Phân lập vi khuẩn bacillus subtils từ phân heo, khảo sát khả năng ứng chế sản sinh aflatoxin của các chủng phân lập được

CHƯƠNG I
MỞ ĐẦU
ĐẶT VẤN ĐỀ

1.1.

Trên thế giới hiện nay, việc nghiên cứu mức độ nhiễm nấm mốc và độc tố nấm trên
lương thực, thực phẩm là vấn đề quan trọng nhằm bảo vệ sức khoẻ con người và vật nuôi.
Độc tố aflatoxin chủ yếu do loài vi nấm Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus tạo
ra, là độc tố nguy hiểm nhất và thường nhiễm trên nông sản, gây độc cho người và gia
súc.
Ở nước ta, với đặc điểm khí hậu nhiệt đới nóng ẩm, độ ẩm trong không khí thường
cao, thời vụ canh tác, thu hoạch thường rơi vào mùa mưa trong khi các phương tiện thu
hoạch, phơi sấy nông sản kém, kho chứa không đảm bảo khô ráo thoáng mát là điều kiện
rất thuận lợi cho nấm mốc phát triển gây nhiễm độc tố cho thực phẩm và thức ăn chăn
nuôi. Một số phương pháp vật lý (phân hủy bằng không khí nóng, nhiệt, tia xạ) và hóa
học (sử dụng chất oxy hóa khử, kiềm, khí NH 3) đã được áp dụng để ngăn ngừa sự sản
sinh aflatoxin trong thực phẩm và thức ăn gia súc. Tuy nhiên, hầu hết các phương pháp
đó không được phổ biến rộng rãi do chi phí cao hoặc khó thực hiện, làm mất giá trị dinh
dưỡng sản phẩm, chất lượng cảm quan. Một trong những xu hướng hiện nay là áp dụng
phương pháp vi sinh vật học. Các loài nấm mốc (Rhizopus stolonifer, Rhizopus arhizus),
vi khuẩn (Bacillus subtilis, Bacillus pulimus), nấm men (Saccharomyces cerevisiae), xạ
khuẩn đã được thử nghiệm về khả năng làm giảm aflatoxin thu được kết quả cũng rất khả
quan.
Được sự cho phép của Khoa Chăn Nuôi Thú y và dưới sự hướng dẫn của PGS.TS.
Nguyễn Ngọc Hải, chúng tôi tiến hành đề tài “ Phân lập vi khuẩn Bacillus subtils từ phân
heo, khả sát khả năng ức chế sản sinh aflatoxin của các chủng phân lập được”.

1

Mục tiêu: Đánh giá khả năng ức chế aflatoxin của Bacillus subtilis.
Yêu cầu
- Phân lập và định danh vi khuẩn Bacillus subtilis từ phân heo.
- Đánh giá khả năng ức chế aflatoxin của Bacillus subtilis.

2


CHƯƠNG II
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. KHÁI QUÁT VỀ VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS
2.1.1. Lịch sử phát hiện
Bacillus subtilis được phát hiện đầu tiên trong phân ngựa năm 1941 bởi tổ
chức y học Nazi của Đức. Lúc đầu được sử dụng chủ yếu là để phòng bệnh lỵ cho
các binh sĩ Đức chiến đấu ở Bắc Phi. Việc điều trị phải đợi đến những năm
1949 - 1957, khi Henrry và các cộng sự tách được chủng thuần khiết của Bacillus
subtilis. Từ đó “subtilis therapy” có nghĩa là "thuốc subtilis" ra đời trị các chứng
viêm ruột, viêm đại tràng, chống tiêu chảy trong rối loạn tiêu hoá. Ngày nay, vi
khuẩn này đã trở nên rất phổ biến, được sử dụng rộng rãi trong y học, chăn nuôi,
thực phẩm (trích Lý Kim Hữu, 2005).
2.1.2. Đặc điểm phân loại và sự phân bố của vi khuẩn Bacillus subtilis
2.1.2.1. Đặc điểm phân loại
Theo đặc điểm phân loại của Bergey (1994), vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc
Bộ: Eubacterriales
Họ: Bacillaceae
Giống: Bacillus
Loài: Bacillus subtilis
2.1.2.2. Đặc điểm phân bố
Vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc nhóm vi sinh vật bắt buộc của đường ruột,
chúng được phân bố hầu hết trong tự nhiên. Phần lớn chúng cư trú trong đất, thông

thường đất trồng trọt chứa khoảng 10 - 100 triệu CFU/g. Đất nghèo dinh dưỡng ở
vùng sa mạc, vùng đất hoang thì vi khuẩn Bacillus subtilis rất hiếm. Nước và bùn

3


cửa sông cũng như ở nước biển cũng có mặt bào tử và tế bào Bacillus subtilis (Vũ
Thị Thứ, 1996).
2.1.2. Đặc điểm hình thái
Vi khuẩn Bacillus subtilus là trực khuẩn Gram dương có hai đầu tròn, kích
thước 0,5 – 0,8 µm x 1,5 – 3 µm, thường đứng đơn lẻ hoặc tạo thành chuỗi ngắn,
có khả năng di động, có khả năng sinh bào tử nhỏ hơn tế bào sinh dưỡng, kích
thước 0,9 - 0,6 µm. Vị trí của bào tử trong tế bào sinh dưỡng không theo một
nguyên tắc chặt chẽ nào, có thể lệch tâm hoặc gần tâm nhưng không chính tâm
(trích dẫn bởi Nguyễn Lân Dũng,1983).
2.1.3. Đặc điểm nuôi cấy
Điều kiện nuôi cấy: hiếu khí, nhiệt độ tối ưu 370 C.
Nhu cầu O2: Bacillus subtillis là vi khuẩn hiếu khí nhưng có khả năng phát
triển trong môi trường thiếu oxy.
Độ pH: Bacillus subtilis thích hợp nhất với pH = 7 - 7,4.
Trên môi trường thạch đĩa TSA: khuẩn lạc dạng tròn, rìa răng cưa không
đều, có tâm sẩm màu, phát triển chậm, màu vàng xám, đường kính 3 – 5 mm. Sau
1 - 4 ngày bề mặt nhăn nheo, màu hơi xẩm.
Trên môi trường thạch nghiêng TSA: dễ mọc, tạo thành màu hơi xám, rìa
gợn sóng.
Môi trường canh TSB: Bacillus subtilis phát triển làm đục môi trường, tạo
màng nhăn trên bề mặt môi trường canh, lắng cặn kết lại như vẩn mây ở đáy, khó
tan đều khi lắc lên.
Dinh dưỡng: cần các nguyên tố C, H, O, N và các nguyên tố khác.
2.1.5. Đặc điểm cấu trúc kháng nguyên

