Nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến sự phát sinh cơ quan của lan thiên nga (cycnoches chlorochỉon) giai đoạn in vitro

TRƢỜNG ĐẠI HỌC HÙNG VƢƠNG
KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN

---------***---------

TRƢƠNG NGỌC TUẤN

NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG CỦA CHẤT ĐIỀU HÒA
SINH TRƢỞNG ĐẾN SỰ PHÁT SINH CƠ QUAN CỦA LAN
THIÊN NGA (Cycnoches chlorochiron) GIAI ĐOẠN IN VITRO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Ngành: Sƣ phạm Sinh học

PHÚ THỌ, 2019


TRƢỜNG ĐẠI HỌC HÙNG VƢƠNG
KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN

---------***---------

TRƢƠNG NGỌC TUẤN

NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG CỦA CHẤT ĐIỀU HÒA
SINH TRƢỞNG ĐẾN SỰ PHÁT SINH CƠ QUAN CỦA LAN
THIÊN NGA (Cycnoches chlorochiron) GIAI ĐOẠN IN VITRO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Ngành: Sƣ phạm Sinh học
Giáo viên hƣớng dẫn: TS. Trần Trung Kiên

PHÚ THỌ, 2019


LỜI CẢM ƠN
Trong thời gian nghiên cứu và hoàn thành khóa luận, em xin gửi lời cảm
ơn chân thành nhất tới thầy giáo hƣớng dẫn TS. Trần Trung Kiên đã hƣớng dẫn
tận tình, quan tâm và động viên em hồn thành khóa luận.
Em xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc đến các thầy (cô) trong Trung tâm
nghiên cứu Công nghệ sinh học trƣờng Đại học Hùng Vƣơng cùng toàn thể các
thầy cô giáo trong Khoa Khoa học Tự nhiên, Trƣờng Đại học Hùng Vƣơng đã tạo
điều kiện giúp đỡ để em thực hiện và hồn thành khóa luận này.
Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè, những ngƣời đã
luôn bên cạnh động viên, giúp đỡ em trong suốt q trình thực hiện và hồn
thành khóa luận tốt nghiệp này.
Em xin chân thành cảm ơn!
Phú Thọ, ngày tháng 05 năm 2019

Sinh viên

Trƣơng Ngọc Tuấn


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan số liệu và kết quả nghiên cứu trong khóa luận này là của
tơi, các kết quả nghiên cứu đƣợc trình bày trong khóa luận là trung thực. Mọi sự
giúp đỡ cho việc thực hiện khóa luận này đã đƣợc cảm ơn và các thơng tin trích
dẫn trong khóa luận đã đƣợc chỉ rõ nguồn gốc và đƣợc phép công bố.
Phú Thọ, ngày

tháng 05 năm 2019

Sinh viên

Trƣơng Ngọc Tuấn


DANH MỤC VIẾT TẮT

BAP :

Benzylamino purinne

CT

:

Công thức

ĐC

:

Đối chứng

MS

:

Môi trƣờng Murashige & Skoog

MT

:

Môi trƣờng

NAA :

Naphthtalen acetic acid


DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1. Ảnh hƣởng của BAP đến sự phát triển thân, rễ của cây in vitro lan
Thiên nga (Cycnoches chlorochiron) ................................................................ 23
Bảng 3.2. Ảnh hƣởng của BAP đến sự sinh trƣởng phát triển của lá cây in vitro
lan Thiên nga (Cycnoches chlorochiron) .......................................................... 26
Bảng 3.3. Ảnh hƣởng của BAP đến hệ số nhân, đặc điểm chồi của cây in vitro
lan Thiên nga (Cycnoches chlorochiron) .......................................................... 27
Bảng 3.4. Ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh trƣởng NAA đến sự sinh trƣởng
phát triển của cây in vitro lan Thiên nga (Cycnoches chlorochiron) ................. 29
Bảng 3.5. Ảnh hƣởng của NAA đến sự phát sinh lá ở cây in vitro lan Thiên nga
(Cycnoches chlorochiron) ................................................................................ 31
Bảng 3.6. Ảnh hƣởng của NAA đến hệ số nhân chồi ....................................... 33
Bảng 3.7. Tỉ lệ sống sót khi ra cây ................................................................... 34


DANH MỤC HÌNH
Hình 3.1. Ảnh hƣởng của BAP đến sự phát triển thân,rễ của cây in vitro lan
Thiên nga (Cycnoches chlorochiron) ................................................................ 24

Hình 3.2. Ảnh hƣởng của BAP đến sự phát triển của thân ............................... 24
Hình 3.3. Ảnh hƣởng BAP đến sự phát sinh rễ ............................................... 25
Hình 3.4. Ảnh hƣởng của BAP đến sự phát sinh lá .......................................... 26
Hình 3.5. Ảnh hƣởng của BAP đến hệ số nhân chồi ........................................ 28
Hình 3.6. Ảnh hƣởng của NAA đến sự sinh trƣởng phát triển thân, rễ của cây in
vitro lan Thiên nga (Cycnoches chlorochiron).................................................. 29
Hình 3.7. Ảnh hƣởng của NAA đến sự sinh trƣởng phát triển của thân cây ..... 30
Hình 3.8. Ảnh hƣởng của NAA đến sự phát sinh rễ ......................................... 31
Hình 3.9. Ảnh hƣởng của NAA đến sự phát sinh lá ......................................... 32
Hình 3.10. Ảnh hƣởng của NAA đến hệ số nhân chồi...................................... 33
Hình 3.11. Rễ cây sau 1 tuần ra cây ................................................................. 35


MỤC LỤC
PHẦN 1: MỞ ĐẦU ................................................................................................................... 1
1. Tính cấp thiết của đề tài ...................................................................................................... 1
2. Mục tiêu đề tài ........................................................................................................................ 2
3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn ........................................................................... 2
3.1. Ý nghĩa khoa học ................................................................................................................ 2
3.2. Ý nghĩa thực tiễn ................................................................................................................ 2
Phần II: NỘI DUNG ................................................................................................................. 3
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU ............................................... 3
1.1. Giới thiệu chung về chi Thiên nga (Cycnoches ) .................................................... 3
1.1.1. Vị trí phân loại và phân bố ......................................................................................... 3
1.1.2. Đặc điểm hình thái ........................................................................................................ 3
1.1.3.Lan Thiên nga ( Cycnoches chlorochiron). ............................................................ 4
1.2. Kĩ thuật nhân giống bằng nuôi cấy mô - tế bào thực vật ...................................... 5
1.2.1. Khái niệm .......................................................................................................................... 5
1.2.2. Lịch sử phát triển của kỹ thuật nhân giống bằng nuôi cấy mô - tế bào
thực vật .......................................................................................................................................... 6

