Khảo sát hoạt tính biến tính tinh bột gạo của enzyme phân nhánh tái tổ hợp trong bacillus subtilis p2

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Vật liệu nghiên cứu
2.1.1 Vật liệu
- Plasmid BBE (Đại học Quốc gia Chungnam, Hàn Quốc).
- Bacillus subtilis 1012 (leuA8 metB5 trpC2 hsdRM1) được sử dụng làm chủng biểu
hiện cung cấp bởi Trung tâm Khoa học và Công nghệ sinh học, Trường Đại học
Khoa học tự nhiên- ĐHQG TpHCM.
- Thang protein.

Hình 2.1 Thang chuẩn Promega 10-225 kDa
2.1.2. Dụng cụ thiết bị
2.1.2.1 Dụng cụ
- HisTrapTMFF (GE Healthcare).

Hình 2.2 Cợt sắc ký ái lực Ni-NTA (GE Healthcare)

28


- Màng lọc 0.45µm (Whatman).
- Màng lọc 0,47 µm (MS).
- Màng thẩm tích 12 MWCO (Spectrum Laboratries).
- Erlen, beaker, ống nghiệm.
- Đèn cồn.
- Eppendorf 1,5 mL; 2,0 mL.
- Falcon 15 mL.
- Bộ micropipette đơn kênh (Micropipette Nexty Single Chanel Pipetter, Watson-Nhật).
2.1.2.2 Thiết bị
- Máy ly tâm lạnh (Hettich, Đức).
- Máy ly tâm lạnh (SER 148/3 F30300240, Ý).
- Máy vortex (Velp, Ý).

- Máy đo quang phổ (Cary 50).
- Máy khuấy từ (IKA, Đức).
- Máy phá mẫu bằng sóng siêu âm (Q500-Qsonica, Mỹ).
- Cân phân tích (Kern ABJ 220-4NM, Đức).
- Cân phân tích (SJ 220CE-Vibra, Nhật Bản).
- Máy đo pH (Adwai Instruments, Hungary).
- Nồi hấp tiệt trùng (ALP, Nhật Bản).
- Máy lắc ổn nhiệt.
- Tủ lạnh -20 ºC, 4ºC.

29


- Tủ cấy vơ trùng.
2.1.3 Hóa chất
2.1.3.1 Hóa chất biến nạp
* Tạo tế bào B. subtilis 1012 khả nạp
- Dung dịch CaCl2 100 mM vô trùng (giữ ở 4 ºC).
- Dung dịch glycerol 100% vô trùng (giữ ở 4 ºC).
- Dung dịch EGTA 0,1M, pha bằng nước cất vô trùng và giữ ở 4 ºC.
* Cảm ứng biểu hiện protein trên B. subtilis 1012
- Dung dịch IGPT, pha bằng nước cất khử trùng và giữ ở 4 ºC.
2.1.3.2 Hóa chất điện di
- Dung dịch đệm điện di: Tris 40 g, Glycine 45,5 g trong 5 lít nước.
- Acrylamide mix (29:1).
- SDS (Sodium Dodecyl Sulfate).
- TEMED (N,N,N’,N’- tetramethyl ethylen ediamine).
- APS (Amonium persulfate).
- Tris- HCl (pH 8,8) và Tris- HCl (pH 6,8).
- Thang protein chuẩn BioLab.

- Comassie blue R-250 Stain.
- SDS- loading buffer 5X: 200mM Tris- HCl pH 6,8, 8% SDS, 40% glycerol, 0,4%
bromophenol blue, 200mM DTT (Dithiolthreitol).
- Dung dịch điện di 10X: 140 g Glycine, 30g Tris- HCl, 10 g SDS, thêm dH2O vừa
đủ 1 lít. Pha lỗng 10 lần trước khi dùng.

