống in vitro ta có thể nhân hàng loạt với số lượng rất nhiều,
trong khi đó thời gian lại tiết kiệm hơn so với các phương pháp truyền thống


2

(giâm cành, tách cành, gieo hạt,..), hơn nữa chúng lại có độ đồng đều và sạch
bệnh. Trong nhân giống in vitro các chất điều hịa sinh trưởng, trong đó
cytokinin và auxin, thường được bổ sung vào môi trường nuôi cấ y, có vai trò đă ̣c
biê ̣t quan tro ̣ng đớ i với sự phát sinh chờ i, rễ. Chính vì vậy tơi lựa chọn thực hiện
đề tài: “Ảnh hưởng của cytokinin và auxin đến sự tạo chồi, rễ của loài lan
Ý thảo (Dendrobium gratiosissimum).”
Đề tài này được thực hiện sẽ góp phần hồn thiện quy trình nhân giống
cho lồi lan có giá tri này.
̣
2. Mục tiêu nghiên cứu
- Đánh giá được ảnh hưởng của cytokinin đến sự tạo chồi của loài lan Ý thảo.
- Đánh giá được ảnh hưởng của auxin đến sự tạo rễ của loài lan Ý thảo.
3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài
3.1. Ý nghĩa khoa học
Kết quả đề tài nhằm cung cấp thêm thông tin khoa học về ảnh hưởng của
các nồng độ khác nhau của chất điều hòa sinh trưởng đến sự phát triển thân và rễ
cây in vitro loài lan Ý thảo.
3.2. Ý nghĩa thực tiễn
Đề tài được thực hiện sẽ là cơ sở cho việc hoàn thiện quy trình nhân
giống in vitro cho lồi lan có giá trị này.
Kết quả đề tài góp phần nâng cao năng suất, chất lượng cũng như hiệu quả
kinh tế trong sản xuất giống lan Ý thảo trên địa bàn tỉnh Phú Thọ

3

NỘI DUNG
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Một vài nét giới thiệu về chi Hoàng thảo (Dendrobium) và loài lan Ý
thảo (D. gratiosissimum)
1.1.1. Giới thiệu về chi Hoàng thảo Dendrobium
1.1.1.1. Phân loại
Chi Hoàng thảo (Dendrobium) là một chi lớn thuộc Giới: Plantae, Bộ:
Asparagales, Họ: Orchidaceae, Phân họ: Epidendroideae.
Giống lan Dendrobium được đặt tên vào năm 1799, chữ Dendrobium có nguồn
gốc từ Hy Lạp. Hiện nay, chi này bao gồm hơn 1200 lồi được chia thành 40
nhóm thuộc dịng Dendrobiinae. Chi Dendrobium được phân bố rộng rãi nhiều ở
vùng Nam Á, Đông Á và Đông Nam Á cho đến Philippines, Borneo, Australia,
NewZealand, riêng ở Việt Nam có trên 110 lồi phân bố ở các vùng núi từ Bắc
vào Nam và một số đảo ven biển [5, 12].
Các đại diện của chi Hoàng thảo chủ yếu sống phụ sinh trên thân hoặc các
cành cây ở trong rừng hoặc trên các hốc mùn trên đá, chúng thường mọc ở nơi
ẩm, với độ cao 500 – 1500m so với mực nước biển, cũng có khi gặp chi lan này
mọc ở độ cao 200m hoặc tới 2000m so với mực nước biển. Có người gọi là
Hồng lan, có người gọi là Đăng lan. Dendrobium chia thành 2 dạng chính:
+ Dạng đứng (D. phalaenopsis) thường mọc ở xứ nóng, chịu ẩm và ra
nhiều hoa: Nhất điểm hồng, Nhất điểm hoàng, Báo hỉ, Ý thảo, Thủy tiên…
+ Dạng thịng (D. mobile) chịu khí hậu mát mẻ: Giả hạc, Hạc vĩ, Long
tu, Phi điệp vàng…
1.1.1.2. Đặc điểm hình thái
Rễ chi Dendrobium thuộc loại rễ bì sinh, chung quanh rễ thật được bao bọc
bởi một lớp mô xốp (màng) giúp cây dễ dàng hút nước, muối khoáng và ngăn
chặn ánh sáng mặt trời gay gắt. Chóp rễ có màu xanh lá cây, ở phần rễ có các sắc