1.2.3. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô - tế bào thực vật ............................................. 7
1.2.4. Các giai đoạn trong kỹ thuật nhân giống in vitro ............................................... 8
1.2.5. Các điều kiện nuôi cấy in vitro .................................................................................10
1.2.6. Môi trường nuôi cấy in vitro .....................................................................................11
1.2.7. Tầm quan trọng của phương pháp nuôi cấy mô - tế bào thực vật ................15
1.3. Tình hình nghiên cứu lan Thiên nga ...........................................................................15
1.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ..........................................................................15
1.3.2. Tình hình nghiên cứu trong nước ............................................................................16
1.4. Các chất điều hòa sinh trƣởng ......................................................................................18


1.4.1. BAP ( 6- Benzylaminopurine) ...................................................................................18
1.4.2. NAA ( Naphthalene Acetic Acid) ..............................................................................18
1.5. Giá thể ra cây lan Thiên nga (Cycnoches chlorochiron) .....................................18
Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP .......................................19
NGHIÊN CỨU............................................................................................................................19
2.1. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu ...............................................................................19
2.2. Nội dung nghiên cứu .......................................................................................................19
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu ................................................................................................19
2.3.1. Phương pháp luận .........................................................................................................19
2.3.2. Phương pháp bố trí thí nghiệm .................................................................................19
2.3.3. Phương pháp thu thập số liệu ...................................................................................21
2.3.4. Phương pháp xử lý liệu ...............................................................................................22
CHƢƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .................................23
3.1. Ảnh hƣởng của BAP đến sự phát sinh hình thái cây in vitro lan Thiên nga
(Cycnoches chlorochiron) ......................................................................................................23
3.1.1. Ảnh hưởng của BAP đến sự phát sinh thân, rễ của cây in vitro lan Thiên
nga ( Cycnoches chlorochiron) ............................................................................................23
3.1.2. Ảnh hưởng của BAP đến sự sinh trưởng phát triển của lá cây in vitro lan
Thiên nga (Cycnoches chlorochiron) .................................................................................26

3.1.3. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng BAP đến sự phát sinh chồi của
cây in vitro lan Thiên nga (Cycnoches chlorochiron) ...................................................27
3.2. Ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh trƣởng NAA đến sự sinh trƣởng phát
triển của cây in vitro lan Thiên nga ( Cycnoches chlorochiron) ................................28
3.2.1. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng NAA đến sự sinh trưởng phát
triển thân, rễ của cây in vitro lan Thiên nga ( Cycnoches chlorochiron) ..............28
3.2.2. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng NAA đến sự phát sinh lá của
cây in vitro lan Thiên nga (Cycnocheschlorochiron) ....................................................31


3.2.3. Ảnh hưởng của NAA đến hệ số nhân chồi, đặc điểm chồi của cây in vitro
lan Thiên nga (Cycnoches chlorochiron) ..........................................................................33
3.3. Ảnh hƣởng của giá thể đến tỉ lệ sống sót của lan Thiên nga (Cycnoches
chlorochiron) khi ra cây ..........................................................................................................34
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..............................................................................................36
1. Kết luận....................................................................................................................................36
2. Kiến nghị .................................................................................................................................36
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................................37


1

PHẦN 1: MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Họ lan hay phong lan (Orchidaceae) là một trong những họ thực vật lớn
nhất với khoảng trên 35.000 loài phân bố rộng rãi trên toàn thế giới
(Dressler1993). Đây là họ hoa đẹp và thƣờng có hƣơng thơm nên rất đƣợc ƣa
chuộng. Việt Nam là một quốc gia thuộc vùng khí hậu nhiệt đới thích hợp cho
sự phát triển của các lồi phong lan. Theo cuốn Phong lan Việt Nam của Trần
Hợp thì Việt Nam có 137 - 140 chi với trên 1000 loài [3] . Trong những năm gần

đây, đời sống kinh tế đƣợc nâng cao, nhu cầu về thƣởng thức hoa của ngƣời Việt
Nam ngày càng đƣợc quan tâm và phát triển, chính vì vậy việc cung cấp cây lan
giống cho thị trƣờng ngày càng đƣợc quan tâm. Tuy nhiên, các giống hoa lan
phổ biến trên thị trƣờng nƣớc ta hiện nay chủ yếu là do nhập ngoại từ Thái Lan,
Đài Loan, Trung Quốc.., việc tự nhân giống để cung cấp cho thị trƣờng trong
nƣớc vẫn còn nhiều hạn chế. Lan rừng rực rỡ sắc màu nhƣ những giống lan
ngoại nhập nhƣng lại có vẻ đẹp tự nhiên và phần lớn có hƣơng thơm vì vậy ln
đƣợc ƣa chuộng đối với những ngƣời chơi lan. Thế giới lan rừng rất phong phú
với nhiều chủng loại trong đó phải kể đến chi Cycnoches chlorochilon (lan
Thiên nga)
Lan Thiên nga (Cycnoches chlorochilon) là loại hoa rất đẹp và quý hiếm
lan Thiên nga là loại lan biểu sinh trong rừng lá rộng trên thân cây ở độ cao
khoảng 300 - 1600m, phát triển trong nhiệt độ mát đến ấm nóng. Tại Việt Nam,
cây có mặt ở miền Bắc. Lan Thiên nga rất sai hoa, nở nhiều hoa to 6 - 7 cm, mọc
từng chùm, mỗi bơng hoa có hình giống nhƣ một chú chim thiên nga. Hiện nay,
Lan Thiên nga rất ít đƣợc tìm thấy trong tự nhiên do bị thu mua và khai thác ráo
riết. Ngƣời chơi hoa ai cũng muốn sở hữu lan Thiên nga trong vƣờn khiến giá
thành của lan Thiên nga tự nhiên bị đẩy lên rất cao và trở thành loài ngày càng
bị săn lùng khai thác nhiều hơn đến cạn kiệt.Việc nhân giống lan Thiên nga theo
phƣơng pháp truyền thống rất chậm không đáp ứng đủ nhƣ cầu ngƣời chơi.