4


Bacillus subtilis có kháng nguyên H và O, cấu trúc kháng nguyên dạng D và L của
acid glutamic.
Sản sinh kháng sinh subtilin và bacitracin có tác dụng ức chế vi khuẩn G+ và G-.
Bệnh học: đa số chủng Bacillus subtilis không gây bệnh.
2.1.6. Bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis
Bào tử vi khuẩn là một kết cấu do sự biến đổi của tế bào sinh dưỡng trong một giai
đoạn nào đó của quá trình sinh trưởng của vi khuẩn. Mỗi tế bào chỉ tạo thành một bào tử
(trích dẫn bởi Nguyễn Khắc Tuấn, 1996).
Bào tử vi khuẩn không phải là một bộ phận làm chức năng sinh sản mà chỉ là một
thể biến đổi của tế bào nhằm bảo tồn, đổi mới và nâng cao sức sống của vi khuẩn.
Bào tử là một hình thức tiềm sinh của vi khuẩn, có sự đề kháng cao với các nhân
tố bất lợi của ngoại cảnh.
Theo Nguyễn Xuân Thành và ctv (2005) thì sự tồn tại lâu dài của bào tử là do
chúng có các đặc tính sau:
-

Nước trong bào tử phần lớn ở trạng thái liên kết, do đó không có khả năng làm

-

biến tính protein khi tăng nhiệt độ.
Do trong bào tử có một lượng lớn ion Ca 2+ và acid dipicolinic. Protein trong bào
tử kết hợp với dipicolinat canxi tạo thành một phức chất có tính ổn định cao đối

-

với nhiệt độ.

Các enzyme và các hoạt chất sinh học khác trong bào tử đều tồn tại dưới dạng
không hoạt động làm hạn chế sự trao đổi chất của bào tử với môi trường bên

-

ngoài.
Sự có mặt của các acid amin chứa lưu huỳnh, đặt biệt là cysteine giúp bào tử đề

-

kháng với tia cực tím .
Với cấu trúc có nhiều màng bao bọc và tính ít thẩm thấu của các lớp màng, làm
cho các chất hóa học và các chất sát trùng khó có thể tác động đến bào tử .
5


Khi gặp điều kiện thuận lợi, bào tử sẽ nảy mầm và phát triển thành một tế bào mới có
sức sống mạnh mẽ hơn (trích dẫn bởi Nguyễn Khắc Tuấn, 1996).
2.1.7. Cơ chế đối kháng của Bacillus subtilis với vi sinh vật gây bệnh
Với vi sinh vật gây bệnh, mỗi loài sinh vật khác nhau sẽ thích hợp ở điều
kiện môi trường, sinh khuẩn lạc khác nhau. Thay đổi môi trường hoặc
các yếu tố môi trường bất lợi làm thay đổi điều kiện sống, hạn chế hoặc ức
chế sự phát triển của vi sinh vật. Thực tế khi môi trường nuôi cấy nấm bệnh có sự
hiện diện của Bacillus subtilis với một số lượng lớn sẽ xảy ra sự cạnh tranh dinh
dưỡng. Cạnh tranh không gian sinh sống giữa vi khuẩn và nấm, do vi khuẩn phát
triển nhanh hơn (trong 24 giờ) sẽ sử dụng phần lớn các chất dinh dưỡng trong môi
trường, đồng thời tạo ra một số loại kháng sinh nên sự sinh trưởng của nấm bị ức
chế (Nguyễn Lân Dũng và Hoàng Đức Thuận, 1976).
Phương thức diệt nấm và tác nhân gây bệnh như sau:
Đầu tiên vi khuẩn Bacillus subtilis tạo thành khối xung quanh tác nhân gây bệnh

ngăn chặn không cho chúng bám vào vật chủ để gây bệnh.
Sau đó, Bacillus tiết ra hỗn hợp gồm nhiều lipopeptid (được gọi là serenade) để
làm thủng vách tế bào và màng tế bào chất của tác nhân gây bệnh do đó ngăn chặn sự
phát triển của chúng. Serenade có thể được bảo quản, sử dụng như một loại thuốc trừ sâu
hóa học tổng hợp, đã được kiểm tra và chứng minh trong phòng thí nghiệm là không gây
độc đối với cá hồi, ong mật, chim cút,…và nhiều loài khác. Serenade gồm 3 nhóm
lipopeptid có tên là surfactin, agrastain và iturin. Ba nhóm này kết hợp với nhau để làm
tăng hoạt tính diệt các mầm bệnh kể cả vi sinh vật gây hại, nấm mốc và cả bào tử gây
bệnh của chúng.
Surfactin là nhóm chất có hoạt tính sinh học, bản chất là lipopeptid. Bản thân
surfactin không gây độc cho nấm nhưng khi kết hợp với iturin thì trở thành hợp chất diệt

6


nấm. Surfactin có khả năng làm thủng vách tế bào của các tác nhân gây bệnh và bào tử
của chúng, giúp cho agrastain và iturin phát huy tác dụng.
Hình 2.1. Cấu trúc hóa học của surfactin
( />
Agrastatin

vừa mới được phát hiện cũng có khả năng diệt nấm giống như

surfactin và iturin.

