Khảo sát hoạt tính biến tính tinh bột gạo của enzyme phân nhánh tái tổ hợp trong bacillus subtilis p3

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Phân tích tính chất hoá lý và cấu trúc phân tử của tinh bột gạo
3.1.1 Phân tích tính chất hóa lý của tinh bợt gạo
3.1.1.1 Độ hồ tan, độ nhớt, tốc độ thối hóa của gel bột gạo
* Độ hòa tan của bột gạo tự nhiên
Trong q trình khảo sát, tinh bợt gạo tan trong nước ở nhiệt độ 25oC: 6,5 ± 1,4
(mg/ml). Đợ hịa tan của bợt gạo tự nhiên trong nước khơng đáng kể, phù hợp với
kết quả phân tích trọng lượng phân tử của bột gạo (trọng lượng phân tử của
amylopectin bột gạo tự nhiên khoảng 108 và trọng lượng phân tử của amylose
khoảng 105). Theo nghiên cứu của Mukerjea et al. thì bợt gạo Thái Lan có đợ tan
khoảng 7,8 (mg/ml) [75]. Sự khác biệt đợ hịa tan giữa các loại gạo khác nhau có
thể do đặc điểm giống, thổ nhưỡng điều kiện canh tác, làm ảnh hưởng đến tỷ lệ
amylose/amylopectin, trọng lượng phân tử của amylopectin và amylose.
* Độ nhớt của dung dịch hồ tinh bột
Độ nhớt của dung dịch hồ tinh bột ở nhiệt độ 25oC: 1,7 ± 0,5 (cP), nhỏ hơn độ nhớt
dung dịch hồ bột của khoai mì. Theo nghiên cứu của Reddy et al (2014) thì các
giống khoai mì Basmati, HTM và Swarna có độ nhớt lần lượt là 2,0 cP; 3,5cP và 2,5
cP ở cùng nồng độ dung dịch 1%, nhiệt độ đo 25oC [76]. Sự khác biệt này là do tỷ
lệ amylose/amylopectin trong tinh bợt. Khoai mì có amylopectin cao hơn nên độ
nhớt cao hơn so với độ nhớt của dung dịch hồ bợt gạo. Tính chất này ảnh hưởng đến
tính chất vật lý của sản phẩm chế biến từ tinh bột.
* Tốc độ thối hóa của gel
Sự thối hóa tinh bợt là mợt trong những tính chất làm thay đổi tính chất của sản
phẩm. Thối hóa tinh bợt được định nghĩa là hiện tượng tinh bợt đã hồ hóa bị mất
nước và tái kết tinh. Bản chất của hiện tượng này chính là sự biến đổi về cấu trúc và
mất ẩm của hạt tinh bột trong thời gian bảo quản. Khi chế biến nhiệt, tinh bột sẽ hút

49


nước, trương nở và tạo gel. Nhưng trong thời gian bảo quản nó có xu hướng nhả

nước để tái kết tinh. Quá trình dịch chuyển và biến đối trạng thái liên kết tự do của
nước trong các cấu tử tinh bợt là hai yếu tố quan trọng nhất kiểm sốt sự biến đổi về
cấu trúc [77].
Kết quả cho thấy tỷ lệ thối hóa của gel tinh bợt là 10% khi bảo quản ở nhiệt đợ 4oC
(Hình 3.1).
7
y = 1.3214x - 0.2714

Năng lượng (J/g)

6
5
4
3
2
1
0
0

-1

1

2

3

4

5

6

Thời gian bảo quản (ngày)

Hình 3.1 Tốc đợ thối hóa của gel bợt gạo khi bảo quản ở nhiệt đợ 4oC
Tốc đợ thối hóa của gel ảnh hưởng đến sự ổn định của sản phẩm từ bột, khả năng
tách nước, đặc biệt trong các ứng dụng sản xuất sản phẩm sốt hay dạng gel. Q
trình thối hóa của gel 10% của bột gạo tự nhiên khi bảo quản ở nhiệt đợ 4oC tăng
tuyến tính trong 5 ngày bảo quản. Năng lượng thối hóa tăng từ 0 lên 6,3 J/g bợt
trong 5 ngày khảo sát. Tốc đợ thối hóa trung bình của gel bợt gạo đạt 10% ở nhiệt
đợ 4oC là 1,32 J/g.ngày. So với gel từ tinh bột khoai mì thì tốc đợ thối hóa trung
bình của gel bột gạo cao hơn khoảng 20%.

50


3.1.1.2 Hằng số động học của phản ứng thuỷ phân bột gạo tự nhiên
Bảng 3.1 Động học phản ứng với các enzyme tiêu hóa khác nhau
Thơng số động học
Enzyme tiêu hóa
Km(mg/ml)

kcat(1/s)

kcat/Km

PPA (Porcine Pancreatic
Amylase)

0,12±0,04

627,5±38,3

5230±569,7

Glucoamylase (Aspergillus niger)

0,82±0,05

59,2±3,5

72,2±2,9

Giá trị Km của enzyme PPA đối với bột gạo tự nhiên là 0,12 nhỏ hơn 6,8 lần so với
giá trị Km của enzyme glucoamylase đối với bợt gạo, thể hiện enzyme tiêu hóa PPA
có ái lực rất lớn đối với bột gạo tự nhiên. Theo nghiên cứu của Han Young-Joo thì
giá trị Kcat/Km của enzyme PPA đối với bột khoai tây và lúa miến lần lượt là 5.036
ml/mg.s và 4.863 ml/mg.s thấp hơngiá trị Kcat/Km của gạo là 4030 ml/mg.s, thể
hiện tốc đợ tiêu hóa của enzyme PPA đối với bột gạo cao hơn so với khoai tây và
lúa miến [78].
3.1.2 Cấu trúc phân tử của bợt gạo
Kết quả phân tích hàm lượng amylose trong tinh bợt gạo là 26,7 ± 0,5%.

