Nghiên cứu ảnh hưởng bổ sung của các chất hữu cơ đến sự phát sinh cơ quan của loài lan hoàng thảo kèn (dendrobium lituiflorum) giai đoạn in vitro

TRƯỜNG ĐẠI HỌC HÙNG VƯƠNG
KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN
------------------------------

NGUYỄN THÙY LINH

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC CHẤT
BỔ SUNG HỮU CƠ ĐẾN SỰ PHÁT SINH CƠ QUAN
CỦA LOÀI LAN HOÀNG THẢO KÈN (Dendrobium
lituiflorum) GIAI ĐOẠN IN VITRO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Ngành: Sư phạm Sinh học

Phú Thọ, 2018


TRƯỜNG ĐẠI HỌC HÙNG VƯƠNG
KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN
-----------------------------

NGUYỄN THÙY LINH

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC CHẤT
BỔ SUNG HỮU CƠ ĐẾN SỰ PHÁT SINH CƠ QUAN
CỦA LOÀI LAN HOÀNG THẢO KÈN (Dendrobium
lituiflorum) GIAI ĐOẠN IN VITRO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Ngành: Sư phạm Sinh học

NGƯỜI HƯỚNG DẪN: TS. TRẦN TRUNG KIÊN

Phú Thọ, 2018


i

LỜI CẢM ƠN
Trong thời gian nghiên cứu và hoàn thành khóa luận, em xin gửi lời
cảm ơn chân thành nhất tới thầy giáo hƣớng dẫn TS. Trần Trung Kiên đã
hƣớng dẫn tận tình, quan tâm và động viên em hồn thành khóa luận.
Em xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc đến các thầy (cô) trong Trung tâm
nghiên cứu Công nghệ sinh học trƣờng Đại học Hùng Vƣơng cùng toàn thể
các thầy cô giáo trong Khoa Khoa học Tự nhiên, Trƣờng Đại học Hùng Vƣơng
đã tạo điều kiện giúp đỡ để em thực hiện và hồn thành khóa luận này.
Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè, những ngƣời đã
luôn bên cạnh động viên, giúp đỡ em trong suốt q trình thực hiện và hồn
thành khóa luận tốt nghiệp này.
Em xin chân thành cảm ơn!
Phú Thọ, ngày tháng 05 năm 2018

Sinh viên

Nguyễn Thùy Linh


ii

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan số liệu và kết quả nghiên cứu trong khóa luận này là

của tơi, các kết quả nghiên cứu đƣợc trình bày trong khóa luận là trung thực.
Mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện khóa luận này đã đƣợc cảm ơn và các
thơng tin trích dẫn trong khóa luận đã đƣợc chỉ rõ nguồn gốc và đƣợc phép
công bố.
Phú Thọ, ngày tháng 05 năm 2018

Sinh viên

Nguyễn Thùy Linh


iii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

AC

: Than hoạt tính

BAP

: Benzylamino purine

ĐC

: Đối chứng

IAA

: Indole acetic acid

KC

: Knudson C

NAA

: Naphthalen acetic acid

MS

: Môi trƣờng Murashige & Skoog

MT

: Môi trƣờng

PLSs

: Protocorom


iv

DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1. Ảnh hƣởng của môi trƣờng nền đến hệ số nhân, đặc điểm chồi của
cây in vitro loài lan Hoàng Thảo Kèn (D. lituiflorum) .................................... 27
Bảng 3.2. Ảnh hƣởng của chuối lên sự phát triển thân, rễ của cây in vitro loài
lan Hoàng Thảo Kèn (D. lituiflorum).............................................................. 28
Bảng 3.3. Ảnh hƣởng của chuối lên sự phát triển lá của cây in vitro loài lan

Hoàng Thảo Kèn (D. lituiflorum) ................................................................... 30
Bảng 3.4. Ảnh hƣởng của nƣớc dừa lên sự phát triển thân, rễ của cây in vitro
loài lan Hoàng Thảo Kèn (D. lituiflorum)....................................................... 32
Bảng 3.5. Ảnh hƣởng của nƣớc dừa lên sự phát triển lá của cây in vitro loài
lan Hoàng Thảo Kèn (D. lituiflorum).............................................................. 35
Bảng 3.6. Ảnh hƣởng của khoai tây lên sự phát triển thân, rễ của cây in vitro
loài lan Hoàng Thảo Kèn (D. lituiflorum)....................................................... 36
Bảng 3.7. Ảnh hƣởng của khoai tây lên sự phát triển lá của cây in vitro loài
lan Hoàng Thảo Kèn (D. lituiflorum).............................................................. 39
Bảng 3.8. Ảnh hƣởng của pepton lên sự phát triển thân, rễ của cây in vitro loài
lan Hoàng Thảo Kèn (D. lituiflorum).............................................................. 41
Bảng 3.9. Ảnh hƣởng của pepton lên sự phát triển lá của cây in vitro loài lan
Hoàng Thảo Kèn (D. lituiflorum) ................................................................... 43


v

DANH MỤC BẢNG
Hình 3.1. Ảnh hƣởng của mơi trƣờng nền đến hệ số nhân chồi..................... 28
Hình 3.2. Ảnh hƣởng của chuối đến lên sự phát sinh cơ quan của cây in vitro
lồi lan Hồng Thảo Kèn (D. lituiflorum)....................................................... 29
Hình 3.3. Ảnh hƣởng của chuối đến chiều cao của thân ............................... 29
Hình 3.4. Ảnh hƣởng của chuối đến số rễ. ..................................................... 30
Hình 3.5. Ảnh hƣởng của chuối đến số lá. ..................................................... 31
Hình 3.6. Ảnh hƣởng của nƣớc dừa đến lên sự phát sinh cơ quan của cây in
vitro loài lan Hoàng Thảo Kèn (D. lituiflorum) .............................................. 33
Hình 3.7. Ảnh hƣởng của nƣớc dừa đến chiều cao của thân.......................... 33
Hình 3.8. Ảnh hƣởng của nƣớc dừa đến số rễ. ............................................... 34
Hình 3.9. Ảnh hƣởng của nƣớc dừa đến số lá. ............................................... 35
Hình 3.10. Ảnh hƣởng của khoai tây đến lên sự phát sinh cơ quan của cây in

vitro loài lan Hoàng Thảo Kèn (D. lituiflorum) .............................................. 37
Hình 3.11. Ảnh hƣởng của khoai tây đến chiều cao của thân ........................ 37
Hình 3.12. Ảnh hƣởng của khoai tây đến số rễ. ............................................. 38
Hình 3.13. Ảnh hƣởng của khoai tây đến số lá. ............................................. 39
Hình 3.14. Ảnh hƣởng của pepton đến lên sự phát sinh cơ quan của cây in
vitro loài lan Hoàng Thảo Kèn (D. lituiflorum) .............................................. 41
Hình 3.15. Ảnh hƣởng của pepton đến chiều cao của thân ............................ 42
Hình 3.16. Ảnh hƣởng của pepton đến số rễ. ................................................. 42
Hình 3.17. Ảnh hƣởng của pepton đến số lá. ................................................. 43