Hình 2.2. Cấu trúc hoá học của Argastin

7

Inturin là nhóm chất chiếm vai trò quan trọng nhất trong quá trình diệt nấm, bản
chất là lipoprotein được chiết từ môi trường nuôi cấy vi khuẩn Bacillus subtilis. Iturin

diệt nấm bằng cách tác dụng lên màng tế bào chất, làm tan màng, tạo thành những lổ
thủng trên đó để làm mất tính thẩm thấu chọn lọc của màng.
Hình 2.3. Cấu trúc hóa học của iturin
Ngoài ra, Bacillus subtilis cũng đối kháng với vi khuẩn gây bệnh như Escherichia coli.
Bacillus subtilis có khả năng tổng hợp một số chất kháng sinh nên gây ức chế quá trình
sinh trưởng và phát triển của Escherichia coli, điều đó được thể hiện qua số lượng
Escherichia coli trong bảng ( Nguyễn Quỳnh Nam, 2006).
Bảng 2.1. Bacillus subtilis đối kháng với Escherichia coli trong môi trường TSB
Mẫu

Thời gian (giờ)

0
12
24
10
8
1
4,45.10
29,80.10
15,75.107
2
4,45.1010
19,95.108
9,55.107
3
4,45.1010

17,26.108
8,30.107
10
8
4
4,45.10
19,95.10
13,67.107
5
4,45.1010
23,40.108
2,60.107
Đối chứng
4,45.1010
22,15.108
61,76.107
Mẫu (1,2,3,4,5): môi trường TSB chứa Bacillus subtilis và Escherichia coli

36
<106
<106
<106
<106
<106
23.1012

8


Mẫu đối chứng: môi trường TSB chứa Escherichia coli

2.1.8. Những nghiên cứu về tác dụng đối kháng Aspergillus của Bacillus subtilis
Trong nước:
Nguyễn Đình Đào năm 1993 đã tiến hành kiểm tra khả năng đối kháng của chủng
Bacillus subtilis AO1 với Aspergillus flavus và Aspergillus parasticus và kết quả là có sự
ức chế nấm mốc Aspergillus (trích dẫn bởi Nguyễn Thị Ngọc Trân, 1995).
Nguyễn Hữu Phúc và cộng sự năm 1993 đã sử dụng vi khuẩn Bacillus subtilis để
ức chế sinh trưởng và sản xuất aflatoxin của Aspergillus flavus, Aspergillus parasticus
trên đậu phộng (trích dẫn bởi Lâm Thanh Thúy Trân, 1995).
Nguyễn Thị Ngọc Trân năm 1995 đã tiến hành kiểm tra khả năng đối kháng của
chủng Bacillus subtilis AO1 (do trung tâm công nghệ sinh học thuộc liên hiệp sản xuất
hóa chất cung cấp) với Aspergillus flavus trên môi trường thạch khoai tây-glucose và kết
quả rất khả quan.
Năm 2006, Nguyễn Ngọc Thanh Xuân với đề tài “Khảo sát khả năng sử dụng vi
khuẩn Bacillus subtilis có nguồn gốc từ đất trong xử lý nhiễm aflatoxin trên nguyên liệu
bắp” cho thấy vi khuẩn Bacillus subtilis phân lập từ đất có khả năng làm giảm aflatoxin
trên môi trường bắp. Tỷ lệ nuôi cấy bào tử nấm mốc/bào tử vi khuẩn là 1/10 3, hàm lượng
aflatoxin giảm 99,6 lần.
Năm 2007, Phạm Hồng Thái đã thực hiện đề tài “Phân lập vi khuẩn Bacillus
subtilis phân lập từ đất, khảo sát khả năng ức chế sản sinh aflatoxin của các chủng phân
lập được”. Kết quả cho thấy vi khuẩn Bacillus subtilis phân lập từ đất có khả năng làm
giảm aflatoxin trên môi trường bắp. Tỷ lệ nuôi cấy tử nấm mốc/bào tử vi khuẩn là 1/10 3,
hàm lượng aflatoxin giảm 8,8 lần.
Ngoài nước:

9


Một số thí nghiệm về khả năng ức chế sinh tổng hợp aflatoxin của một số chủng vi
khuẩn Bacillus subtilis đã được thực hiện với Aspergillus flavus và Aspergillus
parasticus.

Norio Kimura (1990) đã sử dụng vi khẩn Bacillus subtilis để ngăn chặn sự phát
triển và sinh độc tố của chủng Aspergillus flavus và Aspergillus parasticus trên đậu
phộng và bắp. Các chủng Bacillus subtilis NK330 và NK-C-3 ức chế mạnh mẽ sự phát
triển của nấm mốc và tổng hợp aflatoxin.
2.2.
KHÁI QUÁT VỀ NẤM MỐC SINH AFLATOXIN
2.2.1. Khái niệm nấm mốc:

Nấm mốc là vi sinh vật (vi nấm) có cấu tạo gần giống với thực vật, sống ký sinh
hay hoại sinh trên nhiều loại chất khác nhau, đặc biệt là các chất hữu cơ đơn giản nhất là
hydrocacbon.
Nấm mốc không chứa diệp lục tố, cấu tạo dạng sợi có vách ngăn hoặc không có
vách ngăn.Những sợi nấm này phân nhánh, hình thành từng đám chằng chit gọi là hệ
thống sợi nấm. Có 2 loại sợi:
• Sợi nấm dinh dưỡng: nằm trong lớp môi trường, làm nhiệm vụ hấp thu chất
•

dinh dưỡng cho toàn bộ hệ nấm.
Sợi nấm khí sinh: thường nhô lên trên môi trường, giữ vai trò sinh sản (tạo

bào tử).
2.2.2. Độc tố nấm mốc
Là sản phẩm phụ của quá trình trao đổi tự nhiện của nấm mốc và có thể gây độc
cho con người và gia súc. Độc tố nấm mốc có tính bền với nhiệt độ cao và không bị tiêu
diệt trong quá trình chế biến thức ăn thông thường. Tùy từng loại mà độc tố nấm mốc có
thể gây nhiễm độc cấp tính và mãn tính.
Hiện nay đã phát hiện trên 300 loại độc tố mycotoxin từ hơn 100 loài nấm mốc.
Trong đó có khoảng 20 loại độc tố gây nguy hiểm đến sức khỏe con người và vật nuôi. 5
loại độc tố nguy hiểm nhất hiện nay là aflatoxin, deoxynivalenol, zearalenone, achratoxin
và fumonisin (Trần Cúc Phương, 2008).