4

lạp khơng bị ngăn bởi mơ xốp nên có thể giúp cây quang hợp. Rễ của lan
Dendrobium không chịu được lạnh, nếu bị lạnh trong thời gian dài, rễ cây sẽ bị
mục nát và cây bị chết [4].
Thân thuộc loại giả hành có đặc điểm là những đoạn phình to, bên trong có
các mơ mềm chứa dịch nhày làm giảm sự mất nước và dự trữ chất dinh dưỡng
để nuôi cây trong điều kiện khô hạn khi cây sống bám trên cao. Ngồi ra giả
hành cịn chứa diệp lục tố nên có thể quang hợp được. Hình dạng và kích thước
của giả hành rất đa dạng: hình cầu, thn dài hay hình trụ xếp chồng lên nhau
tạo thành thân giả có lá mọc xen kẽ [9].
Lá có hình kim, trụ hay phiến mỏng. Dạng lá mềm mại, mọng nước, dai, có
màu xanh bóng, đậm hay nhạt tùy thuộc vào vị trí sống của cây. Phiến lá trải
rộng hay gấp lại theo gân vòng cung như cái quạt hay chỉ gấp lại theo gân giữa
như hình chữ V [4]. Các lồi thuộc giống Dendrobium đôi khi trút lá vào mùa
khô hạn. Sau đó, cây ra hoa hay sống ẩn để khi gặp mưa thì cho chồi mới [1].
Dendrobium có cụm hoa mọc từ thân thành từng chùm, trên một cành hoa
có những chiếc hoa đơn xếp theo hình xoắn ốc, các hoa đơn liền cành nhờ
cuống. Cuống kéo dài cho tới bầu hoa tạo ra ba lá noãn (bầu hoa được tạo thành
bởi 3 lá đài, 3 cánh hoa và một trụ hoa) [1].
- Cụm hoa chùm thường nhiều hoa hoặc ít hoa, dài thường rũ thõng
xuống, nhiều lồi hoa có giá trị làm cảnh [7].
- Hoa lưỡng tính, đối xứng hai bên. Màu sắc hoa đa dạng, sặc sỡ, đa số
có lồi có hương thơm. Bao hoa chia hai vịng. Vịng ngồi gồm một lá đài
giữa và hai lá đài bên. Vịng trong gồm có hai cánh hoa và một cánh mơi [7].
- Cằm được hình thành nhờ mép phần gốc hai lá đài bên dính nhau và dính
với chân cột, có các hình bán cầu, hình túi đến hình cựa, hình trụ cong ít nhiều [7].
- Cánh mơi khác nhiều so với các thành phần còn lại của bao hoa cả về
màu sắc, kích thước và trang trí (đốm, vạch, diềm tua, u lồi, đường sống, lông

5

phủ chiếm vị trí khá quan trọng trong phân loại). Nhiều lồi có gốc cánh mơi
dính với chân cột tạo thành cựa [7].
- Quả nang, khi hạt chín, các nang bung ra chỉ cịn dính lại với nhau ở đỉnh
gốc. Ở một số lồi khi chín quả khơng nứt ra nên hạt chỉ ra khỏi quả khi bị mục
nát. Quả chứa 10.000 – 100.000 hạt, đôi khi đến 3 triệu hạt có kích thước rất nhỏ
nên phơi hạt chưa phân hóa. Sau 3 – 5 tháng hạt chín và phát tán nhờ gió [7].
- Hạt lan có kích thước rất nhỏ, phơi hạt chưa phân hóa. Sau 12 - 18 tháng
hạt chín phát tán nhờ gió. Khi gặp nấm cộng sinh tương thích trong điều kiện phù
hợp hạt sẽ nảy mầm [7].
1.1.2. Giới thiệu về loài lan Ý thảo (D. gratiosissimum)
Lan Ý thảo hay Hoàng thảo ý thảo (D. gratiosissimum) là một loài lan
thuộc chi Dendrobium của họ Orchidaceae. Là cây thân thảo, mọc thành cụm,
với thân trịn có đốt được bao quanh bằng bao vỏ lâu rụng và chặt, sống chủ
yếu là lâu năm, biểu sinh trên thân và cành cây thân gỗ chứa nhiều mùn, có
quan hệ cộng sinh với nấm. Thân dài 25 – 40 cm, đường kính 0,5 - 0,7 cm,
thịng xuống, gióng dài 2,5 - 2,7 cm. Lá trơng giống như da, mép lá nhẵn,
hình mác, xếp hai dãy, dài 8 – 10 cm, rộng 1,2 -1,8 cm, ở đầu 2 thùy lệch.
Cụm hoa chứa 1-3 hoa dạng bên, mọc gần các đốt ở phần trên của thân khơng
cịn lá, hoa lộn ngược. Lá bắc nhỏ, hình mác, dài 0,5 cm, đầu tù. Hoa nở vào
mùa xuân, đường kính 3–7 cm, cánh hoa và lá đài màu trắng với chóp màu
tím nhạt. Các lá đài gần đều, hình mác, dài 2,3-2,5 cm, rộng 0,6-0,8 cm, đầu
hơi nhọn. Lá đài ở lưng tự do, các lá đài bên hơi chếch tại đế. Cằm dài 0,5 cm,
có đầu tù. Cánh hoa gần giống như lá đài ở lưng, hình mác, dài 2,4-2,5 cm,
rộng 1-1,2 cm, đầu tù [6]. Cánh mơi gần trịn, dài 2,5-2,7 cm, rộng 2,1-2,3
cm, gốc hơi thót và có các vạch chéo màu tím ở chóp, ở giữa có một đốm màu
vàng. Trụ màu trắng, cao 0,3-0,4 cm. Nắp hình mũ cao, màu trắng, bề mặt

