Phân lập và xác định cấu trúc hợp chất thiên nhiên từ cặn chiết MeOH thân cây trâu cổ (ficus pumila l)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC HÙNG VƯƠNG
KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN

ĐỖ NGỌC ÁNH

PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HỢP CHẤT
THIÊN NHIÊN TỪ CẶN CHIẾT MeOH THÂN CÂY
TRÂU CỔ (Ficus pumila L.)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Ngành: Sư phạm Hóa học

Phú Thọ, 2020


TRƯỜNG ĐẠI HỌC HÙNG VƯƠNG
KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN

ĐỖ NGỌC ÁNH

PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HỢP CHẤT
THIÊN NHIÊN TỪ CẶN CHIẾT MeOH THÂN CÂY
TRÂU CỔ (Ficus pumila L.)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Ngành: Sư phạm Hóa học

NGƯỜI HƯỚNG DẪN:

1. TS. Triệu Quý Hùng
2. ThS. Nguyễn Thị Bình Yên

Phú Thọ, 2020


i

LỜI CAM ĐOAN

Em xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu khoa học của riêng em dưới
sự hướng dẫn khoa học của ThS. Nguyễn Thị Bình Yên và TS. Triệu Quý
Hùng. Các nội dung chưa được công bố trong các cơng trình khoa học khác. Các
số liệu tham khảo được trích dẫn đầy đủ.

Sinh viên

Đỗ Ngọc Ánh


ii

LỜI CẢM ƠN

Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn Thầy hướng dẫn khoa
học: ThS. Nguyễn Thị Bình Yên và TS. Triệu Quý Hùng - Trường Đại học
Hùng Vương đã chỉ ra hướng nghiên cứu và tận tình hướng dẫn em trong suốt quá
trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp.
Nhân dịp này em xin bày tỏ sự cảm ơn sâu sắc đến Ban Lãnh đạo Trường
Đại học Hùng Vương, Khoa Khoa học Tự nhiên-Trường Đại học Hùng Vương đã
tạo cho em một môi trường học tập khoa học, nghiêm túc.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân và các bạn sinh

viên K14 - ĐHSP Hóa học-Trường Đại học Hùng Vương đã hỗ trợ, động viên em
trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài..

Phú Thọ, ngày 31 tháng 5 năm 2020
Sinh viên

Đỗ Ngọc Ánh


iii

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ................................................. v
DANH MỤC CÁC HÌNH .................................................................................... vi
DANH MỤC CÁC BẢNG.................................................................................. vii
MỞ ĐẦU ............................................................................................................... 1
1. Lý do lựa chọn đề tài ......................................................................................... 1
2. Mục tiêu của đề tài ............................................................................................ 1
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài .......................................................... 2
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU ..................................... 3
1.1 Giới thiệu về chi Ficus .................................................................................... 3
1.2 Các nghiên cứu về hóa thực vật chi Ficus ...................................................... 7
1.3 Sơ lược về lớp chất steroid .............................................................................. 8
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU .................................................................................................................... 11
2.1 Đối tượng, vật liệu nghiên cứu...................................................................... 11
2.1.1 Đối tượng nghiên cứu ............................................................................. 11
2.1.2 Vật liệu và thiết bị ................................................................................... 11
2.2 Phương pháp nghiên cứu ............................................................................... 11

2.2.1 Phương pháp ngâm chiết......................................................................... 11
2.2.2 Phương pháp phân lập hợp chất thiên nhiên ........................................... 12
2.2.3 Phương pháp xác định cấu trúc hợp chất thiên nhiên ............................. 20
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ............................ 26
3.1 Thu hái, xử lý mẫu và điều chế các cặn chiết ............................................... 26
3.2 Quá trình phân lập các chất từ dịch chiết MeOH .......................................... 29
3.2.1 Khảo sát thành phần định tính và lựa chọn dung mơi ............................ 29
3.2.2 Q trình phân lập các chất ..................................................................... 31


iv

3.3 Xác định cấu trúc hợp chất M1 ..................................................................... 33
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ............................................................................. 39
1. Kết luận ........................................................................................................... 39
2. Kiến nghị ......................................................................................................... 39
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 40


v

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
 Các phương pháp sắc ký
TLC

Thin Layer Chromatography: Sắc ký lớp mỏng

CC

Column Chromatography: Sắc ký cột

 Các phương pháp phổ
1

H-NMR Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy: Phổ cộng hưởng từ
hạt nhân proton
s: singlet (vạch đơn)
m: multiplet (đa vạch)

d: doublet (vạch đôi)
dd: double doublet (tách đôi vạch đôi)