2.2.3. Độc tố aflatoxin
2.2.3.1.
Lịch sử phát hiện và quá trình hình thành aflatoxin

10


Aflatoxin là độc tố vi nấm được phát hiện vào năm 1960 khi gây chết trên 10.000
gà tây con ở nước Anh với tổn thương gan rất nặng nề như hoại tử, chảy máu trong gan,
tăng sinh ống dẫn mật. Tiếp sau đó người ta phát hiện thêm loại mycotoxin này cũng gây
tổn thương gan ở súc vật thí nghiệm khác như vịt con, chuột, thỏ, khỉ, heo, bò, cừu. Đến
năm 1961, Sargeant và ctv đã cấy và phân lập được độc tố này và đặt tên là aflatoxin
(Dương Thanh Liêm, 2009).
Aflatoxin được sản sinh ra bởi vi nấm Aspergillus flavus và Aspergillus
parasiticus. Ngoài ra còn một số loài khác như Aspergillus nomius, Aspergillus
pseudotamarii,

Aspergillus

bombycis,

Aspergillus

ochraceoroseus,

Emericella

venezuelensis (Yu và ctv, 2004). Con đường tổng hợp aflatoxin bao gồm ít nhất 18 phản
ứng chuyển đổi bắt đầu bằng cách tổng hợp polypeptide từ acetate, tương tự như quá
trình tổng hợp axit béo. Theo Prieto và Woloshuk (1997), quá trình hình thành aflatoxin

B1 như sau: NOR → averantin → averufanin → averufin → hydroxyversicolorone →
versiconal hemiacetal acetate → versicolorin A → saerigmatocystin → Omethylsterigmatocystin → aflatoxin B1.
Một số gen tương ứng quy định các enzyme tham gia vào quá trình sinh tổng hợp
aflatoxin bao gồm pksA, pksL1, fas1A, nor-1, NorA, avf1, vbs, ver1, stcP, omtA, ord1,
avnA và gen aflR (Prieto và Woloshuk, 1997). 25 gen nằm trong khu vực DNA 70kb đã
được xác định liên quan đến quá trình sinh tổng hợp aflatoxin (trích dẫn Yu và ctv,
2004).
Các yếu tố ảnh hưởng đến sự hình thành aflatoxin có thể được chia thành 3 loại:
vật lý, dinh dưỡng và các yếu tố sinh học (Gourama và Bullerman, 1995). Trong đó yếu
tố vật lý đóng vai trò quan trọng. Yếu tố vật lý bao gồm nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng, sự lưu
thông khí và mức độ của các khí trong khí quyển. Aflatoxin được sản xuất ở nhiệt độ từ
12 – 410C và nhiệt độ tối ưu là 250C đến 320C (Lillehoj, 1983). Sự sản xuất aflatoxin đặc
biệt ưa chuộng bởi những điều kiện rất ẩm ướt. Tổng hợp aflatoxin tăng lên ở 27 0C, độ
ẩm không khí lớn hơn 62% và độ ẩm trong thức ăn chăn nuôi trên 14% (Royes và
Yanong, 2002). Sự hiện diện của CO 2 và O2 cũng ảnh hưởng đến sự tăng trưởng của nấm
mốc và sản xuất độc tố aflatoxin. Nhiều nghiên cứu đã báo cáo rằng độ pH ban đầu
11


không ảnh hưởng đáng kể đến sản xuất độc tố aflatoxin, trong khi các nhà điều tra khác
cho thấy rằng ở pH axit yếu, nấm mốc phát triển tốt hơn và sản sinh nhiều aflatoxin hơn
(Landers và ctv, 1967).

12


Bảng 2.2: Một số loài nấm mốc có khả năng sản sinh aflatoxin
Loài nấm mốc
B1
+

+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+

Aflatoxin
B2
G1
+
+
+
+
+

Tác giả
G2

Aspergillus flavus
Sargeant và ctv, 1961
Aspergillus parasiticus
+
Coduer và ctv, 1963
Aspergillus nomius

+
Kurzman và ctv, 1987
Aspergillus oryzae
Basappa và ctv, 1967
Aspergillus niger
Kulik và Holaday, 1967
Aspergillus wentii
Kulik và Holaday, 1967
Aspergillus ruber
Kulik và Holaday, 1967
Aspergillus ostianus
+
Scot và ctv, 1968
Aspergillus ochraceus
Van Walbeck và ctv, 1968
Penicillium puberulum
+
+
+
Kulik và Holaday, 1967
Penicillium variabile
Kulik và Holaday, 1967
Penicillium
Kulik và Holaday, 1967
frequentans
Penicilium citrinum
+
Kulik và Holaday, 1967
Rhizopus. sp
+

Van Walbeck và ctv, 1968
Các loài nấm mốc có vai trò quan trọng trong sản sinh Aflatoxin là Aspergillus flavus và
Aspergillus parasiticus, các loài nấm khác: Penicillium spp và Rhizopus. Spp thường ít có
vai trò gây bệnh trong thực tế (Lê Anh Phụng, 2001).
2.2.4. Cấu trúc và tính chất vật lý, hóa học

Aflatoxin là hợp chất hữu cơ có nhân đa mạch vòng là dẫn xuất difurocoumarin.
Khoảng 20 loại aflatoxin đã được xác định.Trong đó có 4 loại được để ý sớm nhất và
nhiều nhất là B1, G1, B2, G2. Trong ánh sáng cực tím bước sóng dài (380-315 nm), B1
và B2 phát ra màu xanh nước biển, G1 và G2 phát ra màu xanh lá cây (Devero, 1999).

13


Hình 2.4. Cấu trúc hoá học của aflatoxin B1, B2, G1, G2
Mặc dù aflatoxin B1, B2, G1, G2 được phổ biến trong cùng một mẫu thức ăn,
nhưng aflatoxin B1 là chủ yếu, chiếm 60 – 80% tổng số aflatoxin. Ngoài ra, trong hầu hết
các trường hợp, aflatoxin G1 được tìm thấy ở nồng độ cao hơn aflatoxin B2 và G2
(Weidenborner, 2001).
Các aflatoxin phát quang mạnh dưới ánh sáng cực tím sóng dài. Điều này cho
phép phát hiện các hợp chất này ở nồng độ cực kỳ thấp ( 0,5ng hay thấp hơn trên một vết
ở sắc kí bản mỏng). Nó cung cấp cơ bản về mặt thực hành cho tất cả các phương pháp
hóa lý về việc phát hiện định lượng. Nồng độ aflatoxin M1 0,02mg/l có thể được phát
hiện trong sữa lỏng.
Aflatoxin tinh khiết rất bền bững ở nhiệt độ cao lên đến điểm nóng chảy, khi được
làm nóng trong không khí. Tuy nhiên, nó tương đối bền khi để dưới không khí và dưới tia
cực tím ở phiến sắc kí bản mỏng, và đặc biệt khi hòa tan ở các dung môi có độ phân cực
cao. Các aflatoxin trong các dung môi clorofom và benzene bền vững trong nhiều năm
nếu được giữ trong chỗ tối và lạnh. Các aflatoxin ít hoặc không bị phá hủy dưới điều kiện