2

Ngày nay cùng với sự phát triển của công nghệ sinh học thì nhân giống
(in vitro) là cơng cụ đắc lực trong việc bảo tồn và phát triển các loài lan q
hiếm. Trong nhân giống in vitro, ngồi mơi trƣờng nuôi cấy cơ bản, ngƣời ta
thƣờng bổ sung thêm vào mơi trƣờng ni cấy các vitamin, các chất điều hịa
sinh trƣởng, đƣờng, than hoạt tính, nuớc ép các loại hoa quả nhƣ: chuối, nƣớc
dừa, khoai tây…chúng có ảnh hƣởng rất lớn đến hệ số nhân và chất lƣợng của

chồi, cũng nhƣ có ảnh hƣởng lớn tới khả năng phát sinh cơ quan.
Đã có nhiều các cơng trình nghiên cứu về ảnh hƣởng của các chất điều
hòa sinh trƣởng trong việc nhân giống in vitro của nhiều loài lan nhƣ Đai châu
hay Hồng thảo, tuy nhiên các cơng trình nghiên cứu về lan Thiên nga tại Việt
Nam và trên thế giới vẫn cịn rất ít và chƣa đầy đủ. Chính vì vậy chúng tôi lựa
chọn thực hiện đề tài “ Nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng
đến sự phát sinh cơ quan của lan Thiên nga (Cycnoches chlorochiron) giai
đoạn in vitro”.
2. Mục tiêu đề tài
Đánh giá đƣợc nồng độ của các chất điều hòa sinh trƣởng tới sự phát sinh
cơ quan sinh dƣỡng của lan Thiên nga ( Cycnoches chlorochiron).
3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn
3.1. Ý nghĩa khoa học
Kết quả nghiên cứu đề tài sẽ cung cấp các dẫn liệu khoa học làm cơ sở
đánh giá những tác động của các chất điều hòa sinh trƣởng đến khả năng phát
sinh cơ quan cây in vitro loài lan Thiên Nga (Cycnoches chlorochiron).
3.2. Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả nghiên cứu sẽ đƣợc ứng dụng trong nuôi cấy mơ lồi lan Thiên
nga (Cycnoches chlorochiron) góp phần sản xuất giống có hiêu quả cao, chất
lƣợng tốt, ứng dụng vào sản xuất, nâng cao hiệu quả kinh tế trên địa bàn tỉnh
Phú Thọ.


3

Phần II: NỘI DUNG
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
1.1. Giới thiệu chung về chi Thiên nga (Cycnoches )
1.1.1. Vị trí phân loại và phân bố
Giới: Plantae

Bộ: Asparagales
Họ: Orchidaceae
Chi: Cycnoches chlorochiron
Lan Cynoches viết tắt Cyc. là một loài phong lan do John Lindley công bố
vào năm 1832 căn cứ theo một bông hoa do nhà trồng lan Loddiges & Son gửi
cho. John Lindley đã dùng tên chủ nhân vƣờn lan đó để đặt tên cho cây lan
Cynoches lodigesii. Khơng giống nhƣ những lồi lan khác, thƣờng có nhị đực và
nhị cái cùng ở trong một bơng hoa. Lồi lan này lại có hoa cái và hoa đực riêng
biệt, có khi cùng một cành và có khi lại ở một cành khác. Lan Cycnoches cũng
cùng một giòng họ với Catasetum, Mormodes, Clowesia. Chữ Cynoches do
tiếng Hy lạp “Kyknos” có nghĩa là Thiên Nga và “auchen” có nghĩa là chiếc cổ,
căn cứ vào hình dáng trục nhụy của bơng hoa đực. Thân cây lan trơng tựa nhƣ
điếu xì gà, dài khoảng 20-40 cm trên ngọn có vài chiếc lá to bản, mỏng và có
gân. Dị hoa mọc ở gần ngọn có một vài hoa hoặc rất nhiều hoa nhƣ Cyc.
cooperi. Hoa nở vào mùa Thu rất thơm và lâu tàn, to chừng 12-15 cm tùy theo
giống.Lồi lan này có chừng 25 giống mọc từ Tây Mỹ qua Trung Mỹ tới lƣu
vực sơng Amazon thuộc Peru[3].
1.1.2. Đặc điểm hình thái
Chi lan Thiên nga có một số đặc điểm hình thái sau:
- Thân: đều phân đốt, hình trụ,...Có chiều dài từ 20 - 40cm ở cây trƣởng
thành Lát cắt ngang thân có thể là hình trịn, bầu dục, đơi thay đổi từ 5 - 7 cm.
Phần gốc, nơi xuất phát của rễ thƣởng nhỏ nhƣng cũng có thể phình to[3].


4

- Rễ: Rễ của các đại diện chi Thiên Nga là rễ khí sinh, mảnh, hình trụ,
màu xanh và chuyển thành nâu khi già, chúng thƣờng ôm lấy giá thể hoặc bng
thõng xuống. Ở một số lồi đƣợc bao bọc bởi lớp mô hút ẩm dày bao gồm cả
những lớp tế bào chết chứa đầy khơng khí do đó có ánh lên màu xám bạc. Chiều

dài rễ từ 3- 5 cm; rễ thƣờng mọc từ phần gốc của thân hoặc có thể ở mấu thân
một vài lồi[4].
- Lá: mọc thành hai dãy so le, khơng có cuống mà chỉ có bẹ ôm lấy thân.
Lá thƣờng cứng,to, bản mỏng, bề mặt thƣờng nhẵn
- Hoa: Hoa đơn tính, đối xứng hai bên, màu sắc sặc sỡ, hoa nở vào mùa
thu, có hƣơng thơm dịu, lâu tàn.Nhị hoa cong nhƣ cổ chim thiên nga, cánh hoa
dày, hoa to có kích thƣớc từ 4-6cm[4].
- Cụm hoa:Cụm hoa chùm từ 12-15 hoa trên 1 cụm. Cụm hoa dài thƣờng
rũ thõng xuống, nhiều lồi hoa có giá trị làm cảnh[4].
- Quả: Quả nang thƣờng hình chạy hoặc hình con suốt, chứa rất nhiều hạt
nằm xen lẫn những sợi lông mảnh. Hạt rất nhỏ, hầu nhƣ không trọng lựợng, bao
quanh hạt là lớp màng dạng mắt võng, trong suốt chứa đầy khơng khí dễ dàng
bay cùng hạt trong khơng khí nhờ gió[4].
- Hạt: Một quả chứa từ 10.000 đến 100.000 hạt, đôi khi đến 3 triệu hạt
nên hạt lan có kích thƣớc rất nhỏ, phơi hạt chƣa phân hóa. Sau 12 - 18 tháng hạt
chín phát tán nhờ gió. Khi gặp nấm cộng sinh tƣơng thích trong điều kiện phù
hợp hạt sẽ nảy mầm[4].
1.1.3.Lan Thiên nga ( Cycnoches chlorochiron).
Lan Thiên nga (Cycnoches chlorochilon) là loại hoa rất đẹp và quý hiếm
lan Thiên nga là loại lan biểu sinh trong rừng lá rộng trên thân cây ở độ cao
khoảng 300 - 1600m, phát triển trong nhiệt độ mát đến ấm nóng. Tại Việt Nam,
cây có mặt ở miền Bắc. Lan Thiên nga rất sai hoa, nở nhiều hoa to 6 - 7 cm, mọc
từng chùm, mỗi bông hoa có hình giống nhƣ một chú chim thiên nga. Hiện nay,
Lan Thiên nga rất ít đƣợc tìm thấy trong tự nhiên do bị thu mua và khai thác ráo


5

riết và cạn kiệt..Việc nhân giống lan Thiên nga theo phƣơng pháp truyền thống
rất chậm không đáp ứng đƣợc nhu cầu thực tế.

