Nghiên cứu tạo vật liệu khởi đầu và cảm ứng tạo protocom của loài lan sơn thủy tiên (dendrobium chrysotoxum)

1

TRƢỜNG ĐẠI HỌC HÙNG VƢƠNG
KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN
-----------------------

VI THỊ MINH HUỆ

NGHIÊN CỨU TẠO VẬT LIỆU KHỞI ĐẦU
VÀ CẢM ỨNG TẠO PROTOCOM
CỦA LỒI LAN SƠN THỦY TIÊN
(Dendrobium chrysotoxum)

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Ngành: Sƣ phạm Sinh học

Phú Thọ, 2017


2
TRƢỜNG ĐẠI HỌC HÙNG VƢƠNG
KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-----------------------

VI THỊ MINH HUỆ

NGHIÊN CỨU TẠO VẬT LIỆU KHỞI ĐẦU
VÀ CẢM ỨNG TẠO PROTOCOM
CỦA LỒI LAN SƠN THỦY TIÊN

(Dendrobium chrysotoxum)

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Ngành: Sƣ phạm Sinh học

NGƢỜI HƢỚNG DẪN: TS. TRẦN TRUNG KIÊN

Phú Thọ, 2017


i
LỜI CẢM ƠN
Trong thời gian nghiên cứu và hoàn thành khóa luận, em đã nhận đƣợc sự
giúp đỡ của ban lãnh đạo trƣờng Đại học Hùng Vƣơng, cùng toàn thể các thầy
cô giáo trong khoa Khoa học tự nhiên đã tạo điều kiện giúp đỡ để em nghiên
cứu và thực hiện khóa luận này. Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất
tới thầy giáo hƣớng dẫn TS.Trần Trung Kiên đã tận tình hƣớng dẫn, quan tâm
và động viên em hồn thành khóa luận.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô trong Trung tâm nghiên cứu
công nghệ sinh học, trƣờng Đại học Hùng Vƣơng đã tận tình giúp đỡ, chỉ bảo
giúp em hồn thành tốt khóa luận này.
Em xin chân thành cảm ơn!
Phú Thọ, tháng 5 năm 2017
Sinh Viên

Vi Thị Minh Huệ


ii
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

BAP
CT
KC
MS
NAA
NXB
MT
½ MS

Benzylaminopurine
Cơng thức
Mơi trƣờng Knudson C
Môi trƣờng Murashige and Skoog
Naphthalene Acetic Acid
Nhà xuất bản
Môi trƣờng
Môi trƣờng ½ Murashige & Skoog


iii
DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
8

Bảng 3.1.

Một số loại hóa chất thƣờng dùng trong khử trùng bề
mặt mẫu cấy
Số lƣợng mẫu nhiễm trong công thức khử trùng 1

Bảng 3.2.

Số lƣợng mẫu nhiễm trong công thức khử trùng 2

23

Bảng 3.3.

Số lƣợng mẫu nhiễm trong công thức khử trùng 3

23

Bảng 3.4.

Số lƣợng mẫu nhiễm trong cơng thức khử trùng 4

24

Bảng 3.5.

Ảnh hƣởng của hóa chất khử trùng đến tỷ lệ sống của

25

Bảng 1.1.

23

hạt lan Sơn Thủy Tiên sau 4 tuần nuôi cấy

Bảng 3.6.

Đặc điểm protocom lan Sơn Thủy Tiên trên công thức

29

môi trƣờng MT1
Bảng 3.7.

Đặc điểm protocom lan Sơn Thủy Tiên trên công thức

29

môi trƣờng MT2
Bảng 3.8.

Đặc điểm protocom lan Sơn Thủy Tiên trên công thức

30

môi trƣờng MT3
Bảng 3.9.

Đặc điểm protocom lan Sơn Thủy Tiên trên công thức

30

môi trƣờng MT4
Bảng 3.10. Đặc điểm protocom lan Sơn Thủy Tiên trên công thức

31

môi trƣờng MT5
Bảng 3.11. Đặc điểm protocom lan Sơn Thủy Tiên trên công thức

31

môi trƣờng MT6
Bảng 3.12. Ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi cấy đến tỷ lệ tạo

32

protocom
Bảng 3.13. Đặc điểm chiều cao chồi lan Sơn Thủy Tiên ở các môi
trƣờng sau 8 tuần cấy chuyển

37


iv
Bảng 3.14. Số lá lan Sơn Thủy Tiên ở các môi trƣờng sau 8 tuần

39

cấy chuyển
Bảng 3.15. Số rễ lan Sơn Thủy Tiên ở các môi trƣờng sau 8 tuần cấy
chuyển

40

v
DANH MỤC HÌNH

Trang
Hình 2.1.

Lan Sơn Thủy Tiên (Dendrobium Chrysotoxum)

17

Hình 2.2.

Qủa lan Sơn Thủy Tiên

17

Hình 3.1.

Biểu đồ ảnh hƣởng của hóa chất khử trùng đến tỷ lệ sống

25

của hạt lan Sơn Thủy Tiên sau 4 tuần ni cấy.
Hình 3.2.

Mẫu tái sinh sau 4 tuần ni cấy

27

Hình 3.3.

Mẫu nhiễm sau 4 tuần ni cấy

28

Hình 3.4.

Biểu đồ ảnh hƣởng của mơi trƣờng ni cấy đến tỷ lệ tạo
protocom

33

Hình 3.5.