14


nấu bình thường và làm nóng khi thanh trùng. Tuy nhiện, khi có độ ẩm và ở nhiệt độ cao
vẫn có thể tiêu hủy aflatoxin trong một khoảng thời gian nhất định.
Các aflatoxin được hòa tan trong các dung môi phân cực nhẹ như clorofom,
methanol và đặc biệt ở dimethylsufoit (dung môi thường được sử dụng như phương tiện
trong việc áp dụng các aflatoxin vào các động vật thí nghiệm). Tính tan của aflatoxin
trong nước dao động từ 10-20mg/l.
Sự có mặt của vòng lacton ở phân tử aflatoxin làm chúng nhạy cảm với việc thủy
phân trong môi trường kiềm, đặc tính này là quan trọng trong bất kì quá trình chế biến
thực phẩm vì quá trình xử lý kiềm làm giảm hàm lượng aflatoxin của các sản phẩm, mặc
dù sự có mặt của protein, pH và thời gian xử lý có thể thay đổi các kết quả. Tuy nhiên
nếu xử lý kiềm là nhẹ thì việc axit hóa sẽ làm phản ứng ngược trở lại để tạo aflatoxin ban
đầu.
Ở nhiệt độ cao (khoảng 100oC) sự mở vòng decarboxylation xảy ra và phản ứng có
thể tiến xa hơn, dẫn đến sự mất mát các nhóm methoxy từ vòng thơm.
Khi có các acid vô cơ và bổ sung nước, aflatoxin B1 và G1 chuyển hóa thành
aflatoxin B2A và G2A. Các sản phẩm cộng hợp tương tự của aflatoxin B1 và G1 cũng
được hình thành với clorua acid formic thionyl, clorua acid acetic và acid thionyl
trifluoroacetic.
Nhiều tác nhân oxy hóa, chẳng hạn như hypochloride ratri, thuốc tím, chlorine,
hydrogen peroxide, ozone và peborat natty phản ứng với aflatoxin và thay đổi các phân
tử aflatoxin, một số phản ứng làm mất huỳnh quang.
Sự hydro hóa aflatoxin B1 và B2 sinh ra aflatoxin G1, G2 tương ứng. Sự khử
aflatoxin B1 bằng 3 mol hydro sinh ra tetrahydroxyaflatoxin. Khử aflatoxin B1 và B2
bằng natriborohydride tạo ra RB1 va RB2 tương ứng. Hiện tượng đó là kết quả của việc
mở vòng lacton bởi sự khử nhóm acid và nhóm xeton ở vòng cyclopentene.
2.2.5.

Cơ chế gây độc
Aflatoxin B1 là phân tử ái lực mạnh với thành ruột, có trọng lượng phân tử thấp

nên dễ dàng được hấp thụ hoàn toàn sau khi ăn.
15


Khi đến ruột non, aflatoxin B1 sẽ nhanh chóng được hấp thu vào tĩnh mạch và ruột
non, tá tràng.
Từ ống tiêu hóa, theo tĩnh mạch cửa, aflatoxin tập trung vào gan nhiều nhất (chiếm
khoảng 17% lượng aflatoxin của cơ thể) tiếp theo là ở thận, cơ, mô mỡ, tụy, lách và 80%
bị bài tiết ra ngoài trong khoảng một tuần và đáng chú ý là nó còn bài tiết qua tuyến sữa
gây bệnh cho thai nhi đang bú sữa mẹ. Chu kì bán rã trong huyết tương là 36,5phút,
lượng phân phối là 14% trọng lượng cơ thể, giải phóng khỏi cơ thể là 1,25l/kg/h.
aflatoxin M1 chủ yếu bài tiết trong vòng 48h (Hendrickse, 1991).
Cho đến nay, các luận chứng khoa học đã công nhận khả năng tác động lên tế bào gan
của aflatoxin trải qua 5 giai đoạn sau:
-

Tác động qua lại với AND và ức chế các polumeraza chịu trách nhiện tổng hợp

AND và ARN.
- Ngừng tổng hợp AND
- Giảm tổng hợp AND và ức chế tổng hợp ARN truyền tin.
- Biến đổi hình thái nhân tế bào.
- Giảm tổng hợp protein.
Hậu quả của quá trình tác động sinh hoá lên tế bào gan này là gây ung thư biểu mô
tế bào gan.
2.2.6. Những tác hại do aflatoxin gây ra
Theo Dương Thanh Liêm (2002), aflatoxin gây ra những tác hại rất lớn cho cơ thể con

người và động vật. Những tác hại đó như sau:
- Gây tổn thương tế bào gan: tất cả các trường hợp xác nhận sự ngộ độc
aflatoxin đều có bệnh tích giống nhau là gan của động vật bị nhiễm đều hư hại
nặng. Tuỳ theo mức độ nhiễm ít hay nhiều, lâu hay mau mà bệnh tích trên gan
có khác nhau. Biểu hiện chung là: ban đầu gan biến thành màu vàng tươi, mật
sưng. Sau đó gan sưng to lên, mật căng phồng và bắt đầu nổi mụt nhỏ trên bề
mặt gan làm cho nó gồ ghề đôi khi có những nốt hoại tử trắng. Sau cùng do
-

nhiễm khuẩn mà gan trở nên bở, dễ bể.
Thận cũng bị sưng to làm cho việc bài thải chất độc ra khỏi cơ thể trở nên khó
khăn. Từ đó làm cho triệu chứng ngộ độc trở nên trầm trọng.

16


-

Bào mòn ống tiêu hoá nên làm giảm khả năng tiêu hoá các chất dinh dưỡng
trong thức ăn. Đôi khi cũng thấy tổn thương ở miệng, làm cho thú khó lấy thức

-

ăn.
Làm giảm khả năng đề kháng của động vật, ức chế hệ thống sinh kháng thể.
Do đó khi nhiễm aflatoxin cơ thể rất mẫn cảm với các bệnh thông thường, có

-

thể gây tử vong cho thú.

Làm thay đổi hoạt động sinh lý bình thường, gây rối loạn sinh sản.
Làm giảm tính ngon miệng đối với thức ăn do sự phát triển của nấm mốc làm

-

mất mùi thức ăn.
Làm hư hại các chất dinh dưỡng trong thức ăn như glucid, protein, acidamin,
vitamin…Làm thức ăn bị giảm giá trị nghiêm trọng, mất mùi tự nhiên nên thú
không thích ăn.