Ngày nay với sự phát triển của công nghệ sinh học thì nhân giống (in
vitro) là cơng cụ đắc lực trong việc bảo tồn và phát triển các lồi lan q hiếm.
Trong nhân giống in vitro, ngồi mơi trƣờng nuôi cấy cơ bản, ngƣời ta thƣờng
bổ sung thêm vào môi trƣờng nuôi cấy các vitamin, các chất điều hịa sinh
trƣởng, đƣờng, than hoạt tính, nuớc ép các loại hoa quả nhƣ: chuối, nƣớc dừa,
khoai tây…chúng có ảnh hƣởng rất lớn đến hệ số nhân và chất lƣợng của chồi,
cũng nhƣ có ảnh hƣởng lớn tới khả năng phát sinh cơ quan. Hiện nay việc
nghiên cứu về lan Thiên nga ở nƣớc ta cịn ít tuy nhiên vì giá trị thƣơng phẩm
của chúng rất cao nên ngƣời ta đã áp dụng công nghệ nuôi cấy mô để nhân
nhanh và bảo vệ ngn gen của lồi này vừa tránh bị khai thác quá mức vừa
nâng cao hiệu quả kinh tế.
1.2. Kĩ thuật nhân giống bằng nuôi cấy mô - tế bào thực vật
1.2.1. Khái niệm
Kỹ thuật nuôi cấy mô - tế bào thực vật hay nhân giống in vitro đều là
thuật ngữ mô tả các phƣơng pháp nuôi cấy các bộ phận thực vật (tế bào đơn, mô,
cơ quan) trong ống nghiệm có chứa mơi trƣờng dinh dƣỡng thích hợp nhƣ muối
khống, vitamin, đƣờng và các chất điều hịa sinh trƣởng thực vật trong điều
kiện vô trùng. Kỹ thuật nuôi cấy mô - tế bào thực vật cho phép tái sinh chồi
hoặc cơ quan từ các mô nhƣ lá, thân, hoa, rễ, củ hoặc đỉnh sinh trƣởng. Trƣớc
kia ngƣời ta dùng phƣơng pháp này để nghiên cứu các đặc tính cơ bản của tế bào
nhƣ sự phân chia, đặc tính di truyền và ảnh hƣởng của các hóa chất đối với tế
bào và mơ trong q trình ni cấy. Hiện nay, các nhà khoa học sử dụng hệ
thống nuôi cấy mô thực vật để nghiên cứu tất cả các vấn đề có liên quan đến
thực vật nhƣ sinh lý học, hóa sinh học, di truyền học và cấu trúc thực vật. Kỹ
thuật nuôi cấy mô - tế bào thực vật cũng mở rộng tiềm năng nhân giống vơ tính
đối với các lồi cây trồng quan trọng, có giá trị về mặt kinh tế và thƣơng mại
trong đời sống hàng ngày của con ngƣời.


6

1.2.2. Lịch sử phát triển của kỹ thuật nhân giống bằng nuôi cấy mô - tế bào
thực vật
Năm 1902, nhà thực vật học ngƣời Đức Gottlied Haberlandt lần đầu tiên
đƣa ra ý tƣởng cấy mơ của sinh vật ra ngồi cơ thể nhƣng những thí nghiệm của
Haberlandt khi đó với các tế bào mơ mềm biểu bì đã bị thất bại do chúng không
thể phân chia đƣợc [9]. Năm 1922, Kotte cùng với Robbins đã lặp lại thí nghiệm
của Haberlandt với đỉnh sinh trƣởng tách từ đầu rễ một cây hịa thảo (cây ngơ).
Hai tác giả đã ni đƣợc trong một thời gian ngắn (12 ngày) trên mơi trƣờng
lỏng có chứa đƣờng glucozơ và muối khoáng thu đƣợc hệ rễ nhỏ [9]. Năm 1934,
bắt đầu giai đoạn thứ 2 của lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật khi White (ngƣời
Mỹ) đã duy trì đƣợc sinh trƣởng của đầu rễ cà chua trong một thời gian khá dài,
trên môi trƣờng lỏng có chứa đƣờng, một số muối khống và dịch chiết nấm
men [9]. Trong thời gian 1941 - 1952, nhiều chất điều kích thích sinh trƣởng
thuộc nhóm Auxin đƣợc nuôi cấy và tổng hợp thành công: axit naphthalene
axetic (NAA), axit 2,4 D - dichlorophenoxy axetic (2,4 D)…Năm 1954, Skoog
và Miller đã phát hiện ra các hợp chất có thể điều khiển sự nhân chồi. Skoog
phát hiện chế phẩm thuỷ phân của tinh dịch cá bẹ kích thích sinh trƣởng rõ rệt
trong nuôi cấy các mảnh mô thân cây thuốc lá. Một năm sau, chất đó đƣợc tổng
hợp thành cơng và đƣợc Skoog gọi là kinetin có tác dụng kích thích sự phân bào.
Skoog và Miller đã chứng minh sự biệt hóa của rễ, chồi trong nghiên cứu ni
cấy mơ tủy thuốc lá phụ thuộc vào nồng độ tƣơng đối của auxin/cytokinin và từ
đó đƣa ra quan niệm điều khiển hoocmon trong quá trình hình thành cơ quan ở
thực vật. Thành công của Skoog và Miller dẫn đến nhiều phát hiện quan trọng,
mở đầu cho giai đoạn thứ 3 của nuôi cấy mô tế bào thực vật. Năm 1962,
Murashige và Skoog đã cải tiến môi trƣờng nuôi cấy, đánh dấu một bƣớc tiến trong
kỹ thuật nuôi cấy mô.
Môi trƣờng của họ đã đƣợc dùng làm cơ sở cho việc nuôi cấy nhiều loại
cây và vẫn còn đƣợc sử dụng rộng rãi cho đến nay [9]. Trong khoảng thời gian
từ 1954 - 1959, kỹ thuật nuôi cấy tế bào đơn đã đƣợc phát triển và hoàn thiện