vi

MỤC LỤC
Phần I: MỞ ĐẦU .............................................................................................. 1
1. Tính cấp thiết của đề tài ................................................................................ 1
2. Mục tiêu đề tài ............................................................................................... 2
3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn.......................................................... 2
3.1. Ý nghĩa khoa học ....................................................................................... 2
3.2. Ý nghĩa thực tiễn ........................................................................................ 2
Phần II: NỘI DUNG ......................................................................................... 3
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU .................................. 3
1.1. Giới thiệu chung về chi Hồng Thảo (Dendrobium) ................................. 3
1.1.1. Vị trí phân loại và phân bố ...................................................................... 3
1.1.2. Đặc điểm hình thái .................................................................................. 3
1.1.3. Lan Hoàng Thảo Kèn (D. lituiflorum) .................................................... 5
1.2. Kĩ thuật nhân giống bằng nuôi cấy mô - tế bào thực vật ........................... 6
1.2.1. Khái niệm ................................................................................................ 6
1.2.2. Lịch sử phát triển của kỹ thuật nhân giống bằng nuôi cấy mô - tế bào
thực vật .............................................................................................................. 7

1.2.3. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô - tế bào thực vật ................................. 8
1.2.4. Các giai đoạn trong kỹ thuật nhân giống in vitro ................................... 9
1.2.5. Các điều kiện nuôi cấy in vitro ............................................................. 11
1.2.6. Môi trƣờng nuôi cấy in vitro ................................................................. 12
1.2.7. Tầm quan trọng của phƣơng pháp nuôi cấy mơ - tế bào thực vật ........ 16
1.3. Tình hình nghiên cứu lan Hồng Thảo .................................................... 17
1.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ........................................................ 17
1.3.2. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc.......................................................... 18
1.4. Các chất bổ sung hữu cơ .......................................................................... 20
1.4.1. Chuối ..................................................................................................... 20
1.4.2. Nƣớc dừa ............................................................................................... 20
1.4.3. Khoai tây ............................................................................................... 21


vii

1.4.4. Peptone .................................................................................................. 21
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP .................. 22
NGHIÊN CỨU ................................................................................................ 22
2.1. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu............................................................ 22
2.2. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 22
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu.......................................................................... 22
2.3.1. Phƣơng pháp luận.................................................................................. 22
2.3.2. Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm.............................................................. 22
2.3.3. Phƣơng pháp thu thập số liệu ................................................................ 25
2.3.4. Phƣơng pháp xử lý số liệu..................................................................... 26
CHƢƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ..................... 27
3.1. Nghiên cứu ảnh hƣởng của môi trƣờng nền đến khả năng nhân nhanh
cụm chồi cây in vitro loài lan Hoàng Thảo Kèn (D. lituiflorum) ................... 27
3.2. Nghiên cứu ảnh hƣởng của chuối lên sự phát sinh cơ quan cây in vitro

loài lan Hoàng Thảo Kèn (D. lituiflorum)....................................................... 28
3.2.1. Nghiên cứu ảnh hƣởng của chuối lên sự phát triển thân, rễ của cây in
vitro loài lan Hoàng Thảo Kèn (D. lituiflorum) .............................................. 28
3.2.2. Nghiên cứu ảnh hƣởng của chuối lên sự phát triển lá của cây in vitro
loài lan Hoàng Thảo Kèn (D. lituiflorum)....................................................... 30
3.3. Nghiên cứu ảnh hƣởng của nƣớc dừa lên sự phát sinh cơ quan cây in
vitro loài lan Hoàng Thảo Kèn (D. lituiflorum) .............................................. 32
3.3.1. Nghiên cứu ảnh hƣởng của nƣớc dừa lên sự phát triển thân, rễ của cây
in vitro loài lan Hoàng Thảo Kèn (D. lituiflorum) .......................................... 32
3.3.2. Nghiên cứu ảnh hƣởng của nƣớc dừa lên sự phát triển lá của cây in
vitro loài lan Hoàng Thảo Kèn (D. lituiflorum) .............................................. 34
3.4. Nghiên cứu ảnh hƣởng của khoai tây lên sự phát sinh cơ quan cây in
vitro loài lan Hoàng Thảo Kèn (D. lituiflorum) .............................................. 36
3.4.1. Nghiên cứu ảnh hƣởng của khoai tây lên sự phát triển thân, rễ của cây
in vitro loài lan Hoàng Thảo Kèn (D. lituiflorum) .......................................... 36


viii

3.4.2. Nghiên cứu ảnh hƣởng của khoai tây lên sự phát triển lá của cây in
vitro loài lan Hoàng Thảo Kèn (D. lituiflorum) .............................................. 38
3.5. Nghiên cứu ảnh hƣởng của peptone lên sự phát sinh cơ quan cây in vitro
loài lan Hoàng Thảo Kèn (D. lituiflorum)....................................................... 40
3.5.1. Nghiên cứu ảnh hƣởng của pepton lên sự phát triển thân, rễ của cây in
vitro loài lan Hoàng Thảo Kèn (D. lituiflorum) .............................................. 40
3.5.2. Nghiên cứu ảnh hƣởng của pepton lên sự phát triển lá của cây in vitro
loài lan Hoàng Thảo Kèn (D. lituiflorum)....................................................... 43
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................................ 45
1.Kết luận ........................................................................................................ 45
2.Kiến nghị ...................................................................................................... 45

TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................... 46
Tài liệu tham khảo tiếng việt........................................................................... 46
Tài liệu tham khảo nƣớc ngoài........................................................................ 47


1

Phần I: MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Họ lan hay phong lan (Orchidaceae) là một trong những họ thực vật
lớn nhất với khoảng trên 35.000 loài phân bố rộng rãi trên toàn thế giới
(Dressler1993). Đây là họ hoa đẹp và thƣờng có hƣơng thơm nên rất đƣợc ƣa
chuộng. Việt Nam là một quốc gia thuộc vùng khí hậu nhiệt đới thích hợp cho
sự phát triển của các lồi phong lan. Theo cuốn Phong lan Việt Nam của Trần
Hợp thì Việt Nam có 137 - 140 chi với trên 1000 loài [3]. Trong những năm
gần đây, đời sống vật chất bớt khó khăn, nhu cầu thƣởng thức hoa của ngƣời
Việt ngày càng đƣợc chú trọng và phát triển, chính vì vậy việc cung cấp lan
giống cho thị trƣờng càng đƣợc quan tâm. Tuy nhiên, các giống hoa lan phổ
biến trên thị trƣờng nƣớc ta hiện nay chủ yếu là do nhập ngoại từ Thái Lan,
Đài Loan, Trung Quốc.., việc tự nhân giống để cung cấp cho thị trƣờng trong
nƣớc vẫn cịn nhiều hạn chế. Lan rừng tuy khơng rực rỡ sắc màu nhƣ những
giống lan ngoại nhập nhƣng lại có vẻ đẹp tự nhiên thanh thốt và phần lớn có
hƣơng thơm vì vậy ln đƣợc ƣa chuộng đối với những ngƣời chơi lan. Thế
giới lan rừng rất phong phú với nhiều chủng loại trong đó lớn nhất phải kể
đến chi Dendrobium (cịn gọi là Hồng Thảo).
Hồng Thảo Kèn (Dendrobium lituiflorum) là loại hoa rất đẹp và quý
hiếm. Hoàng Thảo Kèn là loại lan biểu sinh trong rừng lá rộng trên thân cây
ở độ cao khoảng 300 - 1600 m, phát triển trong nhiệt độ mát đến ấm nóng.
Tại Việt Nam, cây có mặt ở miền Bắc. Hồng Thảo Kèn rất sai hoa, nở nhiều
hoa to 6 - 7 cm, mọc từng chùm 2 - 3 chiếc trên 1 mắt ở các đốt giữa thân đến