 Các chữ viết tắt khác
TMS

Tetramethyl silan

CTPT

Công thức phân tử

 Tên của các hợp chất được viết theo nguyên bản Tiếng Anh


vi

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1: Lá và quả cây Trâu cổ ........................................................................... 7
Hình 2.1. Minh họa sắc kí lớp mỏng ................................................................... 13
Hình 2.2. Bản mỏng Silica gel F254 của hãng Merck ........................................ 14

Hình 2.3. Một số cột sắc kí (1) và Silica gel 60 của hãng Merck (2) ................. 18
Hình 2.4. Minh họa sắc kí cột ............................................................................. 19
Hình 2.5. Độ chuyển dịch hóa học của proton .................................................... 22
Hình 2.6. Phổ EI11 của benzamide ..................................................................... 24
Hình 2.7. Phổ ESI-MS của lactose ...................................................................... 25
Hình 3.1. Thân cây Trâu cổ sau khi được phơi khơ, say nhỏ ............................. 26
Hình 3.2. Mẫu thân cây trâu cổ ngâm trong dung mơi n-hexane........................ 27
Hình 3.3. Lọc dịch chiết qua vải lọc và giấy lọc................................................. 27
Hình 3.4. Chưng cấ t dich
̣ chiế t dưới hê ̣ thố ng cấ t quay có áp suấ t giảm............ 28
Hình 3.5. Sơ đồ ngâm chiết thân cây Trâu cổ ..................................................... 28
Hình 3.6. Bản mỏng TLC cặn CH2Cl2, hệ dm II, hiện màu bằng TT Cerisulfat 30
Hình 3.7. Sơ đồ phân lập dịch chiết MeOH thân cây Trâu cổ ............................ 33
Hình 3.8. Cấu trúc hợp chất M1 .......................................................................... 34
Hình 3.9. Bản mỏng TLC so sánh giữa hợp chất M1 với hỗn hợp chuẩn .......... 35
Hình 3.10. Phổ IR của M1 .................................................................................. 36
Hình 3.11. Phổ MS của M1 ................................................................................. 37
Hình 3.12. Phổ 1H-NMR của M1 ........................................................................ 38


vii

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1 Tần số hấp thụ hồng ngoại của một số nhóm nguyên tử ..................... 23
Bảng 3.1. Kết quả khảo sát cặn chiết MeOH ...................................................... 30
Bảng 3.2. Kết quả các phân đoạn thu được từ cột tổng MeOH .......................... 32


1

MỞ ĐẦU
1. Lý do lựa chọn đề tài
Từ nhiều thế kỷ nay, các sản phẩm thiên nhiên luôn là một nguồn chủ yếu
cung cấp các thuốc chữa bệnh cho con người, và khoảng một nửa các dược phẩm
được sử dụng ngày nay bắt nguồn từ các sản phẩm thiên nhiên. Do tính đa dạng
cả về cấu trúc hố học lẫn hoạt tính sinh học, các sản phẩm thiên nhiên khơng
những được sử dụng trực tiếp làm các tác nhân điều trị mà còn là những hợp chất
dẫn đường cho việc phát triển các thuốc mới.
Việt Nam là nước nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, ẩm ướt quanh
năm, do đó hệ thực vật phát triển rất đa dạng và phong phú, tiềm ẩn những hoạt
chất có khả năng chữa các bệnh nan y.
Theo tác giả Võ Văn Chi, chi Ficus (tên tiếng Việt là Trâu cổ) ở Việt Nam
có 99 lồi và nhiều lồi Ficus này đã được sử dụng làm thuốc giảm đau, thanh
nhiệt, cầm máu, trị ghẻ lở; một số lồi cịn dùng quả để bồi bổ sức khỏe, ...[1] mở
ra tiềm năng nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các loài
Ficus.
Dựa trên các tài liệu tham khảo cho thấy cho đến nay vẫn chưa có cơng trình
khoa học nào cơng bố về thành phần hóa học thân cây Trâu cổ trên địa bàn tỉnh
Phú Thọ. Xuất phát từ các lý do trên, nhằm mục tiêu tìm kiếm các hợp chất thiên
nhiên từ các loài thực vật của Việt Nam, chúng tôi lựa chọn đề tài “Phân lập và
xác định cấu trúc hợp chất thiên nhiên từ cặn chiết MeOH thân cây Trâu cổ (Ficus
pumila L.)”.

2. Mục tiêu của đề tài
- Điều chế cặn chiết MeOH thân cây Trâu cổ và phân lập được chất sạch từ
cặn chiết CH2Cl2 thân cây Trâu cổ.
- Xác định cấu trúc hợp chất phân lập được từ cặn chiết MeOH thân cây
Trâu cổ bằng các phương pháp phổ.