30


- Dung dịch nhuộm: 0,625 g comassive brilliant blue, 112,5 mL ethanol 99%, 25
mL glacial acetic acid, thêm H2O vừa đủ 1 lít.
- Dung dịch giải nḥm: 75 mL acid acetic, 100 mL ethanol, thêm H2O đến 1 lít.
Thành phần được thể hiện trong Bảng 2.1
Bảng 2.1 Thành phần gel polyacrylmaide
Thành phần

Gel gom

Gel phân tích

Nước

2115,4 µl

2307,7 µl

Acrylamide mix

461,5 µl

2769,2 µl

Tris 0,5 M (pH 6,8)

746,2 µl

Tris 1,5 M (pH 8,8)

1730,8 µl

SDS 10%

34,6 µl

69,2 µl

APS 10%

23,1 µl

46,2 µl

TEMED

3,46 µl

3,46 µl

2.1.3.3 Hóa chất tinh chế protein
Bảng 2.2 Thành phần buffer dùng trong tinh chế protein

Nờng độ
Hóa chất
Binding buffer

Washing buffer

Elution buffer

Tris-Cl (pH 8,0)

50 mM

50 mM

50 mM

Imidazole

5 mM

20 mM

300 mM

NaCl

100 mM

100 mM

50 mM

EDTA

0,1 mM

0,1 mM

0,1 mM

PMSF

1 mM

1 mM

1 mM

31


2.1.3.4 Hóa chất định lượng đường khử
- 0,016 M sodium acetate, pH 4,8.
- 2,0 N sodium hydroxide.
- Thuốc thử Dinitrosalicylic acid. Chuẩn bị bằng cách hòa 1 g 3,5-dinitrosalicylic
acid trong 50 mL nước cất. Thêm thật chậm 30 g sodium potassium tartrate
tetrahydrate, dung dịch có màu vàng đục. Thêm 20 ml 2,0 N sodium hydroxide, dung
dịch chuyển sang màu vàng cam trong suốt. Định mức đến 100 mL bằng nước cất.
Tránh tiếp xúc với carbon dioxide và bảo quản không quá 2 tuần trong chai tối màu.
- 1% Tinh bột: 1 g tinh bột trong 100 mL 0,016 M đệm sodium acetate pH 4,8. Đun

nóng và khuấy đến khi tan, sau đó làm ng̣i.
- Dung dịch maltose chuẩn (5 µM/mL): 180 mg maltose (MW 360,3) trong 100 mL
nước cất.
2.1.3.4 Hóa chất khác
- Kanamycin 50 mg/mL, pha bằng nước cất vô trùng và bảo quản ở -20 ºC.
- Dung dịch IPTG, pha bằng nước cất vô trùng và bảo quản ở -20 ºC.
2.1.4 Môi trường
- Môi trường LB (Luria - Bertami): 10 g trypton, 5 g yeast extract (cao nấm men), 5
g NaCl, dH2O vừa đủ 1 lít.
- Mơi trường LB - Agar: thành phần như LB lỏng, bổ sung 2% agar.
- Môi trường LB - Kana: là môi trường LB có bổ sung Ampicillin nồng đợ cuối 50
µg/mL.
- Mơi trường LB - Agar - Kana: là môi trường LB - Agar có bổ sung Ampicillin
nồng đợ cuối 50 µg/mL.

32


Các môi trường trên được hấp khử trùng ở 121 ºC, 20 phút. Sau đó bổ sung kháng
sinh vơ trùng để đạt nồng đợ thích hợp.
- 10X S - Base (Spizizen’s salt): 2 g (NH4)2SO4, 14 g K2HPO4, 6 g KH2PO4, 1 g
sodium citrate, thêm dH2O đủ 100 mL, hấp khử trùng. Bổ sung 0,1 mL MgSO4 1M
vô trùng sau khi hấp.
- Môi trường HS (High salt medium): 10 mL 10X S - Base, 2,5 mL glucose 40%, 5
mL L - tryptophan 0,1%, 1 mL casein 2%, 5 mL yeast extract 10%, 10 mL arginine
8% và histidine 0,4%, thêm dH2O đủ 100 mL.
- Môi trường LS (Low salt medium): 10 mL 10X S – Base, 2,5 mL glucose 20%,
0,5 mL L - tryptophan 0,1%, 0,5 mL casein 2%, 5 mL yeast extract 10%, 0,25 mL
MgCl2 1 M, 0,05 mL CaCl2 1 M, thêm dH2O đủ 100 mL.
Tất cả thành phần pha HS và LS được hấp khử trùng ở 121 ºC, 20 phút trước khi