phủ nhú mịn. Bầu dài 2,8-3,5 cm. Quả nang hình trứng thn dài [6]. Lồi
này có thể tái sinh bằng hạt và chồi [13].


6

Lan Ý thảo được tìm thấy chủ yếu trong các rừng cây lá sớm rụng và khô
cũng như các rừng thường xanh mưa ẩm vùng đất thấp hay miền núi tại Hải
Nam (Trung Quốc), Assam (Ấn Độ), Lào, Thái Lan, Việt Nam và Myanma
tại cao độ trong khoảng 0 tới 1.600 m. Tại Việt Nam, lan Ý thảo sống trong tự
nhiên có tại các tỉnh Quảng Trị (huyện Hướng Hóa: Lao Bảo), Kon Tum
(huyện Đắk Tô: rừng cấm Đắk Uy), Gia Lai (huyện Chư Păh: Gia Lu), Lâm
Đồng (Đà Lạt, Bảo Lộc) [6]. Mơi trường phát triển thích hợp với Lan Ý thảo
có khí hậu từ mát tới nóng với lượng ánh sáng trung bình[6].
1.2. Kĩ thuật nhân giống bằng nuôi cấy mô - tế bào thực vật
1.2.1. Giới thiệu chung
Kỹ thuật nuôi cấy mô- tế bào thực vật hay nhân giống in vitro đều là
thuật ngữ mô tả các phương pháp nuôi cấy các bộ phận thực vật (tế bào đơn,
mơ, cơ quan) trong ống nghiệm có chứa mơi trường dinh dưỡng thích hợp
như muối khống, vitamin, đường và các chất điều hòa sinh trưởng thực vật
trong điều kiện vô trùng.
Chồi hoặc cơ quan từ các mô như lá, thân, hoa, rễ, củ hoặc đỉnh sinh
trưởng có thể được tái sinh nhờ kỹ thuật nuôi cấy mô. Trước kia người ta
dùng phương pháp này để nghiên cứu các đặc tính cơ bản của tế bào như sự
phân chia, đặc tính di truyền và ảnh hưởng của các hóa chất đối với tế bào và
mơ trong q trình ni cấy. Hiện nay, các nhà khoa học sử dụng hệ thống
nuôi cấy mô thực vật để nghiên cứu tất cả các vấn đề có liên quan đến thực
vật như sinh lý học, hóa sinh học, di truyền học và cấu trúc thực vật.
Kỹ thuật nuôi cấy mô- tế bào thực vật có tiềm năng nhân giống vơ tính
đối với các lồi cây trồng quan trọng, có giá trị về mặt kinh tế và thương mại

trong đời sống hàng ngày của con người.