ngọn. Hiện nay, Hoàng Thảo Kèn rất ít đƣợc tìm thấy trong tự nhiên do bị
thu mua và khai thác ráo riết. Ngƣời chơi hoa ai cũng muốn đƣợc sở hữu
Hoàng Thảo Kèn trong vƣờn khiến giá thành của Hoàng Thảo Kèn tự nhiên bị
đẩy lên rất cao và trở thành loài ngày càng bị săn lùng khai thác nhiều hơn
đến cạn kiệt.Việc nhân giống Hồng Thảo Kèn theo phƣơng pháp truyền
thống rất chậm khơng đáp ứng đủ nhƣ cầu ngƣời chơi [1].


2

Ngày nay cùng với sự phát triển của công nghệ sinh học thì vi nhân
giống (in vitro) là cơng cụ đắc lực trong việc bảo tồn và phát triển các lồi lan
q hiếm. Trong nhân giống in vitro, ngồi mơi trƣờng nuôi cấy cơ bản,
ngƣời ta thƣờng bổ sung thêm vào mơi trƣờng ni cấy các vitamin, các chất
điều hịa sinh trƣởng, đƣờng, than hoạt tính, nuớc ép các loại hoa quả nhƣ:
chuối, nƣớc dừa, khoai tây…chúng có ảnh hƣởng rất lớn đến hệ số nhân và
chất lƣợng của chồi, cũng nhƣ có ảnh hƣởng lớn tới khả năng phát sinh cơ
quan.
Đã có nhiều cơng trình nghiên cứu về ảnh hƣởng của các chất điều hòa
sinh trƣởng trong việc nhân giống in vitro lan Hồng Thảo Kèn, tuy nhiên các
cơng trình nghiên cứu về ảnh hƣởng của các chất bổ sung hữu cơ hầu nhƣ
chƣa đƣợc nghiên cứu tại Việt Nam và trên thế giới rất ít và chƣa đầy đủ.
Chính vì vậy chúng tơi lựa chọn thực hiện đề tài:: “Nghiên cứu ảnh hƣởng
của các chất bổ sung hữu cơ đến sự phát sinh cơ quan của lan Hoàng
Thảo Kèn (Dendrobium lituiflorum) giai đoạn in vitro”.
2. Mục tiêu đề tài
Đánh giá đƣợc ảnh hƣởng của nồng độ các chất bổ sung hữu cơ đến sự
phát sinh cơ quan của loài lan Hoàng Thảo Kèn (Dendrobium lituiflorum).
3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn
3.1. Ý nghĩa khoa học

Kết quả nghiên cứu đề tài sẽ cung cấp các dẫn liệu khoa học làm cơ sở
đánh giá những tác động của các chất bổ sung hữu cơ đến khả năng phát sinh
cơ quan cây in vitro loài lan Hoàng Thảo Kèn (Dendrobium lituiflorum).
3.2. Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả nghiên cứu đƣợc ứng dụng trong ni cấy mơ lồi lan Hồng
Thảo Kèn (Dendrobium lituiflorum), góp phần sản xuất giống có hiệu quả
cao, chất lƣợng tốt, ứng dụng vào sản xuất, nâng cao hiệu quả kinh tế trên địa
bàn tỉnh Phú Thọ


3

Phần II: NỘI DUNG
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
1.1. Giới thiệu chung về chi Hoàng Thảo (Dendrobium)
1.1.1. Vị trí phân loại và phân bố
Giới: Plantae
Bộ: Asparagales
Họ: Orchidaceae
Phân họ: Epidendroideae
Chi: Dendrobium
Giống lan Dendrobium đƣợc đặt tên vào năm 1799, chữ Dendrobium
có nguồn gốc từ Hy Lạp, Dendro có nghĩa là cây gỗ, cây lớn; bio là sự sống.
Dendrobium rất phong phú về chủng với khoảng 1600 loài phân bố trên các
vùng thuộc Châu Á, tập trung nhiều ở Đông Nam Á và Châu Úc [3].
Trên thế giới chi lan Hồng Thảo có khoảng 1400 lồi, chủ yếu phân bố ở
Đông Nam Á và các đảo thuộc Philippine, Malaysia, Indonesia, Papua New
Guinea, Đơng Bắc Australia. Ở Việt Nam có 107 loài và 1 thứ, phân bố ở các
vùng núi từ Bắc vào Nam và một số đảo ven biển. Các đại diện của chi Hoàng
Thảo chủ yếu sống phụ sinh trên thân hoặc các cành cây ở trong rừng hoặc

trên các hốc mùn trên đá, chúng thƣờng mọc ở nơi ẩm, với độ cao 500 - 1500
m so với mực nƣớc biển, cũng có khi gặp chi lan này mọc ở độ cao 200m
hoặc tới 2000 m so với mực nƣớc biển.
1.1.2. Đặc điểm hình thái
Lan Dendrobium có thể chia thành hai nhóm theo dạng thân của chúng:
- Dạng thịng (Nobile) là dạng thân mền thƣờng ở vùng có khí hậu mát
mẻ, hoa đƣợc tạo ra từ chồi sơ khởi của giả hành đã trƣởng thành, gồm: Giả
hạc, Hạc vĩ, Long tu, Phi điệp vàng…
- Dạng đứng (Phalaenopsis) là dạng thân cứng thƣờng sống ở vùng khí
hậu nóng hơn, hoa đƣợc mọc ở giả hành cú lẫn giả hành mới. Ở giả hành mới,