pha môi trường, các amino acid được pha bằng nước cất khử trùng.
2.2 Nội dung nghiên cứu
- Nội dung 1: Phân tích tính chất hố lý và cấu trúc phân tử của tinh bột gạo.
- Nội dung 2: Biến nạp plasmid mang gen mã hóa cho enzyme phân nhánh vào vi
khuẩn Bacillus subtilis; biểu hiện, thu nhận và tinh sạch enzyme phân nhánh:
+ Biến nạp plasmid mang gen mã hóa cho enzyme phân nhánh vào vi khuẩn
Bacillus subtilis.
+ Nuôi cấy vi khuẩn Bacillus subtilis tái tổ hợp.
+ Thu nhận và tinh sạch enzyme phân nhánh bằng sắc ký ái lực với Ni-NTA resin.
- Nội dung 3: Khảo sát hoạt tính của enzyme phân nhánh đối với tinh bột gạo dưới
các điều kiện khác nhau:
+ Khảo sát ảnh hưởng của pH;

33


+ Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ;
+ Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ bột gạo;
+ Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ enzyme;
+ Khảo sát ảnh hưởng của thời gian thủy phân.
Trong mỗi thí nghiệm khảo sát, hiệu quả biến tính được đánh giá thơng qua chỉ tiêu
DE. Trong sản phẩm của thí nghiệm cuối cùng, cấu trúc tinh bợt biến tính được
đánh giá và so sánh với cấu trúc tinh bột ban đầu.
2.3 Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Nội dung 1: Phân tích tính chất hoá lý và cấu trúc phân tử của tinh bột gạo
- Các mẫu gạo lấy từ: Công ty Lương thực Tiền Giang.
- Giống gạo được sử dụng trong thí nghiệm là IR50404 (tên thương mại là gạo 504).
Đây là giống gạo được sử dụng tại cơ sở bánh bún, hủ tiếu thuộc làng nghề bánh
bún, hủ tiếu xã Mỹ Phong, Tp. Mỹ Tho, tỉnh Tiền Giang (loại gạo đã làm sạch
cám). Gạo được thu về, tiến hành nghiền thành bột như tại các cơ sở sản xuất.

- Các chỉ tiêu phân tích:
+ Phân tích tính chất hóa lý, bao gồm:
i) Xác định đợ hịa tan của bợt gạo trong nước;
ii) Đánh giá đợ nhớt của dung dịch bột gạo bằng nhớt kế;
iii) Khả năng tạo gel;
iv) Tốc đợ thối hố khi bảo quản gel (hồ) tinh bột: theo phương pháp của Singh et
al (2004);
+ Phân tích cấu trúc phân tử của tinh bợt gạo:

34


i) Hàm lượng amylose: xác định bằng cách đo màu bột tạo phức với iodine theo
phương pháp chuẩn của Juliano cùng các cợng sự (1971, có điều chỉnh);
ii) Cấu trúc phân tử: phân tích bằng sắc ký trao đổi ion với hệ thống sắc ký lỏng cao
áp (C18).
Để phân tích cấu trúc của mạch tinh bột (chiều dài mạch và tỉ lệ nhánh) của bợt và
bợt sau khi biến tính, sử dụng HPLC với quy trình sau:
+ 1 mL mẫu được xử lý với enzyme isoamylase (25 mM; 0,36 U/mg) trong dung
dịch đệm acetate (pH 4,3) ở 60oC, 48 giờ.
+ Dừng phản ứng bằng cách đun sôi dung dịch trong 10 phút.
+ Sau đó mang đi ly tâm với tốc đợ 12.000 vịng/phút trong 10 phút. Mẫu sau ly
tâm sẽ được lọc bởi màng lọc 0,45m (Millex, Millipore, Bedford, MA, USA).
+ Cấu trúc của chuỗi được phân tích bằng HPAEC (high-performance anion-exchange
chromatography), hệ thống (Dionex-300, Dionex, Sunnyvale, CA, USA) đồng bợ với
đầu dị điện tử (ED40, Dionex). Cợt trao đổi ion CarboPacTM PA1(250 x 4 mm,
Dionex) và cột bảo vệ được sử dụng để tách riêng các mẫu đã được gắn thêm nhánh.
+ Sau khi cột được cân bằng bởi NaOH 150 mM, mẫu được rửa giải nhiều lần với
hệ dung dịch sodium acetate 600 mM trong NaOH 150 mM, tốc độ 1 mL/phút. Tốc
độ thay đổi nồng độ sodium acetate như sau: 10 - 30% trong 0 - 10 phút, 30 - 40%