7

1.2.2. Lịch sử phát triển của kỹ thuật nhân giống bằng nuôi cấy mô - tế bào
thực vật
Đầu tiên, năm 1983, hai nhà sinh vật Đức Schleiden và Schwann đã đề
xướng thuyết tế bào và nêu rõ: Mọi cơ thể sinh vật phức tạp đều gồm những đơn
vị nhỏ các tế bào hợp thành. Các tế bào đã phân hóa đều mang các thơng tin di
truyền có trong tế bào.
Nhà thực vật học người Đức Gottlied Haberlandt (1902) là người đầu
tiên đưa các giả thuyết của Schleiden và Schwann vào thực nghiệm để chứng
minh tính tồn tại của tế bào, nhưng ông đã thất bại trong nuôi cấy các tế bào
đã phân hóa tách từ một số cây một lá mầm. Ngày nay, chúng ta đã biết được
nguyên nhân thất bại vì cây một lá mầm là đối tượng rất khó ni cấy, hơn
nữa ơng lại dùng những tế bào đã mất hết khả năng tái sinh [21].
Kotte cùng với Robbins (1922) đã lặp lại thí nghiệm của Haberlandt với
đỉnh sinh trưởng tách từ đầu rễ một cây hòa thảo (cây ngô). Hai tác giả đã nuôi
được trong một thời gian ngắn (12 ngày) trên mơi trường lỏng có chứa đường
glucozơ và muối khoáng thu được hệ rễ nhỏ [21].
Năm 1934, bắt đầu giai đoạn thứ 2 của lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực
vật khi White (người Mỹ) đã duy trì được sinh trưởng của đầu rễ cà chua
trong một thời gian khá dài, trên môi trường lỏng có chứa đường, một số
muối khống và dịch chiết nấm men [21].
Trong thời gian 1941-1952, nhiều chất điều kích thích sinh trưởng thuộc
nhóm Auxin được ni cấy và tổng hợp thành công: axit naphthalen axetic
(NAA), axit 2,4 D- dichlorophenoxy axetic (2,4 D)…[21].
Skoog và Miller (1954) đã phát hiện ra các hợp chất có thể điều khiển sự
nhân chồi. Skoog phát hiện chế phẩm thuỷ phân của tinh dịch cá bẹ kích thích

sinh trưởng rõ rệt trong ni cấy các mảnh mơ thân cây thuốc lá. Một năm
sau, chất đó được tổng hợp thành công và được Skoog gọi là kinetin có tác
dụng kích thích sự phân bào. Skoog và Miller đã chứng minh sự biệt hóa của


8

rễ, chồi trong nghiên cứu nuôi cấy mô tủy thuốc lá phụ thuộc vào nồng độ
tương đối của auxin/cytokinin và từ đó đưa ra quan niệm điều khiển hormon
trong quá trình hình thành cơ quan ở thực vật. Thành cơng của Skoog và
Miller dẫn đến nhiều phát hiện quan trọng, mở đầu cho giai đoạn thứ 3 của
nuôi cấy mô tế bào thực vật. Năm 1962, Murashige và Skoog đã cải tiến môi
trường nuôi cấy, đánh dấu một bước tiến trong kỹ thuật nuôi cấy mô. Môi
trường của họ đã được dùng làm cơ sở cho việc nuôi cấy nhiều loại cây và
vẫn còn được sử dụng rộng rãi cho đến nay [21].
Trong khoảng thời gian từ 1954 -1959, kỹ thuật nuôi cấy tế bào đơn đã
được phát triển và hồn thiện dần. Melcher và Beckman đã ni cấy các tế
bào đơn trong các bình dung tích lớn có sục khí và bổ sung chất dinh dưỡng
định kỳ. Khả năng nuôi cấy các tế bào thực vật và tái tạo được cây hoàn chỉnh
từ tế bào đã mở ra những triển vọng mới cho chọn dòng đột biến, sản xuất các
chất trao đổi thứ cấp...[21].
Năm 1960 – 1964, Morel cho rằng có thể nhân giống vơ tính địa lan bằng
ni cấy đỉnh sinh trưởng và đã tạo ra được các protocom từ địa lan. Từ kết quả
đó, lan được xem là cây nuôi cấy mô đầu tiên được thương mại hóa [21].
Guha & cộng sự (1966) đã tạo được cây đơn bội từ nuôi cấy túi phấn cây cà
độc dược. Sau đó Bourin & Nitsch (1967) cũng thành cơng với cây thuốc lá. Việc
tạo cây đơn bội thành công ở nhiều lồi thực vật thơng qua ni cấy bao phấn và
hạt phấn đóng góp rất lớn cho các nghiên cứu di truyền và lai tạo giống [21].
Từ những năm 1970 trở đi, các nhà khoa học đã chú ý vào triển vọng của
kỹ thuật nuôi cấy protoplast, khi 2 tác giả người Nhật là Nagata và Takebe đã

