Nghiên cứu chế tạo tấm tế bào sụn từ tế bào gốc mô mỡ và mảng chân bì ứng dụng điều trị tổn thương bề mặt sụn khớp trên mô hình thô

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

ĐẶNG TRẦN QUÂN

NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO TẤM TẾ BÀO SỤN TỪ TẾ BÀO
GỐC MÔ MỠ VÀ MÀNG CHÂN BÌ ỨNG DỤNG ĐIỀU TRỊ
TỔN THƯƠNG BỀ MẶT SỤN KHỚP TRÊN MƠ HÌNH THỎ

LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh – năm 2022


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

ĐẶNG TRẦN QUÂN

NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO TẤM TẾ BÀO SỤN TỪ TẾ BÀO
GỐC MÔ MỠ VÀ MÀNG CHÂN BÌ ỨNG DỤNG ĐIỀU TRỊ
TỔN THƯƠNG BỀ MẶT SỤN KHỚP TRÊN MƠ HÌNH THỎ

NGÀNH: KHOA HỌC Y SINH
MÃ SỐ: 9720101

LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
1. PGS.TS. Trần Công Toại
2. PGS.TS. Ngô Quốc Đạt

Thành phố Hồ Chí Minh – năm 2022


MỤC LỤC
Trang
LỜI CAM ĐOAN ................................................................................................................i
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ THUẬT NGỮ ANH – VIỆT ................................ ii
DANH MỤC HÌNH...........................................................................................................iv
DANH MỤC BẢNG ..........................................................................................................vi
MỞ ĐẦU .............................................................................................................................1
CHƯƠNG 1 ........................................................................................................................4
TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................................................4
1.1. Công nghệ mô sụn ...................................................................................................... 4
1.2. Tế bào gốc trung mô từ mô mỡ .................................................................................. 5
1.3. Giá thể sử dụng trong công nghệ mô sụn ................................................................ 15
1.4. Yếu tố tăng trưởng trong công nghệ mô.................................................................. 19
1.5. Công nghệ tạo tấm tế bào ......................................................................................... 20
1.6. Kỹ thuật nuôi cấy tế bào ........................................................................................... 21
1.7. Mơ hình động vật trong đánh giá vật liệu ghép ...................................................... 22
1.8. Các phương pháp đánh giá quá trình lành thương của mơ sụn .............................. 24
1.9. Các nghiên cứu liên quan ......................................................................................... 26
CHƯƠNG 2 ......................................................................................................................33
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................................33

2.1. Thiết kế nghiên cứu................................................................................................... 33
2.2. Đối tượng nghiên cứu ............................................................................................... 33
2.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu............................................................................ 33
2.4. Quy trình nghiên cứu ................................................................................................ 34


2.5. Đạo đức nghiên cứu .................................................................................................. 46
CHƯƠNG 3 ......................................................................................................................47
KẾT QUẢ .........................................................................................................................47
3.1. Phân lập, nuôi cấy và định danh tế bào gốc trung mô từ mô mỡ thỏ .................... 47
3.2. Tạo tấm tế bào sụn từ tế bào gốc trung mô mỡ thỏ và màng chân bì .................... 53
3.3. Kết quả đánh giá tiềm năng tái tạo mô sụn in vivo của mảnh ghép tấm tế bào sụn
trên mơ hình thỏ ........................................................................................................ 64
CHƯƠNG 4 ......................................................................................................................74
BÀN LUẬN .......................................................................................................................74
4.1. Phân lập, nuôi cấy và định danh tế bào gốc trung mô thu nhận từ mô mỡ thỏ ..... 74
4.2. Tạo tấm tế bào sụn từ tế bào gốc trung mô mỡ thỏ và màng chân bì .................... 78
4.3. Bàn luận kết quả ghép tấm tế bào sụn trên mơ hình thỏ......................................... 85
KẾT LUẬN .......................................................................................................................89
KIẾN NGHỊ ......................................................................................................................91
DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ CÓ LIÊN QUAN
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


i

LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được
trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chưa từng được công bố ở bất kỳ nơi

nào.

Tác giả luận án

Đặng Trần Quân


ii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ THUẬT NGỮ ANH – VIỆT
TIẾNG VIỆT
Chữ viết tắt