trong 10 - 16 phút, 40 - 50% trong 16 - 27 phút, 50 - 60% trong 27 - 44 phút và 60 64% trong 44 - 60 phút.
2.3.2 Nội dung 2: Biến nạp plasmid mang gen mã hóa cho enzyme phân nhánh vào
vi khuẩn Bacillus subtilis; biểu hiện, thu nhận và tinh sạch enzyme phân nhánh
Đề tài kế thừa: có sẵn plasmid sinh enzyme phân nhánh cho cơ chất là tinh bột và vi
sinh vật nuôi cấy: sử dụng vi khuẩn Bacillus subtilis. (Các nội dung chọn dịng, biến
nạp plasmid vào vi kh̉n, ni cấy và thu nhận enzyme đã được tác giả Lê Quang

35


Trí [40] nghiên cứu, khơng bố trí thí nghiệm, chỉ thực hiện đúng quy trình để nhận
được vi khuẩn mang plasmid cần và enzyme thô đủ số lượng cho các nội dung sau).
2.3.2.1 Biến nạp plasmid mang gen mã hóa cho enzyme phân nhánh vào vi khuẩn
Bacillus subtilis
- Chuẩn bị tế bào khả nạp B. subtilis:
+ Cấy 1 khuẩn lạc B. subtilis vào 5 mL môi trường HS, lắc 37oC, qua đêm.
+ Cấy truyền sang 55 mL môi trường HS sao cho giá trị OD600 cuối đạt được 0,1,
lắc 250 vòng/phút ở 37oC.
+ Tiến hành dựng đường cong tăng trưởng.
+ Khi sự tăng trưởng bắt đầu vào pha cân bằng, thu 10 mL dịch nuôi cấy (mỗi lần
thu cách nhau 15 phút) cho vào 1 mL glycerol (100%), huyền phù và giữ trong đá
15 phút. Sau đó chia vào mỗi eppendorf 1 mL dịch, bảo quản ở -800C.
+ Các phân đoạn tế bào khả nạp được cho biến nạp vào plasmid để chọn ra phân
đoạn cho hiệu suất biến nạp cao nhất.
- Biến nạp plasmid vào tế bào B. subtilis:
+ Lắc nhẹ 1 mL tế bào khả nạp trong 10 mL LS, tốc đợ lắc 60 vịng/phút ở 300C
trong 2 giờ.
+ Bổ sung 100 µl EGTA, ủ 10 phút ở nhiệt đợ phịng.
+ Chia 1 mL dịch ni cấy vào eppendorf chứa 10 µg plasmid, lắc 250 vịng/phút
trong 2 giờ ở 370C.

+ Ly tâm 9.000 vòng/phút, bỏ 1 phần dịch nổi, huyền phù sinh khối với phần dịch
còn lại, trải dịch huyền phù trên đĩa LB-Agar-Kana.
+ Ủ 370C, qua đêm.