thành công trong việc làm cho protoplast thuốc lá tái tạo được cellulose.
Melchers và cộng sự (1978) đã lai tạo thành công protoplast của cà chua với
protoplast của khoai tây, mở ra một triển vọng mới trong lai xa ở thực vật.
Ngoài ra, trong những điều kiện nhất định, các protoplast có khả năng hấp thụ


9

các phân tử lớn, hoặc các cơ quan tử từ bên ngồi, do đó chúng là những đối
tượng lý tưởng cho các nghiên cứu về di truyền thực vật [21].
Hiện nay, công nghệ nuôi cấy mô- tế bào thực vật đã được phát triển với tốc
độ nhanh trên nhiều cây khác và được ứng dụng rộng rãi trong đời sống [21].
1.2.3. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô - tế bào thực vật
Kỹ thuật nuôi cấy mô- tế bào dựa vào cơ sở khoa học là tính tồn năng
của tế bào, sự phân hóa và phản phân hóa [21].
1.2.3.1. Tính tồn năng của tế bào
- Giả thuyết về tính toàn năng của tế bào theo Gottlibeb Haberlant (1902) là
“Tế bào bất kỳ của cơ thể sinh vật nào cũng đều mang tồn bộ lượng thơng tin di
truyền (DNA) cần thiết và đủ của cả sinh vật đó. Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi
tế bào đều có thể phát triển thành một cá thể hồn chỉnh” [21]. Tính tồn năng là
cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mơ tế bào thực vật [21].
1.2.3.2. Sự phân hóa và phản phân hóa
Sự phân hóa tế bào là sự chuyển hóa các tế bào thành các mơ chun hóa,
đảm nhận các chức năng khác nhau trong cơ thể. Tuy nhiên, khi tế bào đã phân
hóa thành mơ chức năng chúng hồn tồn mất khả năng phân chia của mình.
Trong những điều kiện mơi trường thích hợp, chúng lại có thể trở về dạng
tế bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ như tế bào hợp tử ban đầu và cho ra các
tế bào mới có khả năng tái sinh thành cây hồn chỉnh. Q trình đó được gọi là
sự phản phân hóa tế bào [10].
1.2.4. Các giai đoạn trong kỹ thuật nhân giống in vitro

Q trình ni cấy in vitro được chia ra 5 giai đoạn:
* Giai đoạn 1: Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ
Trước khi tiến hành nhân giống in vitro cần chọn lọc cẩn thận các cây mẹ
(cây cho nguồn mẫu nuôi cấy). Các cây này phải sạch bệnh, đặc biệt là bệnh
virus và ở giai đoạn sinh trưởng mạnh. Việc trồng các cây mẹ trong điều kiện
mơi trường thích hợp với chế độ chăm sóc và phòng trừ sâu bệnh hiệu quả


10

trước khi lấy mẫu cấy sẽ làm giảm tỷ lệ mẫu nhiễm, tăng khả năng sống và sinh
trưởng của mẫu cấy in vitro [21].
* Giai đoạn 2: Nuôi cấy khởi động
Là giai đoạn khử trùng đưa mẫu vào nuôi cấy in vitro. Giai đoạn
này cần đảm bảo các yêu cầu: tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại
và sinh trưởng tốt [21]. Khi lấy mẫu cần chọn đúng loại mô, đúng giai đoạn
phát triển của cây. Quan trọng nhất là đỉnh chồi ngọn, đỉnh chồi nách và sau đó
là đỉnh chồi hoa, cuối cùng là đoạn thân, mảnh lá…[21].
* Giai đoạn 3: Nhân nhanh
Là giai đoạn kích thích mơ ni cấy phát sinh hình thái và tăng nhanh
số lượng thơng qua các con đường: hoạt hóa chồi nách, tạo chồi bất định,
tạo phơi vơ tính [21].
* Giai đoạn 4: Tạo cây in vitro hoàn chỉnh
Để tạo rễ cho chồi, người ta chuyển chồi từ môi trường nhân nhanh sang môi
trường tạo rễ. Môi trường tạo rễ thường được bổ sung một lượng nhỏ Auxin. Một
số chồi có thể phát sinh rễ ngay sau khi chuyển từ môi trường nhân nhanh giàu
cytokinin sang môi trường không chứa chất điều hịa sinh trưởng [21].
* Giai đoạn 5: Thích ứng cây in vitro ngồi điều kiện tự nhiên
Mục đích là đưa cây từ ống nghiệm ra vườm ươm với tỷ lệ sống cao. Cây
trong ống nghiệm đã đạt được nhưng tiêu chuẩn hình thái nhất định (số lá, số rễ,