Chữ viết đầy đủ

BN

Bệnh nhân

CS

Cộng sự

TBG

Tế bào gốc

TBGTM

Tế bào gốc trung mô

TIẾNG ANH
Chữ viết tắt

Tên tiếng Anh

Tên tiếng Việt

ADSC

Adipose-derived Stem Cells

Tế bào gốc từ mô mỡ

BMSC

Bone Marrow Stem Cells

Tế bào gốc từ tủy xương

Cell scraper

Dụng cụ bóc tách tế bào

Fibroblastic-Colony Forming

Đơn vị tạo cụm nguyên bào sợi

CFU
CM

DMEM/F12

Units
Conditioned medium

Mơi trường điều hịa

Dulbecco's Modified Eagle
Medium/Nutrient Mixture F-12

DMSO

Dimethyl sulfoxide

ECM

Extracellular Matrix

EDTA

Ethylenediaminetetraacetic acid

EV

Extracellular Vesicles

Túi ngoại bào

FBS

Fetal Bovine Serum

Huyết thanh phơi bị

Flow cytometry

Kỹ thuật đếm tế bào dòng chảy

FDA

Food and Drugs Aministration

Cục quản lý thực phẩm và thuốc

FGF

Fibroblast growth factor

Yếu tố tăng trưởng nguyên bào sợi

Chất nền ngoại bào


iii

GMP

Good Manufacturing Practices

Thực hành sản xuất tốt

HA

Hyaluronic Acid

Axit hyaluronic

HBsAg

Hepatitis B surface Antigen

Kháng nguyên bề mặt viêm gan B

HCV

Hepatitis C virus

Virus viêm gan C

H&E

Haematoxyline and Eosine

HIV
IGF
ISCT

ISO

Human Immuno-deficiency

Virus gây suy giảm miễn dịch ở

Virus

người

Insullin-like growth factor

Yếu tố tăng trưởng giống insullin

International Society for Cellular

Hội liệu pháp Tế bào Quốc Tế

Therapy
International Organization for
Standardization

PBS

Phosphate Buffered Saline

PLA

Processed lipoaspirate

RT-PCR

Tổ chức Quốc tế về Tiêu chuẩn hoá

Đệm phốt phát

Real time Polymerase chain
reaction

SEM

Scanning electron microscopy

Kính hiển vị điện tử quét

SAL

Sterility assurance level

Độ đảm bảo vô trùng

TGF

Transforming growth factor

Yếu tố tăng trưởng chuyển dạng


iv

DANH MỤC HÌNH

Trang
Hình 1.1. Tiềm năng biệt hóa của TBGTM thu nhận từ mơ mỡ

9

Hình 1.2. Hai giả thuyết về tái tạo sụn khớp liên quan đến tế bào gốc

12

Hình 1.3. Tiềm năng biệt hóa của TBGTM thành tế bào sụn

14

Hình 3.1. Hình ảnh phân lập mẫu mơ mỡ

47

Hình 3.2. Đồ thị sự tăng trưởng của tế bào thu nhận từ mơ mỡ sau lần
cấy chuyền thứ ba

49

Hình 3.3. Tế bào gốc bám dính trên bề mặt chai ni

50

Hình 3.4. Kết quả biệt hóa TBGTM từ mơ mỡ thỏ in vitro

51

Hình 3.5. Đánh giá biểu hiện dấu ấn bề mặt của tế bào gốc từ mơ mỡ thỏ

53

Hình 3.6. Sự biểu hiện các gien sox9, col2a1, col1a2, colX, acan, runx2
khi cảm ứng biệt hóa tạo sụn
Hình 3.7. Kết quả thu nhận giá thể màng chân bì da người

54
56

Hình 3.8. Kết quả đánh giá độc tính của màng chân bì đối với TBGTM
trong vịng 48 giờ ni cấy
Hình 3.9. Kết quả ni TBGTM trên màng chân bì

57
58

Hình 3.10. Kết quả chuyển TBGTM lên màng chân bì mốc ngày thứ 7
sau biệt hóa tạo sụn

59

Hình 3.11. Kết quả chuyển TBGTM lên màng chân bì mốc ngày thứ 14
sau biệt hóa tạo sụn

59

Hình 3.12. Cấu trúc mô học nhuộm H&E của tấm tế bào sụn được cuộn
TBGTM 2 lần

60

Hình 3.13. Cấu trúc mơ học nhuộm H&E và Safranin O của tấm tế bào
sụn sau khi chuyển TBGTM 1 lần
Hình 3.14. Cấu trúc mơ học nhuộm H&E và Safranin O của tấm tế bào

61


v

sụn sau khi chuyển TBGTM 2 lần

62

Hình 3.15. Tấm tế bào sụn quan sát dưới KHV điện tử quét (SEM)

63

Hình 3.16. Hình ảnh mổ ghép tấm tế bào sụn trên thỏ

65

Hình 3.17. Hình ảnh thu nhận mẫu ghép để đánh giá mơ học

65

Hình 3.18. Kết quả khảo sát mơ học tấm tế bào sụn trên thỏ sau 1 tháng

68

Hình 3.19. Kết quả khảo sát mô học tấm tế bào sụn trên thỏ sau 2 tháng

70

Hình 3.20. Kết quả khảo sát mô học tấm tế bào sụn trên thỏ sau 3 tháng

72

Hình 3.21. Kết quả nhuộm Safranin O tấm tế bào sụn trên thỏ

73

Hình 4.1. Kết quả đánh giá tiềm năng biệt hóa của TBGTM từ mơ mỡ
thỏ của tác giả Helena Debiazi Zomer và Tao-Chen Lee

76

Hình 4.2. So sánh kết quả thu nhận giá thể màng chân bì với các tác
giả khác

81

Hình 4.3. Kết quả mơ học tấm tế bào sụn từ sự kết hợp TBGTM mỡ và
màng chân bì của tác giả Ken Ye và cộng sự.

84


vi

DANH MỤC BẢNG

Trang
Bảng 1.1. Công cụ đánh giá sửa chữa sụn của Hiệp hội sửa chữa sụn
quốc tế (ICRS)

25

Bảng 2.1. Danh sách các đoạn mồi khảo sát các gien đặc hiệu của TBGTM

37

Bảng 2.2. Danh sách các đoạn mồi khảo sát các gien tạo sụn

39

Bảng 3.1. Thống kê mật độ tế bào thu được trên các mẫu mô mỡ đã tiến
hành phân lập

47

Bảng 3.2. Sự tăng sinh của tế bào thu nhận từ mô mỡ

48

Bảng 3.3. Kết quả đánh giá biệt hóa TBGTM từ mơ mỡ thỏ in vitro

52

Bảng 3.4. Đánh giá biểu hiện dấu ấn bề mặt của tế bào gốc từ mơ mỡ thỏ

53

Bảng 3.5. Tóm tắt một số đặc điểm của thỏ trong quá trình nghiên cứu

66

Bảng 3.6. Thỏ bị hủy ghép

67

Bảng 4.1. So sánh sự biểu hiện các dấu ấn đặc hiệu của TBGTM từ mỡ thỏ
bằng phương pháp đo tế bào dòng chảy của các tác giả nước ngoài

77


1

MỞ ĐẦU
Hiện nay, tỷ lệ mắc các bệnh lý về khớp đang ngày càng tăng. Những nguyên
nhân làm tổn thương lớp sụn đầu khớp như thối hóa khớp, chấn thương thể thao, thói
quen sinh hoạt … [160]. Trên thế giới có khoảng 263 triệu người gặp tình trạng thối
hóa khớp [77] và khoảng 20% người trưởng thành từ 45 tuổi ở Mỹ được chẩn đoán
bằng X-quang [95]. Tại Việt Nam, tỷ lệ lưu hành bệnh thối hóa khớp gối trên Xquang là 44,6% ở người trên 40 tuổi [6]. Những bệnh về khớp không chỉ gặp ở những
người lớn tuổi mà còn gặp ở các đối tượng trung niên và thanh niên, gây ảnh hưởng tới
khả năng vận động cũng như giảm đáng kể chất lượng cuộc sống của người bệnh [11].
Cấu trúc mơ học của sụn khớp có tới 80% là nước, khơng có mạch máu, dây thần kinh
và bạch huyết và chỉ có một loại tế bào sụn, dẫn đến mơ sụn này có khả năng sửa chữa
nội tại rất hạn chế.