Hình 3.2 Phân bố chiều dài mạch nhánh của amylopectin trong phân tử tinh bợt gạo
Tính chất hố lý và sinh học của các loại bột phụ thuộc vào cấu trúc phân tử, hàm
lượng amylose và sự phân bố mạch của amylopectin của bột. Bột gạo được cấu tạo

51

bởi 2 loại polysaccharide là amylose và amylopectin, tương tự như các loại bột từ
ngủ cốc khác. Trong các loại bợt, tỉ lệ amylose trung bình là 25% và amylopectin là
75%. Tuy nhiên bợt gạo khảo sát có hàm lượng amylose cao hơn trung bình, đạt
26,7 ± 0,5 %. Tỷ lệ phân bố mạch của amylopectin trong phân tử bột gạo (%) được
thể hiện trong Bảng 3.2. Trong đó, amylopectin có DP 6-12 chiếm 25%. Trong khi
đó, amypolpectin có mạch DP 13 - 24 chiếm đến 44%. Amylopectin có mạch DP
25-36 chiếm 19% và amylopectin có DP > 36 chiếm 10%. Tinh bợt gạo tự nhiên có
DP trung bình là 20,3.
Bảng 3.2 Mạch amylopectin trong phân tử tinh bột gạo (%)
A

B1

B2

B3

Chiều dài mạch trung bình

25,1±0,7

43,7±0,2

19,3±0,3

9,9±0,2

20,3±0,2

Ghi chú: A. DP 6-12; B1. 13-24; B2. 24-36; B3. >36

3.2 Biến nạp plasmid mang gen mã hóa enzyme phân nhánh vào vi kh̉n B.
subtilis; ni cấy vi khuẩn B. subtilis và thu nhận, tinh sạch enzyme phân
nhánh
3.2.1 Biến nạp plasmid mang gen mã hóa enzyme phân nhánh vào vi khuẩn B.
subtilis
Để thu nhận enzyme phân nhánh (BBE) với số lượng lớn sử dụng cho thí nghiệm
tiếp theo, plasmid mang gen mã hóa cho enzyme mục tiêu được biến nạp vào B.
subtilis 1012 và sàng lọc trên môi trường chứa kháng sinh. Kết quả biến nạp được
thể hiện ở Hình 3.3.

52


A

B

Hình 3.3 Kết quả biến nạp BBE vào Bacillus subtilis 1012
A. Đối chứng âm; B. B. subtilis 1012 biến nạp với pBBE

Các tế bào B. subtilis 1012 có mang plasmid tái tổ hợp mang gene kháng kháng sinh
có khả năng mọc được trên môi trường chứa kháng sinh Kanamycin. Kết quả cho
thấy ở đĩa đối chứng âm (B. subtilis biến nạp với nước cất) (Hình 3.3.A) khơng có
sự x́t hiện của khuẩn lạc, ngược lại, ở đĩa có trải vi khuẩn được biến nạp với
plasmid có sự xuất hiện của các khuẩn lạc mọc trên mơi trường có chứa kháng sinh
Kanamycin (Hình 3.3.B). Điều này chứng tỏ rằng đã biến nạp thành công plasmid
mang BBE vào tế bào B. subtilis 1012 và những khuẩn lạc này có khả năng mang
plasmid tái tổ hợp.

3.2.2 Thu nhận và tinh sạch enzyme phân nhánh
Sau q trình biến nạp và ni cấy vi khuẩn trong điều kiện thích hợp để tạo
enzyme phân nhánh. Tiến hành phá vỡ tế bào và thu nhận protein tổng. Dịch này
được nạp vào cột sắc ký Ni - NTA để tiến hành tinh chế.

53


Hình 3.4 Kết quả điện di SDS-PAGE BBE trong quá trình tinh chế
M: thang protein; B: dịch sau qua cột; W: washing buffer; E1-E5: các phân đoạn dung ly với
Elution buffer

Dịch protein tổng sau khi lọc được nạp trực tiếp đi qua cột sắc ký ái lực Ni-NTA.
Do enzyme phân nhánh được biểu hiện bằng hệ thống vector biểu hiện pBBE nên
protein tạo ra sẽ được dung hợp với đuôi histidine (His-tag) giúp protein tái tổ hợp
bám vào cột sắc ký nhờ liên kết ái lực với resin Ni2+ trong cột, trong khi các protein
khác sẽ bị loại bỏ bằng dung dịch washing chứa 30 mM imidazole. Sau khi đã rửa
sạch các protein tạo liên kết không đặc hiệu với cợt sắc ký, protein đích được đẩy
phân đoạn bằng dung dịch elution chứa 300 mM imidazole. Kết quả thu được trên
bảng điện di SDS-PAGE cho thấy BBE tái tổ hợp đã được thu lại ở dạng tinh sạch,
có kích thước khoảng 80 kDa (Hình 3.4).
Phân tích kết quả sau tinh chế cho thấy, protein mục tiêu sau tinh chế có tỷ lệ cao,
chiếm 72,86 % protein trong dung dịch (kết quả phân tích tỷ lệ của protein mục tiêu
được biểu hiện so với protein tổng của tế bào B. subtilis bằng phần mềm UNSCAN-IT gel 7.1).
Kết quả SDS-PAGE và phân tích tỷ lệ phần trăm protein sau tinh chế cho thấy trong
dịch vẫn cịn lẫn mợt lượng nhỏ enzyme khơng phải enzyme mục tiêu. Điều này có
thể do trong quá trình rửa giải khơng triệt để các protein khác bám trên cột, nồng độ