2

3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
- Ý nghĩa khoa học: Kết quả của đề tài đóng góp thơng tin cho lĩnh vực
nghiên cứu hóa thực vật về thành phần hóa học thân cây Trâu cổ (Ficus pumila
L.) họ dâu tằm (Moraceae).
- Ý nghĩa thực tiễn: Đề tài cung cấp cơ sở khoa học định hướng cho việc
nghiên cứu, sử dụng loài thực vật Trâu cổ (Ficus pumila L.) của Việt Nam; đồng
thời góp phần nâng cao kiến thức về thực nghiệm chiết tách, phân lập các hợp
chất thiên nhiên, về phổ cộng hưởng từ hạt nhân cho sinh viên. Bên cạnh đó đề tài
cịn là tài liệu tham khảo cho sinh viên ngành hóa học và cán bộ nghiên cứu hóa học
hữu cơ.


3

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU
1.1 Giới thiệu về chi Ficus
Theo tác giả Võ Văn Chi [1], chi Trâu cổ (F.pumila L) được biết đến là họ
Dâu tằm (Moraceae) [Tên Latin của cây, biến âm của chữ sakon: Tên Hy Lạp của
cây Sung ngọt] – Sung, Vả, Đa. Nhóm này bao gồm khoảng 800 lồi, chủ yếu ở
vùng nhiệt đới và nóng trên thế giới, chủ yếu ở vùng Ấn Độ - Mã Lai. Ở nước ta
có 99 loài mà nhiều loài được sử dụng trong y học cổ truyền cũng như trong dân
gian.
Theo từ điển thực vật thông dụng Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam
của tác giả Đỗ Tất Lợi cho ta biết các loài Ficus L ở dạng cây gỗ lớn, cây nhỡ hay
dây leo, có dịch như sữa. Lá cây Trâu cổ mọc so le hay mọc đối, nguyên, chia
thùy hoặc có răng; lá kèm thường rụng sớm. Khi cây ra hoa cụm hoa gồm nhiều
hoa chứa trong một đế hoa kín gọi là “ sung”, phía trên có một lỗ mở có vảy.
Trong đế của hoa sung có các hoa đực, cái hay trung tính, hoa đực ở phía trên,

hoa cái ở phía dưới và hoa trung tính tiêu giảm thành đài hoặc hoa cái [1]. Ở nước
ta, có 99 lồi; nhiều loài đã được sử dụng trong dân gian [1].
F.abelii Miq –Sung chè, Rù rì.
Các cây sung chè, Rù rì thường ở dạng bụi cao 1-2m; cành và cuống lá có
lơng dày xám. Lá các loài sung chè mọc so le, hình trứng ngược thn hay hình
dải, dài 4-8cm, rộng 1-2cm, mặt trên bóng, mặt dưới đầy lơng xám, gốc nhọn hay
tù trịn; gân bên 7-10 đơi; cuống lá dài 4-8mm. Cụm hoa hình trứng ngược trịn
hay hình quả lê, dài 7-18mm, đường kính 5-10mm, có lơng mịn, trên cuống dài
6-20mm, khi chín có màu đo đỏ. Phân bố ở Ấn Độ, Mianma, Trung Quốc, Việt
Nam, Lào. Ở nước ta có gặp từ Lạng Sơn, Hà Tây, Thanh Hóa vào Thừa Thiên –
Huế. Cây mọc hoang trong rừng, ven sông suối. Ở Vân Nam (Trung Quốc), thân
cây được dùng làm thuốc thanh nhiệt lợi niệu và chỉ thống.
F.altissima Blume – Đa tía, Đa.


4

Các cây đa tía, Đa thường ở dạng những cây gỗ rất lớn, cao đến 25m, khơng
có rễ phụ, cành ngang. Thân cây đa tía trịn , lớn, nhẵn. Lá của cây mọc so le, hình
bầu dục hay trái xoan, dài 8-21cm, rộng 4-12cm, trịn ở gốc, tù và có mũi nhọn ở
đầu, phiến dày, dai, nhẵn bóng cả 2 mặt 3-5 gân gốc, gân bên 4-5 đôi. Cuống lá
dài 2,8-5,5cm, hơi dẹt, khía rãnh. Lá kèm có lơng. Phân bố ở Ấn Độ, Trung Quốc,
Việt Nam đến Malaixia, Inđônêxia và Philippin. Ở nước ta cây thường được trồng
ở nhiều nơi từ Lạng Sơn, Phú Thọ, Hà Tây... và Quảng Trị, Khánh Hòa, Ninh
Thuận. Ở Trung Quốc rễ phụ của cây được dùng làm thuốc thanh nhiệt giải độc,
hoạt huyết, giảm đau.
F.carica L. – Sung ngọt, Vả tây.
Loài cây sung ngọt, vả tây là những cây thân gỗ nhỏ, thường có dạng bụi cao
trung bình 3-4cm, song thân cây có thể có chu vi tới 1m. Lá của cây dai, nạc, có
lơng, dài và rộng 10-20cm, hình chân vịt hay dạng tim nhiều hay ít, rất đa dạng,