Các phương pháp điều trị bệnh hiện nay chủ yếu là điều trị triệu chứng. Trong
những trường hợp tổn thương nặng hoặc điều trị nội khoa không hiệu quả thì phẫu
thuật thay khớp thường được lựa chọn. Phẫu thuật thay khớp gối là một phẫu thuật lớn
nên cũng có nhiều biến chứng và việc thay khớp gối nhân tạo cũng có hạn chế là tuổi
thọ của mảnh ghép thường từ 10-15 năm phải mổ lại để thay mới, đặc biệt bất lợi trên
những bệnh nhân trẻ tuổi. Hiện nay để cải thiện và nâng cao chất lượng điều trị, các
bác sĩ lâm sàng đã lựa chọn nhiều phương pháp khác nhau như tiêm nội khớp, kích
thích mọc sụn bằng tạo tổn thương dưới sụn [141] hay liệu pháp tế bào gốc hoặc ghép
tế bào sụn tự thân [29] để điều trị nhằm phục hồi sụn khớp, làm chậm q trình thối
hóa, và kéo dài thời gian phải thay khớp. Các kết quả của các kỹ thuật điều trị này
thường giảm hiệu quả theo thời gian do mô sụn bị xơ hóa dẫn đến cứng khớp sụn

[112] hoặc mô ghép sụn thiếu sự gắn kết giữa mô chủ và mô ghép [155] làm kết quả
ghép không đạt hiệu quả cao.
Các kỹ thuật ghép dựa trên tế bào dần cho thấy có vai trị ưu việt, trong đó, tế bào
gốc trung mô (TBGTM) đã nổi lên như là một lựa chọn đầy hứa hẹn để điều trị các tổn
thương sụn khớp và các giai đoạn viêm khớp ban đầu [91]. TBGTM là những tế bào
gốc đa tiềm năng, có thể biệt hóa thành nhiều dịng tế bào khác nhau bao gồm cả tế


2

bào sụn, có khả năng tự tái tạo, tính mềm dẻo cao, khả năng ức chế miễn dịch và
chống viêm [62], [108]. Tại Việt Nam đã có những nghiên cứu ban đầu về tiềm năng
sử dụng tế bào gốc trong điều trị bệnh thối hóa khớp gối [25], [26], [158]. Kết quả
cho thấy thử nghiệm lâm sàng ứng dụng TBGTM từ mỡ tự thân đang mở ra một
hướng điều trị ít xâm hại cho bệnh thối hóa khớp, giúp cải thiện tốt tình trạng lâm
sàng và chất lượng cuộc sống cho bệnh nhân. Tuy vậy, các nghiên cứu vẫn còn hạn
chế, chưa đánh giá được sự tái tạo hay phục hồi sụn khớp và việc ghép TBGTM từ mô
mỡ trực tiếp như hiện nay còn nhiều khiếm khuyết đặc biệt trong các trường hợp tổn

thương sâu và hoặc rộng mặt khớp. Đối với những trường hợp thối hóa khớp mức độ
3, 4 và hoặc rộng trên lâm sàng cần có mảnh sụn ghép thay thế.
Câu hỏi được đặt ra là “Làm sao tái tạo, phục hồi mô sụn ở vùng sụn khớp bị tổn
thương?” Để giải quyết vấn đề này, công nghệ mô sụn ra đời với sự kết hợp giữa tế
bào và giá thể nhằm tạo ra một tấm tế bào sụn nhân tạo giống với sụn tự nhiên. Lĩnh
vực nghiên cứu công nghệ mô sụn đã thu hút nhiều nhà khoa học khắp nơi trên thế
giới và đã đạt được những thành tựu đáng kể [102].
Xuất phát từ những nhu cầu và tiềm năng ứng dụng mà tấm tế bào sụn mang lại,
nhóm nghiên cứu quyết định thực hiện đề tài nghiên cứu “Nghiên cứu chế tạo tấm tế bào
sụn từ tế bào gốc mô mỡ và màng chân bì ứng dụng điều trị tổn thương bề mặt sụn khớp
trên mơ hình thỏ”.


3

Thực hiện đề tài này, chúng tôi nhằm đạt các mục tiêu sau:
Mục tiêu nghiên cứu:
a. Mục tiêu tổng quát
Đánh giá tiềm năng tái tạo mô sụn của tấm tế bào sụn trên mơ hình thỏ.
b. Mục tiêu chun biệt:
 Thiết lập quy trình phân lập, ni cấy và định danh tế bào gốc trung mô từ
mô mỡ thỏ.
 Thiết lập quy trình tạo tấm tế bào sụn từ tế bào gốc trung mơ từ mỡ thỏ và
màng chân bì.
 Xây dựng mơ hình đánh giá hiệu quả phục hồi tổn thương bề mặt sụn khớp
in vivo của tấm tế bào sụn trên mơ hình thỏ.