Hình thái protocom sau 5 tuần ni cấy

34

Hình 3.6a. Hình thái protocom ni cấy trong MT1, MT2, MT3 sau

35

5 tuần đƣợc soi dƣới kính hiển vi
Hình 3.6b. Hình thái protocom ni cấy trong MT4, MT5, MT6 sau
5 tuần đƣợc soi dƣới kính hiển vi
Hình 3.7. Biểu đồ chiều cao trung bình của chồi lan Sơn Thủy Tiên

36
38

ở các mơi trƣờng sau 8 tuần cấy chuyển
Hình 3.8.

Biểu đồ số lá trung bình của lan Sơn Thủy Tiên ở các

39

mơi trƣờng sau 8 tuần cấy chuyển
Hình 3.9.

Biểu đồ số rễ trung bình của lan Sơn Thủy Tiên ở các

41

mơi trƣờng sau 8 tuần cấy chuyển
Hình 3.10. Chồi lan Sơn Thủy Tiên sau 8 tuần theo dõi

42


vi
MỤC LỤC
PHẦN 1:MỞ ĐẦU............................................................................................1
1. Lý do chọn đề tài ........................................................................................... 1
2. Mục tiêu nghiên cứu...................................................................................... 2
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn ...................................................................... 2
3.1. Ý nghĩa khoa học ............................................................................... 2
3.2. Ý nghĩa thực tiễn ............................................................................... 2
PHẦN 2: NỘI DUNG ....................................................................................... 3

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU .................................. 3
1.1. Đặc điểm sinh học và sinh thái học của lồi lan Sơn Thủy Tiên............... 3
1.1.1. Nguồn gốc, vị trí phân loại ............................................................ 3
1.1.2. Đặc điểm sinh học và sinh thái học ............................................... 3
1.2. Kỹ thuật nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào .......................................... 4
1.2.1. Định nghĩa...................................................................................... 4
1.2.2. Cơ sở lý luận của nuôi cấy mô tế bào ............................................ 4
1.2.3. Ưu điểm, nhược điểm của phương pháp nhân giống in vitro ........ 5
1.2.4. Quy trình nhân giống in vitro ........................................................ 7
1.3. Một số nghiên cứu nhân giống hoa lan trên thế giới và ở Việt Nam....... 10
1.3.1. Trên thế giới ................................................................................. 10
1.3.2. Ở Việt Nam ................................................................................... 13
CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..............17
2.1. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu............................................................ 16
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu .................................................................. 16


vii
2.1.2. Phạm vi nghiên cứu..................................................................... 16
2.2. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 17
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu.......................................................................... 17
2.3.1. Phương pháp nghiên cứu lý thuyết .............................................. 17
2.3.2. Phương pháp luận ........................................................................ 17
2.3.3. Phương pháp bố trí thí nghiệm .................................................... 17
2.3.4. Phương pháp thu thập số liệu ...................................................... 19
2.3.5. Phương pháp phân t ch v

l số liệu ...................................... 19

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN........................22

3.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của chất khử trùng tới tỷ lệ tạo mẫu sạch
in vitro ................................................................................................................. 21
3.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi cấy đến khả năng tạo
protocom.............................................................................................................. 27
3.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh trƣởng trong giai
đoạn tạo chồi. ...................................................................................................... 36
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................................ 42
1. Kết luận ....................................................................................................... 42
2. Kiến nghị ..................................................................................................... 42
TÀI LIỆU THAM KHẢO...............................................................................44


1
PHẦN 1: MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Phong lan đƣợc biết đến là một loài hoa đẹp mang nhiều ý nghĩa, thƣờng
đƣợc dùng làm cảnh và trang trí, một số lồi có tác dụng chữa bệnh. Lan Hồng
Thảo (Dendrobium) là một chi lớn trong họ Lan (Orchidaceae) có khoảng 1400
lồi, ở Việt Nam có 107 lồi, phân bố ở các vùng núi từ Bắc vào Nam và cả trên
một số đảo ven biển [2].
Lan Sơn Thủy Tiên (Dendrobium chrysotoxum), thuộc chi Hoàng Thảo, là
loài lan rừng Việt Nam phân bố chủ yếu ở Tây Ngun [5]. Hoa có hình thái
đẹp, hƣơng thơm nhẹ nhàng, tƣơi mát, dễ chăm sóc, và là một trong số các loài
lan Hoàng Thảo rất đƣợc ƣa chuộng. Hiện nay loài lan này trong tự nhiên đang
bị suy giảm nghiêm trọng do khai thác để trồng, bán làm cây cảnh, đôi khi làm
thuốc và do chặt phá rừng gây hủy hoại nơi cƣ trú.
Để hạn chế việc khai thác quá mức lan Sơn Thủy Tiên ngoài tự nhiên cũng
nhƣ để bảo tồn loài lan này, việc nhân giống bằng công nghệ nuôi cấy mô tế bào
thực vật (in vitro) đƣợc quan tâm. Công nghệ nhân giống in vitro là công cụ đắc
lực trong việc bảo tồn và phát triển các loài lan quý. Phƣơng pháp này mang lại

nhiều ƣu điểm nhƣ hệ số nhân giống cao, cây con tạo ra đồng đều về mặt di
truyền, sạch bệnh, đồng thời có tiềm năng sinh học cao.
Nghiên cứu tạo vật liệu khởi đầu (khử trùng) và cảm ứng tạo protocom (mô
sẹo) thông qua các môi trƣờng khác nhau của loài lan Sơn Thủy Tiên
(Dendrobium chrysotoxum) hiện tại vẫn cịn rất ít các cơng trình nghiên cứu
[9;10]. Tại Việt Nam vẫn chƣa có đề tài nào nghiên cứu, so sánh về tạo vật liệu
khởi đầu và cảm ứng tạo protocom thông qua các môi trƣờng khác nhau của lồi
lan này. Xuất phát từ những lý do trên, tơi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên
cứu tạo vật liệu khởi đầu và cảm ứng tạo protocom của loài lan Sơn Thủy
Tiên (Dendrobium chrysotoxum)”.