thường có 5-7 thùy cách nhau bởi nhưxng góc lõm sâu; phiến xanh sẫm ở trên,
xanh nhạt ở dưới và ráp. Quả sung to, dạng như quả lê, hình gụ hay gần hình cầu,
có màu sắc thay đổi khi chín. Gốc ở vùng cận Đông ( Xyri, Iran, Á Tiểu Á, Hy
Lạp) nay trở thành hoang dại ở vùng Địa Trung Hải. Quả chín ăn rất ngọt dùng
ăn tươi hoặc phơi khơ như Chà là. Ở Ấn Độ quả được dùng làm thức ăn bổ dưỡng,
dịch quả xanh được dùng để hủy các mụn hạt cơm thường.
F.elastica Roxb.Ex Horn– Đa búp đỏ.
Cây đa búp đỏ là cây có dạng thân gỗ lớn cao đến 30m, tán xòe rộng, rất
nhiều rễ phụ to ở thân và cành. Cành của cây đa búp đỏ nhiều, khỏe, màu nâu
xám, nhẵn. Lá mọc so le, phiến thuôn hay hình trái xoan, tù ở gốc, có mũi nhọn ở
đầu, có 3-5 gân gốc, mặt trên màu lục bóng. Lá kèm rất dài, màu đỏ, mềm, sớm
rụng, bọc lấy các lá non thành một búp đỏ ở đầu cành. Phân bố ở Ấn Độ, Neepan,
Việt Nam, Mianma, Malaixia. Ở nước ta cây được nhập trồng ở nhiều thành phố
lớn, nay trở thành cây mọc hoang dại ở nhiều nơi, từ vùng đồng bằng lên vùng
núi cao đến 1000m. Lá được dùng làm thuốc giải cảm cho ra mồ hôi. Tua rễ lợi


5

tiểu mạnh, thường được dùng chữa phù nề, cổ trướng do sơ gan. Mủ dùng chữa
mụn nhọt.
F.erecta Thunb.Var.BeecheyanaKinh - Sung thiên tiên.
Cây sung thiên tiên là cây dạng nhỡ hay cây gỗ, cao 1-8m, cành to 5mm,
lóng ngắn, lúc non có lơng nằm. Lá cây có phiến bầu dục thon, dài 7-18cm, rộng
3,5 – 9cm, đầu nhọn, gốc hẹp hình tim, gân từ gơc chạy đến ½ phiến, gân bên 5
đôi, cuống dài 1,5cm; Lá kèm 1cm. Quả sung cô độc, trịn trịn, đường kính 11,8cm, trên cuống dài 2,3 cm, bao chung có 3 lá bắc nhỏ; hoa đực rải rác, có 3 lá
đài, 2-3 nhị; hoa cái có 3 lá đài, vòi nhụy dài; quả bé 1-3mm. Phân bố ở Nhật Bản,
Trung Quốc, Đài Loan, và Việt Nam. Ở nước ta có gặp ở Thanh Hóa. Cây mọc
trong rừng. Ở Trung Quốc, rễ cây được dùng chữa phong thấp, đau nhức xương.
Quả sung dùng để chữa bệnh trĩ.

F.hirta Vahl – Vú bị, Ngái lơng.
Cây vú bị, ngái lơng cây thân nhỡ hay cây nhỏ, cao 2-8m, có nhựa mủ; cành,
lá, cuống lá và hoa đều có lơng hoe dày. Lá cây có dạng hình bầu dục, hay xoan
ngược, phiến đơn hay chia 3 thùy, dài 8-25cm, rộng 4-13cm, thn trịn ở gốc, có
mũi nhọn ở đầu, có lơng nhám ở trên, lông hoe dài ở mặt dưới, mép có răng, cuống
2,5-5cm, có lơng dày, cứng. Cây vú bị, ngái lông thường được phân bố ở Ấn Độ,
Trung Quốc, Việt Nam. Ở nước ta cây này mọc hoang ở nhiều nơi và thường gặp
trong rừng thứ sinh, trên đất trống khe núi, các nguồn nước. Ra hoa từ tháng 12
đến tháng 2. Vở thân được dùng bện dây. Rễ cây dùng làm thuốc trị phong thấp,
tổn thương do lao lực, địn ngã tổn thương, bạch đới, ít sữa.
F.sumatrana Miq.var.subsumatranaCorner – Đa cừa, Cừa.
Cây đa cừa, Cừa là loại cây gỗ cao 20m, dày 80cm ở gốc, nhánh non khá
mảnh, dây 3-5mm, có mắt xít nhau. Lá cây hình bầu dục, tù hay trịn ở gốc, hơi
thót lại ở đầu tù, dài 5-10cm, rộng 3-5cm, rất nhẵn, dai; mép nguyên; gân gốc 3,
gân phụ 5 đơi, dính nhau với gân mép; cuống lá dài 15mm, dẹp, khơng có rãnh,
rộng 2,5mm,kéo dài dưới phiến tới các gân gốc bên chính; Lá kèm của cây có
hình ngọn giáo nhọn, dài 15-18mm. Cây thường tập trung phân bố ở Việt Nam,