54

imidazole trong dung dịch wash không đủ lớn để đẩy những protein này ra khỏi cột
trong bước rửa cột. Phân đoạn chứa enzyme mục tiêu được thẩm tích nhằm loại
muối và những protein tạp dưới 12 kDa.
3.3 Khảo sát hoạt tính biến tính tinh bột gạo của enzyme phân nhánh
3.3.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH
Enzyme chỉ có thể hoạt động tốt nhất ở trạng thái nhất định khi vận tốc xúc tác của
phản ứng enzyme mạnh nhất. Trong q trình thuỷ phân tinh bợt, tốc đợ phản ứng
phụ tḥc vào sự hình thành liên kết enzyme - tinh bột. Liên kết này do sự hấp thụ
lẫn nhau giữa các nhóm háo nước có trên bề mặt của các hạt tinh bột và enzyme
như [- COOH], [- OH], [- COO], [NH2], [- SH]. Các nhóm này khi tác dụng với
nhau sẽ làm giảm năng lượng bề mặt, làm biến dạng các phần riêng biệt của phân tử
amylose và amylopectin, dẫn đến làm đứt các liên kết glucoside để tạo sản phẩm và
giải phóng enzyme. Trạng thái này phụ tḥc vào nhiều yếu tố trong đó có pH mơi
trường [79]. Kết quả chỉ số DE khảo sát ở các giá trị pH khác nhau được thể hiện
qua Bảng 3.3.
Bảng 3.3 Chỉ số DE của tinh bợt biến tính ở các giá trị pH khác nhau
Mẫu

pH

Chỉ số DE

1

5,0

0,190±0,008bc

2

5,5

0,178±0,002b

3

6,0

0,145±0,004a

4

6,5

0,120±0,006a

5

7,0

0,138±0,009a

ĐC

0,212±0,030c

F

**

(Trong cùng một cột, các giá trị có kí tự in thường (a đến c) khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa
thống kê (p ≤ 0,01))

55


Dựa vào kết quả Bảng 3.3 cho thấy có sự khác biệt về chỉ số DE ở các giá trị pH
khác nhau. Ở thí nghiệm đối chứng (khơng sử dụng enzyme), chỉ số DE cao nhất là
0,212. Điều này chứng tỏ rằng amylose trong dung dịch tinh bột không bị thay đổi
cấu trúc thành các cấu trúc nhánh nên dễ dàng bị thủy phân bằng α-amylase và tạo
ra hàm lượng đường khử cao, dẫn đến chỉ số DE cao.
Mặt khác, càng tăng giá trị pH từ 5,0 đến 7,0 chỉ số DE của tinh bợt biến tính có xu
hướng giảm. Trong đó, ở các giá trị pH 6,0; 6,5 và 7,0 chỉ số DE đạt thấp nhất và có
khác biệt thống kê với các giá trị còn lại với mức ý nghĩa 1%. Theo Shih et al.
(2007), pH trong môi trường phản ứng có khả năng tác đợng lên trạng thái tích điện
của nhóm carboxyl hoặc nhóm amin qua đó làm thay đổi các mối liên kết ion (vốn
có chức năng tạo cấu hình 3D cho phân tử protein), chính vì vậy sẽ làm thay đổi
cấu hình khơng gian của phân tử enzyme. Tại pH tối ưu, cấu hình khơng gian của
enzyme hoặc trạng thái tích điện của cơ chất là phù hợp cho phản ứng xảy ra nhất.
Ngoài pH tối ưu thì khả năng xúc tác của enzyme yếu hơn hoặc bị bất hoạt [80].
Theo nghiên cứu, thông số hoạt động tối ưu của enzyme phân nhánh là ở pH trung
tính (6,0 - 7,0). Trong điều kiện thí nghiệm đã khảo sát, khơng có sự khác biệt về ý
nghĩa thống kê giữa các giá trị pH 6,0; 6,5 và 7,0 do vậy để tiết kiệm hóa chất trong
việc điều chỉnh giá trị pH, mẫu ứng với pH 7 được lựa chọn để làm thơng số thích
hợp cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.3.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt đợ
Nhiệt đợ có ảnh hưởng rất lớn đến phản ứng enzyme. Trong các phản ứng sinh học,
khi nhiệt độ tăng, khả năng xúc tác của enzyme sẽ tăng. Tuy nhiên, do bản chất
enzyme là protein không bền nhiệt nên tốc đợ phản ứng có mợt giới hạn nhất định,

q giới hạn đó tốc đợ phản ứng sẽ giảm [57]. Tùy thuộc vào nguồn gốc enzyme,
loại cơ chất, pH môi trường… mà nhiệt đợ tối thích cho hoạt đợng của enzyme có
thể thay đổi. Kết quả khảo sát sự thay đổi giá trị DE ở các mức nhiệt độ khác nhau
được thể hiện ở Bảng 3.4.

56


Bảng 3.4 Chỉ số DE của tinh bợt biến tính ở các nhiệt độ khác nhau

Mẫu

Nhiệt độ (ºC)

Chỉ số DE

1

50

0,186±0,013c

2

55

0,162±0,007bc

3

60

0,152±0,005b

4

65

0,111±0,019a

5

70

0,142±0,009b

6

75

0,139±0,006b

7

80

0,161±0,006bc

ĐC

0,212±0,030d

F

**

(Trong cùng một cột, các giá trị có kí tự in thường (a đến d) khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa
thống kê (p ≤ 0,01))

Theo Bảng 3.4, khi tăng nhiệt đợ từ 50℃ - 65℃, hoạt tính biến tính của enzyme
tăng nên cấu trúc tinh bột được biến đổi thích hợp nhất nên giá trị DE giảm và đạt
thấp nhất là 0,111 (tại 65℃). Điều này được giải thích là do sự va chạm giữa tất cả
các phân tử tăng lên khi nhiệt độ tăng. Vận tốc tăng lên, thời gian giữa các lần va
chạm sẽ nhanh hơn dẫn đến nhiều phân tử đạt đến năng lượng hoạt hóa hơn, làm
tăng tốc độ của các phản ứng. Đồng thời, vì các phân tử cũng chuyển đợng nhanh
hơn nên sự va chạm giữa các enzyme và chất nền cũng tăng lên [81].
Tuy nhiên, khi tăng nhiệt độ lên 70℃ - 80℃, chỉ số DE có xu hướng tăng (hoạt tính
enzyme phân nhánh giảm). Điều này cũng hoàn toàn phù hợp với lý thuyết, nếu
nhiệt độ quá cao, enzyme bị biến tính. Khi cấu hình vị trí xúc tác khơng cịn phù
hợp với cơ chất, enzyme mất hoạt tính xúc tác. Khi nhiệt độ hạ thấp hơn nhiệt độ tối
ưu, cơ chất và phân tử enzyme chuyển động chậm. Tần số va chạm giữa chúng thấp,
kết quả là ít phức hợp enzyme-cơ chất được hình thành và tốc đợ phản ứng sẽ giảm.