2
2. Mục tiêu nghiên cứu
- Xác định công thức khử trùng mẫu quả tối ƣu nhất cho cây lan Sơn Thủy
Tiên trong giai đoạn tạo vật liệu khởi đầu.
- Xác định môi trƣờng nuôi cấy phù hợp nhất với đối tƣợng cây lan Sơn
Thủy Tiên đến giai đoạn in vitro tạo protocom.
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
3.1. Ý nghĩa khoa học
Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ cung cấp các dẫn liệu khoa học giúp hoàn
thiện quy trình nhân giống in vitro giống lan Sơn Thủy Tiên (Dendrobium
chrysotoxum) mở ra hƣớng nghiên cứu hồn thiện quy trình nhân giống đối với
các giống hoa lan khác ở nƣớc ta.
3.2. Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả của đề tài có thể ứng dụng vào quá trình nhân giống in vitro giống
lan Sơn Thủy Tiên (Dendrobium chrysotoxum) tại trƣờng Đại học Hùng Vƣơng.


3

PHẦN 2: NỘI DUNG
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
1.1. Đặc điểm sinh học và sinh thái học của lồi lan Sơn Thủy Tiên
1.1.1. Nguồn gốc, vị trí phân loại

Cây lan Sơn Thủy Tiên (Dendrobium chrysotoxum) thuộc họ Orchidaceae bộ Orchidales - phân lớp Ngọc lan Magnoliidae - lớp Ngọc lan Magnoliopsida Ngành hạt kín Magnoliophyta [1].
1.1.2. Đặc điểm sinh học và sinh thái học
Lan Sơn Thủy Tiên (Dendrobium chrysotoxum) là lồi lan rừng Việt Nam.
Chúng có giả hành hình dùi bắp, hẹp ở đáy, lớn mập ở giữa rồi thon lại, có nhiều
sóng dọc thấp, màu vàng khi già, cao đến 30cm, mập ú to 3–5cm đƣờng kính;
mang 6-7 lá ở đỉnh, dài 8–15cm, rộng 2.5-3cm. Chùm hoa mọc mạnh, nghiêng
xéo ra rồi cong xuống, dài đến 20cm với nhiều hoa thƣa. Hoa to cỡ 5cm, thơm,
màu vàng đậm, ánh nhƣ sáp, trung tâm mơi vàng cam, có lơng và rìa mép. Lồi


4
này có hoa khoảng tháng 2 (âm lịch), tái sinh bằng chồi và hạt, mọc bám trên
các cây gỗ lớn trong rừng, ở độ cao 600-1200m. Do có hoa đẹp nên đƣợc dùng
làm cảnh, ngồi ra cịn có giá trị về dƣợc phẩm.
Trên thế giới, lan Sơn Thủy Tiên (Dendrobium chrysotoxum) có ở Ấn Độ,
Trung Quốc, Mianma, Thái Lan, Lào. Còn ở Việt Nam chúng phân bố chủ yếu ở
Nghệ An (Vinh), Kontum (Đắklei, Đắk Uy), Gia Lai (Chƣ Pah), Đắk Lắk (Bn
Ma Thuột), Lâm Đồng (Đà Lạt).
Lồi có khu phân bố và nơi cƣ trú chia cắt. Hiện đã bị suy giảm nghiêm
trọng do khai thác để trồng, bán chủ yếu làm cây cảnh, đôi khi làm thuốc và chặt
phá rừng hủy hoại nơi cƣ trú [9].
1.2. Kỹ thuật nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào
1.2.1. Định nghĩa
Nhân giống cây bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào là phƣơng pháp nuôi cấy
mô tế bào trong môi trƣờng dinh dƣỡng nhân tạo trong điều kiện vô trùng và tái

sinh chúng thành cây con [14].
Nhân giống cây bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào là phƣơng pháp mới bổ
sung cho các kỹ thuật nhân giống truyền thống nhiều kỹ thuật tiến bộ, có thể
khắc phục đƣợc những hạn chế của phƣơng pháp nhân giống truyền thống.
1.2.2. Cơ sở lý luận của nuôi cấy mô tế bào
Cơ sở lý luận của phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào in vitro là học thuyết về
tính tồn năng của tế bào. Theo Haberlandt G (1902), nhà thực vật học ngƣời
Đức, tất cả các tế bào của cây đều mang toàn bộ thông tin di truyền của cơ thể,
khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có khả năng tái sinh và phát triển
thành các cơ thể hoàn chỉnh. Thực tế đã chứng minh đƣợc khả năng tái sinh một
cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một tế bào riêng lẻ. Hàng trăm loài cây trồng đã
đƣợc nhân giống trên quy mô thƣơng mại bằng cách nuôi cấy trong môi trƣờng


5
nhân tạo vô trùng và tái sinh chúng thành cây với hệ số nhân giống vơ cùng lớn
(Murashige, 1980).
Q trình phát sinh hình thái trong ni cấy in vitro thực vật thực chất là q
trình phân hóa và phản phân hóa. Tất cả các tế bào trong cơ quan khác nhau của
cơ thể thực vật đều bắt nguồn từ tế bào phôi sinh. Sự chuyển tế bào phôi sinh
thành các tế bào chuyên hóa để đảm nhiệm các chức năng khác nhau đƣợc gọi là
sự phân hóa tế bào. Cịn q trình phản phân hóa thì ngƣợc lại với q trình
phân hóa, có nghĩa là tế bào phân hóa thành mơ chức năng khơng hồn tồn mất
đi khả năng phân chia mà ở điều kiện thích hợp cúng có thể trở về dạng phôi
sinh và tái phân sinh.
Bản chất của q trình này là một q trình hoạt hóa, ức chế các gen. Trong
quá trình phát triển cá thể, ở từng thời điểm nhất định đều có một số gen nhất
định đƣợc hoạt hóa cho ra tính trạng mới, một số gen khác lại bị đình chỉ hoạt
động. Điều này xảy ra theo một chƣơng trình đã đƣợc mã hóa trong cấu trúc
phân tử ADN của mỗi tế bào khiến quá trình sinh trƣởng phát triển của cơ thể