Đặc biệt, aflatoxin có có khuynh hướng gây ung thư.
Từ đó có thể thấy aflatoxin làm giảm thấp sự sinh trưởng, sức sản xuất của thú.
Hậu quả cuối cùng là có thể gây chết thú.
2.2.7.

Các phương pháp ức chế và loại trừ aflatoxin

Phương pháp vật lý
-

Loại bỏ phần bị nhiễm nấm mốc: các hạt bị nhiễm nấm mốc thường có sự thay đổi

-

về màu sắc và có thể được lựa ra.
Xử lý nhiệt: ở nhiệt độ cao thì có khả năng tiêu diệt nấm mốc sinh độc tố (Dương
Thanh Liêm và ctv, 2006). Còn aflatoxin là chất chịu nhiệt, vì vậy các biện pháp
vật lý bằng nhiệt chỉ làm thay đổi nhỏ về mức độ của chúng (Tripathi và Mishra,

-

2010).
Phương pháp chiếu xạ: tia X, tia γ, tia UV, tia hồng ngoại, ánh sáng mặt trời được

-

nghiên cứu rộng rãi nhằm làm giảm độc tố aflatoxin.
Dùng các chất hấp phụ và chất kết dính độc tố: dùng một số chất có khả năng hấp
phụ hoặc liên kết được độc tố nấm mốc trong đường tiêu hóa của động vật nên làm
giảm sự hấp thu qua niêm mạc ruột (Lê Anh Phụng, 2002).

Phương pháp hóa học

17


Phương pháp sử dụng các dung môi hóa chất có thể trích xuất các hợp chất này mà
chỉ gây ảnh hưởng tối thiểu về chất lượng dinh dưỡng. Tuy nhiên, công nghệ này vẫn còn
tốn kém, khó thực hiện trong thực tế, bên cạnh đó còn gây mùi vị không tốt. Ozon hóa là
phương pháp hóa học đã được nghiên cứu nhiều nhất cho việc khử nhiễm aflatoxin trong
thực phẩm.
Phương pháp vi sinh vật học
Hiện nay, một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng aflatoxin dễ bị một số vi sinh vật như
nấm, vi khuẩn và nấm men phân hủy sinh học. Một số loài vi khuẩn, chẳng hạn như
Lactobacillus, Bacillus, Pseudomonas, Ralstonia và Burkholderia spp đã cho thấy khả
năng ức chế sự phát triển của nấm và sự sản xuất aflatoxin bởi Aspergillus spp trong
phòng thí nghiệm (Reddy và ctv, 2010). Taylor và ctv (2010) đã nghiên cứu một số
enzyme thuộc nhóm actinomicetales ở Mycobacterium smegmatis có khả năng tác động
vào nhóm este của aflatoxin bằng cách kích hoạt các phân tử cho quá trình tự thủy phân
và khử nhiễm. Niu và ctv (2008) đã nghiên cứu một số vi sinh vật sử dụng coumarin như

là một nguồn cacbon, kết quả chỉ ra rằng tác động làm giảm aflatoxin đã được thực hiện
bởi enzyme protease. Nghiên cứu của Cacciamani và ctv (2007) đánh giá sử dụng
A.oryzae và Rhizopus sp. có thể làm giảm đến 80% aflatoxin B1. Các loại nấm hoại sinh
như Candida krusei và Pichia anomala cũng hứa hẹn cho thấy là tác nhân kiểm soát sinh
học aflatoxin (Reddy và ctv, 2010)

18


CHƯƠNG III
NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH
3.1.
-

THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM
Thời gian: Thời gian thực hiện tiểu luận từ tháng 10/2012 đến tháng 6/2013
Địa điểm: Phòng thực hành vi sinh, khoa Chăn Nuôi- Thú Y trường Đại học Nông
Lâm TPHCM; phòng chẩn đoán xét nghiệm thú y Hàn Việt; phân tích hàm lượng

-

aflatoxin tại trạm chẩn đoán, xét nghiệm và điều trị chi cục thú y TPHCM
ĐỐI TƯỢNG KHẢO SÁT
Chủng vi khuẩn Bacillus subtilis được phân lập từ phân heo.
Chủng nấm mốc Aspergillus flavus sinh aflatoxin do phòng thực hành vi sinh cấp.
THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ THÍ NGHIỆM
Thiết bị: kính hiển vi, tủ sấy, tủ ấm, nồi hấp tiệt trùng (autoclave), cân điện tử,

-

máy lắc (vortex), lò vi sóng, đèn cực tím, nồi đun cách thuỷ,…
Dụng cụ: ống nghiệm, đĩa petri, que cấy, đèn cồn, bình tam giác, bacher,

3.2.
-

3.3.

micropipette, đũa khuấy thuỷ tinh, ống đông, que trang, buồng đếm Neubauer, giá
để ống nghiệm, máy điện di,…Tất cả các dụng cụ thuỷ tinh dùng trong thí nghiệm
phải được sấy tiệt trùng ở 170oC/45 phút. Dụng cụ nhựa phải được hấp tiệt trùng
3.4.
-

bằng autoclave ở 121oC/15 phút.
MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY
Môi trường thạch nước cốt dừa: dùng kiểm tra khả năng sinh aflatoxin của
Aspergillus flavus. Nước cốt dừa đóng hộp được pha loãng với nước theo tỷ lệ 1:1.

-

Sau đó thêm agar theo tỷ lệ thích hợp. Hấp tiệt trùng ở 121oC/15 phút.
Môi trường bắp: bắp hạt trước khi dùng phải được nghiền nhỏ như hạt tấm. Sau đó
hấp tiệt trùng, xác định hàm lượng aflatoxin và đo hàm lượng ẩm. Điều chỉnh hàm
lượng ẩm đến 30% bằng nước đã được hấp tiệt trùng, cho vào chai nâu, mỗi chai
50g bắp. Hấp tiệt trùng ở 121oC/20 phút trước khi tiến hành nuôi cấy
( Thành phần các môi trường được trình bày ở phần phụ lục)

-

3.5.