6

Lào, Campuchia và Indonexia. Ở nước ta, cây có gặp từ Quảng Trị vào tới Lâm
Đồng. Cây mọc ven rừng núi. Nhựa mủ của cây dùng để cầm máu các vết thương.
F.pumila L– Trâu cổ, Sộp, Vẩy ốc.
Theo dân gian cây trâu cổ còn được gọi là vương bất lưu hành, sộp, vẩy ốc.
Đây là một loại cây cảnh nhưng lại có rất nhiều cơng dụng q, cây thường ở dạng
dây leo nhiều dễ bám, thân áp sát vào vách đá, vơ cây hay bờ tường; lúc non cây
có nhựa mủ trắng; nhánh nhiều, ngắn, mềm, mảnh, màu nâu hồng, lúc non có lơng
ngắn; các nhánh bị mang lá khơng cuống, gốc hình tim, các nhánh tự do mang lá
lớn hơn, phiến lá hình trái xoan hay hình bầu dục, nhẵn cả 2 mặt, mép lá nguyên,

có 3-5 gân gốc, nổi rõ ở mặt dưới; cuống lá có lơng. Cây có nguồn gốc từ Trung
Quốc, Nhật Bản, được trồng ở nhiều nước. Ở nước ta cây được trồng ở nhiều nơi,
nhất là các thành phố và thị xã. Cây ưa ẩm, mát, đủ ánh sáng. Nhiều bộ phận của
cây : rễ, dây, lá và quả phức được sử dụng làm thuốc. Quả phức, thường được
dùng trị lị lâu ngày, dây rễ của cây thường dùng cho việc trị phong thấp, sưng
độc, ung nhọt và kinh nguyệt khơng đều. Cịn lá của cây được dùng trị viêm khớp
xương, nhức mỏi chân tay, đòn ngã tổn thương; cũng dùng trị mụn nhọn, ngứa lở.
Dân gian còn dùng nhựa của cây Trâu cổ để bôi ngứa, ghẻ lở, hắc lào và một số
bệnh ngoài da khác.
Trâu cổ là một dây leo như rễ bám. Lõi hóa gỗ, thân có vỏ xù xì, từng đốt
dài, ngắn không đều nhau. Rễ mọc xung quanh các đốt, rễ bám vào vách đá, tường
nhà hoặc thân cây to cho cây leo lên nhà. Đường kính thân bình thường 3-5mm,
có khi tới 10mm [1].
Cành và lá non khi bẻ có nhựa màu trắng. Có 2 loại cành: Cành phía dưới lá
nhỏ như vẩy ốc (nên có tên cây là Dây vẩy ốc). Cành trưởng thành phía trên, lá to
hơn và dày, ráp như lá duối, (nhưng khơng có lơng) có hoa quả.


7

Hình 1.1: Lá và quả cây Trâu cổ
Đế hoa phình lên thành Quả giả dạng như quả Ngái, quả Sung, quả Vả thường
gọi là Quả, dài khoảng 30-40 mm, đường kính khoảng 25-30mm.
1.2 Các nghiên cứu về hóa thực vật chi Ficus
Dựa trên các tài liệu tham khảo cho thấy đến nay vẫn chưa có cơng trình
khoa học nào cơng bố chi tiết về thành phần hóa học của cây Trâu cổ.
Theo Từ điển thực vật thông dụng của tác giả Võ Văn Chi chỉ ra cho thấy
cây Trâu cổ có chứa steroid như β – sitosterol (1) [1].

Cơng trình công bố gần đây nhất trên thế giới năm 2012, cho thấy nhóm các

hợp chất terpenoid lupeol (2), guaiazulene (3), cadalene (4); flavonoid như
quercitin (5), alkaloid như dopamine (6), adrenaline (7), serotonin (8); các hợp
chất coumarin như umbeliferone (9) đã được phân lập từ một số loài thuộc chi
Ficus [4].


8

1.3 Sơ lược về lớp chất steroid
Các hợp chất steroid là những hợp chất thiên nhiên mà cấu trúc phân tử dựa
trên cấu trúc hệ 4 vòn của hợp chất androstane [5], [6].