chiều cao cây). Cây con cao 5-7 cm, có từ 3-4 lá có thể chuyển ra ngồi bình. Giá
thể thích hợp là giá thể sạch, tơi xốp, thoát nước. Phải chủ động điều chỉnh được độ
ẩm, sự chiếu sáng của vườm ươm, cũng như có chế độ dinh dưỡng phù hợp [15].
1.2.5. Phytohormon trong ni cấy in vitro
Các chất điều hồ sinh trưởng là thành phần không thể thiếu được trong
môi trường ni cấy, có vai trị quan trọng trong phát sinh hình thái thực vật
in vitro. Hiệu quả tác động của chất điều hoà sinh trưởng phụ thuộc vào loại
và nồng độ chất điều hoà sinh trưởng sử dụng trong nuôi cấy.


11

- Nhóm Auxin: Được đưa vào mơi trường ni cấy nhằm thúc đẩy sự sinh
trưởng và giãn nở tế bào, tăng cường các quá trình sinh tổng hợp và trao đổi
chất, kích thích sự hình thành rễ và tham gia cảm ứng phát sinh phơi vơ tính...
(Epstein&cs, 1989) [21]. Các loại auxin thường sử dụng cho nuôi cấy như
IAA (Indole acetic acid), IBA (Indole butyric acid), NOA (Naphthoxy acetic
acid), α- NAA (α- Naphthalene acetic acid), 2,4-D (2,4-diclorophenoxy acetic
acid)... Các auxin khác có hàm lượng sử dụng từ 0,1 – 2,0 mg/l [21].
- Nhóm Cytokinin: Kích thích sự phân chia tế bào, sự hình thành và sinh
trưởng của chồi in vitro (Miller, 1962) [21]. Các cytokinin có biểu hiện ức chế
sự tạo rễ và sinh trưởng của mơ sẹo nhưng có ảnh hưởng dương tính rõ rệt
đến sự phát sinh phơi vơ tính của mẫu ni cấy. Các loại cytokinin thường
dùng trong nuôi cấy mô là Zeatin (6-[4-hydroxy-3-metyl-but-2-enylamino]
purine), Kinetin (6-furfurylamino purine), BAP (Bezylamino purine), TDZ
(Thidiazuzon). Hàm lượng sử dụng của các Cytokinin dao động từ 0,1-2,0
mg/l. Ở những nồng độ cao hơn, nó có tác dụng kích thích rõ rệt đến sự hình
thành chồi nách, đồng thời ức chế mạnh sự tạo rễ của chồi nuôi cấy. Kinetin
và BAP là hai loại được sử dụng rộng rãi. Thường sử dụng phối hợp cả auxin
và cytokinin ở những tỷ lệ khác nhau [21].

- Nhóm Gibberellin: Ngồi hai nhóm chính là auxin và cytokinin, trong
ni cấy mơ người ta cịn sử dụng thêm Gibberellin để kích thích kéo dài tế
bào, qua đó làm tăng kích thước của chồi ni cấy... GA3 là loại Gibberellin
được sử dụng thường xuyên nhất. Tuy nhiên do mẫn cảm với nhiệt độ nên
phải lọc qua màng lọc vô trùng rồi mới đưa vào môi trường [21].
1.2.6. Tầm quan trọng của phương pháp nuôi cấy mô - tế bào thực vật
Phương pháp này có ý nghĩa vơ cùng to lớn đối với việc nghiên cứu
lý luận sinh học cơ bản, đồng thời có giá trị đóng góp trực tiếp cho thực
tiễn sản xuất và đời sống.