7

dần. Melcher và Beckman đã nuôi cấy các tế bào đơn trong các bình dung tích
lớn có sục khí và bổ sung chất dinh dƣỡng định kỳ. Khả năng nuôi cấy các tế
bào thực vật và tái tạo đƣợc cây hoàn chỉnh từ tế bào đã mở những triển vọng
mới cho chọn dòng đột biến, sản xuất các chất trao đổi thứ cấp...Năm 1960 1964, Morel cho rằng có thể nhân giống vơ tính địa lan bằng ni cấy đỉnh sinh
trƣởng và đã tạo ra đƣợc các protocom từ địa lan. Từ kết quả đó, lan đƣợc xem
là cây ni cấy mơ đầu tiên đƣợc thƣơng mại hóa. Năm 1966, Guha & cộng sự
đã tạo đƣợc cây đơn bội từ ni cấy túi phấn cây cà độc dƣợc. Sau đó Bourin &
Nitsch (1967) cũng thành công với cây thuốc lá. Việc tạo cây đơn bội thành
cơng ở nhiều lồi thực vật thông qua nuôi cấy bao phấn và hạt phấn đóng góp rất
lớn cho các nghiên cứu di truyền và lai tạo giống. Từ những năm 1970 trở đi,
các nhà khoa học đã chú ý vào triển vọng của kỹ thuật nuôi cấy protoplast, khi 2
tác giả ngƣời Nhật là Nagata và Takebe đã thành công trong việc làm cho
protoplast thuốc lá tái tạo đƣợc cellulose. Melchers và cộng sự (1978) đã lai tạo
thành công protoplast của cà chua với protoplast của khoai tây, mở ra một triển
vọng mới trong lai xa ở thực vật. Ngoài ra, trong những điều kiện nhất định, các
protoplast có khả năng hấp thụ các phân tử lớn, hoặc các cơ quan tử từ bên
ngoài, do đó chúng là những đối tƣợng lý tƣởng cho các nghiên cứu về di truyền
thực vật [8]. Từ đó đến nay, công nghệ nuôi cấy mô - tế bào thực vật đã đƣợc phát
triển với tốc độ nhanh trên nhiều cây khác và đƣợc ứng dụng rộng rãi trong nhân
giống nhiều lồi thực vật, chọn dịng chống chịu, lai xa, chuyển gen ở thực vật…
1.2.3. Cơ sở khoa học của ni cấy mơ - tế bào thực vật
1.2.3.1. Tính toàn năng của tế bào
Gottlibeb Haberlant (1902) - nhà thực vật học ngƣời Đức đã đặt nền móng
đầu tiên cho ni cấy mơ tế bào thực vật. Ơng đã đƣa ra giả thuyết về tính tồn
năng của tế bào trong cuốn sách "Thực nghiệm về nuôi cấy tách rời". Theo ông:
“Tế bào bất kỳ của cơ thể sinh vật nào cũng đều mang tồn bộ lƣợng thơng tin di

truyền (DNA) cần thiết và đủ của cả sinh vật đó. Khi gặp điều kiện thích hợp,
mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cá thể hồn chỉnh” [9]. Tính toàn năng


8

của tế bào mà Haberlandt nêu ra chính là cơ sở lý luận của phƣơng pháp nuôi cấy
mô tế bào thực vật. Cho đến ngày nay, các nhà khoa học đã chứng minh đƣợc khả
năng tái sinh một cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một tế bào riêng rẽ.
1.2.3.2. Sự phân hóa và phản phản hóa
Sự phân hóa tế bào là sự chuyển hóa các tế bào thành các mơ chun hóa,
đảm nhận các chức năng khác nhau trong cơ thể. Tuy nhiên, khi tế bào đã phân
hóa thành mơ chức năng chúng hồn tồn mất khả năng phân chia của mình.
Trong những điều kiện mơi trƣờng thích hợp, chúng lại có thể trở về dạng tế bào
phơi sinh và phân chia mạnh mẽ nhƣ tế bào hợp tử ban đầu và cho ra các tế bào
mới có khả năng tái sinh thành cây hồn chỉnh. Q trình đó đƣợc gọi là sự phản
phân hóa tế bào. Về bản chất thì sự phân hóa và phản phân hóa là một q trình
điều hồ hoạt hóa gen. Tại một thời điểm nào đó trong q trình phát triển của
cá thể có một số gen đƣợc hoạt hóa (mà vốn trƣớc đây bị hạn chế) để tạo ra tính
trạng mới, một số gen khác lại bị đình chỉ hoạt động. Điều này xảy ra theo một
chƣơng trình đã đƣợc mã hóa trong cấu trúc của phân tử DNA ở mỗi tế bào. Mặt
khác khi cho tế bào nằm trong một khối mô của cơ thể thƣờng bị ức chế bởi các
tế bào xung quanh. Khi tách riêng từng tế bào hoặc giảm kích thƣớc của khối
mơ sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho sự hoạt hóa các gen của tế bào, q trình hoạt
hóa sẽ đƣợc xảy ra theo một cấu trúc nhất định sẵn có trong bộ gen đó.
1.2.4. Các giai đoạn trong kỹ thuật nhân giống in vitro
Quá trình nuôi cấy in vitro đƣợc chia ra 5 giai đoạn:
* Giai đoạn 1: Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ
Trƣớc khi tiến hành nhân giống in vitro cần chọn lọc cẩn thận các cây mẹ
(cây cho nguồn mẫu nuôi cấy). Các cây này phải sạch bệnh, đặc biệt là bệnh

virus và ở giai đoạn sinh trƣởng mạnh. Việc trồng các cây mẹ trong điều kiện
mơi trƣờng thích hợp với chế độ chăm sóc và phịng trừ sâu bệnh hiệu quả trƣớc
khi lấy mẫu cấy sẽ làm giảm tỷ lệ mẫu nhiễm, tăng khả năng sống và sinh
trƣởng của mẫu cấy in vitro.
* Giai đoạn 2: Nuôi cấy khởi động