thực vật ln đƣợc hài hịa. Mặt khác, khi nằm trong khối mơ bình thƣờng, tế
bào ln bị chi phối bởi các tế bào xung quanh. Khi tế bào đƣợc tách riêng rẽ,
tác dụng ức chế của các tế bào xung quanh khơng cịn nữa thì các gen đƣợc hoạt
hóa và q trình phân hóa sẽ xảy ra theo một q trình định sẵn [3].
1.2.3. Ưu điểm, nhược điểm của phương pháp nhân giống in vitro
* Ưu điểm:
Phƣơng pháp nhân giống in vitro có khả năng khắc phục đƣợc nhiều trở ngại
mà những phƣơng pháp nhân giống khác thƣờng gặp. Sau đây là những ƣu điểm
chính:
- Cây con đƣợc trẻ hóa và sạch bệnh, vì vậy có tiềm năng sinh trƣởng, phát
triển và năng suất cao.


6
- Tạo cây con đồng nhất về mặt di truyền, bảo tồn đƣợc các tính trạng đã
chọn lọc.
- Tạo đƣợc dòng thuần của các cây tạp giao.
- Bảo quản và lƣu giữ tập đồn gen.
- Có khả năng sản xuất quanh năm.
- Có thể nhân nhanh nhiều cây khơng kết hạt trong những điều kiện sinh thái
nhất định hoặc hạt nảy mầm kém.
- Hệ số nhân giống cao, rút ngắn thời gian đƣa một giống mới vào sản xuất
đại trà.
* Nhược điểm:
Nhƣợc điểm chính của phƣơng pháp ni cấy in vitro là đòi hỏi trang thiết bị
tiên tiến và kỹ thuật cao nên chỉ hiệu quả đối với những cây có giá trị cao hoặc
khơng nhân giống đƣợc bằng phƣơng pháp khác. Ngồi ra phƣơng pháp này cịn
có những bất lợi sau:
- Mặc dù số lƣợng cây giống thu đƣợc có thể rất cao nhƣng cây con kích thƣớc
nhỏ địi hỏi phải có kỹ thuật chăm sóc đặc biệt ở giai đoạn sau ống nghiệm.

- Cây có thể có những đặc tính khơng mong muốn.
- Khả năng đột biến cao.
- Khả năng tái sinh có thể mất đi do cấy chuyển nhiều lần.
- Cây giống có thể bị nhiễm bệnh đồng loạt.
Tuy vậy phƣơng pháp nhân giống in vitro ngày càng đƣợc sử dụng rộng rãi
để phục vụ cho những mục đích sau:
- Nhân nhanh và duy trì các cá thể đầu dịng tốt để cung cấp hạt giống các
lồi cây trồng khác nhau nhƣ cây lƣơng thực có củ, cây rau, cây hoa...của
nhóm cây thân thảo.
- Nhân nhanh và kinh tế các kiểu gen quý hiếm của giống cây công nghiệp
và gốc ghép cho nghề trồng cây ăn quả, cây cảnh của nhóm cây thân gỗ.


7
- Nhân nhanh ở điều kiện vô trùng và cách ly tái nhiễm kết hợp với
làm sạch virut.
- Bảo quản và lƣu giữ các tập đồn giống nhân giống vơ tính và các lồi giao
phấn trong ngân hàng gen.
1.2.4. Quy trình nhân giống in vitro
Gồm 5 giai đoạn [4]:
- Giai đoạn chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ
Mục đích chủ yếu của giai đoạn này là chuẩn bị đƣợc nguồn ngun liệu thực
vật cho q trình ni cấy. Khâu đầu tiên của giai đoạn này có thể coi nhƣ một
bƣớc thuần hóa vật liệu ni cấy. Cây mẹ (là cây cho nguồn mẫu nuôi cấy) đƣợc
đƣa ra khỏi nơi phân bố tự nhiên để chúng thích ứng với mơi trƣờng mới, đồng thời
giảm bớt khả năng nhiễm bệnh của mẫu nuôi cấy và chủ động nguồn mẫu trong
công tác nhân giống. Cây mẹ phải sạch bệnh, đặc biệt là bệnh virut và ở giai đoạn
sinh trƣởng mạnh. Thông thƣờng, cây mẹ là cây có những tính trạng tốt, đạt tiêu
chuẩn của các nhà chọn giống hoặc là những đối tƣợng đang có nguy cơ tuyệt
chủng. Trong trƣờng hợp cần thiết có thể làm trẻ hóa vật liệu giống.

- Giai đoạn nuôi cấy khởi động
Là giai đoạn khử trùng và đƣa mẫu vào ni cấy in vitro. Khi đã có nguồn
ngun liệu nuôi cấy, tiến hành lấy mẫu và xử lý mẫu cấy trong những điều kiện
vô trùng. Khi lấy mẫu cần chọn loại mẫu cấy phù hợp (đúng loại mô, đúng giai
đoạn phát triển: thƣờng lấy chồi đỉnh, chồi nách hay đoạn thân, mảnh lá...).
Ngƣời ta thƣờng khử trùng mẫu cấy bằng một số loại hóa chất nhƣ: HgCl2 0,1%,
cồn 70%, H2O2, Ca(OCl)2.... Để tăng tính linh động của hóa chất diệt khuẩn,
ngƣời ta thƣờng sử dụng thêm các chất làm giảm sức căng bề mặt nhƣ tween 20,
tween 80, teepol... Mẫu sau khi đƣợc khử trùng đƣợc cấy vào môi trƣờng nuôi
cấy khởi động.