36


2.3.2.2 Thu nhận và tinh sạch enzyme phân nhánh
- Sau q trình biến nạp và ni cấy vi khuẩn trong điều kiện thích hợp để tạo
enzyme phân nhánh. Tiến hành phá vỡ tế bào và thu nhận enzyme thô.
- Tinh sạch enzyme thô. Theo kết quả nghiên cứu, enzyme phân nhánh có trọng lượng
phân tử là 74 KDa.
- Quy trình ni cấy và biểu hiện enzyme với tổng thể tích lên men 1 L:
+ Chủng B. subtilis được hoạt hóa trong 15 mL môi trường LB chứa Kanamycin
nồng độ 50 µg/mL, nuôi cấy lắc 250 rpm, 370C qua đêm.
+ Tiếp tục hoạt hóa thứ cấp từ dịch hoạt hóa sơ cấp trong 50 mL môi trường LB Kana, nuôi cấy lắc 250 rpm, 370C trong 16 - 18 giờ.
+ Đo OD600 và chuyển dịch nuôi cấy sang 1 L môi trường LB - Kana, sao cho OD
đạt 0,1. Nuôi cấy lắc 250 rpm, 370C cho đến khi dịch nuôi cấy đạt giá trị OD600
khoảng 0,8 - 1,0; tiến hành cảm ứng với nồng độ 0,5 mM IPTG và thời gian cảm
ứng là 3 giờ trong điều kiện lắc 37 ºC.
+ Tiến hành thu tổng sinh khối vào thời điểm đã khảo sát.
+ Bảo quản sinh khối ở -800C.
- Quy trình tinh chế:
+ Sinh khối B. subtilis thu được sau khi ni cấy và cảm ứng biểu hiện trước đó
được huyền phù trong dung dịch Binding buffer, bổ sung 20 µg/mL Dnase I và 1
mM PMSF. Huyền phù sinh khối.
+ Phá tế bào bằng sống siêu âm. Chu trình phá tế bào gồm biên đợ sóng 70 trong 10
giây, nghỉ 25 giây, 6 chu kỳ, thực hiện trong đá lạnh.
+ Tiến hành ly tâm 13.000 rpm, 30 phút, 40C, thực hiện 2 lần, thu nhận phần dịch
nổi chứa enzyme dạng tan.

37


+ Phần dịch nổi được lọc qua màng lọc 0,22 µm.
+ Phần dịch nổi sau khi lọc được cho chảy qua cột Histrap HP (GE healthcare) đã
được cân bằng với dung dịch Binding buffer; các enzyme có His-tag sẽ bám lên cột.
+ Rửa sạch các enzyme bám không đặc hiệu bằng 100 mL dung dịch rửa chứa 5 nM
Imidazole.
+ Enzyme mục tiêu được dung ly ra khỏi cột bằng dung dịch dung ly chứa Imidazole
với nồng độ tăng dần từ 10, 40, 100 và 250 nM, thu với nhiều phân đoạn.
+ Kiểm tra các phân đoạn enzyme bằng phương pháp SDS-PAGE.
+ Sau khi có kết quả điện di, thu nhận enzyme ở phân đoạn có protein mục tiêu tinh
sạch tiến hành thẩm tách trong dung dịch bảo quản (50mM Tris pH 7,5, 1mM PMSF),
đo nồng độ enzyme và bảo quản ở -200C.
2.3.3 Nội dung 3: Khảo sát hoạt tính của enzyme phân nhánh đối với tinh bột gạo
dưới nhiều điều kiện khác nhau
2.3.3.1 Nguyên lý
Enzyme phân nhánh xúc tác thủy phân liên kết α-1-4-glycosidic của amylose tạo
dextrin và amylose mạch ngắn, song song đó xúc tác tạo liên kết α-1-6-glycosidic với
dextrin hoặc amylose còn lại. Kết quả tạo glucan phân nhánh. Đồng thời enzyme
phân nhánh này xúc tác thủy phân amylopectin tại liên kết α-1-4-glycosidic ở giữa
mạch, tạo ra các bó amylopectin. Như vậy sau giai đoạn này sẽ thu được bợt gạo biến
tính với hàm lượng amylose thấp và các bó amylopectin có trọng lượng thấp.
2.3.3.2 Bố trí thí nghiệm
Bố trí các thí nghiệm thích hợp q trình biến tính bợt gạo bằng enzyme phân nhánh:
Thơng thường, 2 thơng số nhiệt độ và pH thuộc về bản chất enzyme, do đó, cần
khảo sát 2 thơng số này trước và chỉ cần khảo sát từng biến. Sau khi tìm được thơng
số nhiệt đợ và pH thích hợp, tiếp tục khảo sát tiếp 2 thông số nồng độ bột gạo và
nồng độ enzyme; cuối cùng, khảo sát thời gian phản ứng.