Môi trường phân lập, giữ giống và đếm số lượng vi khuẩn: môi trường NA
Môi trường tăng sinh khối vi khuẩn : NB
Môi trường giữ giống vi khuẩn: Glycerin 30%
Môi trường giữ giống nấm: môi trường PDA
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
19


3.5.1. Phân lập và định danh vi khuẩn Bacillus subtilis từ phân heo
- Lấy mẫu: mẫu phân heo được lấy cho vào túi nilon, bảo quản trong thùng xốp
đựng đá, vận chuyển về phòng thí nghiệm.
- Tăng sinh và phân lập:
Lấy 10g phân heo cho vào 90 ml nước muối sinh lý vô trùng chứa trong bình tam
giác 100ml, lắc đều, được nồng độ pha loãng 10-1 .
Chuẩn bị 4 ống nghiệm, mỗi ống chứa 9ml nước muối sinh lý vô trùng và được
đánh số thứ tự từ 1 đến 4. Dùng micropipette hút 1ml dịch mẫu từ nồng độ pha loãng 10 -1
cho vào ống nghiệm thứ 1 và lắc đều bằng máy vortex được nồng độ pha loãng 10 -2, tiếp
tục như vậy được 10-3, 10-4, 10-5.
Hút 0,1ml từ nồng độ pha loãng 10 -3, 10-4, 10-5 cho vào đĩa thạch Nutrient Agar,
mỗi nồng độ 2 đĩa. Dùng que trang vô trùng trang đều lên bề mặt thạch. Sau đó đem ủ ở
370C/24 giờ.
Quan sát các khuẩn lạc mọc trên bề mặt thạch, chọn ra những khuẩn lạc nghi ngờ
là Bacillus subtilis (khuẩn lạc dạng R có rìa răng cưa nhỏ, khô, màu trắng hơi đục) tiến
hành nhuộm Gram và quan sát dưới kính hiển vi quang học có độ phóng đại 1000 lần.
Chọn những khuẩn lạc có tiêu bản vi khuẩn phù hợp với những đặc điểm của vi khuẩn
Bacillus subtilis (trực khuẩn Gram dương, 2 đầu tròn, kích thước nhỏ, riêng lẻ, sinh bào
tử nhỏ hơn tế bào, bào tử nằm chính tâm hoặc lệch tâm, không làm phình tế bào) tiến
hành cấy giữ giống trên môi trường thạch nghiêng NA để làm các bước tiếp theo.

- Kỹ thuật PCR xác định loài: Phương pháp PCR được tiến hành theo mô tả của
Abushady và ctv (2005), sử dụng cặp mồi 5’ –AAGAGTTTGATCATGGCTCAG – 3’ và
5’ –AGGAGGTGATCCAACCGCA– 3’. Chương trình PCR được thiết lập ở biến tính
940C trong 1 phút, gắn mồi ở 50 0C trong 1 phút và kéo dài ở 72 0C trong 1 phút cho tổng
số 35 chu kỳ.
Bảng 3.1. Thành phần phản ứng (Bacillus subtilis)
Thành phần
H2O

Thể tích (µl)
4,5
20


GoTaq Green Master Mix, 2X

12,5

Mồi xuôi (10 µM)

1,5

Mồi ngược (10 µM)

1,5
20

Mẫu DNA

5

Tổng thể tích

25

Bảng 3.2. Chu trình nhiệt
Giai đoạn

Nhiệt độ

Thời gian

Tiền biến tính

95oC

5 phút

Biến tính

95oC

1 phút

Bắt cặp

55 oC

1 phút

Kéo dài

72 oC

1 phút

Kéo dài cuối

72 oC

10 phút

Giữ sản phẩm

4 oC

∞

Primer

Trình tự

ytcP-F

GCTTACGGGTTATCCCGC

ytcP-R

CCGACCCCATTTCAGACATATC

Số chu kỳ
1
30
1

Kích thước
SP

Phát hiện

460 bp

B. subtilis

3.5.2. Xác định định tính khả năng ức chế aflatoxin của những chủng Bacillus
subtilis phân lập được
Dùng que cấy vòng lấy 1 ít vi khuẩn Bacillus subtilis phân lập được được giữ
trong ống môi trường NA nghiêng vào đĩa thạch nước cốt dừa và ủ trong tủ ấm ở 37 oC
trong 2 ngày. Mỗi đĩa từ 3 đến 4 chủng vi khuẩn Bacillus subtilis phân lập được. Sau 2
ngày, dùng que cấy móc lấy 1 ít sợi nấm mốc Aspergillus flavus trong ống giống vào giữa
đĩa thạch nước cốt dừa đã cấy vi khuẩn xung quanh, giữ ở nhiệt độ phòng 3-5 ngày.

21


Theo dõi quan sát màu huỳnh quang xung quanh khuẩn lạc Aspergillus flavus ở
các phía có cấy vi khuẩn Bacillus subtilis và không cấy vi khuẩn bằng cách đem soi dưới
đèn UV (bước sóng 365nm).
Màu huỳnh quang càng sáng ít ở đĩa cấy vi khuẩn nào thì chủng vi khuẩn đó có
khả năng ức chế sản sinh aflatoxin càng mạnh.

Sau đó chọn những chủng vi khuẩn có khả năng ức chế sản sinh aflatoxin mạnh
nhất để tiến hành thì nghiệm tiếp theo.
3.5.3. Đánh giá khả năng ức chế aflatoxin của chủng Bacillus subtilis phân lập
được trên môi trường bắp
3.5.3.1. Phương pháp thu hoạch và xác định bào tử nấm mốc Aspergillus
flavus
Cấy chủng nấm mốc đã được kiểm tra khả năng sinh độc tố lên ống môi trường
thạch nghiêng PDA, để ở nhiệt độ phòng 4 ngày. Sau đó cho khoảng 9ml nước muối sinh
lý vô trùng vào ống môi trường PDA đã cấy nấm mốc, dùng que cấy vòng khuấy nhẹ và
hút lấy huyễn dịch bào tử bằng micropipette rồi cho vào một ống nghiệm vô trùng khác.
Tiến hành đếm số lượng bào tử nấm mốc trong huyễn dịch thu hoạch bằng phương pháp
dùng buồng đếm Neubauer dưới kính hiển vi có độ phóng đại x40 lần.
Cố định buồng đếm, đặt lamell lên, dùng micropipette hít 1 ít (khoảng 100µl)
huyễn dịch bào tử nấm mốc thu được nhỏ vào rãnh buồng đếm cho dàn đều khắp buồng
đếm. Cộng số bào tử có được ở các ô vừa đếm và áp dụng công thức để xác định số
lượng bào tử nấm mốc/ml (xem phụ lục).
3.5.3.2. Phương pháp thu hoạch và xác định số lượng bào tử vi khuẩn
Bacillus subtilis
Cấy chuyển vi khuẩn Bacillus subtilis từ ống giống sang môi trường ống thạch
nghiêng NA, để trong tủ ấm 370C trong 24h.
Dùng que cấy vòng lấy 1 ít khuẩn lạc hoà tan vào trong ống chứa 9ml nước muối
sinh lý thu được ống huyễn dịch vi khuẩn. Pha loãng huyễn dịch vi khuẩn thu được bằng
cách dùng các ống nghiệm chứa 9ml nước muối vô trùng, đánh số thứ tự trên các ống
nước muối. Dùng micropipette hútt 1ml huyễn dịch vi khuẩn cho vào ống nghiệm tiếp
22


