Tuyển chon xạ khuẩn và phân tích đặc tính của hệ Enzyme amylase ngoại bào từ xạ khuẩn P1

BỘ CƠNG THƢƠNG
ĐẠI HỌC CƠNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC
KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI
NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƢỜNG

Tên đề tài: TUYỂN CHỌN XẠ KHUẨN VÀ PHÂN TÍCH ĐẶC TÍNH
CỦA HỆ ENZYME AMYLASE NGOẠI BÀO TỪ XẠ KHUẨN
Mã số đề tài: 184.TP13
Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Thị Diệu Hạnh
Đơn vị thực hiện: Viện Công nghệ Sinh học và Thực phẩm

Tp. Hồ Chí Minh – 12/2020
1


LỜI CÁM ƠN
Chúng tôi xin chân thành cám ơn Trường Đại học Cơng nghiệp Thành phố Hồ Chí
Minh đã cấp kinh phí và tạo điều kiện thuận lợi cho nghiên cứu “Tuyển chọn xạ khuẩn và
phân tích đặc tính của hệ enzyme amylase ngoại bào từ xạ khuẩn”.
Chúng tôi xin cám ơn phịng Quản lí Khoa học và Hợp tác Quốc đã tạo điều kiện
thuận lợi cho chúng tơi hồn tất nghiên cứu này. Đồng thời, chúng tôi cũng trân trọng cám
ơn Viện Công nghệ Sinh học và Thực phẩm đã tạo điều kiện về cơ sở vật chất, thiết bị cho
việc thực hiện các thí nghiệm trong đề tài.
Chúng tơi trân trọng cám ơn PGS. TS. Nguyễn Đình Qn, ThS. Trần Thị Tưởng An
- Phịng Thí nghiệm Biomass, Trường Đại học Bách Khoa Thành phố Hồ Chí Minh đã hỗ
trợ chúng tơi trong q trình thực hiện đề tài.
Chân thành cám ơn các em sinh viên Bùi Thảo Vy, Đặng Lương Phương Thảo, Hứa
Trường Chinh, Đặng Bích Ngân, Hứa Huỳnh Minh Thảo và tất cả thành viên Phịng thí
nghiêm Công nghệ Vi sinh đã hỗ trợ chúng tôi trong q trình thực hiện đề tài này.

Trân trọng cám ơn.

NHĨM TÁC GIẢ

2


PHẦN I. THƠNG TIN CHUNG
I. Thơng tin tổng qt
1.1. Tên đề tài: Tuyển chọn xạ khuẩn và phân tích đặc tính của hệ enzyme amylase ngoại
bào từ xạ khuẩn
1.2. Mã số: 184.TP13
1.3. Danh sách chủ trì, thành viên tham gia thực hiện đề tài
TT

Họ và tên
(học hàm, học vị)

1 TS. Nguyễn Thị Diệu
Hạnh

2 TS. Phạm Tấn Việt

3 TS. Nguyễn Ngọc Ẩn

4 Nguyễn Thị Thanh Thúy

5 Nguyễn Thị Thu Trang

6 Hứa Huỳnh Minh Thảo

Đơn vị cơng tác

Vai trị thực hiện đề tài

Viện CNSH&TP- Chủ nhiệm đề tài thực hiện các nội
Trường ĐHCN Tp. dung:
- Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn
HCM
có hoạt tính sinh học
- Sản xuất dung dich enzyme
amylase ngoại bào từ xạ khuẩn
- Các thí nghiệm xác định hoạt tính
enzyme, động học enzyme
- Viết đề cương chi tiết
- Chịu trách nhiệm tổng thể về tất
cả các thí nghiệm trong đề tài
- Viết báo cáo tổng kết đề tài, viết
bài báo khoa học
Viện CNSH&TP - - Thu thập các mẫu đất từ các
Trường ĐHCN Tp. nguồn khác nhau để phân lập xạ
khuẩn
HCM
- Tinh sạch enzyme amylase
- Xác định động học enzyme
Viện CNSH&TP - - Tinh sạch enzyme amylase
Trường ĐHCN Tp. - Phân tích kết quả định danh xạ
khuẩn
HCM
- Xử lý số liệu.