9

Là giai đoạn khử trùng đƣa mẫu vào nuôi cấy in vitro. Giai đoạn này cần
đảm bảo các yêu cầu: tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại và sinh trƣởng
tốt. Khi lấy mẫu cần chọn đúng loại mô, đúng giai đoạn phát triển của cây. Quan
trọng nhất là đỉnh chồi ngọn, đỉnh chồi nách và sau đó là đỉnh chồi hoa, cuối
cùng là đoạn thân, mảnh lá…Chồi ngon, chồi nách đƣợc sử dụng để nhân nhanh
các cây: măng tây, dứa, khoai tây, thuốc lá, hoa cúc…ở súp lơ thì dung hoa tự
non, ở bầu bí các mảnh lá mầm là ngun liệu ni cấy thích hợp để nhân nhanh
in vitro. Chồi non nảy mầm từ hạt cũng có thể đƣợc sử dụng làm mẫu cấy.
* Giai đoạn 3: Nhân nhanh
Là giai đoạn kích thích mơ ni cấy phát sinh hình thái và tăng nhanh số
lƣợng thơng qua các con đƣờng: hoạt hóa chồi nách, tạo chồi bất định, tạo phơi
vơ tính. Phải xác định đƣợc mơi trƣờng và điều kiện ngoại cảnh thích hợp để có
hiệu quả là cao nhất. Nếu mơi trƣờng có nhiều cytokinin sẽ kích thích tạo chồi.
Điều kiện ni cấy thƣờng là 25 - 270C và 16 giờ chiếu sáng/ngày, cƣờng độ
ánh sáng 2000 - 4000 lux. Tuy nhiên đối với mỗi loại đối tƣợng ni cấy địi hỏi
có chế độ ni cấy khác nhau: nhân nhanh súp lơ cần quang chu kì chiếu sáng 9
giờ/ngày, nhân nhanh phong lan phalenopsis ở giai đoạn đầu cần che tối.
* Giai đoạn 4: Tạo cây in vitro hoàn chỉnh
Để tạo rễ cho chồi, ngƣời ta chuyển chồi từ môi trƣờng nhân nhanh sang
môi trƣờng tạo rễ. Môi trƣờng tạo rễ thƣờng đƣợc bổ sung một lƣợng nhỏ
Auxin. Một số chồi có thể phát sinh rễ ngay sau khi chuyển từ môi trƣờng nhân

nhanh giàu cytokinin sang mơi trƣờng khơng chứa chất điều hịa sinh trƣởng.
* Giai đoạn 5: Thích ứng cây in vitro ngồi điều kiện tự nhiên
Để đƣa cây từ ống nghiệm ra vƣờm ƣơm với tỷ lệ sống cao, cây sinh
trƣởng tốt cần đảm bảo một số yêu cầu: Cây trong ống nghiệm đã đạt đƣợc
những tiêu chuẩn hình thái nhất định (số lá, số rễ, chiều cao cây). Cây con cao
5 - 7 cm và có từ 3 - 4 lá có thể chuyển sang cấy vào bầu đất mùn vơ trùng có bổ
sung các chất dinh dƣỡng. Có giá thể tiếp nhận cây in vitro thích hợp: giá thể


10

sạch, tơi xốp, thoát nƣớc. Phải chủ động điều chỉnh đƣợc độ ẩm, sự chiếu sáng
của vƣờm ƣơm, cũng nhƣ có chế độ dinh dƣỡng phù hợp [6].
1.2.5. Các điều kiện nuôi cấy in vitro
1.2.5.1. Điều kiện vô trùng
Đây là điều kiện tiên quyết đối với thành công của quá trình ni cấy in
vitro. Nếu trong q trình ni cấy khơng đảm bảo điều kiện vơ trùng thì mẫu sẽ
bị nhiễm nấm, khuẩn.
* Vô trùng dụng cụ và môi trƣờng: Để vơ trùng dụng cụ và mơi trƣờng
ni cấy, có thể sử dụng một trong các phƣơng pháp sau:
- Khử trùng khô: Phƣơng pháp này chỉ dùng cho các dụng cụ bằng kim
loại, thuỷ tinh, các dụng cụ có tính chịu nhiệt. Các dụng cụ trƣớc khi đem sấy
phải đƣợc gói kín bằng giấy nhơm và chỉ đƣợc mở trong tủ cấy vô trùng. Thiết
bị dùng khử trùng khô là lò sấy, tủ sấy, nhiệt độ thƣờng dùng là 1210C - 180 0C,
trong 90 - 120 phút.
- Khử trùng ƣớt: Là phƣơng pháp áp dụng hiệu quả và phổ biến trong vô
trùng môi trƣờng và các dụng cụ nuôi cấy. Thiết bị sử dụng là nồi hấp vô trùng,
nhiệt độ thƣờng dùng ở 1210C.
- Màng lọc: Dùng để loại bỏ các tác nhân gây nhiễm có kích thƣớc 0,025 10µm khỏi môi trƣờng nuôi cấy, nƣớc cất... Đây là phƣơng pháp phù hợp với
các môi trƣờng mà thành phần của chúng bị phân huỷ ở nhiệt độ cao.

* Vô trùng mẫu cấy: Với các loại mẫu cấy khác nhau hoặc cùng loại mẫu
cấy nhƣng ở các vị trí khác nhau... thì phƣơng pháp khử trùng mẫu cấy là khác
nhau. Phƣơng pháp phổ biến trong vô trùng mẫu cấy hiện nay là sử dụng hóa
chất có khả năng tiêu diệt vi sinh vật nhƣ cồn 700, các chất làm giảm sức căng
bề mặt nhƣ Tween 20, Tween 80, fotoflo, teepol, thủy ngân hoặc các chất kháng
sinh,… Hiệu quả khử trùng phụ thuộc vào loại, nồng độ, thời gian xử lý hóa chất
khử trùng. Một hóa chất đƣợc lựa chọn để vơ trùng phải đảm bảo 2 thuộc tính:
Có khả năng diệt vi sinh vật tốt và khơng hoặc ít ảnh hƣởng mẫu thực vật [8].


11

1.2.5.2. Ánh sáng và nhiệt độ.
Các mẫu nuôi cấy thƣờng đƣợc đặt trong những phịng ni ổn định về
ánh sáng và nhiệt độ. Tất cả các trƣờng hợp nuôi cấy đều cần có ánh sáng trừ
một số trƣờng hợp ni cấy tạo mơ sẹo, nhƣng q trình nhân giống của chúng
cũng cần có ánh sáng. Nhiệt độ của các phịng ni cây thƣờng đƣợc duy trì từ
25 - 280C nhờ các máy điều hồ nhiệt độ.
1.2.6. Mơi trường ni cấy in vitro
1.2.6.1. Thành phần của môi trường
Thành phần môi trƣờng nuôi cấy mô - tế bào thay đổi tuỳ theo lồi thực
vật, loại tế bào, mơ và cơ quan ni cấy. Đối với cùng một loại mô, cơ quan
nhƣng mục đích ni cấy khác nhau thì mơi trƣờng ni cấy khác nhau cũng
khá cơ bản. Mơi trƣờng ni cấy cịn thay đổi theo giai đoạn sinh trƣởng và phát
triển của mẫu cấy. Mặc dù có sự đa dạng về thành phần các chất nhƣng môi
trƣờng nuôi cấy đều gồm các thành phần sau:
* Thành phần vô cơ: Bao gồm các muối khoáng (đa lƣợng và vi lƣợng)
đƣợc bổ sung vào mơi trƣờng ni cấy.
- Trong muối khống đa lƣợng, các nguyên tố cần phải cung cấp là: Nitơ,
phospho, kali và sắt.