theo trộn đề và lắc trên máy vortex, thu được nồng độ pha loãng 10 -2, tiếp tục pha loãng
như trên thu được các nồng độ pha loãng 10 -3, 10-4, 10-5, 10-6. Sau đó đem đun cách thuỷ
các ống huyễn dịch đã được pha loãng ở 70 0C trong 15 ph để tiêu diệt các tế bào sinh

dưỡng và hoạt hoá bào tử vi khuẩn. Đun xong, để nguội, dùng micropipette hút 100µl
huyễn dịch bào tử vi khuẩn cho lên đĩa môi trường NA (mỗi nồng độ 2 đĩa), trang đều
bằng que trang vô trùng, để đĩa NA trong tur aams 37 0C trong 24h. Sau đó đếm số lượng
khuẩn lạc vi khuẩn hình thành trên đĩa
3.5.3.3. Bố trí thí nghiệm
-

Chuẩn bị nguyên liệu

Nguyên liệu bắp được xử lý bằng cách xay nhỏ, kích thước khoảng 2 – 3 mm, sau
đó được sấy khô ở ở 1100C trong 30 phút nhằm ngăn chặn sự phát triển của nấm mốc.
Xác định ẩm độ của bắp bằng phương pháp sấy: tiến hành sấy cho đến khi khối
lượng bắp không thay đổi, từ sự thay đổi khối lượng của bắp có thể tính được ẩm độ của
bắp. Bắp được giữ trong những chai sẫm màu (khoảng 50gr/chai) được hấp tiệt trùng sau
đó bổ sung lượng nước để ẩm độ đạt khoảng 30% trước khi tiến hành thí nghiệm.
-

Nuôi cấy chung bào tử nấm mốc và bào tử vi khuẩn trên môi trường
nguyên liệu bắp

Thí nghiệm được bố trí thành 5 lô:
Lô 1: nuôi cấy chung bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis chủng thứ nhất và bào tử
nấm Aspergillus flavus trên môi trường nguyên liệu bắp (đã được bổ sung nước đạt ẩm độ
30%) theo tỉ lệ bào tử nấm mốc và bào tử vi khuẩn tương ứng là 104/106.
Lô 2: nuôi cấy chung bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis chủng thứ hai và bào tử
nấm Aspergillus flavus trên môi trường nguyên liệu bắp (đã được bổ sung nước đạt ẩm độ
30%) theo tỉ lệ bào tử nấm mốc và bào tử vi khuẩn tương ứng là 104/106.
Lô 3: nuôi cấy chung bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis chủng thứ ba và bào tử
nấm Aspergillus flavus trên môi trường nguyên liệu bắp (đã được bổ sung nước đạt ẩm độ
30%) theo tỉ lệ bào tử nấm mốc và bào tử vi khuẩn tương ứng là 104/106.

Lô 4: đối chứng dương, nuôi cấy 10 4 bào tử nấm mốc aflatoxin trên môi trường
nguyên liệu bắp (đã được bổ sung nước đạt ẩm độ 30%).
23


Lô 5: đối chứng âm, chỉ bổ sung nước.
Sau khi cấy bào tử nấm mốc và bào tử vi khuẩn theo tỉ lệ nghiên cứu vào các chai,
đặt các chai ở nhiệt độ phòng (25 – 30 0C). Sau 7 ngày, tiến hành phân tích hàm lượng
aflatoxin bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp.
3.5.3.3. Chỉ tiêu theo dõi
Xác định hàm lượng aflatoxin trong từng lô thí nghiệm để đánh giá kết quả ức chế
sự sản sinh aflatoxin của từng chủng nghiên cứu.
3.5.4. Phương pháp phân tích mẫu

Phân tích hàm lượng aflatoxin bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC)
3.5.5. Phương pháp xử lý số liệu

Số liệu được phân tích thống kê trên phần mềm Minitab 16.0, các số liệu được xử lý
bằng trắc nghiệm F (Chi-Square Test), trắc nghiệm Turkey’s (Anova).

24


CHƯƠNG IV
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. KẾT QUẢ
4.1.1. Kết quả phân lập Bacillus subtilis từ phân heo
Phân heo được pha loãng ở các nồng độ 10 -2, 10-3, 10-4 đun cách thuỷ ở 700C trong 15
phút, hút lấy 100µl dịch pha loãng đem trang trên môi trường NA đĩa, ủ trong tủ ấm 37 0C
trong 18 giờ. Kết quả được thể hiện ở hình 4.1, bắt khuẩn lạc đặc trưng là khuẩn lạc khô

rìa nhăn, nằm sát bề mặt thạch.

Hình 4.1. Khuẩn lạc vi khuẩn Bacillus subtils trên môi trường NA
Các khuẩn lạc đặc trưng được nhộm gram để quan sát dưới kính hiển vi (độ phóng đại
x1000 lần) để khảo sát các đặc điểm hình thái. Chúng tôi nhận thấy các chủng vi khuẩn
nghi ngờ có hình thái giống với
Bacillus subtilis, là những trực khuẩn
bắt màu gram (+), ngắn và ngỏ, kích
thước 0,5-0,8 µm, hai đầu tròn, thường
đứng riêng lẻ, đôi khi xếp thành chuỗi
ngắn từ 3-5 tế bào, có bào tử.

Hình 4.2. Hình thái vi khuẩn Bacillus subtilis ở độ phóng đại x1000
25