57


Dựa vào kết quả trên cho thấy nhiệt độ 65℃ là nhiệt đợ thích hợp cho hoạt đợng
của enzyme phân nhánh nên được lựa chọn là mức nhiệt độ cho các thí nghiệm tiếp
theo.
3.3.3 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ bột gạo

Nồng độ cơ chất là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến tốc độ phản
ứng enzyme. Trong cùng một nồng độ enzyme, khi nồng đợ tinh bợt tăng, tốc đợ
biến tính tăng, chỉ số DE giảm.
Kết quả chỉ số DE của dung dịch biến tính ở các nồng đợ cơ chất 1%, 5%, 7%, 10%
(v/v) tại pH 7 và nhiệt độ 65℃ được thể hiện thông qua Bảng 3.5.
Bảng 3.5 Chỉ số DE của tinh bợt biến tính ở các nồng đợ cơ chất khác nhau

Mẫu

Nồng độ cơ chất
(%)

Chỉ số DE

1

1

0,201±0,028b

2

3

0,178±0,031ab

3

5

0,117±0,036a

4

7

0,173±0,052ab

5

10

0,198±0,014b

ĐC

0,212±0,030b

F

*

(Trong cùng một cột, các giá trị có kí tự in thường (a đến b) khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa
thống kê (p ≤ 0,05))

Kết quả Bảng 3.5 cho thấy chỉ số DE cao nhất ở nồng độ cơ chất là 1% và 10%. Khi
nồng độ tinh bột tăng từ 3% - 7%, DE có xu hướng giảm và đạt thấp nhất ở nồng độ
5% (DE = 0,117). Tuy nhiên, khi tăng nồng độ cơ chất tinh bột lên 10%, chỉ số DE
tăng, chứng tỏ hiệu suất phản ứng biến tính tinh bột của enzyme phân nhánh không
cao nên không tạo được nhiều cấu trúc glucan phân nhánh. Điều này có thể được

58


giải thích là do nồng đợ tinh bợt cao nên độ nhớt của dung dịch trở nên rất cao làm
enzyme phân nhánh khó tiếp xúc với cơ chất tinh bợt. Ở điều kiện phản ứng khảo
sát, 5% tinh bột là nồng đợ cho hoạt tính enzyme cao nhất. Do đó nồng đợ này được
chọn cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.3.4 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ enzyme
Tương tự như các yếu tố pH, nhiệt độ và nồng đợ cơ chất, nồng đợ enzyme cũng có
ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của enzyme. Trong trường hợp cơ chất cố định và
nồng độ enzyme tăng dần, ban đầu tốc độ phản ứng sẽ tăng nhanh do môi trường
thừa cơ chất. Sau một thời gian, cơ chất bị phân giải dần và giảm nồng độ nên tốc
độ phản ứng khơng tăng lên nữa mà có khuynh hướng giảm dần hoặc ngừng hẳn khi
gặp điều kiện bất lợi [60]. Kết quả trình bày ở Bảng 3.6 cho thấy có sự khác biệt của
chỉ số DE theo nồng độ enzyme trong phản ứng.
Bảng 3.6 Chỉ số DE của tinh bột biến tính ở các nồng đợ enzyme khác nhau

Mẫu

Nờng độ enzyme
(U)

Chỉ số DE

1

15

0,176±0,034b

2

20

0,173±0,025b

3

25

0,156±0,050ab

4

30

0,114±0,004a

5

35

0,182±0,017b

ĐC

0

0,212±0,030b

F

*

(Trong cùng một cột, các giá trị có kí tự in thường (a đến b) khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa
thống kê (p ≤ 0,05))

Qua Bảng 3.6 cho thấy khi tăng nồng độ enzyme từ 15U - 30U thì chỉ số DE giảm
từ 0,176 xuống 0,114. Trong đó, ở nồng đợ enzyme 25U và 30U, DE đạt giá trị thấp

59


nhất và khác biệt có ý nghĩa thống kê so với các giá trị còn lại. Theo Nguyễn Trọng
Cẩn và cộng sự (1998), trong điều kiện nồng độ cơ chất thích hợp thì vận tốc phản
ứng tuyến tính với nồng đợ enzyme [60]. Enzyme phân nhánh có tác dụng kép trên
chất nền tinh bột, phá vỡ chuỗi (phá vỡ liên kết α-D-1,4 glycosidic, giảm liên kết αD1,6 glycosidic) và hình thành chuỗi bên mới (biến đổi liên kết α-D-1,4 glycosidic
thành liên kết α-D-1,6, liên kết α-D1,3 hoặc liên kết α-D-1,4 khác) [44]. Do đó,
nồng đợ enzyme tăng, dẫn đến tốc đợ hình thành mạch nhánh trong phân tử tinh bợt
biến tính tăng lên.
Tuy nhiên khi nồng đợ enzyme tăng đến mợt giới hạn thì tốc đợ phản ứng khơng
tăng lên nữa. Giai đoạn đầu khi nồng độ cơ chất thừa, vận tốc phản ứng tỷ lệ thuận
với nồng độ enzyme, hàm lượng chất khơ hịa tan tăng. Càng về sau sản phẩm tạo
thành tăng lên, vừa đóng vai trị chất ức chế không cạnh tranh, vừa làm cho lượng
cơ chất trong môi trường giảm nên khi tiếp tục tăng nồng đợ enzyme thì vận tốc
phản ứng tăng khơng đáng kể. Kết quả này cho thấy rằng việc tăng thêm nồng đợ
enzyme khơng có tác dụng làm tăng sự biến tính của tinh bợt, điều này có nghĩa là
tốc đợ phản ứng khơng tăng do hiện tượng bão hịa enzyme.
Dựa trên kết quả thí nghiệm kết hợp với điều kiện kinh tế, nồng đợ enzyme 25 U

được lựa chọn cho thí nghiệm tiếp theo.
3.3.5 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian thủy phân
Thời gian biến tính cũng là mợt yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến tốc độ tiêu hóa
của tinh bợt biến tính. Sau khi xác định được các giá trị thích hợp là pH 7,0, nhiệt
đợ 65℃, nồng độ tinh bột 5% và nồng độ enzyme 25 U cho hoạt đợng thích hợp của
enzyme phân nhánh, tiến hành khảo sát các mức thời gian thủy phân là 0,5 giờ, 3
giờ, 6 giờ, 9 giờ, 18 giờ, 24 giờ. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần với 3 ống nghiệm
khác nhau. Kết quả thí nghiệm được thể hiện ở Bảng 3.7.