8
Bảng 1.1: Một số loại hóa chất thƣờng dùng trong khử trùng bề mặt mẫu cấy:
Hoá chất

Nồng độ áp dụng

Thời gian áp dụng
(phút)

Calci hypochlorite

9-10%

5-30

Nƣớc Javel hoặc

2% của dung dịch tẩy rửa

5-30

Clorox (NaOCl)

(20% NaOCl)

Nƣớc Brom

1-2%

2-10

H2O2

10-20%

5-15

AgNO3

1%

5-30

HgCl2

0.1-1%

2-10

Kháng sinh

400-500 mg/l

30-60

Một số vấn đề phát sinh trong khử trùng bề mặt mẫu cấy:
- Virus: Virus là tác nhân gây hại nguy hiểm trong nông nghiệp. Một mẫu
cấy nhiễm virus có thể tạo ra vơ số cây con nhiễm. Vì vậy để tạo cây giống
khơng nhiễm virus thì mẫu cấy ban đầu phải đảm bảo khơng bị nhiễm virus.
- Vi khuẩn: Nhiễm do vi khuẩn thƣờng gặp trong ni cấy mơ. Vi khuẩn có
thể sống tự do trong khơng khí, sự hiện diện của chúng trong mơi trƣờng ni
cấy gây nhiều bất lợi, có thể gây chết cây hoặc làm chậm sinh trƣởng của mẫu
nuôi cấy.
Trong thực tế, việc quản lý mẫu cấy và môi trƣờng ni cấy vơ trùng là
rất khó khăn. Đơi khi triệu chứng nhiễm xuất hiện chậm trong môi trƣờng nuôi
cấy hoặc sau vài lần cấy chuyền. Các vi khuẩn gây nhiễm thƣờng gặp trong q
trình ni cấy là Agrobacterium, Bacillus, Pseudomonas, Lactobacillus,
Staphylococus. Biện pháp khắc phục phổ biến là cấy đỉnh sinh trƣởng hoặc dùng
kháng sinh.


9
- Nấm: Nấm rất dễ nhiễm trong q trình ni cấy làm hạn chế sự phát triển
của mẫu cấy, làm chết mẫu cấy. Nhiều loại nấm thƣờng gặp trong nuôi cấy mô
là Aspergillus, Candida, Microsprium, Phialopora. Sự nhiễm nấm thƣờng dễ
phát hiện sau 1 đến 2 tuần cấy mẫu, nguyên nhân gây nhiễm là do khử trùng bề
mặt mẫu cấy chƣa sạch hoặc hố chất khử trùng chƣa thíchhợp, nhiễm do thao
tác cấy chuyền hoặc bởi côn trùng nhỏ...

Giai đoạn này cần đảm bảo các yêu cầu: Tỷ lệ nhiễm bệnh thấp, tỷ lệ sống
cao, mô tồn tại và sinh trƣởng tốt [19].
- Giai đoạn nhân nhanh
Một trong những ƣu thế lớn nhất của phƣơng pháp nhân giống in vitro so với
các phƣơng pháp nhân giống truyền thống là có hệ số nhân cao. Vì vậy, giai
đoạn nhân nhanh đƣợc coi là giai đoạn then chốt của toàn bộ quá trình nhân
giống. Phải xác định đƣợc mơi trƣờng dinh dƣỡng và môi trƣờng vật lý phù hợp
để đạt hiệu quả cao nhất. Vai trò của các chất điều hòa sinh trƣởng, chất phụ gia
(nƣớc dừa, khoai tây...) là đặc biệt quan trọng. Tăng cƣờng chiếu sáng là yếu tố
quan trọng kích thích mơ phân hóa mạnh. Bảo đảm chế độ nhiệt 20-300C. Yêu
cầu cần đạt trong giai đoạn này là tạo đƣợc hệ số nhân cao.
- Giai đoạn tạo cây hồn chỉnh
Đây là giai đoạn các chồi đã đạt kích thƣớc nhất định và đƣợc chuyển từ môi
trƣờng ở giai đoạn 3 sang môi trƣờng nuôi cấy tạo rễ để hình thành cây hồn
chỉnh. Ở giai đoạn này, mơi trƣờng cần giảm lƣợng cytokinin và tăng lƣợng
auxin để rễ phát triển (Pierik, 1987). Các chất α – NAA, IBA, IAA thƣờng đƣợc
sử dụng ở nồng độ 1-5 mg/l để tạo rễ cho hầu hết các loại cây trồng. Từ những
chồi riêng lẻ này sẽ xuất hiện rễ và trở thành cây hoàn chỉnh. Lúc này cây con
rất nhạy cảm với độ ẩm và bệnh tật do hoạt động của lá và rễ mới sinh rất yếu,
cây chƣa chuyển sang giai đoạn tự dƣỡng. Yêu cầu cần đạt đƣợc trong giai đoạn
này là cây con tạo ra đủ tiêu chuẩn về chiều cao, số lá và số rễ.