9

Trong tự nhiên, các hợp chất steroid thường có dạng lập thể mà ở đó các
vịng A và B tiếp giáp tương tự cis- và trans-Decalin. Hầu hết các hợp chất steroid
trong tự nhiên có cấu trúc lập thể B-C, C-D tiếp giáp theo dạng trans.

CH 3 R
H 3C
H

HO
H

CH3 H CH3

H

H
H

=

HO

A

H

H

H

H

C

B

R
D

H

H

Dạng trans A-B steroid
CH 3 R

H 3C

CH3 H CH 3
H

H

H
H

HO
H

H

C

B

=

H

A

HO

H

D

R
H

H

H

Dạng cis A-B steroid
Một số hợp chất steroid điển hình trong tự nhiên như androsterone (10),
cholesterol (11), testosterone (12), estradiol (13) [6].


10


11

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Đối tượng, vật liệu nghiên cứu
2.1.1 Đối tượng nghiên cứu
Thân cây Trâu cổ được thu hái tại Phường Hùng Vương - Thị xã Phú Thọ Tỉnh Phú Thọ vào tháng 7/2018.
Phạm vi nghiên cứu: Cặn chiết MeOH thân cây Trâu cổ.
2.1.2 Vật liệu và thiết bị
Dung môi được sử dụng để phân lập hợp chất thiên nhiên: n-hexane, CH2Cl2,
EtOAc, MeOH, Acetone đều là hóa chất kỹ thuật của Hàn Quốc được chưng cất
lại trước khi sử dụng.
Quá trình quay cất dung môi dưới áp suất giảm được thực hiện trên máy
IKA®RV10 của Anh.

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều được đo bằng máy Bruker Avance
500 với TMS làm chất nội chuẩn thuộc Viện Hóa học –Viện Hàn lâm Khoa học
và Công nghệ Việt Nam.
2.2 Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Phương pháp ngâm chiết
Do cấu tạo hóa học của cây cỏ thường là những chất liệu đại phân tử tương
đối trơ, khơng hịa tan trong dung mơi hữu cơ, vì thế việc khảo sát hợp chất tự
nhiên nghĩa là chiết lấy và khảo sát các chất biến dưỡng thứ cấp có trọng lượng
phân tử nhỏ.
Nguyên tắc tổng quát là lựa chọn dung mơi và quy trình phù hợp để chiết
tách hợp chất ra khỏi mẫu cây, điều này tùy thuộc vào đặc tính của chất thứ cấp
có trong cây mà người khảo sát mong muốn tách cơ lập: cấu trúc hóa học đa dạng,
tính chất phân cực khác biệt,… Muốn chiết hợp chất ra khỏi cây cỏ cần chọn dung
môi phù hợp có độ phân cực tăng dần (n-hexane, dichloromethane, ethyl acetate,


12

methanol,…), sử dụng kỹ thuật chiết tách phù hợp bằng cách ngâm dầm rồi lọc.
Sau khi lọc, phần bã cây hoặc sinh khối cịn lại được lọc bỏ. Dung mơi qua lọc
được thu hồi bằng máy cô quay chân không ở nhiệt độ thấp khoảng 30-45oC vì
thực hiện ở nhiệt độ cao có thể làm hư hại một vài hợp chất kém bền nhiệt.
Kĩ thuật chiết ngâm dầm: Ngâm bột cây trong một bình chứa bằng thủy tinh
hoặc bằng thép khơng gỉ, bình có nắp đậy. Tránh sử dụng bình bằng nhựa vì dung
mơi hữu cơ có thể hịa tan một ít nhựa, gây nhầm lẫn là hợp chất đó có chứa trong
cây [2].
Rót dung mơi tinh khiết vào bình cho đến xấp xỉ bề mặt của lớp bột cây. Giữ
yên ở nhiệt độ phòng trong một đêm hoặc một ngày, để cho dung môi xuyên thấm
vào cấu trúc tế bào thực vật và hòa tan các hợp chất tự nhiên. Sau đó, dung dịch
chiết được lọc ngang qua một tờ giấy lọc; thu hồi dung mơi sẽ có được cao chiết.