4

CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Công nghệ mô sụn
Công nghệ mô là một lĩnh vực đa ngành, ứng dụng các công cụ kỹ thuật kết hợp
y sinh học và khoa học công nghệ để sử dụng các tế bào sống hoặc thu hút các tế bào
nội sinh nhằm hỗ trợ sự hình thành hoặc tái tạo mơ để hồi phục, duy trì hoặc cải thiện
chức năng của mơ [3], cơng nghệ mô đã được áp dụng để sửa chữa, tái tạo các tổn
thương ở nhiều loại cơ quan khác nhau như mô xương, gan, tụy … và mạch máu
[105].
Riêng đối với cơng nghệ mơ sụn, mục đích nghiên cứu là tạo ra các loại tấm tế
bào sụn công nghệ dùng để thay thế mơ sụn. Một trong những lợi ích quan trọng nhất
của cơng nghệ này là có thể sử dụng chính tế bào tự thân của người bệnh để tạo ra các
mảnh ghép cho chính họ, các mảnh ghép thay thế này có thể dễ dàng vượt qua rào cản
miễn dịch ghép của cơ thể. So với việc sử dụng mô ghép tự thân, mảnh ghép công
nghệ sử dụng một lượng tế bào hiến ít hơn (vì số tế bào thu nhận được sẽ được làm
tăng lên thông qua việc nhân khối in vitro) và làm giảm tổn thương cho người bệnh khi
phải phẫu thuật thu nhận mô sụn tự thân để ghép vào các tổn thương sụn.
Các thành phần cơ bản để tạo ra tấm tế bào sụn dựa trên nền tảng cơng nghệ mơ
gồm có 3 yếu tố là tế bào, giá thể và các yếu tố hoạt hóa sinh học để hỗ trợ q trình
tạo sụn. Trong đó, giá thể kết hợp với yếu tố hoạt hóa sinh học sẽ tạo một mơi trường
thuận lợi giúp cho sự tăng trưởng và biệt hóa của tế bào, đồng thời giá thể cịn giúp tạo
sự tồn vẹn cơ học khi cấy ghép in vivo. Sự tăng sinh, hoạt động biến dưỡng và biệt
hóa của tế bào sẽ được định hướng thông qua tác động của các yếu tố tăng trưởng [37].
Nguồn tế bào được sử dụng trong công nghệ mô sụn được nghiên cứu ứng dụng nhiều
hiện nay là TBGTM, đây được cho là sự lựa chọn phù hợp thay thế cho tế bào sụn
trong việc tái tạo mô. Không những khắc phục được những nhược điểm khi cấy ghép
tế bào sụn, TBGTM cịn có khả năng điều biến miễn dịch giúp hạn chế quá trình viêm
khi cấy ghép và khả năng biệt hóa thành tế bào sụn [100].

5

1.2. Tế bào gốc trung mô từ mô mỡ
1.2.1. Tế bào gốc trung mô
Hiện nay, tế bào gốc (TBG) được xem là nguồn tế bào vơ tận. Chúng có thể được
thu nhận từ phôi, thai và các mô ở người trưởng thành. Ngược lại với những tế bào từ
cơ thể trưởng thành, TBG từ phơi hoặc thai có khả năng tăng sinh khơng giới hạn nên
có thể được sử dụng trong các liệu pháp điều trị. Ngoài ra, các TBG này cịn có khả
năng biệt hóa thành nhiều loại tế bào khác nhau của cơ thể khi cảm ứng trong điều
kiện ni cấy thích hợp.
Trong giai đoạn 3 lá phơi, lớp trung bì phơi được tạo thành giữa lớp ngoại bì và
nội bì phơi. Lớp tế bào của phần trung bì có chứa các tế bào được cho là các tế bào gốc
trung mô (TBGTM), đây là quần thể tế bào gốc đa tiềm năng còn tồn tại sau khi sinh.
TBGTM có thể thu nhận từ nhiều nguồn mơ khác nhau của phôi, thai cho đến các
mô của cơ thể trưởng thành. Tuy nhiên, các nhà nghiên cứu tập trung nhiều hơn ở các
loại mơ có nguồn gốc từ cơ thể trưởng thành vì các ưu điểm nổi bật mà các mô này
mang lại như dễ thu nhận, vượt qua rào cản y đức cũng như có thể dễ dàng để ghép tự
thân lại cho người bệnh [69]. Ngày nay, các TBGTM được xác định chắc chắn xuất
hiện trong nhiều loại mô, cụ thể như là mô mỡ, mô cơ, màng xương, cuống rốn, máu
cuống rốn, tủy răng, nhú răng, gai nhau, dịch ối … đã được nghiên cứu rất nhiều, với
nguồn cung cấp TBGTM khá dồi giàu sẽ là một điều kiện thuận lợi để chúng ta có thể
sử dụng các tế bào này trong các liệu pháp tế bào, đặc biệt là trong lĩnh vực y học tái
tạo [164].
Khả năng tăng trưởng và duy trì tiềm năng biệt hóa của TBGTM phụ thuộc vào
nhiều yếu tố như là nguồn mơ thu nhận, kỹ thuật ni cấy, hóa chất sử dụng …. Trong
đó, đặc biệt là việc lựa chọn loại huyết thanh phù hợp để bổ sung vào môi trường nuôi
tế bào. Theo như Caplan và CS [30] sự hình thành chất nền ngoại bào cũng được quan
sát thấy khi ni TBGTM trong mơi trường có chứa nồng độ huyết thanh cao của thai
bò hoặc ngựa khi sử dụng ở nồng độ 10% hoặc 20% huyết thanh. Do đó, huyết thanh
cung cấp nhiều yếu tố rất quan trọng cho việc trao đổi, vận chuyển các phân tử thiết

yếu và chất dinh dưỡng để hỗ trợ cho tế bào tăng trưởng.


6

Số lượng TBGTM hiện diện trong một mẫu tủy xương có thể được xác định bằng
cách đếm các cụm tế bào CFU trong giai đoạn nuôi cấy sơ cấp bằng cách áp dụng
phương pháp tạo dòng tế bào theo tác giả Friedenstein [56]. Số lượng các cụm tế bào
được tìm thấy tương ứng với số lượng tế bào đơn nhân ban đầu được phân lập từ tủy
xương [56], nhiều tác giả đồng ý rằng dữ liệu đó có thể sử dụng để tính tốn cho các
TBGTM trong nguồn mẫu thu nhận từ ban đầu. Thông thường số lượng này nằm trong
khoảng 1 TBGTM cho khoảng từ 1×105 đến 1×106 tế bào đơn nhân trong tủy xương
[71]. Trong lĩnh vực công nghệ mô sụn cần phải sử dụng một lượng lớn tế bào để ghép
lại cho người bệnh, do đó một lượng nhỏ các TBGTM phân lập sẽ được nhân khối và
cho tăng trưởng để gia tăng đủ số lượng tế bào để tiến hành ghép lại cho người bệnh.
Quần thể TBGTM chưa có dấu ấn đặc hiệu để xác định. Tuy nhiên, quần thể tế
bào tiền thân của các tế bào này đã được xác định bằng sự hiện diện của một số dấu ấn
bề mặt tế bào cũng như không biểu hiện của một số dấu ấn. Hội liệu pháp Tế bào Quốc
Tế (ISCT) đã đưa ra các tiêu chí để sử dụng cho việc định danh các quần thể TBGTM
này [48]:
 Thứ nhất, đó là các tế bào có khả năng bám dính vào đáy chai ni khi
được ni cấy trong điều kiện in vitro.
 Thứ hai, đó là các tế bào không biểu hiện các dấu ấn của các tế bào tạo
máu như CD11b, CD14, CD34, CD45, B-lymphocyte antigens CD19 và
CD79a và HLA-DR nhưng biểu hiện được các dấu ấn như CD73, CD90
và CD105.
 Thứ ba, đó là các tế bào có khả năng biệt hóa thành các tế bào của dịng
trung mơ như là tế bào sụn, tế bào mỡ và tế bào xương trong điều kiện in
vitro.
1.2.2. Đặc điểmTBGTM thu nhận từ mô mỡ