10
- Giai đoạn đưa cây mô ra ngo i vườn ươm
Đây là giai đoạn chuyển dần cây con từ ống nghiệm ra nhà kính rồi ra ngồi
trời để tạo điều kiện cho cây con tự dƣỡng hồn tồn và thích nghi dần với môi
trƣờng tự nhiên. Khi cây đủ tiêu chuẩn cứng cáp thì mang trồng. Để đƣa cây từ
ống nghiệm ra mơi trƣờng bên ngồi đạt tỷ lệ sống cao cần đảm bảo một số yêu
cầu: cây trong ống nghiệm đạt những tiêu chuẩn về hình thái nhất định, có giá

thể tiếp nhận cây in vitro thích hợp, phải giữ ẩm cho cây khi mới đƣa cây từ ống
nghiệm ra, duy trì độ ẩm trên 50% để cây con không mất nƣớc đặc biệt trong 2-3
tuần đầu, tránh ánh sáng quá mạnh gây cháy lá, tránh nhiễm khuẩn và nấm gây
thối nhũn. Điều kiện môi trƣờng trong giai đoạn này là rất quan trọng, cần tạo
điều kiện cho bộ rễ phát triển, Cây cứng cáp và phòng bệnh cho cây. Đây đƣợc
xem là công đoạn quyết định khả năng ứng dụng quy trình này trong thực tiễn
sản xuất.
1.3. Một số nghiên cứu nhân giống hoa lan trên thế giới và ở Việt Nam
1.3.1. Trên thế giới
Trên thế giới, phong lan là loài hoa đẹp và rất đƣợc ƣa chuộng, hiện có
khoảng 25.000 lồi hoa lan khác nhau. Hiện nay nhu cầu về hoa lan trên thế giới
rất cao, nghề nuôi trồng hoa lan đã trở thành một bộ phận chủ yếu của ngành
trồng hoa xuất khẩu của nhiều nƣớc. Trong điều kiện tự nhiên, sự phát triển về số
lƣợng lan bằng con đƣờng sinh sản sinh dƣỡng rất chậm. Mặt khác, một số lồi
lan có hạt bản thân hạt lại rất khó nảy mầm nhƣ các lồi lan thuộc chi
Phaphiopelium, Dendrobium, Cymbidium, Vanda.... Đứng trƣớc những vấn đề
trên cùng với nhu cầu thƣờng thức hoa lan ngày càng cao, ngày nay với sự tiến bộ
của khoa học kỹ thuật, đặc biệt là công nghệ khoa học thực vật đã làm thay đổi
hoàn toàn kỹ thuật nhân giống lan. Với kỹ thuật nhân giống in vitro không những
tạo đƣợc số lƣợng cây giống lớn đồng nhất trong một thời gian ngắn mà cịn ngăn
cản sự thối hóa giống.


11
Haberlandt (1898) là ngƣời đầu tiên đề xuất phƣơng pháp ni cấy mơ tế
bào thực vật. Ơng đã tìm cách ni cấy tế bào đã phân hóa tách từ lá một số cây
một lá mầm nhƣng không thành công. Hơn thế, ông lại dùng tế bào đã mất hết
khả năng tái sinh [2].
Năm 1904, Noel Benarrd và Burgeff ngƣời Đức cộng tác với nhau để đƣa ra
phƣơng pháp gieo hạt lan có nhiễm trong chai thạch. Phƣơng pháp này đã làm

gia tăng số lƣợng lớn cây con trồng từ hạt.
Vào những năm 1930, Schmacker (1929), Schitterer (1931), Laurue (1933)
đã bƣớc đầu nuôi cấy thành công đầu rễ phân lập trong mơi trƣờng nhân tạo.
Đây là những tiến bộ rất có ý nghĩa [2].
Năm 1931, White và Gautheret đã nghiên cứu thành công môi trƣờng nuôi
cấy phong lan. Trên môi trƣờng của White và Gautheret, hạt lan có thể nảy mầm
khơng cần sự có mặt của nấm Rhiroctonia.
Georges Morel, học trị của R.J.Gautheret đã áp dụng phƣơng pháp nuôi cấy
mô vào cây lan từ năm 1956. Ơng cơng bố thành cơng ấy trên A.O.S (American
Orchid Society) vào năm 1960 và giống lan đầu tiên ông áp dụng thành công là
giống lan Cymbidium.
Một số nghiên cứu về chi Dendrobium:
Với cây hoa lan, việc sử dụng các hình thức sinh sản vơ tính nhƣ ƣơm, giâm
cây keiki rất ít đƣợc áp dụng. Phƣơng pháp nhân giống vơ tính bằng ni cấy
mơ tế bào thực vật ra đời đã nhận đƣợc nhiều sự quan tâm và đƣợc áp dụng vào
nhân giống cây hoa lan để tạo số lƣợng lớn. Môi trƣờng dinh dƣỡng sử dụng cho
việc nuôi cấy mô hoa lan đƣợc sử dụng chủ yếu là môi trƣờng MS (Murashige –
Shoog, 1962), 1/2 MS, V.W (Vacine – Went, 1949), KC (Knudson’s C medium,
1921), N6 (Chu’s, 1975),... [5]; [7].
Trong thời gian qua đã có một số tác giả nghiên cứu nhân giống bằng hạt ở
các loài lan khác nhau trong chi Hoàng Thảo (Dendrobium) nhƣ: lan Đơn Cam