+ Nitơ vô cơ đƣợc đƣa vào môi trƣờng ở hai dạng nitrat (NO3-) với hàm
lƣợng ≈ 25 mM và amon (NH4+) với hàm lƣợng từ 2 - 20 mM.
+ Phospho thƣờng đƣợc đƣa vào môi trƣờng ở dạng muối phosphat, hai
loại hợp chất hay đƣợc dùng nhất là NaH2PO4 và KH2PO4. Hàm lƣợng phospho
trong môi trong môi trƣờng nuôi cấy từ 0,15 - 0,40 mM.
+ Kali đƣợc cung cấp cho môi trƣờng nuôi cấy dƣới dạng KNO3, KCl và
KH2PO4. Nồng độ kali sử dụng từ 2 - 25 mM.
- u cầu về muối khống vi lƣợng của mơ thực vật trong ni cấy khá
phức tạp và ít đƣợc nghiên cứu. Chúng cần thiết để thúc đẩy sự sinh trƣởng và
phát triển của mẫu nuôi cấy. Đây là những nguyên tố đƣợc sử dụng ở nồng độ
nhỏ hơn 30 ppm, chúng đóng vai trị quan trọng trong các hoạt động của
enzyme.


12

+ Fe: thiếu Fe làm giảm ARN, protein nhƣng lại làm tăng ADN và các
axit amin tự do làm cho các tế bào không phân chia.
+ Bo: thiếu Bo trong môi trƣờng nuôi cấy thƣờng gây lên biểu hiện thừa
Auxin. Mơ ni cấy có biểu hiện tạo mơ sẹo hóa mạnh nhƣng thƣờng là mô xốp,
mọng nƣớc, kém tái sinh...
* Thành phần hữu cơ
- Vitamin, aminoaxit, amit, myo - inositol:
+ Vitamin: Các vitamin hay đƣợc sử dụng là các vitamin nhóm B (B1,
B3, B6), ngồi ra mơi trƣờng ni cấy còn sử dụng một số vitamin khác nhƣ
vitamin H, vitamin M, vitamin B2, vitamin C, vitamin E... với các nồng độ khác
nhau.
+ Myo-inositol là một loại đƣờng - rƣợu liên quan đến quá trình tổng hợp
phospholipit, pectin của thành tế bào và các hệ thống màng trong tế bào, tham
gia vào dinh dƣỡng khoáng, vận chuyển đƣờng và trao đổi hydratcacbon. Hàm

lƣợng sử dụng là 100 mg/l môi trƣờng .
+ Các aminoaxit và amit: Đối với nhiều loại mẫu nuôi cấy, mơi trƣờng
phải đƣợc bổ sung các aminoaxit, amit... vì chúng có vai trị quan trọng trong
phát sinh hình thái. Theo Skoog & Milles (1957) tất cả các dạng tự nhiên của
aminoaxit (dạng L) dễ dàng đƣợc mô nuôi cấy hấp thụ, L-arginin dùng cho nuôi
cấy rễ, L- tyrolin dùng cho nuôi cấy chồi, L- serin dùng cho nuôi cấy hạt phấn.
Nồng độ sử dụng mỗi loại 10 - 100 mg/l .
- Thành phần hữu cơ phức hợp: Đƣợc dùng trong môi trƣờng nuôi cấy để
cung cấp thêm nitơ hữu cơ, aminoaxit, vitamin và các khoáng chất...Chúng đƣợc
sử dụng khi mơi trƣờng khống xác định khơng đạt kết quả mong muốn về sinh
trƣởng và phát triển của mẫu nghiên cứu. Một số chất đƣợc sử dụng phổ biến là:
Cazein thuỷ phân, dịch chiết nấm men, dịch chiết hoa, củ, quả,...
* Các chất điều hoà sinh trƣởng
Các chất điều hoà sinh trƣởng là thành phần không thể thiếu đƣợc trong
môi trƣờng ni cấy, có vai trị quan trọng trong phát sinh hình thái thực vật in


13

vitro. Hiệu quả tác động của chất điều hoà sinh trƣởng phụ thuộc vào loại và
nồng độ chất điều hoà sinh trƣởng sử dụng trong ni cấy.
- Nhóm Auxin: Đƣợc đƣa vào môi trƣờng nuôi cấy nhằm thúc đẩy sự
sinh trƣởng và giãn nở tế bào, tăng cƣờng các quá trình sinh tổng hợp và trao đổi
chất, kích thích sự hình thành rễ và tham gia cảm ứng phát sinh phơi vơ tính...
(Epstein&cs, 1989).
Các loại auxin thƣờng sử dụng cho nuôi cấy:
+ IAA (Indole acetic acid)
+ IBA (Indole butyric acid)
+ NOA (Naphthoxy acetic acid)
+ α- NAA (α- Naphthalene acetic acid) + 2.4 D (2.4 diclorophenoxy

acetic acid)... IAA ít sử dụng do kém bền với nhiệt và ánh sáng, nếu dùng thì ở
hàm lƣợng cao 1,0 - 3,0 mg/l (Dodds & Robert, 1999). Các auxin khác có hàm
lƣợng sử dụng từ 0,1 - 2,0 mg/l.
- Nhóm Cytokinin: Kích thích sự phân chia tế bào, sự hình thành và sinh
trƣởng của chồi in vitro (Miller, 1962). Các cytokinin có biểu hiện ức chế sự tạo
rễ và sinh trƣởng của mô sẹo nhƣng có ảnh hƣởng dƣơng tính rõ rệt đến sự phát
sinh phơi vơ tính của mẫu ni cấy. Các loại cytokinin thƣờng dùng trong nuôi
cấy mô là:
+ Zeatin (6-[4-hydroxy-3-metyl-but-2-enylamino] purine).
+ Kinetin (6-furfurylamino purine) + BAP (Bezylamino purine).
+ TDZ (Thidiazuzon).
Hàm lƣợng sử dụng của các Cytokinin dao động từ 0,1 - 2,0 mg/l. Ở
những nồng độ cao hơn, nó có tác dụng kích thích rõ rệt đến sự hình thành chồi
nách, đồng thời ức chế mạnh sự tạo rễ của chồi nuôi cấy. Trong các loại
cytokinin nói trên, kinetin và BAP là hai loại đƣợc sử dụng rộng rãi hơn cả. Đa
số các trƣờng hợp phải sử dụng phối hợp cả auxin và cytokinin ở những tỷ lệ
khác nhau.