TBGTM từ mơ mỡ hay cịn gọi là tế bào gốc từ mô mỡ (ADSC) được phát hiện
đầu tiên vào năm 1980 do Plaas và Vryer. Các tác giả cho rằng, mô mỡ bò trưởng
thành chứa các tế bào giống nguyên bào sợi có tiềm năng biệt hóa thành tế bào mỡ.
Một số nghiên cứu đã kiểm tra sự tồn tại của tế bào gốc trong mơ mỡ ở các lồi khác


7

nhau.
Năm 2001, Patricia Zuk và nhóm nghiên cứu của đại học California (Mỹ) công
bố thu nhận được tế bào từ mỡ hút được xử lý bằng kỹ thuật chọc hút mỡ. Mỡ sau khi
thu nhận được rửa với dung dịch PBS và tách với collagenase 0,075%. Phân lớp mạch
nền được thu nhận bao gồm các loại tế bào khác nhau như TBGTM, tế bào gốc tạo
máu và các tế bào không phải tế bào gốc như tế bào nội mạch, nguyên bào sợi, tế bào
máu, tế bào tiềm năng tạo mỡ và tế bào quanh mao mạch. Để phân lập TBGTM khỏi
các tế bào khác, tế bào được nuôi trên bề mặt ni cấy plastic trong thời gian dài, trong
đó các tế bào có khả năng bám dính bám trên bề mặt ni cấy có khả năng sống sót
trong khi các tế bào phát triển huyền phù như tế bào tạo máu khơng có khả năng tăng
sinh và bị loại bỏ trong q trình ni. Sau vài lần cấy chuyền, các tế bào không phải
tế bào gốc như tế bào nội mơ có khả năng tăng sinh và chu kỳ sống có giới hạn khơng
thể duy trì trong điều kiện ni cấy, vì vậy mất đi trong q trình ni. Lượng ADSC
thu nhận từ mô mỡ tương đương (hay nhiều hơn) lượng TBG thu từ tủy xương [42].
Với 30 ml tủy xương thu được khoảng 1x105 tế bào [24], trong khi với 21 ml mỡ hút
dưới xương bánh chè có thể thu được khoảng 5,5x106 tế bào [167]. Quần thể tế bào
này có thể được duy trì trong điều kiện in vitro trong thời gian dài với khả năng tăng
sinh ổn định và khả năng biệt hóa thành các dịng tế bào khác nhau.
Việc phát hiện sự tồn tại của nguồn TBGTM trong mô mỡ đã mở ra một tiềm
năng to lớn trong ứng dụng điều trị. Thứ nhất, mô này là phổ biến, có nhiều trong cơ
thể người, dễ dàng thu nhận, ít xâm lấn nên ít gây đau đớn cho bệnh nhân so với việc
thu nhận tủy xương. Lượng TBGTM tự thân cần thiết cho nghiên cứu có thể được thu

nhận từ khoảng 1g mỡ. Hơn nữa, chỉ cần gây tê cục bộ và vết thương có thể lành trong
vòng 1 tuần. Nếu mỡ thu nhận từ người cho là mỡ hút hoặc mỡ từ phẫu thuật dưới da,
thì lượng TBGTM đủ để cấy ghép ngay sau đó mà không cần qua bước nhân khối ex
vivo. Thứ hai, mơ này cũng là nguồn tế bào có thể tự tái tạo lại được trong cơ thể. Thứ
ba, và quan trọng nhất, nó là nguồn mơ tự ghép.
Ngồi ra, mơ mỡ có những đặc điểm nổi trội hơn các nguồn mơ có thể thu nhận
được tế bào gốc trưởng thành trong nghiên cứu và ứng dụng. Đó là vì:


8

Thứ nhất, mơ mỡ có chứa các tế bào cơ trơn thành mạch, tế bào nội mô, nguyên
bào sợi, tế bào máu và các TBGTM hay còn gọi là tế bào gốc từ mơ mỡ (ADSC) [87].
Các ADSC này có thể dễ dàng được phân lập, nuôi cấy, tăng sinh in vitro và có thể
cảm ứng biệt hóa thành các tế bào của các dòng khác nhau. Các tế bào này rất hiệu quả
trong việc tái tạo mô sau các tai nạn dẫn đến chấn thương làm mất mô mềm, có thể tồn
tại lâu khi mơ thiếu máu ni và trong môi trường thiếu dinh dưỡng khi so sánh với tế
bào mỡ trưởng thành [31], [36].
Thứ hai, mơ mỡ có tỷ lệ ADSC cao. Mỗi gram mô mỡ chứa 105 ADSC [136].
Trong khi, TBGTM chỉ tồn tại rất ít trong tủy xương và các mô khác, với tủy xương
TBGTM chiếm khoảng 0.0001% - 0.01% của tổng số tế bào đơn nhân [130]. ADSC từ
mơ mỡ có những đặc điểm tương tự TBGTM thu từ tủy xương. Trong điều kiện nuôi
cấy cả hai biểu hiện hình thái giống các nguyên bào sợi. Biểu hiện các dấu ấn bề mặt
như CD105, STRO-1, CD166 và CD117, là các dấu ấn của các tế bào gốc đa tiềm
năng [67], [142]. Chúng không biểu hiện các dấu ấn của tế bào gốc tạo máu và tế bào
nội mô, sự biểu hiện của HLA-DR trong ADSC là dưới 1% [19], [48]. Tuy nhiên, so
với TBGTM từ tủy xương, các ADSC được nuôi cấy dễ dàng hơn với tốc độ tăng
trưởng nhanh hơn và thời gian nuôi cấy lâu hơn trước khi trở nên già cỗi [96].
Thứ ba, điều đáng lưu ý là khả năng biệt hóa của các ADSC ít chịu ảnh hưởng
của tuổi người hiến mô [79].