38


a. Thí nghiệm khảo sát pH thích hợp cho phản ứng enzyme
Bảng 2.3 Thơng số thí nghiệm a
Thơng số khảo sát

Giá trị

pH của phản ứng enzyme

5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0

Thông số cố định
Lượng mẫu sử dụng

100 mL dung dịch hồ tinh bột 5% (w/w)

Lượng enzymm sử sụng

25 U/g

Nhiệt độ enzyme

60OC

Thời gian ủ

6 giờ

- Số lần lặp lại: 3 lần.
→ Hàm mục tiêu: Chỉ số DE của tinh bột gạo.
- Sơ đồ bố trí thí nghiệm:
Bột gạo

Hồ hóa

Hạ nhiệt
Ủ enzyme

pH5.0

….

pH5.5

Đánh giá mẫu

Chọn
pH

39

pH7.0


- Cách thực hiện:
+ Hịa tan bợt gạo trong các dung dịch đệm pH 5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0 và hồ hóa 100
mL huyền phù bợt nồng đợ 5% (w/w) (có kh́y trợn) trong 15 phút ở 60℃.

+ Làm ng̣i hồ tinh bột trên xuống 600C cho dịch enzyme α-amylase 25 U/g vào
và ủ ở 600C trong 6 giờ trong bể điều nhiệt có rung lắc.
+ Sau 6 giờ cho 300 mL ethanol 960 vào dịch hồ tinh bột đã ủ với enzyme để kết tủa
tinh bột. Tách kết tủa bằng cách ly tâm 6000 vòng trong 20 phút. Tinh bột này được
rửa lại 2 lần bằng nước cất và được tách ra bằng cách ly tâm. Tinh bột đã biến tính
bằng enzyme được sấy đối lưu ở 500C trong 24 giờ. Mẫu bột gạo đối chứng được
tiến hành hồ hóa, kết tủa, rửa tủa và sấy khơ mẫu như các mẫu khảo sát (độ ẩm của
các mẫu sau khi sấy khơ vào khoảng 12 ± 0,5%). Sau đó tiến hành nghiền mịn. Bợt
gạo sau biến tính được sử dụng cho các bước tiếp theo nhằm xác định DE.
b. Thí nghiệm khảo sát nhiệt độ thích hợp cho phản ứng của enzyme phân nhánh
Bảng 2.4 Thơng số thí nghiệm b
Thơng số khảo sát
Nhiệt độ ủ enzyme

Giá trị
50oC; 55oC; 60oC; 65oC; 70oC; 75oC; 80oC

Thông số cố định
Lượng mẫu sử dụng

100 mL dung dịch hồ tinh bợt có nồng đợ 5% (w/w)

Lượng enzyme sử sụng

25 U/g

pH của phản ứng enzyme

Kết quả thí nghiệm a

Thời gian ủ

6 giờ

- Số lần lặp lại: 3 lần.
→ Hàm mục tiêu: Chỉ số DE của tinh bột gạo.
- Cách thực hiện:
+ Hồ hóa 100 mL huyền phù bợt nồng đợ 5% (w/w) (đệm pH thích hợp ở thí
nghiệm a) (có kh́y trợn) trong 15 phút.

40


+ Cho dịch hồ tinh bột trên vào bể ổn nhiệt, cho dịch enzyme phân nhánh 25 U/mẫu và
ủ ở các nhiệt độ 50, 55, 60, 65, 70, 75, 800C trong 6 giờ trong bể điều nhiệt có rung lắc.
+ Sau 6 giờ cho 300 mL ethanol 960 vào dịch hồ tinh bột đã ủ với enzyme để kết tủa
tinh bợt. Tách kết tủa bằng cách ly tâm 6000 vịng trong 20 phút.
+ Bột này được rửa lại 2 lần bằng nước cất và được tách ra bằng cách ly tâm. Bợt đã
biến tính bằng enzyme được sấy đối lưu ở 500C trong 24 giờ. Mẫu bột đối chứng
được tiến hành hồ hóa, kết tủa, rửa tủa và sấy khơ mẫu như các mẫu khảo sát (độ ẩm
của các mẫu sau khi sấy khô vào khoảng 12 ± 0,5%). Sau đó tiến hành nghiền mịn.
Bợt gạo sau biến tính được sử dụng cho các bước tiếp theo nhằm xác định DE.
- Sơ đồ bố trí thí nghiệm:
Bột gạo

Hồ hóa

Hạ nhiệt
Ủ enzyme

50oC

….