12
(Dendrobium unicum) đƣợc cho nảy mầm từ hạt 180 ngày tuổi, Hoàng Thảo Đùi
Gà (Dendrobium nobile), lan Trúc Phật Bà (Dendrobium pendulum) từ hạt
trƣởng thành; lan Tam Bảo Sắc (Dendrobium devonianum) đƣợc cho nảy mầm
từ hạt giống ở các lứa tuổi khác nhau, lan Vảy Rồng (Dendrobium aggregatum)
đƣợc cho nảy mầm từ hạt 3-4 tháng tuổi,...[16].
Gần đây nhất (năm 2015) một bài báo tổng quan về nuôi cấy in vitro từ hạt

quả của chi lan Hoàng Thảo (Dendrobium) đã chỉ ra một số môi trƣờng để khử
trùng quả lan đƣợc sử dụng nhiều nhất là: EtOH (cồn) và HgCl2 (28,3%), EtOH
và NaOCl (15,1%), EtOH và đốt nhanh trên ngọn lửa đèn cồn (15,1%); trong đó
nồng độ các chất thƣờng đƣợc sử dụng là: EtOH 70%, HgCl2 0,1-1%, NaOCl 110%. Đồng thời, nghiên cứu cũng chỉ ra một số môi trƣờng nuôi cấy hạt lan
đƣợc sử dụng nhiều nhất trong các nghiên cứu là: MS (30,2%), ½ MS (13,2%),
KC (11,3%), N6 (11,3%). Phần lớn các môi trƣờng đều đƣợc bổ sung
phytohoocmon với nồng độ 0,1-2 mg/l [16].
Sơn Thủy Tiên (Dendrobium chrysotoxum) là một loài lan đẹp, tuy nhiên trên
thế giới cũng chƣa có nhiều cơng trình nghiên cứu. Roy và cộng sự (2007)
nghiên cứu sự hình thành mơ sẹo từ đỉnh chồi sử dụng mơi trƣờng Knudson’s C
(KC) sửa đổi, có bổ sung các chất điều hòa sinh trƣởng nhƣ Thidiazuron (TDZ),
N6-benzylaminopurine (BAP) và α-Naphthaleneacetic acid (NAA) ở các nồng
độ khác nhau [17]. Nhóm tác giả ngƣời Ấn Độ (2014) nghiên cứu sự nảy mầm
của hạt lan Sơn Thủy Tiên (Dendrobium chrysotoxum) trong mơi trƣờng Mitra
(M) có bổ sung với nồng độ khác nhau của auxin và cytokinin. Nghiên cứu chỉ
ra rằng, sự nảy mầm hạt lan tốt nhất khi môi trƣờng M có bổ sung 0.4% than
hoạt tính (AC), 2mg/l 6-benzyl amino purine (BAP), và 2 mg/l indole-3-acetic
acid (IAA) [18].


13
1.3.2. Ở Việt Nam
Việt Nam có khí hậu nhiệt đới gió mùa, có nhiều điều kiện tự nhiên thích
hợp cho sự sinh trƣởng và phát triển của nhiều giống lan. Bênh cạnh đó, cơng
nghệ ni cấy mơ cũng đã đƣợc nghiên cứu khá lâu, đến nay đã thu đƣợc một số
kết quả tiêu biểu.
Theo các chuyên gia về hoa của trƣờng Đại học Nơng nghiệp I, với khoảng
755 lồi lan hiện có, với khí hậu thích hợp và nguồn ngun liệu làm giá thể
phong phú, Việt Nam có thể trở thành một nƣớc sản xuất hoa phong lan lớn
trong khu vực.

Viện Di truyền Nông nghiệp Việt Nam bƣớc đầu cũng đã có những thành
cơng trong việc ni cấy phong lan theo công nghệ đƣợc chuyển giao từ Thái
Lan. Một số địa phƣơng khác nhƣ Sa Pa, Phú Yên bƣớc đầu đã khảo sát và
nghiên cứu phƣơng pháp nhân giống, hoàn thiện quy trình sản xuất phong lan.
Tháng 9 năm 2004, Tiến sĩ Dƣơng Tấn Nhựt đã nhân giống vơ tính thành
cơng lồi lan Hài Hồng, đây là một trong những loài đặc hữu của Việt Nam [8].
Năm 2006 đến 2008, trƣờng Đại học An Giang thực hiện đề tài với 2 quy
trình vi nhân giống lan Dendrobium anosmum và Dendrobium mini, thử nghiệm
ra cây lan Dendrobium mini trên nhiều loại giá thể khác nhau [15].
Kết quả trên giống lan Dendrobium anosmum là:
- Quả lan Dendrobium anosmum sau khi đƣợc tự thụ 4 tháng, đem khử trùng
và gieo cấy hạt vào mơi trƣờng thích hợp. Sau 3 tháng gieo cấy thì tất cả các hạt
đều nảy mầm tốt, tỷ lệ đạt đƣợc là ≥ 85% trên môi trƣờng MS + 1mg/l NAA và
môi trƣờng MS + 1mg/l BAP + 0,2mg/l NAA.
- Sau giai đoạn nhân nhanh: Chồi lan Dendrobium anosmum phát triển và
nảy chồi rất tốt trên môi trƣờng MS + 2mg/l BAP, ở thời gian 3 tháng sau khi
cây đạt 3,17 chồi, chồi cao 20,6mm. Môi trƣờng MS không bổ sung BAP cho
kết quả nhân chồi thấp. Đồng thời khi sử dụng BAP ở nồng độ cao (10mg/l) vào