Sau khi được phân lập và nuôi cấy tăng sinh trong phịng thí nghiệm, phương
thức chuyển các ADSC vào ứng dụng cũng cần được quan tâm nghiên cứu. Để ADSC
thực hiện chức năng một cách nhanh chóng và hiệu quả trong y học tái tạo thì các
ADSC này cần được chuyển lên các giá thể phù hợp. Các giá thể có chức năng như
khn ngoại bào sẽ hỗ trợ các ADSC bám dính, tăng sinh và biệt hóa nhằm tái tạo mơ
có định hướng.
ADSC là nguồn thay thế tế bào gốc trưởng thành tự thân, có thể thu nhận nhiều
lần với số lượng lớn mà khơng hoặc rất ít ảnh hưởng đến sức khỏe của bệnh nhân.
Quan trọng nhất là khi phân tích để so sánh TBGTM từ tủy xương, từ mô mỡ và cuống
rốn, cho thấy rõ ràng rằng ADSC khơng có nhiều sự khác biệt về mặt hình thái, kiểu
hình miễn dịch, tần số tạo cụm và tiềm năng biệt hóa. Những đặc điểm này đã mang


9

lại nhiều triển vọng cho các ứng dụng trong lâm sàng của TBGTM từ mơ mỡ.

Hình 1.1. Tiềm năng biệt hóa của TBGTM thu nhận từ mơ mỡ
“Nguồn: Zizhen Si et al, 2019” [140]

1.2.3. Các dấu ấn định danh TBGTM từ mô mỡ
Hầu hết các protein bề mặt được biểu hiện bởi TBGTM cũng được biểu hiện ở
bởi các ADSC. Các nghiên cứu về dấu ấn của tế bào gốc từ mơ mỡ cho thấy chúng có
các kiểu hình sau:
 Những phân tử bám dính: ADSC có biểu hiện CD9, CD29, CD49e, CD54,
CD105, CD106, và CD166 và không biểu hiện CD11b, CD18, CD50, CD56 và CD62
trên bề mặt tế bào [147].
 Những phân tử thụ quan: ADSC biểu hiện CD44 và CD71, CD144

10

 Những enzyme bề mặt: ADSC biểu hiện CD10, CD13, và CD73. Những protein
chất nền ngoại bào và glycoprotein: ADSC biểu hiện collagen tuýp I và III
osteopontin, ostenectin, CD90, CD105 và CD146 [51], [147].
 Protein bộ xương tế bào: ADSC biểu hiện intracellular α smooth muscle actin
và vimentin.
 Protein điều hịa bổ thể: ADSC dương tính với CD55 và CD95.
 Kháng ngun tương hợp mơ: ADSC dương tính với HLA – ABC và âm tính
với HLA- DR (ít hơn 1% ADSC biểu hiện protein HLA –DR) [51], [143].
 ADSC không biểu hiện dấu ấn tế bào gốc máu và tế bào gốc nội mô như CD3,
CD4, CD11b, CD11c, CD14, CD15, CD16, CD19, CD31, CD33, CD38, CD34, C45,
CD56, CD62p, CD79α, CD104, CD144 [51], [143], [147]
Vẫn cịn một số khơng nhất qn giữa các nghiên cứu về các dấu ấn của ADSC.
Ví dụ, trong khi Gronthos và cộng sự [63] tìm thấy CD34 và CD106 trên ADSC, Zuk
và cộng sự [181] thì khơng. Tương tự, trong khi Zuk và cộng sự tìm thấy Stro – 1,
Gronthos và cộng sự [63] thì khơng. Sự khơng nhất qn này có thể do sự khác nhau
trong phương pháp phân lập tế bào, những tế bào được ni cấy sau bao lâu để phân
tích, việc sử dụng những kháng thể đơn dịng dị tìm những epitope khác nhau trên
protein bề mặt giống nhau và độ nhạy khác nhau giữa phương pháp hóa mơ miễn dịch
và flow cytometry.
Ngoài ra, CD90, CD34, CD106, CD105 và Stro – 1 biểu hiện một cách biến động
trong ADSC cả người và động vật, đặc biệt trong những tế bào mới phân lập hoặc ở
những bước cấy chuyền sớm. ADSC mới phân lập và sau khi cấy chuyền đều biểu
hiện những dấu ấn tế bào gốc CD166, CD44, CD29, CD73, CD90 và CD105. Tuy
nhiên, sự biểu hiện của những dấu ấn này tăng lên rất nhiều với sự tăng lên của số lần
cấy chuyền, đạt đến 98% ở lần cấy chuyền thứ 4. ADSC cũng biểu hiện CD11, CD14,
CD45 và CD34 (những dấu ấn của tế bào gốc tạo máu) nhưng sau đó sẽ giảm hoặc mất
đi với sự tăng lên của số lần cấy chuyền [147].
De Ugarte và cộng sự [42] cũng đã so sánh sự biểu hiện dấu ấn bề mặt tế bào trên