60


Bảng 3.7 Chỉ số DE của tinh bợt biến tính ở các thời gian thủy phân khác nhau

Mẫu

Thời gian ủ (giờ)

Chỉ số DE

1

0,5

0,202±0,023c

2

3

0,191±0,025bc

3

6

0,111±0,034ab

4

9

0,113±0,001ab

5

18

0,101±0,053a

6

24

0,109±0,090ab

ĐC

0

0,212±0,030c

F

*

(Trong cùng một cột, các giá trị có kí tự in thường (a đến c) khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa
thống kê (p ≤ 0.05))

Dựa vào Bảng 3.7 cho thấy khi thời gian ủ tăng từ 0,5 giờ đến 24 giờ, chỉ số DE của
tinh bột biến tính có xu hướng giảm từ 0,202 xuống cịn 0,101 (tại thời gian ủ 18
giờ). Trong đó, các khoảng thời gian ủ 6 giờ, 9 giờ, 18 giờ và 24 giờ cho kết quả DE
thích hợp nhất và khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê giữa các giá trị. Kết quả này
là do enzyme xúc tác phản ứng thủy phân càng dài càng tạo lượng tinh bột biến tính
càng nhiều, làm giảm hàm lượng đường khử bị phân hủy bởi α- amylase từ đó chỉ
số DE thấp.
Theo Crabb and Mitchinson (1997), tốc độ phản ứng sẽ tăng theo thời gian phản
ứng do enzyme có thời gian để tiếp xúc với cơ chất [82]. Thời gian thủy phân càng
kéo dài thì phản ứng càng xảy ra triệt để và đạt thông số kỹ thuật [60]. Tuy nhiên
với một lượng cơ chất nhất định, phản ứng thủy phân của enzyme đến mợt giai đoạn
nào đó thì khả năng xúc tác sẽ giảm. Enzyme tạo ái lực với các sản phẩm tạo thành
của phản ứng và cơ chất, các sản phẩm sinh ra đóng vai trị như chất kìm hãm
khơng cạnh tranh và kìm hãm hoạt đợng của enzyme [57].

61


Do đó, dựa trên hiệu śt q trình kết hợp tiết kiệm năng lượng, thời gian biến tính
là 6 giờ được chọn là khoảng thời gian thích hợp nhất.
3.3.6 Kết quả cấu trúc tinh bột sau biến tính

Kết quả phân tích hàm lượng amylose cho thấy, hàm lượng amylose của tinh bợt
biến tính (2,5 ± 0,3) thấp hơn tinh bợt gạo tự nhiên 8 lần (20,4 ± 0,3). Đối với dạng
tinh bợt hồ hóa, cấu trúc của hạt tinh bợt hầu như bị phá vỡ. Cấu trúc phân tử của
tinh bột rất quan trọng trong dinh dưỡng và các chức năng khác trong thực phẩm,
khi hàm lượng amylose thấp, nhiệt đợ hồ hóa giảm. Các đặc tính của tinh bợt hiện
nay phụ thuộc chủ yếu vào tỷ lệ amylopectin/amylopectin, cấu trúc của amylopectin
đặc biệt phân bố theo chiều dài chuỗi phân nhánh [84]. Phân tích cấu trúc tinh bợt
sau biến tính bằng phương pháp HPLC cho thấy tỷ lệ amylopectin mạch nhánh ở
tinh bợt biến tính cao hơn ở tinh bợt chưa biến tính (các phân tử có DP thấp xuất
hiện nhiều hơn). Kết quả xuất ra từ phần mềm cho thấy mạch nhánh của tinh bợt
biến tính tăng thêm 12,3% so với tinh bợt gạo tự nhiên (Hình 3.5).

Hình 3.5 Sự phân bố chiều dài mạch nhánh của amylopectin trong phân tử tinh bột
gạo tự nhiên và tinh bột gạo biến tính

62


KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
1. Kết luận
Tinh bột sử dụng trong nghiên cứu có các chỉ tiêu hóa lý: tinh bột gạo tan trong
nước ở nhiệt độ 25oC: 6,5 ± 1,4 (mg/ml); độ nhớt của dung dịch hồ bột gạo ở nhiệt
đợ 25oC: 1,7 ± 0,5 (cP); tỷ lệ thối hóa của gel tinh bợt là 10% khi bảo quản ở nhiệt
độ 4oC; hàm lượng amylose (%): 26,7 ± 0,5; amylopectin có DP 6-12 chiếm 25% ,
DP 13-24 chiếm đến 44%, mạch DP 25-36 chiếm 19% và amylopectin có DP > 36
chiếm 10%.
Biểu hiện thành công enzyme BBE thông qua hệ thống biểu hiện B. subtilis 1012 và
tinh chế, thu nhận bằng hệ thống sắc ký ái lực Ni-NTA thu được BBE tinh sạch có
kích thước khoảng 80 kDa. Dưới tác dụng của enzyme phân nhánh BBE, tinh bột
gạo bị thủy phân thành các mạch glucan phân nhánh và các bó amylopectin. Thơng

qua đó, cải thiện cấu trúc của tinh bợt, giúp hình thành tinh bợt biến tính chậm tiêu
hóa.
Kết quả khảo sát điều kiện hoạt đợng thích hợp cho q trình biến tính tinh bợt gạo
bằng enzyme phân nhánh: pH 7, nhiệt độ 650C, nồng độ tinh bột 5%, nồng độ
enzyme 25 U và thời gian ủ 6 giờ. Phân tích cấu trúc tinh bợt biến tính có tỷ lệ mạch
nhánh tăng thêm 12,3% so với tinh bột gạo tự nhiên.
2. Kiến nghị
So sánh hoạt tính chuyển hóa của BBE với các enzyme chuyển hóa khác để thu
nhận tinh bợt tinh bợt biến tính là cao nhất.
Nghiên cứu tạo ra các sản phẩm (bún, hủ tiếu, bánh,..) từ sản phẩm tinh bợt biến tính.