4

chồi non nhất ở ngọn là chồi đầu tiên phát triển thành vịi hoa, gồm: Nhất
điểm hồng, Nhất điểm hồng, Báo hỉ, Ý thảo, Thủy tiên…
Chi Hồng thảo có một số đặc điểm sau:
- Thân: Chi lan Hoàng Thảo là cây thân thảo mọc cụm, thẳng đứng
hoặc rủ thõng, phân đốt, sống phụ sinh trên các cây gỗ hoặc số ít các loài sống
bám trên đá, trong rừng ẩm. Chi này thuộc nhóm đa thân với nhiều giả hành,
vừa có thân thật vừa có giả hành. Giả hành tuy là thân nhƣng lại chứa diệp
lục, dự trữ nƣớc và nhiều chất dinh dƣỡng cần thiết cho sự phát triển giả hành
mới. Đa số các củ giả hành có màu xanh nên nó đã cùng với lá làm nhiệm vụ
quang hợp [3].
Thân của các đại diện chi Hoàng Thảo đều phân đốt, hình trụ, hình con
suốt, hình chùy...Có chiều dài từ 2 - 3cm đến 120 cm. Lát cắt ngang thân có
thể là hình trịn, bầu dục, đơi khi hình 4 cánh thay đổi từ 0,3 - 1,5 cm. Phần
gốc, nơi xuất phát của rễ thƣởng nhỏ mảnh nhƣng cũng có thể phình to [4].
- Rễ: Rễ của các đại diện chi Hồng Thảo là rễ khí sinh, mảnh, hình
trụ, màu xanh và chuyển thành nâu khi già, chúng thƣờng ôm lấy giá thể hoặc

bng thõng xuống. Ở một số lồi đƣợc bao bọc bởi lớp mô hút ẩm dày bao
gồm cả những lớp tế bào chết chứa đầy khơng khí do đó có ánh lên màu xám
bạc. Chiều dài rễ từ 0,1 - 0,3 cm; rễ thƣờng mọc từ phần gốc của thân hoặc có
thể ở mấu thân một vài lồi.
- Lá: Lá mọc thành hai dãy so le, khơng có cuống mà chỉ có bẹ ơm lấy
thân. Lá thƣờng cứng, dạng đa bóng, bề mặt thƣờng nhẵn, đơi khi bề mặt và
bẹ lá (thƣờng khi lá non) có phủ lông cứng ngắn màu đen sớm rụng [4].
- Cụm hoa: Cụm hoa chùm thƣờng nhiều hoa hoặc ít hoa. Cụm hoa dài
thƣờng rũ thõng xuống, nhiều lồi hoa có giá trị làm cảnh [4].
- Hoa: Hoa lƣỡng tính, đối xứng hai bên. Màu sắc hoa đa dạng, sặc sỡ.
Hoa đa số có lồi có hƣơng thơm. Bao hoa chia hai vịng. Vịng ngồi gồm
một lá đài giữa và hai lá đài bên. Vịng trong gồm có hai cánh hoa và một
cánh môi [4].


5

- Cằm: Là một bộ phận đƣợc hình thành nhờ mép phần gốc hai lá đài
bên dính nhau và dính với chân cột. Cằm có các hình bán cầu, hình túi đến
hình cựa, hình trụ cong ít nhiều [4].
- Cánh môi: Cánh môi khác nhiều so với các thành phần cịn lại của
bao hoa cả về màu sắc, kích thƣớc và trang trí. Trang trí đa dạng trên cánh
mơi nhƣ đốm, vạch, diềm tua, u lồi, đƣờng sống, lông phủ chiếm vị trí khá
quan trọng trong phân loại. Nhiều lồi có gốc cánh mơi dính với chân cột tạo
thành cựa [4].
- Quả: Quả nang thƣờng hình chạy hoặc hình con suốt, chứa rất nhiều
hạt nằm xen lẫn những sợi lông mảnh. Hạt rất nhỏ, hầu nhƣ không trọng
lựợng, bao quanh hạt là lớp màng dạng mắt võng, trong suốt chứa đầy khơng
khí dễ dàng bay cùng hạt trong khơng khí nhờ gió [4].
- Hạt: Một quả chứa từ 10.000 đến 100.000 hạt, đôi khi đến 3 triệu hạt

nên hạt lan có kích thƣớc rất nhỏ, phơi hạt chƣa phân hóa. Sau 12 - 18 tháng
hạt chín phát tán nhờ gió. Khi gặp nấm cộng sinh tƣơng thích trong điều kiện
phù hợp hạt sẽ nảy mầm [4].
1.1.3. Lan Hoàng Thảo Kèn (D. lituiflorum)
Hoàng Thảo Kèn tên khoa học là Dendrobium Lituiflorum.
Phong lan biểu sinh trong rừng lá rộng trên thân cây có độ cao khoảng
300 -1600 m, phát triển trong nhiệt độ mát đến ấm nóng, lồi Kèn có khả
năng chịu lạnh xuống đến 1,2 ºC. Chúng cần ánh sáng trung bình, khơng ƣa
ánh nắng trực tiếp.
Thân cây dài 50 - 80 cm mềm mại rủ xuống, hình trụ,căng trịn, nhẳn
bóng, thon nhọn dần về phía đầu ngọn, đơi khi đốt thân thắt hình thoi rất nhẹ.
Lá hẹp, thn dài, dẻo dai rụng vào mùa thu. Hoa mang sắc tím quyến rũ biến
thiên từ nhạt đếm sậm, mơi hoa hình chiếc kèn, vành mơi trắng.
Hồng Thảo Kèn rất sai hoa, nở nhiều hoa to 6 - 7 cm, mọc từng chùm
2 - 3 chiếc trên 1 mắt ở các đốt giữa thân đến ngọn, phát sinh từ thân cây trụi
lá cũ. Cây nở hoa từ cuối mùa đông đến mùa xuân, rất thơm và lâu tàn. Hoàng
Thảo Kèn cần nhiều ẩm và phân bón trong lúc phát triển thân non, chỉ để khô


6

khi cây đã ngừng phát triển. Kèn thuộc loại dễ trồng, nhƣng điều đó cịn phụ
thuộc vào thời tiết vùng miền. Hồng Thảo Kèn nhìn xa rất giống với
Den.anosmum vì màu tím trầm na ná nhƣng thực tế so sánh nhau thì hình
dáng khác biệt hồn tồn, Giả Hạc kiêu sa, Kèn quyến rũ.
Hoàng Thảo Kèn là một trong những loại lan tuyệt đẹp và quý hiếm.
Ngoài tự nhiên bây giờ rất khó cịn tìm thấy do bị săn lùng quá nhiều vì vẻ
đẹp của chúng. Ở một số nơi trên thế giới nó cịn đƣợc đƣa vào diện đƣợc bảo
vệ nghiêm ngặt. Nƣớc ta may mắn là một trong những vùng đất đƣợc tạo hóa
ban cho lồi Hồng Thảo Kèn, nếu khơng có biện pháp bảo vệ kịp thời có thể