55oC

Đánh giá mẫu

Chọn
nhiệt độ

41

80oC


c. Thí nghiệm khảo sát nồng độ bột gạo thích hợp cho phản ứng của enzyme
Bảng 2.5 Thơng số thí nghiệm c
Thông số khảo sát

Giá trị

Nồng độ dung dịch hồ tinh bột

1%; 3%; 5%; 7%, 10% (w/w)

Thông số cố định
Lượng mẫu sử dụng

100 mL dung dịch hồ tinh bột

Lượng enzymm sử sụng

25 U/g

pH của phản ứng enzyme

Kết quả thí nghiệm a

Nhiệt đợ ủ enzyme

Kết quả thí nghiệm b

Thời gian ủ

6 giờ

- Số lần lặp lại: 3 lần.
→ Hàm mục tiêu: Chỉ số DE của tinh bột gạo.
- Sơ đồ bố trí thí nghiệm:
Bột gạo

1%

3%

5%

Hồ hóa
Hạ nhiệt

Ủ
enzyme
Đánh giá

mẫu
Chọn
nờng độ

bột
42

7%

10
%


- Cách thực hiện:
+ Hồ hóa 100 mL huyền phù bột với các nồng độ khác nhau 1%, 3%, 5%, 7%, 10%
(w/w), (có kh́y trợn) trong 15 phút.
+ Các bước tiếp theo thực hiện tương tự thí nghiệm a.
d. Thí nghiệm khảo sát nồng độ enzyme phân nhánh thích hợp cho phản ứng
Bảng 2.6 Thơng số thí nghiệm d
Thơng số khảo sát

Giá trị

Nồng độ enzyme

15 U; 20 U; 25 U; 30 U, 35 U

Thông số cố định
Lượng mẫu sử dụng

100 mL dung dịch hồ tinh bợt có nồng đợ là kết
quả chọn từ thí nghiệm c

pH của phản ứng enzyme

Kết quả thí nghiệm a

Nhiệt đợ ủ enzyme

Kết quả thí nghiệm b

Thời gian ủ

6 giờ

- Số lần lặp lại 3 lần.
→ Hàm mục tiêu: Chỉ số DE của tinh bột gạo.

43


- Sơ đồ bố trí thí nghiệm:
Bột gạo

Hồ hóa

Hạ nhiệt

Ủ enzyme

15U

20U

25U

30U

35U

Đánh giá mẫu

- Cách thực hiện:

Chọn
nờng độ
enzyme

+ Hồ hóa 100 mL huyền phù bợt gạo có nồng đợ là kết quả chọn từ thí nghiệm c,
(có kh́y trợn) trong 15 phút.
+ Làm nguội hồ tinh bột trên xuống nhiệt độ thích hợp cho dịch enzyme phân nhánh
ở các mức như trên sơ đồ bố trí thí nghiệm, ủ ở nhiệt đợ và pH thích hợp trong 6 giờ
trong bể điều nhiệt có rung lắc.
+ Các bước tiếp theo thực hiện tương tự thí nghiệm a.

44

e. Thí nghiệm khảo sát thời gian thủy phân thích hợp của phản ứng enzyme
Bảng 2.7 Thơng số thí nghiệm e
Thông số khảo sát
Thời gian ủ

Giá trị
0,5 giờ; 3 giờ; 6 giờ; 9 giờ; 18 giờ; 24 giờ

Thông số cố định
Lượng mẫu sử dụng

100mL dung dịch hồ tinh bợt có nồng đợ là kết quả
chọn từ thí nghiệm c

pH của phản ứng enzyme

Kết quả thí nghiệm a

Nhiệt đợ ủ enzyme

Kết quả thí nghiệm b

Nồng đợ enzyme

Kết quả thí nghiệm d

- Số lần lặp lại 3 lần.
→ Hàm mục tiêu: Chỉ số DE của tinh bột gạo.

- Cách thực hiện:
+ Hồ hóa 100mL huyền phù bợt gạo có nồng đợ là kết quả chọn từ thí nghiệm c, (có
kh́y trợn) trong 15 phút.
+ Làm nguội hồ bột trên xuống nhiệt độ thích hợp cho dịch enzyme phân nhánh với
nồng đợ thích hợp ở trên, ủ trong 0,5; 3; 6; 9; 18; 24 giờ trong bể điều nhiệt có rung lắc.
+ Sau thời gian ủ, cho 300mL ethanol 960 vào dịch hồ tinh bột đã ủ với enzyme để
kết tủa tinh bột. Tách kết tủa bằng cách ly tâm 6000 vòng trong 20 phút.
+ Các bước tiếp theo thực hiện tương tự thí nghiệm a.