63


TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1]. World Health Organization. “Diabetes in Viet
/>
Nam.”

Internet:

[2]. Trương Thị Thảo Nguyên và Trần Hữu Dũng. “Nghiên cứu điều chế tinh bợt
biến tính bền vững với amylase làm thực phẩm chức năng hỗ trợ điều trị
bệnh đái tháo đường,” Tạp chí Dược học. ISSN: 0866-7861, 2012.
[3]. N. S. M. Yazid et al. “Application of Starch and Starch-Based Products in
Food Industry,” Journal of Science and Technology. Vol. 10, no. 2, pp. 144174, 2018.
[4]. Transparency Market Research. “Starch Market - Global Industry Analysis,
Size, Share, Growth, Trends and Forecast 2016 – 2024.” Internet:
/>[5]. Lee et al. “Impact of Diverse Cultivars on Molecular
Structures of Rice

Starch

for

Food

and

Crystalline

Processing,” Carbohydrate

Polymers. Vol. 169, pp. 33-40, 2017.
[6]. W. Girsang. “Feasibility Of Small-Scale Sago Industries in The Maluku
Islands, Indonesia. Sago Palm,” Springer. Pp. 109-121, 2018.
[7]. L. Amagliania et al. “Chemistry, structure, functionality and applications of
rice starch,” Journal of Cereal Science. Vol. 70, pp 291-300, 7/2016.
[8]. World Health Organization. “Global report on diabetes.” Internet:
/>g.pdf?utm_medium=email&utm_source=transaction, 2016.
[9]. Lê Thị Tuyết và cộng sự. “Ảnh hưởng của một số đặc điểm ăn uống và lối
sống tĩnh tại đến bệnh béo phì ở nam học sinh tiểu học Hà Nội năm 2012,”
Khoa học Tự nhiên và Công nghệ. Số 31, tập 2, trang 60-66, 2015.

64


[10]. Bantle and John P. “The Dietary Treatment of Diabetes Mellitus,” Medical
Clinics of North America. Vol. 72, no. 6, 11/1988.
[11]. E. Bertoft. “On the building block and backbone concepts of amylopectin

structure,” Cereal Chemistry. Vol. 90, pp. 294-311, 2013.
[12]. Bismark S. et al. “Effects of Differential Degree of Chemical Modification
on

the Properties of Modified Starches: Sizing,” The Journal of Adhesion.

Vol. 94, no. 2, pp. 97-123, 2018.
[13]. Din, Zia-ud- et al. “Physical and Chemical Modification of Starches - A
Review,” Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 2015.
[14]. Butler D.P. et al. “Starch-acting enzymes”. Pp. 128-155, 2004.
[15]. Mehta D., and Satyanarayana T. “Bacterial and archaeal α‐amylases:
Diversity and amelioration of the desirable characteristics for industrial
applications,” Frontiers in Microbiology. Vol. 7, pp. 1129, 2007.
[16]. Miao et al. “Slowly digestible starch-A review,” Critical Reviews in Food
Science and Nutrition. Vol. 55, pp. 1642-1657, 2015.
[17]. Nisha M., and Satyanarayana T. “Recombinant bacterial amylopullulanases:
Developments and perspectives,” Bioengineered. Vol. 4, pp. 388-400, 2013.
[18]. R. N. Tharanathan. “Starch-Value addition by modification,” Critical
Reviews in Food Science and Nutrition. Vol. 45, pp. 371-384, 2005.
[19]. J. H. Park et al. “Physicochemical properties of enzymatically modified
maize

starch

using

4‐α‐glucanotransferase,” Food

Science

and

Biotechnology. Vol. 16, pp. 902-909, 2007.
[20]. M. W. Kanning et al. “Improved creaminess in stirred yoghurt through
amylomaltase‐treated starch domains,” International Dairy Journal. Vol.
27, pp. 86-91, 2012.

65


[21]. S.

Mun et

al.

“Development

of

reduced‐fat

mayonnaise

using

4αGTase‐modified rice starch and xanthan gum,” International Journal of
Biological Macromolecules. Vol. 44, pp. 400-407, 2009.
[22]. P. S. Hoon et al. “Properties and applications of starch modifying enzymes
for use in the baking industry,” Food Sci Biotechnol. Vol. 27, pp. 299-312,

4/2018.
[23]. H. N. Englyst et al. “Classification and measurement of nutritionally
important starch fractions,” Eur. J. Clin. Nutr. Vol. 46, pp. S33-50, 1992.
[24]. L. C. Tapsell. “Diet and metabolic syndrome: Where does resistant starch fit
in?,” J. AOAC Int. Vol. 87, pp. 756-760, 2004.
[25]. J. Nissar et al. “Resistant Starch- Chemistry and Nutritional properties,”
International Journal of Food Science and Nutrition, Vol. 2, pp. 95-108,
2017.
[26]. A. P. Nugent. “Health properties of resistant starch,” Nutr. Bull. Vol. 30, pp.
27-54, 2005.
[27]. H. S. Lee et al. “Cooperative action of β-glucanotransferase and maltogenic
amylase for an improved process of isomaltooligosaccharide (IMO)
production,” J. Agric. Food Chem. Vol. 50, pp. 2812-2817, 2017.
[28]. N. Grewal et al. “Structure of waxy maize starch hydrolyzed by maltogenic
α‐amylase in relation to its retrogradation,” Journal of Agriculture and Food
Chemistry. Vol. 63, pp. 4196-4201, 2015.
[29]. H. Leemhuis et al. “Isomalto/malto‐ polysaccharide, a novel soluble dietary
fiber made via enzymatic conversion of starch,” Journal of Agricultural and
Food Chemistry. Vol. 62, pp. 12034-12044, 2014.
[30]. D. Goffin et al. “Will isomalto‐oligosaccharides, a well‐established
functional food in Asia, break through the European and American market?