14

* Nguồn cacbon Các mẫu ni cấy thực vật nói chung không thể quang
hợp hoặc quang hợp nhƣng ở cƣờng độ rất thấp. Vì vậy phải đƣa thêm những
hợp chất hydratcacbon vào thành phần môi trƣờng nuôi cấy. Loại hydratcacbon
đƣợc sử dụng phổ biến là đƣờng saccharose với hàm lƣợng từ 2 - 6% (W/v).
Những loại đƣờng khác nhƣ fructose, glucose, maltose, sorbitol rất ít dùng. Hàm
lƣợng đƣờng thấp đƣợc sử dụng cho nuôi cấy tế bào trần, ngƣợc lại hàm lƣợng
đƣờng cao cần cho nuôi cấy hạt phấn và phôi.
* Các thành phần khác
- Tác nhân tạo gel quyết định trạnh thái vật lý của môi trƣờng nuôi cấy.

Chất tạo gel đƣợc sử dụng phổ biến là agar. Nồng độ agar sử dụng từ 0,5 - 10 %
(W/v) tuỳ theo chất lƣợng của chúng và môi trƣờng sử dụng. Khi môi trƣờng
nuôi cấy là môi trƣờng lỏng hoặc bán lỏng thì khơng hoặc bổ sung rất ít agar.
- Than hoạt tính đƣợc dùng để hấp thụ các chất màu, các hợp chất phenol,
các sản phẩm trao đổi chất thứ cấp...Trong trƣờng hợp những chất đó có tác
dụng gây ức chế sinh trƣởng của mẫu nghiên cứu. Mặt khác, khi bổ sung vào
mơi trƣờng, than hoạt tính làm thay đổi mơi trƣờng ánh sáng do mơi trƣờng trở
nên sẫm vì vậy có thể kích thích q trình tạo rễ, một số trƣờng hợp cịn có tác
dụng thúc đẩy phát sinh phơi vơ tính và kích thích sinh trƣởng phát sinh cơ quan
ở các lồi cây gỗ. Nhƣng than hoạt tính lại làm giảm hiệu quả của các chất điều
hoà sinh trƣởng, nồng độ than hoạt tính thƣờng sử dụng từ 0,2 - 0,3(W/v) [8].
1.2.6.2. pH của môi trường
pH của đa số các môi trƣờng nuôi cấy đƣợc điều chỉnh trong phạm vi
5,5 - 6,0 pH dƣới 5,5 làm agar khó chuyển sang trạng thái gel, còn pH lớn hơn
6,0 agar có thể rất cứng. Nếu trong mơi trƣờng có GA3 thì phải điều chỉnh giá
trị pH trong phạm vi nói trên vì ở pH kiềm hoặc quá axit thì GA3 sẽ chuyển
sang dạng khơng có hoạt tính.
1.2.6.3. Tính thẩm thấu của môi trường
Hấp thụ nƣớc của tế bào và mô thực vật trong nuôi cấy bị chi phối bởi thế
năng của nƣớc trong dịch bào và trong môi trƣờng dinh dƣỡng. Các thành phần


15

chính có ảnh hƣởng đến thế năng của nƣớc trong môi trƣờng bao gồm: Hàm
lƣợng đƣờng, hàm lƣợng agar, một số thành phần muối khoáng. Đƣờng vừa là
nguồn cacbon cung cấp cho mẫu ni cấy đồng thời cịn tham gia vào điều chỉnh
khả năng thẩm thấu của môi trƣờng. Hàm lƣợng đƣờng cao, mơ ni cấy khó
hút đƣợc nƣớc. Hàm lƣợng đƣờng thấp là một trong những nguyên nhân gây ra
hiện tƣợng thuỷ tinh hóa ở mẫu ni cấy, đây là trở ngại chính cho việc chuyển

cây từ ống nghiệm ra vƣờn ƣơm hoặc đồng ruộng.
1.2.7. Tầm quan trọng của phương pháp nuôi cấy mô - tế bào thực vật
Phƣơng pháp này có ý nghĩa vơ cùng to lớn đối với việc nghiên cứu lý
luận sinh học cơ bản, đồng thời có giá trị đóng góp trực tiếp cho thực tiễn sản
xuất và đời sống. Về mặt lý luận sinh học cơ bản: đã mở ra khả năng to lớn cho
việc tìm hiểu sâu sắc về bản chất của sự sống. Thực tế đã cho phép chúng ta tách
và nuôi cấy trƣớc hết là mô phân sinh (meristem) rồi từ đó cho ra nhóm tế bào
khơng chun hóa gọi là mơ sẹo (callus) và từ mơ sẹo thì có thể kích thích tái
sinh và tạo cây hồn chỉnh. Về mặt thực tiễn sản xuất: phƣơng pháp nuôi cấy mô
đƣợc sử dụng để phục tráng và nhân nhanh các giống cây trồng q, có giá trị
kinh tế cao. Hiện nay phƣơng pháp này đã trở thành phổ biến và áp dụng trong
cơng tác chọn giống cây trồng. Ngồi ra, bằng phƣơng pháp này chỉ sau thời
gian ngắn chúng ta có thể tạo đƣợc sinh khối lớn có hoạt chất sinh học đƣợc tạo
ra vẫn giữ ngun đƣợc hoạt tính của mình.
1.3. Tình hình nghiên cứu lan Thiên nga
1.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Hiện nay nhu cầu về hoa lan trên thế giới ngày càng lớn vì vậy việc
nghiên cứu nhân giống lan rất đƣợc quan tâm và phát triển mạnh mẽ. Tuy nhiên
đối với lan Thiên nga thì việc nghiên cứu phát triển và nhân giống bằng phƣơng
pháp nuôi cấy mơ vẫn cịn ít chƣa phổ biến. Các nhà khoa học chủ yếu nghiên
cứu về cách trồng và cách chăm sóc lan Thiên nga và nghiên cứu một số yếu tố
ảnh hƣởng đến cây lan trƣởng thành nhƣ nhiệt độ, độ ẩm, nƣớc, ánh sáng …