lâm vào nguy cơ tuyệt chủng ngồi tự nhiên. Ngƣời ta đã tính đến chuyện
ni cấy mơ đại trà cho loài này để giảm tải sự săn lùng chúng trên rừng...
1.2. Kĩ thuật nhân giống bằng nuôi cấy mô - tế bào thực vật
1.2.1. Khái niệm
Kỹ thuật nuôi cấy mô - tế bào thực vật hay nhân giống in vitro đều là
thuật ngữ mô tả các phƣơng pháp nuôi cấy các bộ phận thực vật (tế bào đơn,
mô, cơ quan) trong ống nghiệm có chứa mơi trƣờng dinh dƣỡng thích hợp
nhƣ muối khống, vitamin, đƣờng và các chất điều hịa sinh trƣởng thực vật
trong điều kiện vơ trùng. Kỹ thuật nuôi cấy mô - tế bào thực vật cho phép tái
sinh chồi hoặc cơ quan từ các mô nhƣ lá, thân, hoa, rễ, củ hoặc đỉnh sinh
trƣởng. Trƣớc kia ngƣời ta dùng phƣơng pháp này để nghiên cứu các đặc tính
cơ bản của tế bào nhƣ sự phân chia, đặc tính di truyền và ảnh hƣởng của các
hóa chất đối với tế bào và mơ trong q trình ni cấy. Hiện nay, các nhà
khoa học sử dụng hệ thống nuôi cấy mô thực vật để nghiên cứu tất cả các vấn
đề có liên quan đến thực vật nhƣ sinh lý học, hóa sinh học, di truyền học và
cấu trúc thực vật. Kỹ thuật nuôi cấy mô - tế bào thực vật cũng mở rộng tiềm
năng nhân giống vơ tính đối với các lồi cây trồng quan trọng, có giá trị về
mặt kinh tế và thƣơng mại trong đời sống hàng ngày của con ngƣời.


7

1.2.2. Lịch sử phát triển của kỹ thuật nhân giống bằng nuôi cấy mô - tế bào
thực vật
Năm 1902, nhà thực vật học ngƣời Đức Gottlied Haberlandt lần đầu
tiên đƣa ra ý tƣởng cấy mơ của sinh vật ra ngồi cơ thể nhƣng những thí
nghiệm của Haberlandt khi đó với các tế bào mơ mềm biểu bì đã bị thất bại do
chúng không thể phân chia đƣợc [10]. Năm 1922, Kotte là học trò của
Haberlandt cùng với Robbins đã lặp lại thí nghiệm của Haberlandt với đỉnh
sinh trƣởng tách từ đầu rễ một cây hịa thảo (cây ngơ). Hai tác giả đã nuôi

đƣợc trong một thời gian ngắn (12 ngày) trên mơi trƣờng lỏng có chứa đƣờng
glucozơ và muối khống thu đƣợc hệ rễ nhỏ [10]. Năm 1934, bắt đầu giai
đoạn thứ 2 của lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật khi White (ngƣời Mỹ) đã
duy trì đƣợc sinh trƣởng của đầu rễ cà chua trong một thời gian khá dài, trên
mơi trƣờng lỏng có chứa đƣờng, một số muối khoáng và dịch chiết nấm men
[10]. Trong thời gian 1941 - 1952, nhiều chất điều kích thích sinh trƣởng
thuộc nhóm Auxin đƣợc ni cấy và tổng hợp thành công: axit naphthalen
axetic (NAA), axit 2,4 D - dichlorophenoxy axetic (2,4 D)…Năm 1954,
Skoog và Miller đã phát hiện ra các hợp chất có thể điều khiển sự nhân chồi.
Skoog phát hiện chế phẩm thuỷ phân của tinh dịch cá bẹ kích thích sinh
trƣởng rõ rệt trong ni cấy các mảnh mơ thân cây thuốc lá. Một năm sau,
chất đó đƣợc tổng hợp thành công và đƣợc Skoog gọi là kinetin có tác dụng
kích thích sự phân bào. Skoog và Miller đã chứng minh sự biệt hóa của rễ,
chồi trong nghiên cứu nuôi cấy mô tủy thuốc lá phụ thuộc vào nồng độ tƣơng
đối của auxin/cytokinin và từ đó đƣa ra quan niệm điều khiển hoocmon trong
quá trình hình thành cơ quan ở thực vật. Thành công của Skoog và Miller dẫn
đến nhiều phát hiện quan trọng, mở đầu cho giai đoạn thứ 3 của nuôi cấy mô
tế bào thực vật. Năm 1962, Murashige và Skoog đã cải tiến môi trƣờng nuôi
cấy, đánh dấu một bƣớc tiến trong kỹ thuật nuôi cấy mô.
Môi trƣờng của họ đã đƣợc dùng làm cơ sở cho việc ni cấy nhiều loại
cây và vẫn cịn đƣợc sử dụng rộng rãi cho đến nay [10]. Trong khoảng thời
gian từ 1954 - 1959, kỹ thuật nuôi cấy tế bào đơn đã đƣợc phát triển và hoàn


8

thiện dần. Melcher và Beckman đã nuôi cấy các tế bào đơn trong các bình
dung tích lớn có sục khí và bổ sung chất dinh dƣỡng định kỳ. Khả năng nuôi
cấy các tế bào thực vật và tái tạo đƣợc cây hoàn chỉnh từ tế bào đã mở ra
những triển vọng mới cho chọn dòng đột biến, sản xuất các chất trao đổi thứ

cấp...Năm 1960 - 1964, Morel cho rằng có thể nhân giống vơ tính địa lan
bằng ni cấy đỉnh sinh trƣởng và đã tạo ra đƣợc các protocom từ địa lan. Từ
kết quả đó, lan đƣợc xem là cây ni cấy mơ đầu tiên đƣợc thƣơng mại hóa.
Năm 1966, Guha & cộng sự đã tạo đƣợc cây đơn bội từ nuôi cấy túi phấn cây
cà độc dƣợc. Sau đó Bourin & Nitsch (1967) cũng thành cơng với cây thuốc
lá. Việc tạo cây đơn bội thành công ở nhiều lồi thực vật thơng qua ni cấy
bao phấn và hạt phấn đóng góp rất lớn cho các nghiên cứu di truyền và lai tạo
giống. Từ những năm 1970 trở đi, các nhà khoa học đã chú ý vào triển vọng
của kỹ thuật nuôi cấy protoplast, khi 2 tác giả ngƣời Nhật là Nagata và
Takebe đã thành công trong việc làm cho protoplast thuốc lá tái tạo đƣợc
cellulose. Melchers và cộng sự (1978) đã lai tạo thành công protoplast của cà
chua với protoplast của khoai tây, mở ra một triển vọng mới trong lai xa ở
thực vật. Ngoài ra, trong những điều kiện nhất định, các protoplast có khả
năng hấp thụ các phân tử lớn, hoặc các cơ quan tử từ bên ngồi, do đó chúng
là những đối tƣợng lý tƣởng cho các nghiên cứu về di truyền thực vật [10]. Từ
đó đến nay, cơng nghệ ni cấy mơ - tế bào thực vật đã đƣợc phát triển với
tốc độ nhanh trên nhiều cây khác và đƣợc ứng dụng rộng rãi trong nhân giống
nhiều lồi thực vật, chọn dịng chống chịu, lai xa, chuyển gen ở thực vật…
1.2.3. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô - tế bào thực vật
1.2.3.1. Tính tồn năng của tế bào
Gottlibeb Haberlant (1902) - nhà thực vật học ngƣời Đức đã đặt nền
móng đầu tiên cho ni cấy mơ tế bào thực vật. Ơng đã đƣa ra giả thuyết về
tính tồn năng của tế bào trong cuốn sách "Thực nghiệm về nuôi cấy tách
rời". Theo ông: “Tế bào bất kỳ của cơ thể sinh vật nào cũng đều mang tồn bộ
lƣợng thơng tin di truyền (DNA) cần thiết và đủ của cả sinh vật đó. Khi gặp
điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cá thể hoàn