ADSC và TBG từ tủy xương (BMSC) ở người. Theo nghiên cứu trên, dường như hai


11

quần thể tế bào này tương tự nhau, chỉ có vài khác biệt. Những khác biệt này chủ yếu
trong sự biểu hiện các phân tử bám dính:
 ADSC biểu hiện CD9f (alpha 4 intergrin), trong khi BMSC không biểu hiện.
 ADSC âm tính cho CD106/VCAM1, trong khi BMSC dương tính.
 ADSC biểu hiện mức cao của CD54 (ICAM1), còn BMSC biểu hiện yếu.
 CD43+ được biểu hiện yếu trên ADSC, nhưng không biểu hiện trên BMSC.
CD44 là một thụ thể của hyaluronic acid hay fibronectin được biểu hiện bởi các
BMSC và ADSC.
Dựa vào các kết quả nghiên cứu, De Ugarte và cộng sự đã giả thuyết rằng, cả
ADSC và BMSC là hai nhóm phụ của TBGTM. Sự khác biệt của một số dấu ấn là do
môi trường sống của chúng. Gronthos và cộng sự (2001) đã nghiên cứu ADSC trong
trạng thái biệt hóa và khơng biệt hóa. Các nghiên cứu đồng ý với công bố của De
Ugarte và cộng sự, Gronthos và cộng sự thấy rằng ADSC biểu hiện các protein: CD9,
CD10, CD13, CD29, CD34, CD44, CD49d, và e, CD54, CD55, CD59, CD105,
CD106, CD146, CD166. Tuy nhiên, không giống với BMSC, nhóm của Gronthos
khơng phát hiện sự biểu hiện STRO – 1 trên ADSC người [63].
1.2.4. Tiềm năng sửa chữa sụn của TBGTM từ mô mỡ
Là tế bào tiền thân của mơ chưa trưởng thành, tế bào gốc có thể tự đổi mới và có
khả năng hình thành quần thể tế bào vơ tính và biệt hóa thành nhiều dịng tế bào [85].
Những đặc tính đặc biệt này đặc biệt hấp dẫn để phục hồi các chức năng của nhiều loại
cơ quan. Một số lượng lớn các nghiên cứu đã xác nhận vai trị có lợi của tế bào gốc
trong việc tái tạo sụn khớp, và cơ chế tiềm năng của chúng chủ yếu được chia thành
hai giả thuyết (Hình 1.1), thứ nhất là “khả năng biệt hóa”, nói rằng tế bào gốc trực tiếp
biệt hóa thành tế bào sụn và sửa chữa sụn bị hư hỏng bằng cách thêm hoặc thay thế các
tế bào sụn [38]. Giả thuyết còn lại là “khả năng cận tiết”, trong đó tế bào gốc tiết ra các

yếu tố hoạt tính sinh học, túi ngoại bào (EV) và chất nền ngoại bào (ECM) [90], thay
đổi hành vi sinh học của tế bào thụ cảm (bao gồm tế bào gốc nội sinh, tế bào sụn và
đại thực bào), chẳng hạn như tăng sinh, biệt hóa, di chuyển, phân cực, chuyển hóa và


12

chết tế bào theo lập trình, đồng thời điều hịa vi môi trường tại chỗ để sửa chữa và tái
tạo sụn khớp.

Hình 1.2. Hai giả thuyết về tái tạo sụn khớp liên quan đến tế bào gốc
“Nguồn: Shuangpeng Jiang et al, 2021” [78]
(a) Khả năng biệt hóa của tế bào gốc. Tế bào gốc bị ảnh hưởng bởi vi môi
trường và trực tiếp biệt hóa thành tế bào sụn. (b) Khả năng cận tiết của tế bào gốc. Tế
bào gốc bị ảnh hưởng bởi môi trường vi mô và tiết ra nhiều dẫn xuất khác nhau, bao
gồm các yếu tố tăng trưởng, EV và ECM. Các chất này đã được chứng minh là có khả
năng tạo ra các tế bào gốc nội sinh, thúc đẩy sự biệt hóa của các tế bào gốc nội sinh
thành tế bào sụn, thúc đẩy sự gia tăng của các tế bào sụn, cảm ứng các đại thực bào
phân cực thành loại M2 và điều chỉnh mức độ của các yếu tố gây viêm để có tác dụng
chống viêm. EVs: túi ngoại bào; ECM: chất nền ngoại bào.
Các nghiên cứu ban đầu tập trung vào sự biệt hóa và thay thế trực tiếp của các
TBG. Trong những năm gần đây, ngày càng có nhiều bằng chứng cho thấy lợi ích điều
trị của tế bào gốc có thể là do tác dụng của sản phẩm chế tiết của tế bào gốc.
Sự hình thành sụn bắt đầu bằng sự ngưng tụ trung mơ, khiến TBGTM biệt hóa
thành sụn. Sau đó, một chất nền dày đặc hình thành, làm khn mẫu cho sự hình thành


13

xương dưới sụn và sụn [20]. Ngoài ra, một số lượng lớn các nghiên cứu đã chỉ ra rằng

TBGTM duy trì tính đa năng sau các chu kỳ tăng sinh lặp lại trong ống nghiệm và có
thể biệt hóa thành các tế bào sụn tiết chất nền [164], [179]. Dựa trên những phát hiện
này, hầu hết các nghiên cứu trước đây cho rằng vai trò của tế bào gốc trong việc tái tạo
sụn khớp là do chúng có khả năng biệt hóa thành nhiều dịng [81], [176]. Một số lượng
lớn các nghiên cứu tập trung vào việc phát triển các vật liệu và phương pháp khiến tế
bào gốc biệt hóa thành tế bào có kiểu hình tế bào sụn [27]. Abir và các đồng nghiệp đã
chứng minh rằng các TBGTM tự thân được tiêm vào trong khớp sẽ biệt hóa thành các
tế bào giống tế bào sụn trưởng thành [115], tương tự trong mơ hình tổn thương sụn đầu
gối của chó cũng chứng minh rằng TBGTM được tiêm vào sẽ biệt hóa thành các tế bào
sụn trưởng thành [115].
Các nhà nghiên cứu từ lâu đã biết rằng môi trường điều hịa (CM) của tế bào gốc
có thể thúc đẩy sự tăng sinh và biệt hóa tế bào in vitro và có thể thúc đẩy q trình sửa
chữa và tái tạo mô in vivo [127]. Người ta đã chứng minh rằng tế bào gốc tiết ra nhiều
cytokine và protein. Tác dụng hiệp đồng của các phân tử nhỏ do TBGTM tiết ra có thể
làm giảm tổn thương tế bào và cải thiện khả năng sửa chữa của mô [30]. Thứ hai, có
nhiều báo cáo về tác dụng điều hịa miễn dịch của tế bào gốc. Tế bào gốc có thể điều
chỉnh vi mơi trường miễn dịch trong q trình sửa chữa mô và cung cấp môi trường tốt
để tái tạo mô [100]. TBGTM trong vi mơi trường miễn dịch có thể thúc đẩy q trình
biệt hóa sụn thơng qua cơ chế điều hòa miễn dịch [47]. Đồng thời, một số lượng lớn
các nghiên cứu về việc đồng nuôi cấy TBGTM và tế bào sụn in vitro đã chứng minh
rằng tín hiệu cận tiết là một đặc điểm quan trọng của TBGTM [12], [169], [177].
1.2.5. Tiềm năng biệt hóa thành nguyên bào sụn của TBGTM từ mơ mỡ
TBGTM có nguồn gốc từ mỡ có khả năng biệt hóa sụn tương đồng. Trong bài
tổng quan của tác giả Dubey và cộng sự thì chỉ ra [52] rằng các cytokine như BMP-6
và nồng độ cao hơn của các yếu tố tăng trưởng khác trong môi trường nuôi cấy gây ra
sự cảm ứng thành nguyên bào sụn từ TBGTM. Hơn nữa, sự hiện diện của ascorbic
acid phosphate, dexamethasone, bovine serum albumin, linoleic acid, sodium piruvate,
transferrin, selenous acid, proline, L-glutamine vaf TGF-1 cũng kích thích biệt hóa