Tiếp theo, rót dung mơi mới vào bình chứa bột cây và tiếp tục quá trình chiết thêm
một số lần nữa cho đến khi chiết kiệt mẫu cây [2].
Có thể gia tăng hiệu quả sự chiết bằng cách thỉnh thoảng đảo trộn, xốc đều
lớp bột cây hoặc có thể gắn bình vào máy lắc để lắc nhẹ (chú ý nắp bình bị bung
ra làm dung dịch chiết bị trào ra ngồi).
Mỗi lần ngâm dung mơi, chỉ cần 24 giờ là đủ, vì với một lượng dung mơi cố
định trong bình, mẫu chất chỉ hịa tan vào dung mơi đến đạt mức bão hịa, khơng
thể hịa tan thêm được nhiều hơn; có ngâm lâu hơn chỉ mất thời gian. Nhắc lại
quy tắc chiết là chiết nhiều lần, mỗi lần một ít lượng dung môi [2].
Dung môi sau khi được thu hồi, được làm khan nước bằng các chất làm khan
và được tiếp tục sử dụng để chiết các lần sau.
2.2.2 Phương pháp phân lập hợp chất thiên nhiên
2.2.2.1 Phương pháp kết tinh
Phương pháp kết tinh thường được sử dụng để tinh chế chất rắn bên cạnh các
phương pháp khác như phương pháp sắc ký. Theo nguyên tắc thường các chất rắn
tan tốt hơn trong dung môi ở nhiệt độ cao và tan kém ở nhiệt độ thấp hơn. Dựa


13

theo nguyên tắc này, chất rắn được hòa tan trong một lượng tối thiểu dung môi ở
nhiệt độ cao rồi làm lạnh dung dịch, ở nhiệt độ thấp hơn, dung dịch trở nên quá
bão hòa và chất rắn sẽ kết tủa [2].
Trong kỹ thuật kết tinh cịn có thể sử dụng hỗn hợp dung mơi trong đó dung
mơi hịa tan tốt hơn chất cần kết tinh dễ bay hơi hơn; khi để dung dịch bay hơi
chậm sẽ dần dần đạt tới quá bão hòa và chất rắn sẽ kết tinh [2].
2.2.2.2 Phương pháp sắc ký
Sự sắc kí là một phương pháp vật lí để tách một hỗn hợp gồm nhiều loại hợp
chất ra riêng thành từng loại đơn chất, dựa vào tính ái lực khác nhau của những
loại hợp chất đó đối với một hệ thống (hệ thống gồm hai pha: một pha động và

một pha tĩnh)
Để thực hiện quá trình sắc kí cần có ba hợp phần:
- Pha tĩnh (dung môi hoặc chất hấp phụ)
- Pha động (dung môi, dung mơi rửa giải hoặc khí mang)
- Mẫu chất (hỗn hợp của các hợp chất cần tách)
Trong quá trình sắc kí xảy ra sự phân bố cạnh tranh các chất của hỗn hợp
giữa pha động và pha tĩnh nhờ tính tan khác nhau của chất này trong dung môi
hoặc khả năng hấp phụ khác nhau của chúng; khi ấy cân bằng sẽ được thiết lập.
 Phương pháp sắc ký lớp mỏng

Hình 2.1. Minh họa sắc kí lớp mỏng
M: Hỗn hợp chất ban đầu
A, B: Các vệt chất được phân tách


14

Sắc ký lớp mỏng (TLC – Thin Layer Chromatography), còn gọi là Sắc kí bản
mỏng là một dạng của sắc kí lỏng – rắn dùng để khảo sát thành phần và sắc ký lớp
mỏng điều chế đều được thực hiện trên bản mỏng đế nhôm tráng sẵn Silica gel 60
F254 của hãng Merck có độ dày 0,25 mm. Dung mơi triển khai là 1 hoặc hỗn hợp
một số dung môi thơng dụng như n-hexane, dichloromethane, acetone, methanol,
ethanol.

Hình 2.2. Bản mỏng Silica gel F254 của hãng Merck
Trong phân tích TLC, vết mẫu dung dịch nghiên cứu được chấm vào bản
mỏng sắc kí. Bản sắc kí có mẫu đặt trong bình kín gọi là buồng sắc kí đã được
bão hịa bằng hơi dung môi tinh khiết hay hỗn hợp dung môi. Mức dung môi chiết
nằm đúng dưới đường chuẩn của mẫu.
Khi dung môi chuyển động lên trên, các cấu tử mẫu chuyển động theo với

tốc độ khác nhau hình thành các vết khác nhau có thể định hình được. Khi dung
mơi đã lên gần tới mép trên bản mỏng, sắc kí đã xong và có thể lấy ra khỏi buồng
sắc kí.
Thuốc thử hiện màu được sử dụng là ceri sulfate.