9

chỉnh” [10]. Tính tồn năng của tế bào mà Haberlandt nêu ra chính là cơ sở lý
luận của phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật. Cho đến ngày nay, các
nhà khoa học đã chứng minh đƣợc khả năng tái sinh một cơ thể thực vật hoàn
chỉnh từ một tế bào riêng rẽ.
1.2.3.2. Sự phân hóa và phản phản hóa
Sự phân hóa tế bào là sự chuyển hóa các tế bào thành các mơ chun
hóa, đảm nhận các chức năng khác nhau trong cơ thể. Tuy nhiên, khi tế bào
đã phân hóa thành mơ chức năng chúng hồn tồn mất khả năng phân chia
của mình. Trong những điều kiện mơi trƣờng thích hợp, chúng lại có thể trở
về dạng tế bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ nhƣ tế bào hợp tử ban đầu và
cho ra các tế bào mới có khả năng tái sinh thành cây hồn chỉnh. Q trình đó
đƣợc gọi là sự phản phân hóa tế bào. Về bản chất thì sự phân hóa và phản
phân hóa là một q trình điều hồ hoạt hóa gen. Tại một thời điểm nào đó
trong q trình phát triển của cá thể có một số gen đƣợc hoạt hóa (mà vốn
trƣớc đây bị hạn chế) để tạo ra tính trạng mới, một số gen khác lại bị đình chỉ
hoạt động. Điều này xảy ra theo một chƣơng trình đã đƣợc mã hóa trong cấu
trúc của phân tử DNA ở mỗi tế bào. Mặt khác khi cho tế bào nằm trong một
khối mô của cơ thể thƣờng bị ức chế bởi các tế bào xung quanh. Khi tách
riêng từng tế bào hoặc giảm kích thƣớc của khối mơ sẽ tạo điều kiện thuận lợi
cho sự hoạt hóa các gen của tế bào, q trình hoạt hóa sẽ đƣợc xảy ra theo
một cấu trúc nhất định sẵn có trong bộ gen đó.
1.2.4. Các giai đoạn trong kỹ thuật nhân giống in vitro
Q trình ni cấy in vitro đƣợc chia ra 5 giai đoạn:
* Giai đoạn 1: Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ
Trƣớc khi tiến hành nhân giống in vitro cần chọn lọc cẩn thận các cây
mẹ (cây cho nguồn mẫu nuôi cấy). Các cây này phải sạch bệnh, đặc biệt là
bệnh virus và ở giai đoạn sinh trƣởng mạnh. Việc trồng các cây mẹ trong điều
kiện mơi trƣờng thích hợp với chế độ chăm sóc và phịng trừ sâu bệnh hiệu
quả trƣớc khi lấy mẫu cấy sẽ làm giảm tỷ lệ mẫu nhiễm, tăng khả năng sống
và sinh trƣởng của mẫu cấy in vitro.

10

* Giai đoạn 2: Nuôi cấy khởi động
Là giai đoạn khử trùng đƣa mẫu vào nuôi cấy in vitro. Giai đoạn này
cần đảm bảo các yêu cầu: tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại và sinh
trƣởng tốt. Khi lấy mẫu cần chọn đúng loại mô, đúng giai đoạn phát triển của
cây. Quan trọng nhất là đỉnh chồi ngọn, đỉnh chồi nách và sau đó là đỉnh chồi
hoa, cuối cùng là đoạn thân, mảnh lá…Chồi ngon, chồi nách đƣợc sử dụng để
nhân nhanh các cây: măng tây, dứa, khoai tây, thuốc lá, hoa cúc…ở súp lơ thì
dung hoa tự non, ở bầu bí các mảnh lá mầm là ngun liệu ni cấy thích hợp
để nhân nhanh in vitro. Chồi non nảy mầm từ hạt cũng có thể đƣợc sử dụng
làm mẫu cấy.
* Giai đoạn 3: Nhân nhanh
Là giai đoạn kích thích mơ ni cấy phát sinh hình thái và tăng nhanh
số lƣợng thông qua các con đƣờng: hoạt hóa chồi nách, tạo chồi bất định, tạo
phơi vơ tính. Phải xác định đƣợc mơi trƣờng và điều kiện ngoại cảnh thích
hợp để có hiệu quả là cao nhất. Nếu mơi trƣờng có nhiều cytokinin sẽ kích
thích tạo chồi. Điều kiện nuôi cấy thƣờng là 25 - 27 0C và 16 giờ chiếu
sáng/ngày, cƣờng độ ánh sáng 2000 - 4000 lux. Tuy nhiên đối với mỗi loại
đối tƣợng nuôi cấy địi hỏi có chế độ ni cấy khác nhau: nhân nhanh súp lơ
cần quang chu kì chiếu sáng 9 giờ/ngày, nhân nhanh phong lan phalenopsis ở
giai đoạn đầu cần che tối.
* Giai đoạn 4: Tạo cây in vitro hoàn chỉnh
Để tạo rễ cho chồi, ngƣời ta chuyển chồi từ môi trƣờng nhân nhanh
sang môi trƣờng tạo rễ. Môi trƣờng tạo rễ thƣờng đƣợc bổ sung một lƣợng
nhỏ Auxin. Một số chồi có thể phát sinh rễ ngay sau khi chuyển từ môi trƣờng
nhân nhanh giàu cytokinin sang môi trƣờng khơng chứa chất điều hịa sinh
trƣởng.