66


The status of knowledge on these prebiotics,” Critical Reviews in Food
Science and Nutrition. Vol. 51, pp. 394-409, 2011.
[31]. S. J. Lee et al. “Production and characterization of branched oligosaccharides
from

liquefied

starch

by

the

action

of

Bacillus

licheniformis amylase,” Starch. Vol. 47, pp. 127-134, 1995.
[32]. J. N. BeMiller and R. L. Whistler. “Starch: Chemistry and technology ( 3rd
ed.)”. Burlington, MA: Academic Press, 2009.
[33]. J. H. Auh et al. “Modification of rice starch by selective degradation of
amylose

using

alkalophilic Bacillus cyclomaltodextrinase,” Journal

of

Agricultural and Food Chemistry. Vol. 54, pp. 2314– 2319, 2006.
[34]. M. L. Shinoharaet et al. “A novel thermostable branching enzyme from an
extremely

thermophilic

bacterial

species, Rhodothermus

obamensis,” Applied Microbiology and Biotechnology. Vol. 57, pp. 653–
659, 2001.
[35]. H. Kamasaka et al. “ Bacillus stearothermophilus neopullulanase selective
hydrolysis of amylose to maltose in the presence of amylopectin,” Applied
and Environmental Microbiology. Vol. 68, pp. 1658– 1664, 2002.
[36]. E. J. Oh et al. “Modification of granular corn starch with 4‐αglucanotransferase from Thermotoga maritima: Effects on structural and
physical properties,” Journal of Food Science. Vol. 73, pp. C158–C166,
2008.
[37]. M. Miao et al. “Impact of mild acid hydrolysis on structure and digestion
properties of waxy maize starch,” Food Chemistry. Vol. 126, pp. 506– 513,
2011.
[38]. G. Potocki‐Veronese et al. “Amylose synthesized in vitro by amylosucrase:
Morphology, structure, and properties,” Biomacromolecule. Vol. 6, pp.1000–
1011, 2013.

67


[39]. A. Rolland‐Sabaté et al. “Elongation and insolubilisation of α‐glucans by the
action

of Neisseria

polysaccharea amylosucrase,” Journal

of

Cereal

Science. Vol. 40, pp. 17– 30, 2004.
[40]. Q. T. Le et al. “Amylolytically‐resistant tapioca starch modified by
combined treatment of branching enzyme and maltogenic amylase,”
Carbohydrate Polymers. Vol. 75, pp. 9– 14, 2009.
[41]. H.

Kajiura

et

al.

“A

novel

enzymatic

process

for

glycogen

production,” Biocatalysis and Biotransformation. Vol. 26, pp. 133– 140,

2008.
[42]. B. H. Lee et al. “Enzyme‐synthesized highly branched maltodextrins have
slow glucose generation at the mucosal α‐glucosidase level and are slowly
digestible in vivo,” Plos One. Vol. 8, pp. 59745, 2013.
[43]. M. Miao et al. “Dual‐enzymatic modification of maize starch for increasing
slow digestion property,” Food Hydrocolloids. Vol. 38, pp. 180– 185, 2014.
[44]. L. C. Kyu et al. “Enzymatic Synthesis and Properties of Highly Branched
Rice Starch Amylose and Amylopectin Cluster,” Journal of Agricultural and
Food chemistry. Vol. 56, pp. 126-131, 2008.
[45]. Smith A. M. et al. “The synthesis of the starch granule,” Annu Rev Plant
Physiol Plant Mol Biol. Vol. 48, pp. 65–87, 1997.
[46]. Davies Henrissat B et al. “Glycosyltransferases, glycoside hydrolases:
Surprise, surprise!,” Current Opinion in Structural Biology. Vol. 18, pp.
527– 533, 2008.
[47]. Boyer C. D., and Preiss J. “Multiple forms of (1,4)-α-D-glucosyl transferase
from developing Zea mays L. kernels,” Carbohydr. Res. Vol. 61, pp. 321–
334, 1978.

68


[48]. Haworth W. N. et al. “Synthesis of amylopectin,” Nature (Lond.). Vol.
154, pp. 236–238, 1994.
[49]. A. Regina et al. “Control of starch branching in barley defined through
differential RNAi suppression of starch branching enzyme IIa and Iib,”
Carbohydrate Polymers. Vol. 61, pp. 1469-1482, 3/2010.
[50]. H. Guan et al. “Comparing the properties of Escherichia coli branching
enzyme and maize branching enzyme," Arch Biochem Biophys. Vol. 342, pp.
92-98, 1/1997.
[51]. I. J. Tetlow and M. J. Emes, “A review of Starch-branching enzymes and

their role in amylopectin biosynthesis,” IUBMB Life. Pp. 546-558, 2015.
[52]. X. Li et al. “ Partial branching enzyme treatment increases the low
glycaemic property and α‐1,6 branching ratio of maize starch,” Food
Chemistry. Vol. 164, pp. 502– 509, 2004.
[53]. H.

Takata

et

al.

“Application

of

branching

enzyme

in

starch

processing,” Biocatalysis and Biotransformation. Vol. 28, pp. 60-63, 2010.
[54]. S. A. Barker et al. “Enzymic synthesis of polysaccharides,” Q. Rev. Vol. 5,
pp. 56–83, 1951.
[55]. M. L. Shinohara et al. “A novel thermostable branching enzyme from an
extremely thermophilic bacterial species, Rhodothermus obamensis,” Appl
Microbiol Biotechnol. Vol. 57, pp. 653–659, 2001.

[56]. Đỗ

Q

Hai.

“Giáo

trình

Đợng

học

enzyme.”

Internet:

/>[57]. Nguyễn Đức Lượng và cợng sự. Cơng nghệ enzyme. Nhà xuất bản Đại học
Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh, 2004.