14

sụn trong in vitro. Ngồi những yếu tố trên thì các yếu tố phiên mã như SRY-related
high mobility group-box gene 9 (Sox9), Zinc-finger protein 145 (ZNF145),
HOXD9/10/11/13, FOXO3 A, Wnt 11 và STAT3 có vai trị trong biệt hóa sụn. Hiện
tại đã có mơi trường biệt hóa sụn thương mại.

Hình 1.3. Tiềm năng biệt hóa thành tế bào sụn của TBGTM từ mơ mỡ
“Nguồn: Claire Vinatier et al, 2009” [161]
TBGTM có khuynh hướng tăng sinh đơn lớp trong nuôi cấy in vitro và tránh sự
tiếp xúc tế bào – tế bào bởi sự ức chế tăng sinh. Tuy nhiên, mật độ tế bào cao là điều
kiện cơ bản cho biệt hóa thành nguyên bào sụn. Môi trường DMEM thường được sử
dụng như là môi trường cơ bản trong nuôi cấy tế bào, các chất bổ sung là ascorbate-2phosphate, insulin, TGF-1 và FBS 1% [182]. Tuy nhiên, mơi trường dùng cho biệt
hóa sụn khơng sử dụng FBS cũng kích thích TBGTM biệt hóa thành sụn [18]. Thời
gian biệt hóa từ 14 – 21 ngày.
Khi TBGTM được cảm ứng tạo sụn, chúng trải qua ba giai đoạn chính sự kết
cụm tế bào, sự biệt hóa thành tế bào sụn, sự trưởng thành [128]. Trong giai đoạn kết
cụm tế bào xảy ra khi các tế bào di chuyển lại gần nhau tạo vùng có mật độ tế bào cao.
Khi đó, các tế bào liên kết và tương tác với nhau thông qua các phân tử bám dính như
N-Cadherin phụ thuộc Ca2+, C-CAM khơng phụ thuộc Ca2+ và các cầu nối tế bào.
Những nghiên cứu trước đã chứng minh rằng sự biểu hiện N-cadherin và N-CAM


15

đóng vai trị quan trọng trong sự kết cụm tế bào của q trình biệt hóa tạo sụn in vitro
từ tế bào trung mơ tiền thân tạo sụn biệt hóa thành tế bào sụn trương phình và thành tế
bào giống nguyên bào xương [148]. Và sự biệt hóa này được làm rõ bằng thí nghiệm
của Olberlender và cộng sự (1994), sự hình thành sự bị ức chế khi bổ sung kháng thể
kháng N-cadherin và N-CAM [122].

Giai đoạn biệt hóa thành tế bào sụn được cảm ứng khi có sự tương tác giữa các
thành phần của chất nền ngoại bào với tế bào, cụ thể là việc gắn fibronectin với
syndecan – thụ thể trên màng tế bào. Sau giai đoạn kết cụm, các tế bào bắt đầu tăng
sinh. Đồng thời, chất nền ngoại bào được sản xuất nhiều hơn và có những thay đổi về
thành phần như sự mất dần collagen I, sự tăng lên tenascin, matrilins,
thrombospondins, collagen II, aggrecan. Điều này giúp cho tế bào tiền thân tạo sụn
biệt hóa hồn tồn thành tế bào sụn [73]. Sau đó, tế bào sụn trương phình và thành
phần chính của chất nền ngoại bào là collagen X và fibronectin. Những tế bào sụn
trương phình đi vào hai chu trình khác biệt. Những tế bào này có thể bị cảm ứng chết
theo chương trình khi có sự xâm lấn của mạch máu hoặc chúng thay đổi chất nền
ngoại bào trong vi môi trường xung quanh và tự canxi hóa [21].
Để xác định khả năng biệt hóa thành sụn của TBGTM thì có thể sử dụng các
phương pháp đơn giản như nhuộm chất nền ngoại bào với alcian blue, toluidine blue,
safranin-O. Ngoài ra các kỹ thuật phân tử như real-time PCR, western blot, ELISA và
RNA microarray cũng đã được sử dụng để nghiên cứu sự biểu hiện của các gien sụn
như collagen II, SOX 9 [52], [125].
1.3. Giá thể sử dụng trong công nghệ mô sụn
1.3.1. Đặc điểm chung của giá thể sử dụng trong công nghệ mô
Yếu tố quan trọng quyết định hiệu quả của liệu pháp tế bào gốc là tỷ lệ sống sót
của tế bào gốc trong và sau khi cấy ghép. Giá thể sinh học được sử dụng để sửa chữa
sụn không chỉ cung cấp hỗ trợ cơ học cho các khiếm khuyết của sụn mà còn cung cấp
chất nền hỗ trợ cho sự phát triển, khuếch tán và biệt hóa của tế bào gốc [15]. Hệ thống
phân phối tế bào dựa trên giá thể sinh học có thể được chiết xuất từ các vật liệu có
nguồn gốc tự nhiên, chẳng hạn như Hyaluronic Acid (HA) [131], gelatin [83], alginate