* Giai đoạn 5: Thích ứng cây in vitro ngoài điều kiện tự nhiên
Để đƣa cây từ ống nghiệm ra vƣờm ƣơm với tỷ lệ sống cao, cây sinh
trƣởng tốt cần đảm bảo một số yêu cầu: Cây trong ống nghiệm đã đạt đƣợc
những tiêu chuẩn hình thái nhất định (số lá, số rễ, chiều cao cây). Cây con cao


11

5 - 7 cm và có từ 3 - 4 lá có thể chuyển sang cấy vào bầu đất mùn vơ trùng có
bổ sung các chất dinh dƣỡng. Có giá thể tiếp nhận cây in vitro thích hợp: giá
thể sạch, tơi xốp, thoát nƣớc. Phải chủ động điều chỉnh đƣợc độ ẩm, sự chiếu
sáng của vƣờm ƣơm, cũng nhƣ có chế độ dinh dƣỡng phù hợp [8].
1.2.5. Các điều kiện nuôi cấy in vitro
1.2.5.1. Điều kiện vô trùng
Đây là điều kiện tiên quyết đối với thành cơng của q trình ni cấy in
vitro. Nếu trong q trình ni cấy khơng đảm bảo điều kiện vơ trùng thì mẫu
sẽ bị nhiễm nấm, khuẩn.
* Vô trùng dụng cụ và môi trƣờng: Để vơ trùng dụng cụ và mơi trƣờng
ni cấy, có thể sử dụng một trong các phƣơng pháp sau:
- Khử trùng khô: Phƣơng pháp này chỉ dùng cho các dụng cụ bằng kim
loại, thuỷ tinh, các dụng cụ có tính chịu nhiệt. Các dụng cụ trƣớc khi đem sấy
phải đƣợc gói kín bằng giấy nhơm và chỉ đƣợc mở trong tủ cấy vơ trùng.
Thiết bị dùng khử trùng khơ là lị sấy, tủ sấy, nhiệt độ thƣờng dùng là 1210C 180 0C, trong 90 - 120 phút.
- Khử trùng ƣớt: Là phƣơng pháp áp dụng hiệu quả và phổ biến trong
vô trùng môi trƣờng và các dụng cụ nuôi cấy. Thiết bị sử dụng là nồi hấp vô
trùng, nhiệt độ thƣờng dùng ở 121 0C.
- Màng lọc: Dùng để loại bỏ các tác nhân gây nhiễm có kích thƣớc
0,025 - 10 µm khỏi môi trƣờng nuôi cấy, nƣớc cất... Đây là phƣơng pháp phù
hợp với các môi trƣờng mà thành phần của chúng bị phân huỷ ở nhiệt độ cao.
* Vô trùng mẫu cấy: Với các loại mẫu cấy khác nhau hoặc cùng loại

mẫu cấy nhƣng ở các vị trí khác nhau... thì phƣơng pháp khử trùng mẫu cấy là
khác nhau. Phƣơng pháp phổ biến trong vô trùng mẫu cấy hiện nay là sử dụng
hóa chất có khả năng tiêu diệt vi sinh vật nhƣ cồn 700, các chất làm giảm sức
căng bề mặt nhƣ Tween 20, Tween 80, fotoflo, teepol, thủy ngân hoặc các
chất kháng sinh,… Hiệu quả khử trùng phụ thuộc vào loại, nồng độ, thời gian
xử lý hóa chất khử trùng. Một hóa chất đƣợc lựa chọn để vô trùng phải đảm


12

bảo 2 thuộc tính: Có khả năng diệt vi sinh vật tốt và khơng hoặc ít ảnh hƣởng
mẫu thực vật [10].
1.2.5.2. Ánh sáng và nhiệt độ.
Các mẫu nuôi cấy thƣờng đƣợc đặt trong những phịng ni ổn định về
ánh sáng và nhiệt độ. Tất cả các trƣờng hợp nuôi cấy đều cần có ánh sáng trừ
một số trƣờng hợp ni cấy tạo mơ sẹo, nhƣng q trình nhân giống của
chúng cũng cần có ánh sáng. Nhiệt độ của các phịng ni cây thƣờng đƣợc
duy trì từ 25 - 28 0C nhờ các máy điều hồ nhiệt độ.
1.2.6. Mơi trường ni cấy in vitro
1.2.6.1. Thành phần của môi trường
Thành phần môi trƣờng nuôi cấy mô - tế bào thay đổi tuỳ theo lồi thực
vật, loại tế bào, mơ và cơ quan nuôi cấy. Đối với cùng một loại mô, cơ quan
nhƣng mục đích ni cấy khác nhau thì mơi trƣờng ni cấy khác nhau cũng
khá cơ bản. Môi trƣờng nuôi cấy còn thay đổi theo giai đoạn sinh trƣởng và
phát triển của mẫu cấy. Mặc dù có sự đa dạng về thành phần các chất nhƣng
môi trƣờng nuôi cấy đều gồm các thành phần sau:
* Thành phần vô cơ: Bao gồm các muối khoáng (đa lƣợng và vi lƣợng)
đƣợc bổ sung vào mơi trƣờng ni cấy.
- Trong muối khống đa lƣợng, các nguyên tố cần phải cung cấp là:
Nitơ, phospho, kali và sắt.

+ Nitơ vô cơ đƣợc đƣa vào môi trƣờng ở hai dạng nitrat (NO3-) với
hàm lƣợng ≈ 25 mM và amon (NH4+) với hàm lƣợng từ 2 - 20 mM.
+ Phospho thƣờng đƣợc đƣa vào môi trƣờng ở dạng muối phosphat, hai
loại hợp chất hay đƣợc dùng nhất là NaH2PO4 và KH2PO4. Hàm lƣợng
phospho trong môi trong môi trƣờng nuôi cấy từ 0,15 - 0,40 mM.
+ Kali đƣợc cung cấp cho môi trƣờng nuôi cấy dƣới dạng KNO3, KCl
và KH2PO4. Nồng độ kali sử dụng từ 2 - 25 mM.
- u cầu về muối khống vi lƣợng của mơ thực vật trong ni cấy khá
phức tạp và ít đƣợc nghiên cứu. Chúng cần thiết để thúc đẩy sự sinh trƣởng và
phát triển của mẫu nuôi cấy. Đây là những nguyên tố đƣợc sử dụng ở nồng độ


13

nhỏ hơn 30 ppm, chúng đóng vai trị quan trọng trong các hoạt động của
enzyme.
+ Fe: thiếu Fe làm giảm ARN, protein nhƣng lại làm tăng ADN và các
axit amin tự do làm cho các tế bào không phân chia.
+ Bo: thiếu Bo trong môi trƣờng nuôi cấy thƣờng gây lên biểu hiện
thừa Auxin. Mơ ni cấy có biểu hiện tạo mơ sẹo hóa mạnh nhƣng thƣờng là
mơ xốp, mọng nƣớc, kém tái sinh...
* Thành phần hữu cơ
- Vitamin, aminoaxit, amit, myo - inositol:
+ Vitamin: Các vitamin hay đƣợc sử dụng là các vitamin nhóm B (B1,
B3, B6), ngồi ra mơi trƣờng ni cấy cịn sử dụng một số vitamin khác nhƣ
vitamin H, vitamin M, vitamin B2, vitamin C, vitamin E... với các nồng độ
khác nhau.
+ Myo-inositol là một loại đƣờng - rƣợu liên quan đến quá trình tổng
hợp phospholipit, pectin của thành tế bào và các hệ thống màng trong tế bào,
tham gia vào dinh dƣỡng khoáng, vận chuyển đƣờng và trao đổi