14
môi trƣờng nhân chồi cũng cho kết quả tạo chồi thấp (1,5 chồi), xuất hiện chồi
dị dạng, cây phát triển yếu.
Kết quả trên giống lan Dendrobium mini là:
- Chồi lan Dendrobium mini phát triển và nảy chồi rất tốt trên mơi trƣờng có
bổ sung 1mg/l BAP. Xét về tính kinh tế thì mơi trƣờng 1/2MS + 1mg/l BAP cho
hiệu quả cao hơn trong việc nhân nhanh chồi lan Dendrobium mini. Sau 2 tháng
nhân chồi thì hệ số nhân chồi đạt 3,8 lần, chiều cao chồi đạt 1,26cm [13].
Trung tâm Ứng dụng tiến bộ khoa học và công nghệ đã nghiên cứu và hồn
thiện đƣợc nhiều quy trình vi nhân giống cây trồng bằng phƣơng pháp nuôi cấy

mô các giống cây ăn quả, cây cơng nghiệp, cây hoa cảnh có giá trị kinh tế cao,
phù hợp với điều kiện lập địa ở Bình Định và các tỉnh vùng Nam Trung Bộ và
Tây Nguyên nhƣ: chuối, đu đủ, dứa, mía, bạch đàn, keo lai và một số loài phong
lan, lay ơn, hoa cúc, hoa huệ.... Hầu hết các loại cây này đều đã hồn thiện quy
trình, đủ tiêu chuẩn trồng cây thƣơng phẩm ngoài đồng ruộng và đã chuyển giao
cho ngƣời dân.
Nhƣ vậy, nhân giống bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật ở Việt
Nam ngày càng đƣợc áp dụng rộng rãi đối với nhiều lồi cây trồng nói chung và
cây hoa lan nói riêng. Nhiều lồi lan trong chi Hoàng Thảo ( Dendrobium) đã
đƣợc nghiên cứu nhân giống bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật.
Năm 2009, Nguyễn Văn Minh và Nguyễn Hữu Lễ đã tiến hành nghiên cứu về
ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh trƣởng thực vật lên sự phát sinh chồi và rễ cây
loài lan Giã Hạc (Dendrobium anosmum) [6].
Năm 2011, Nguyễn Văn Song và cộng sự đã nghiên cứu nhân giống in vitro
lan Kim Điệp (Dendrobium chrysotoxum). Kết quả cho thấy nguyên liệu sử
dụng là hạt của quả lan 3 tháng tuổi, môi trƣờng thích hợp cho nảy mầm và phát
sinh protocorm của hạt là MS cơ bản có 20g/l saccarose, 8g/l agar, 15% nƣớc
dừa và 2,0mg/l BAP; môi trƣờng nhân nhanh protocorm tốt nhất là MS cơ bản


15
có 20g/l saccarose, 8g/l agar, 15% nƣớc dừa và 2,0mg/l BAP; mơi trƣờng MS cơ
bản có 30g/l saccarose, 8g/l agar, 1g/l than hoạt tính, 15% nƣớc dừa, 2,0mg/l
BAP và 1,0mg/l NAA thích hợp nhất cho tái sinh chồi từ protocorm và sinh
trƣởng của chồi in vitro [11].
Năm 2012, Vũ Thanh Sắc và cộng sự nghiên cứu về nhân giống in vitro lan
Hồng Thảo Trầm Trắng (Dendrobium anosmumvar.alba) [10].
Cùng năm đó, Nguyễn Thị Sơn và cộng sự cũng đã nghiên cứu về nhân giống
in vitro loài lan Hoàng Thảo Long Nhãn (Dendrobium fimbriatum hook) từ quả
với mục đích bảo tồn và phát triển nguồn gen loài lan quý. Kết quả nghiên cứu

đã chỉ rõ: Nguyên liệu sử dụng là quả lan 3 tháng tuổi; mơi trƣờng thích hợp cho
nảy mầm và phát sinh protocom của hạt là môi trƣờng MS + 100ml nƣớc dừa +
10g saccarose + 6,0g agar/lít mơi trƣờng; môi trƣờng nhân nhanh protocorm tốt
nhất là môi trƣờng KC + 100ml nƣớc dừa + 10g saccarose + 60g khoai tây +
6,0g agar/lít mơi trƣờng; mơi trƣờng MS + 100ml nƣớc dừa + 20g saccarose +
60g chuối chín + 6,0g agar/lít mơi trƣờng là thích hợp nhất cho nhân nhanh chồi
in vitro [12].
Năm 2013,Vũ Ngọc Lan, Nguyễn Thị Lý Anh nghiên cứu về nhân giống
in vitro loài Lan bản địa Thạch Hộc (Dendrobium nobile lindl) nhằm mục đích
để bảo tồn và phát triển lồi lan q chi Hồng Thảo, có giá trị thẩm mỹ và dƣợc
liệu cao, đang có nguy cơ tuyệt chủng. Kết quả cho thấy nguyên liệu sử dụng
thích hợp là quả lan 5 tháng tuổi, mơi trƣờng gieo hạt là MS + (100ml nƣớc dừa
+ 10g saccarose + 6,0g agar)/lít mơi trƣờng [5].


16
CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG, PHẠM VI VÀ PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
- Giống lan Sơn Thủy Tiên (Dendrobium chrysotoxum) thu hái từ cây ngồi
tự nhiên.
- Vật liệu vào mẫu: Qủa lan

Hình 2.1: Cây lan Sơn Thủy Tiên

Hình 2.2: Quả lan Sơn Thủy Tiên

(Dendrobium chrysotoxum)
2.1.2. Phạm vi nghiên cứu

- Phạm vi nghiên cứu: Nghiên cứu các hóa chất khử trùng và sự nảy mầm
của cây lan Sơn Thủy Tiên (Dendrobium chrysotoxum) thông qua các môi
trƣờng nuôi cấy khác nhau đến giai đoạn tạo protocom.
- Địa điểm nghiên cứu: Các thí nghiệm đƣợc tiến hành tại Trung tâm
nghiên cứu công nghệ sinh học của khoa Khoa học tự nhiên và phòng
thực hành Sinh học khoa Khoa học tự nhiên trƣờng Đại học Hùng Vƣơng
- Thị xã Phú Thọ - Tỉnh Phú Thọ.
- Chỉ tiêu đánh giá: Độ nhiễm mẫu, khả năng nảy mầm của hạt lan Sơn
Thủy Tiên.
- Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 10/2016 đến tháng 5/2017