12

- Về mặt lý luận sinh học cơ bản: đã mở ra khả năng to lớn cho việc tìm
hiểu sâu sắc về bản chất của sự sống. Thực tế đã cho phép chúng ta tách và
nuôi cấy trước hết là mơ phân sinh (meristem) rồi từ đó cho ra nhóm tế bào
khơng chun hóa gọi là mơ sẹo (callus) và từ mơ sẹo thì có thể kích thích tái
sinh và tạo cây hoàn chỉnh.
- Về mặt thực tiễn sản xuất: phương pháp nuôi cấy mô được sử dụng để
phục tráng và nhân nhanh các giống cây trồng q, có giá trị kinh tế cao. Hiện
nay phương pháp này đã trở thành phổ biến và áp dụng trong công tác chọn
giống cây trồng. Ngoài ra, bằng phương pháp này chỉ sau thời gian ngắn
chúng ta có thể tạo được sinh khối lớn có hoạt chất sinh học được tạo ra vẫn
giữ ngun được hoạt tính của mình.
1.3. Tình hình nghiên cứu
1.3.1. Tình hình nghiên cứu nhân giống in vitro lan Hồng thảo
1.3.1.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Phong lan là một trong những loại cây trồng đạt thành công nhất trong việc
áp dụng công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật. Trên thế giới đã có nhiều cơng
trình nghiên cứu về nhân nhanh các giống phong lan nhằm bảo tồn cũng như

sản xuất thương mại chúng, trong đó có nhiều loài thuộc chi Hoàng thảo. Sự
sinh trưởng và phát triển của giống phong lan Hoàng Thảo lai trong vi nhân
giống [25]. Năm 2011, Waranyoo Kaewduangta và Pranee Reamkatog đã hồn
thiện đề tài: “Ảnh hưởng của mơi trường cải biến lên sự sinh trưởng và phát
triển của loài Dendrobium parishii trong nhân giống in vitro”. Và chỉ ra môi
trường nhân chồi phù hợp nhất đối với loài lan Dendrobium parishii là: VW +
than hoạt tính (2 g/l) + nước dừa (150 ml/l) + chuối nghiền (50 g/l) + bột nhộng
(5 g/l) + gạo nâu (5 g/l) cho kết quả sau 6 tuần ni cấy chồi có chiều cao là
0,98 cm/chồi và có 7,83 lá/chồi [24]. Năm 2012, tác giả S. Tuhuteru và cộng sự
nghiên cứu về “Sự sinh trưởng và phát triển của lồi lan Dendrobium anosmum
trong ni cấy in vitro với mơi trường có bổ sung thêm nước dừa” đã thu được


13

kết quả cho số lượng, kích thước và chiều cao chồi đạt hiệu quả cao nhất trong
mơi trường MS có bổ sung 100 ml/l nước dừa [27].
1.3.1.2. Tình hình nghiên cứu trong nước
Ở Việt Nam, các loài thuộc chi Hoàng thảo cũng được quan tâm nghiên
cứu nhân giống bằng công nghệ in vitro. Năm 2009, tác giả Nguyễn Văn Vinh
và Nguyễn Hữu Lễ đã nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng
thực vật lên sự phát sinh chồi và rễ cây phong lan giã hạt Dendrobium
anosmum. Các ông đã tìm ra mơi trường nhân nhanh chồi thích hợp nhất có
pH = 5,6 là: MS + đường saccarozơ (30 g/l) + agar (8 g/l) + cacbon hoạt tính
(0,5 g/l) + BAP (0,5 mg/l) hoặc kinetin (1 mg/l), và môi trường ra rễ thích
hợp nhất có pH = 5,6 là: MS + đường saccarozơ (30 g/l) + agar (8 g/l) +
cacbon hoạt tính (0,5 g/l) + IBA (1 mg/l) hoặc NAA (1 mg/l) [20].
Nguyễn Thị Mỹ Duyên (2009) ở trường Đại học An Giang đã tiến hành
triển khai đề tài nhân giống lan Dendrobium anosmum, Dendrobium mini
bằng phương pháp nuôi cấy mô, kết quả nghiên cứu chỉ ra môi trường cho