hydratcacbon. Hàm lƣợng sử dụng là 100 mg/l môi trƣờng [7].
+ Các aminoaxit và amit: Đối với nhiều loại mẫu nuôi cấy, môi trƣờng
phải đƣợc bổ sung các aminoaxit, amit... vì chúng có vai trị quan trọng trong
phát sinh hình thái. Theo Skoog & Milles (1957) tất cả các dạng tự nhiên của
aminoaxit (dạng L) dễ dàng đƣợc mô nuôi cấy hấp thụ, L-arginin dùng cho
nuôi cấy rễ, L- tyrolin dùng cho nuôi cấy chồi, L- serin dùng cho nuôi cấy hạt
phấn. Nồng độ sử dụng mỗi loại 10 - 100 mg/l [7].
- Thành phần hữu cơ phức hợp: Đƣợc dùng trong môi trƣờng nuôi cấy
để cung cấp thêm nitơ hữu cơ, aminoaxit, vitamin và các khoáng chất...Chúng
đƣợc sử dụng khi mơi trƣờng khống xác định khơng đạt kết quả mong muốn
về sinh trƣởng và phát triển của mẫu nghiên cứu. Một số chất đƣợc sử dụng
phổ biến là: Cazein thuỷ phân, dịch chiết nấm men, dịch chiết hoa, củ, quả,...
* Các chất điều hoà sinh trƣởng


14

Các chất điều hồ sinh trƣởng là thành phần khơng thể thiếu đƣợc trong
mơi trƣờng ni cấy, có vai trị quan trọng trong phát sinh hình thái thực vật
in vitro. Hiệu quả tác động của chất điều hoà sinh trƣởng phụ thuộc vào loại
và nồng độ chất điều hoà sinh trƣởng sử dụng trong ni cấy.
- Nhóm Auxin: Đƣợc đƣa vào môi trƣờng nuôi cấy nhằm thúc đẩy sự
sinh trƣởng và giãn nở tế bào, tăng cƣờng các quá trình sinh tổng hợp và trao
đổi chất, kích thích sự hình thành rễ và tham gia cảm ứng phát sinh phôi vơ
tính... (Epstein&cs, 1989).
Các loại auxin thƣờng sử dụng cho ni cấy:
+ IAA (Indole acetic acid)
+ IBA (Indole butyric acid)
+ NOA (Naphthoxy acetic acid)
+ α- NAA (α- Naphthalene acetic acid) + 2.4 D (2.4 diclorophenoxy

acetic acid)... IAA ít sử dụng do kém bền với nhiệt và ánh sáng, nếu dùng thì
ở hàm lƣợng cao 1,0 - 3,0 mg/l (Dodds & Robert, 1999). Các auxin khác có
hàm lƣợng sử dụng từ 0,1 - 2,0 mg/l.
- Nhóm Cytokinin: Kích thích sự phân chia tế bào, sự hình thành và
sinh trƣởng của chồi in vitro (Miller, 1962). Các cytokinin có biểu hiện ức chế
sự tạo rễ và sinh trƣởng của mơ sẹo nhƣng có ảnh hƣởng dƣơng tính rõ rệt
đến sự phát sinh phơi vơ tính của mẫu ni cấy. Các loại cytokinin thƣờng
dùng trong nuôi cấy mô là:
+ Zeatin (6-[4-hydroxy-3-metyl-but-2-enylamino] purine).
+ Kinetin (6-furfurylamino purine) + BAP (Bezylamino purine).
+ TDZ (Thidiazuzon).
Hàm lƣợng sử dụng của các Cytokinin dao động từ 0,1 - 2,0 mg/l. Ở
những nồng độ cao hơn, nó có tác dụng kích thích rõ rệt đến sự hình thành
chồi nách, đồng thời ức chế mạnh sự tạo rễ của chồi nuôi cấy. Trong các loại
cytokinin nói trên, kinetin và BAP là hai loại đƣợc sử dụng rộng rãi hơn cả.
Đa số các trƣờng hợp phải sử dụng phối hợp cả auxin và cytokinin ở những tỷ
lệ khác nhau.


15

- Nhóm Gibberellin: Ngồi hai nhóm chính là auxin và cytokinin, trong
ni cấy mơ ngƣời ta cịn sử dụng thêm Gibberellin để kích thích kéo dài tế
bào, qua đó làm tăng kích thƣớc của chồi ni cấy...GA3 là loại Gibberellin
đƣợc sử dụng thƣờng xuyên nhất. Tuy nhiên do mẫn cảm với nhiệt độ nên
phải lọc qua màng lọc vô trùng rồi mới đƣa vào môi trƣờng.
* Nguồn cacbon Các mẫu ni cấy thực vật nói chung khơng thể quang
hợp hoặc quang hợp nhƣng ở cƣờng độ rất thấp. Vì vậy phải đƣa thêm những
hợp chất hydratcacbon vào thành phần môi trƣờng nuôi cấy. Loại
hydratcacbon đƣợc sử dụng phổ biến là đƣờng saccharose với hàm lƣợng từ 2

- 6% (W/v). Những loại đƣờng khác nhƣ fructose, glucose, maltose, sorbitol
rất ít dùng. Hàm lƣợng đƣờng thấp đƣợc sử dụng cho nuôi cấy tế bào trần,
ngƣợc lại hàm lƣợng đƣờng cao cần cho nuôi cấy hạt phấn và phôi.
* Các thành phần khác
- Tác nhân tạo gel quyết định trạnh thái vật lý của môi trƣờng nuôi cấy.
Chất tạo gel đƣợc sử dụng phổ biến là agar. Nồng độ agar sử dụng từ 0,5 - 10
% (W/v) tuỳ theo chất lƣợng của chúng và môi trƣờng sử dụng. Khi môi
trƣờng nuôi cấy là mơi trƣờng lỏng hoặc bán lỏng thì khơng hoặc bổ sung rất
ít agar.
- Than hoạt tính đƣợc dùng để hấp thụ các chất màu, các hợp chất
phenol, các sản phẩm trao đổi chất thứ cấp...Trong trƣờng hợp những chất đó
có tác dụng gây ức chế sinh trƣởng của mẫu nghiên cứu. Mặt khác, khi bổ
sung vào môi trƣờng, than hoạt tính làm thay đổi mơi trƣờng ánh sáng do mơi
trƣờng trở nên sẫm vì vậy có thể kích thích q trình tạo rễ, một số trƣờng
hợp cịn có tác dụng thúc đẩy phát sinh phơi vơ tính và kích thích sinh trƣởng
phát sinh cơ quan ở các loài cây gỗ [7]. Nhƣng than hoạt tính lại làm giảm
hiệu quả của các chất điều hoà sinh trƣởng, nồng độ than hoạt tính thƣờng sử
dụng từ 0,2 - 0,3(W/v) [10].
1.2.6.2. pH của môi trường
pH của đa số các môi trƣờng nuôi cấy đƣợc điều chỉnh trong phạm vi
5,5 - 6,0 pH dƣới 5,5 làm agar khó chuyển sang trạng thái gel, cịn pH lớn hơn