69


[58]. K. T. Jip et al. “Modes of action of Acarbose hydrolysis and
transglycosylation catalyzed by a Thermostable Maltogenic Amylase, the
gene for which was cloned from a Thermus strain,” Applied and
environmental microbiology. Pp. 1644-1651, 4/1999.
[59]. Fan LT et al. “Mechanism of the enzymic hydrolysis of cellulose: effects of
major structural features of cellulose on enzymic hydrolysis,” Biotechnol

Bioeng. Vol. 22, pp. 177–99, 1980.
[60]. Nguyễn Trọng Cẩn và cộng sự. Công nghệ enzyme. Nhà x́t bản Nơng
nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh, 1998.
[61]. D. L. Purich. “Factors influencing enzyme activities,” Enzyme Kinetics:
Catalysis & Control. Pp. 379-484, 2010.
[62]. Chaiken I.M. “Analytical affinity chromatography in studies of molecular
recognition in biology: a review,” J Chromatogr. Pp. 201-203, 1986.
[63]. J. W. Goding. “Affinity Chromatography,”

Monoclonal Antibodies

princibles and practice. Vol. 3, pp. 327-351, 1996.
[64]. J. A. Bornhorst and J. J. Falke. “Purification of Proteins Using Polyhistidine
Affinity Tags,” Methods in Enzymology. Vol. 326, pp. 245-254, 2000.
[65]. S. Harcum. “Purification of protein solutions,” Biologically Inspired Textiles.
A volume in Woodhead Publishing Series in Textiles, pp. 26-43, 2008.
[66]. Hồng Kim Anh và Ngơ Kế Sương. “Nghiên cứu cơng nghệ sản x́t tinh bợt
biến tính từ tinh bợt sắn và gạo,” trình bày tại Hội nghị Cơng nghệ sinh học
tồn quốc, Hà Nợi, trang 627-634, 2009.
[67]. Vũ Thị Thuận và cộng sự. “Kết quả nghiên cứu lựa chọn enzyme thích hợp
cho q trình sản x́t tinh bợt biến tính,” Tạp chí Thơng tin Khoa học và
Công nghệ số 2, 2015.

70


[68]. Nguyễn Thị Minh Hạnh và cộng sự. “Nghiên cứu quy trình cơng nghệ, thiết
bị và mơ hình chế biến tinh bợt biến tính,” Báo cáo khoa học và kỹ thuật. Đề
tài nhánh thuộc đề tài cấp Nhà nước KC 07-14. Viện Công nghiệp Thực
phẩm, 2003.

[69]. Trương Thị Thảo Nguyên và Trần Hữu Dũng. “Nghiên cứu điều chế tinh bột
biến tính bền vững với amylase làm thực phẩm chức năng hỗ trợ điều trị
bệnh đái tháo đường,” Tạp chí Dược học, ISSN: 0866-7861, 2012.
[70]. Hiroki Takata et al. “Production and some properties of a dextrin with a
narrow size distribution by the cyclization reaction of branching enzyme,”
Journal of Fermentation and Bioengineering. Vol. 84, pp. 119-123, 1997.
[71]. Kwang Yeon Lee et al. “Effects of α-glucanotransferase treatment on the
thermo-reversibility and freeze-thaw stability of a rice starch gel,”
Carbohydrate Polymers. Vol. 63, pp. 347-354, 2006.
[72]. H. J. Ah et al. “Preparation and physical characteristics of slowly digesting
modified food starches,” Carbohydrate Polymers. Vol. 67, pp. 366-374,
2007.
[73]. N.S. Seo et al. “Structural characterization of rice starch in rice cake
modified by Thermus scotoductus 4-alpha-glucanotransferase (TS alpha
GTase),” Journal of Food Science. Vol. 72, pp. C331-6, 2007.
[74]. Quang-Tri Le et al. “Amylolytically-resistant tapioca starch modified by
combined treatment of branching enzyme and maltogenic amylase,”
Carbohydrate Polymers. Vol. 75, pp. 9–14, 2009.
[75]. Mukherjee, P.K. et al. “V. Pharmbit,” Carbohydrate. Vol. 1, pp. 23-29,
2007.

71


[76]. D. K. Reddy and M.G. Bhotmange. “Viscosity of Starch: A Comparative
Study of Indian Rice (Oryza Sativa L.) Varieties,” International Review of
Applied Engineering Research. Vol. 4, pp. 397-402, 2014.
[77]. A. A. Perdon et al. “Starch Retrogradation and Texture of Cooked Milled
Rice During Storage,” Journal of Food Science. Vol. 64, no. 5, 1999.
[78]. J. Y. Han et al. “Molecular structure of sorghum and waxy sorghum

starches,” Food science and biotechnology. Vol. 17, pp. 176-179, 2008.
[79]. 79. Lê Ngọc Tú. Hóa Sinh Cơng Nghiệp. Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật
Hà Nội, 1998, trang 440.
[80]. F. Shih et al. “Physicochemical Properties of Rice Starch Modified by
Hydrothermal Treatments,” Journal of Cereal Chemistry. Vol. 84, pp. 527531, 2007.
[81]. R. M. Daniel et al. “The effect of temperature on enzyme activity: new
insights and their implications,” Extremophiles. Vol. 12, pp. 51–59, 2008.
[82]. W.D. Crabb and M. Colin. “Enzymes involed in the processing of starch to
sugar,” Journal of Trend in Biotechnology. Vol. 15, pp. 349-352, 1997.
[83]. L. Li

et al. “Characterization of maize amylose-extender (ae) mutant

starches,” Carbohydrate Polymers. Vol. 1, pp. 202-205, 2002.

72


PHỤ LỤC KẾT QUẢ THỐNG KÊ
1. Khảo sát ảnh hương của pH đến hoạt tính enzyme
ANOVA
DE
Sum of Squares

df

Mean Square

F

Sig.

Between Groups

.019

5

.004

20.571

.000

Within Groups

.002

12

.000

Total

.021

17

DE
Subset for alpha = 0.05

Duncana

pH

N

1

4

3

.1204

5

3

.1378

3

3

.1447

2

3

.1783

1

3

.1901

6

3

Sig.

2

3

.1901
.2124

.056

.301

.065

Means for groups in homogeneous subsets are displayed.
a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000.

2. Khảo sát ảnh hương của nhiệt đợ đến hoạt tính enzyme
ANOVA
DE
Sum of Squares

df

Mean Square

F

Sig.

Between Groups

.020

7

.003

13.905

.000

Within Groups

.003

16

.000

Total

.023

23

73