hiệu quả nảy chồi cao nhất từ hạt của Dendrobium anosmum là môi trường:
MS + NAA (1 mg/l) hoặc MS + BA (1 mg/l) + NAA (0,2 mg/l), cho tỉ lệ nảy
chồi đạt được là ≥ 85% [2].
Năm 2012, Vũ Thanh Sắc và cộng sự nghiên cứu nhân giống in vitro lan
Hồng thảo trầm trắng (Dendrobium anosmum var.alba) đã tìm ra mơi trường
nhân nhanh chồi thích hợp nhất là: 1/2MS + đường saccarozơ (20 g/l) + agar
(10 g/l) + chuối xanh nghiền (120 g/l)+ nước dừa (10%) + kinetin (1,5 mg/l) +
than hoạt tính (1 g/l) trong mơi trường có pH=5,8. Trên mơi trường này cho
hình thái chồi có màu xanh đậm, lá to, dày, khỏe. Cụm cây nuôi cấy gồm 5
cây sẽ thích hợp cho sự sinh trưởng của cây con in vitro [13].
Vũ Ngọc Lan và Nguyễn Thị Lý Anh (2013) đã nghiên cứu nhân giống in
vitro loài Lan bản địa Dendrobium nobile Lindl (Thạch hộc). Kết quả cho
thấy nguyên liệu sử dụng thích hợp là quả lan 5 tháng tuổi; môi trường gieo


14

hạt là MS + (100 ml nước dừa + 10 g đường saccarozơ + 6,0 g agar)/lít mơi
trường. Trong nhân giống in vitro, môi trường nhân nhanh protocorm tối ưu là
KC + (100 ml nước dừa + 10 g đường saccarozơ + 6,0 g agar)/lít; nhân nhanh
cụm chồi tốt nhất là MS+ (100 ml nước dừa + 10 g đường saccarozơ + 6,0 g
agar)/lít. Mơi trường tối ưu tạo cây hoàn chỉnh là RE+ (10 g đường saccarozơ
+ 0,5g than hoạt tính)/lít, cường độ ánh sáng 2300 lux [10].
1.3.2. Nghiên cứu sử dụng cytokinin và auxin trong nhân giống in vitro lan
Hoàng thảo
1.3.2.1. Nghiên cứu sử dụng cytokinin trong nhân giống in vitro lan Hồng thảo
Đây là nhóm chất kích thích sự phân chia tế bào, sự hình thành và sinh
trưởng của chồi in vitro. Các cytokinin có biểu hiện ức chế sự tạo rễ và sinh
trưởng của mô sẹo nhưng có ảnh hưởng dương tính rõ rệt đến sự phát sinh phơi
vơ tính của mẫu ni cấy. Ngồi ra, cytokinin cảm ứng sự hình thành chồi nách

và loại bỏ ưu thế đỉnh [8]. Các loại cytokinin thường dùng trong nuôi cấy mô
là: Zeatin (6-[4-hydroxy-3-metyl-but-2-enylamino] purine), kinetin (6furfurylamino purine), BAP (Bezylamino purine), TDZ (Thidiazuzon)...
Hàm lượng sử dụng của các cytokinin dao động từ 0,1-2,0 mg/l. Ở
những nồng độ cao hơn, nó có tác dụng kích thích rõ rệt đến sự hình thành
chồi nách, đồng thời ức chế mạnh sự tạo rễ của chồi ni cấy. Trong các loại
cytokinin nói trên, kinetin và BAP là hai loại được sử dụng rộng rãi hơn cả.
Đối với lồi Dendrobium denndanum, khi ni cấy trong mơi trường MS
có bổ sung 2 mg/l BAP đã cho hệ số nhân chồi là 9 chồi/mẫu cấy, cao hơn so
với việc bổ sung BAP ở nồng độ 1mg/l. Tuy nhiên với nồng độ 1mg/l BAP lại
thích hợp cho sự cảm ứng tạo chồi ở loài Dendrobium henanense [26].
Năm 2011, tác giả Nguyễn Văn Song và cộng sự đã thực hiện nhân nhanh
in vitro lan Kim Điệp (Dendrobium chrysotoxum) – Một lồi lan rừng có nguy
cơ tuyệt chủng và chỉ ra mơi trường thích hợp cho nảy mầm và phát sinh
protocom của hạt là MS cơ bản có 20 g/l saccarozơ, 8 g/l agar, 15% nước dừa