15

Cơ sở lý thuyết của phương pháp sắc ký silica gel nói chung là dựa trên khả
năng hấp phụ của khác nhau các chất trên silica gel (pha tĩnh) sẽ được dung môi
rửa giải (pha động) khi đi lên theo lực mao quản sẽ phân tách (giải hấp) ở các vị
trí khác nhau trên đường đi của dung mơi. Chất có độ phân cực kém hơn sẽ đi lên
nhanh hơn chất có độ phân cực cao hơn.
Độ linh động của chất được đánh giá thông qua hệ số Rf.
Rf =

Quãngđườngdichuyểncủachất
Quãngđườngdichuyểncủadungmôi

Trong trường hợp minh họa ở hình vẽ trên: Rf(A) =

lA
l

l

; Rf(B) = B .
l

Với lA là khoảng cách từ điểm 1 đến điểm 2; lB là khoảng cách từ điểm 1 đến

điểm 3; l là khoảng cách từ điểm 1 đến điểm 4.
Muốn đo Rf: sử dụng thước để đo khoảng đường di chuyển của hợp chất và
của dung môi. Thực hiện bài toán chia, kết quả Rf là con số khơng có đơn vị, ln
ln nhỏ hơn 1 (Rf < 1). Quy ước viết Rf với hai con số lẻ sau dấu phẩy.
Hai chất A, B được coi là tách riêng khỏi nhau khi triển khai sắc ký TLC khi
có: Rf(A) ≠ Rf(B). Từ hệ dung mơi khi khảo sát TLC làm cơ sở để lựa chọn hệ
dung môi cho sắc ký cột silica gel.
Sắc kí lớp mỏng là cơng cụ cần thiết được sử dụng trong phịng thí nghiệm,
trong một số công việc sau:
- Để công bố đặc điểm của hợp chất vừa chiết tách cô lập
Để công bố các đặc điểm của một hợp chất, bên cạnh các số liệu phổ RMN,
các đặc tính vật lí như điểm nóng chảy (hoặc nhiệt độ sơi), năng lực triền quang,…
cũng cần cho biết giá trị Rf của hợp chất đó [2].
Một hợp chất tinh khiết có một vết với sắc kí lớp mỏng, với giá trị Rf khơng
đổi, trong một hệ dung môi dung li xác định, bởi bản sắc kí của một lơ sản xuất
nhất định.
Nếu vết mẫu hiện trên bản mỏng là một vết tròn, nhỏ, đo khoảng cách từ
mức xuất phát đến tâm của vết đó. Nếu vết mẫu quá to, phải thực hiện sắc kí bản
mỏng lại, giảm lượng mẫu chất, sao cho vết hiện nhỏ, gọn [2].


16

Giá trị Rf của một hợp chất thay đổi tùy theo nhiều yếu tố:
+ Loại bản mỏng silicagel hoặc alumina của hãng Merck hay Prolabo (bản
mỏng tráng sẵn dù của cùng một hãng sản xuất cũng khác nhau tùy theo lô sản
xuất)
+ Hoạt độ của bản lúc sử dụng khác nhau tùy theo thời gian tồn trữ lâu, mau.
+ Độ dầy của bản.
+ Thành phần của dung môi dung li, chỉ cần thay đổi một ít cũng làm ảnh

hưởng kết quả. Độ bão hịa dung mơi trong bình giải li của hai lần giải li khác
nhau cũng khác nhau.
+ Kĩ thuật giải li: dung môi đi lên hay đi xuống cũng cho kết quả khác nhau.
+ Lượng mẫu chấm lên bản nhiều hay ít cũng làm vị trí của vết trên bản thay
đổi.
- Để kiểm tra xem hai hợp chất có giống nhau (là một chất?)
Tuy rằng Rf của một chất có thể thay đổi theo nhiều yếu tố, nhưng có thể sử
dụng Rf để so sánh xem hai hợp chất có giống nhau hay khơng, vì khi chấm hai
mẫu lên trên cùng một bản mỏng thì các yếu tố vừa nói trên đã khơng cịn ảnh
hưởng [2].
Chuẩn bị ba bản giống nhau. Chấm trên mỗi bản: một chất đang cần nghiên
cứu (thí dụ vết A) và vết mẫu chuẩn đã biết rõ cấu trúc hóa học (vết B). Thực hiện
sự giải li, mỗi bản với một hệ dung môi giải li khác hẳn nhau. Phải lựa chọn ba hệ
dung mơi như thế nào để có: một hệ dung mơi đẩy các vết di chuyển gần với mức
xuất phát (hệ dung mơi ít phân cực); một hệ dung mơi đẩy vết di chuyển đến
khoảng giữa bản (hệ dung môi phân cực trung bình) và một hệ dung mơi đẩy vết
di chuyển xa với mức xuất phát (hệ dung môi phân cực) [2].
Muốn kết luận xem hai hợp chất nào đó có giống nhau hay khơng, phải đáp
ứng cùng lúc hai điều kiện sau, thiếu một cũng khơng đạt, vì lí do sắc kí lớp mỏng
có độ phân giải thấp [2].
+ Về Rf của hai chất so sánh: Cả ba bản phải có hai vết R f ln giống nhau.
Chỉ cần có một bản có sự sai biệt giữa hai vết thì đó là hai chất khác nhau.