45


- Sơ đồ bố trí thí nghiệm:
Bợt gạo

Hồ hóa

Hạ nhiệt

Ủ enzyme

0,5 giờ

3 giờ

6 giờ

9 giờ

18 giờ

24 giờ

Đánh giá mẫu

Chọn
thời gian

2.3.3.3 Chỉ tiêu đánh giá
Phương pháp xác định chỉ số DE (Dextrose Equivalent)
Chỉ số DE là tỷ lệ của hàm lượng đường khử/tổng lượng chất khô của dung dịch,
như vậy DE tối đa có thể đạt 100.
Hút 1mL dung dịch hồ tinh bợt biến tính vào ống nghiệm, bổ sung 1 mL dịch
enzyme (5 U/ml) α-amylase, thủy phân trong 20 phút ở 37 ºC trong bể điều nhiệt có
rung lắc để α-amylase phân cắt tinh bột tạo đường khử. Dung dịch sau phản ứng
đem xác định hàm lượng đường khử theo phương pháp Miller. Nếu tinh bột ban đầu

46


được biến tính càng nhiều thì DE càng thấp do α-amylase không ưu tiên phân cắt
tinh bột phân nhánh.
Phương pháp định lượng đường khử theo phương pháp Miller
+ Nguyên tắc: phương pháp này dựa trên phản ứng tạo màu giữa đường khử với
thuốc thử acid 3,5-Dinitrosalisylic (DNS) và có khả năng hấp thụ bước sóng 540 575 nm. Cường đợ màu của hỗn hợp phản ứng tỷ lệ thuận với nồng độ đường khử.
Dựa vào đồ thị chuẩn của glucose tinh khiết với thuốc thử DNS sẽ tính được hàm
lượng đường khử (ĐK) của mẫu cần khảo sát.
+ Hóa chất:
•

Thuốc thử acid Dinitrosalisylic (DNS) 1%:

✓

Cân 2 g NaOH tinh thể hòa vào 30mL nước cất được dung dịch NaOH
(dung dịch A).

✓

Cân chính xác 1g DNS pha tan trong dung dịch A trên bếp ổn nhiệt 70oC.

✓

Cân 30 g muối Natri-Kali tartrate kép (muối Seignet) pha tan trong 50 mL
nước cất, đun và khuấy trên bếp ổn nhiệt 70oC (dung dịch B).

✓

Trộn hai dung dịch A và B lại với nhau, thêm nước cất định mức đủ 100 mL.
(thuốc thử DNS giữ trong chai nâu tránh ánh sáng).

•

Dung dịch glucose mẫu có nồng đợ 0,5 mg/mL: cân chính xác 0,05 g Dglucose pha trong 100 mL nước cất.

+ Cách tiến hành:
•

Dựng đường chuẩn với dung dịch glucose: pha glucose trong nước với các
nồng độ khác nhau: 0,02 %; 0,04%; 0,06%; 0,08%; 0,1%.

•

Cho 1 mL dung dịch chuẩn vừa pha vào 2 mL dung dịch DNS, đun sôi cách
thủy 5 phút, làm lạnh nhanh đến nhiệt đợ phịng, sau đó đo đợ hấp thu bằng

47


máy quang phổ ở bước sóng 575 nm. Vẽ đường chuẩn glucose với trục tung
là mật độ quang (OD), trục hồnh là nồng đợ glucose.
•

Tiến hành tương tự như với dung dịch glucose. Lấy 1mL dung dịch mẫu có
chứa đường khử, thêm vào 2 mL thuốc thử DNS. Đun sôi cách thủy trong
vòng 5 phút. Làm lạnh nhanh về nhiệt đợ phịng. Đo đợ hấp thu ở bước sóng
575 nm.

•

Từ đồ thị đường chuẩn ta xác định được nồng độ đường khử có trong dung
dịch bợt theo thời gian thủy phân bởi enzyme amylase.

48