ĐHSH11ATT- Viện - Phân lập xạ khuẩn
CNSH&TP -Trường - Khảo sát khả năng sinh enzyme
ĐHCN Tp. HCM amylase của xạ khuẩn
- Khảo sát các điều kiện cảm ứng
sản sinh amylase từ xạ khuẩn
ĐHSH11A- Viện - Phân lập xạ khuẩn
CNSH&TP -Trường - Khảo sát khả năng sinh enzyme
ĐHCN Tp. HCM amylase của xạ khuẩn
- Khảo sát các điều kiện cảm ứng
sản sinh amylase từ xạ khuẩn
ĐHSH10A- Viện - Quan sát cấu trúc đại thể, vi thể
CNSH&TP -Trường của xạ khuẩn
ĐHCN Tp. HCM - Xác định hoạt tính enzyme

1.4. Đơn vị chủ trì: Viện Cơng nghệ sinh học và thực phẩm, Trường Đại học Cơng nghiệp
Tp. Hồ Chí Minh
1.5. Thời gian thực hiện:
3


1.5.1. Theo hợp đồng: từ tháng 10 năm 2018 đến tháng 10 năm 2019
1.5.2. Gia hạn (nếu có): đến tháng 7 năm 2020
1.5.3. Thực hiện thực tế: từ tháng 11 năm 2018 đến tháng 8 năm 2020
1.6. Những thay đổi so với thuyết minh ban đầu (nếu có):
Khơng có sự thay đổi so với thuyết minh ban đầu
1.7. Tổng kinh phí đƣợc phê duyệt của đề tài: 40 triệu đồng (Bốn mươi triệu đồng chẵn)
II. Kết quả nghiên cứu
1. Đặt vấn đề
Amylase là nhóm enzyme quan trọng có khả năng thủy giải tinh bột tạo thành các loại
đường khác nhau như fructose, glucose, maltose và các dextrin trung gian. Amylase được

ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như công nghiệp thực phẩm, các ngành
công nghệ lên men, dệt may và công nghệ sản xuất giấy [1, 2]. Amylase được sử dụng thành
cơng trong q trình đường hóa tinh bột, trong công nghệ sản xuất rượu bia, cải thiện chất
lượng bột trong công nghệ làm bánh và là thành phần trong cơng nghệ giặt tẩy [3-5]. Ngồi
ra, nhiều nghiên cứu cũng đã cho thấy amylase còn được ứng dụng trong y học, cơng nghệ
sinh học và hóa học [5, 6]. Amylase là một trong ba nhóm enzyme được sử dụng nhiều nhất
trong các enzyme công nghiệp, chiếm khoảng 25-33% thị trường enzyme trên toàn thế giới
[7]. Amylase được thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau như thực vật, động vật, vi sinh vật và
chủ yếu là được sản xuất từ vi sinh vật. Amylase vi sinh vật đáp ứng được nhu cầu cơng
nghiệp và có thể gia tăng sự tổng hợp enzyme bằng các kỹ thuật di truyền, phương pháp
nuôi cấy liên tục, cảm ứng và tối ưu hóa các điều kiện sinh trưởng [8]. Các chủng vi sinh vật
thường được sử dụng để sản xuất amylase thuộc chi Bacillus, Streptomyces, Micrococcus,
Pseudomonas, Arthrobacter, Escherichia, Proteus, Aspergillus và Serratia, trong đó các
chủng xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces ngày càng được quan tâm [5, 9-12].
Streptomyces là nhóm vi sinh vật quan trọng có hiệu quả kinh tế cao thuộc họ
actinobacteria. Các chủng xạ khuẩn Streptomyces là đối tượng trong sản xuất khoảng 50%
các hợp chất trao đổi thứ cấp, đặc biệt là các chất kháng sinh, kháng khối u, các enzyme và
các chất ức chế enzyme, các hợp chất kháng khuẩn và kháng oxy hóa, các chất điều hịa
thực vật và vitamin [13-15]. Streptomyces tham gia vào việc sản xuất nhiều loại enzyme
khác nhau và đóng vai trị quan trọng trong việc phân hủy các hợp chất hữu cơ như
cellulase, protease, keratinase, amylase, xylanase, lipase, chitinase, pectinase [5]. Với các
đặc tính chịu nhiệt và chịu kiềm cao, việc sản xuất amylase từ xạ khuẩn ngày càng được
quan tâm. Các amylase chịu nhiệt được sản xuất từ xạ khuẩn được ứng dụng dễ dàng trong
4


nhiều ngành cơng nghiệp khác nhau [5]. Do đó, việc phân lập và chọn lọc các chủng xạ
khuẩn có khả năng sinh tổng hợp amylase mạnh cũng như tối ưu hóa các điều kiện sản xuất
amylase từ các chủng xạ khuẩn được nghiên cứu nhiều trong những năm gần đây [16-19].
Bên cạnh việc xác định mơi trường ni cấy thích hợp để tạo điều kiện cho sự sinh tổng

hợp amylase ngoại bào của xạ khuẩn, các đặc tính sinh hóa của enzyme cũng cần được quan
tâm để có cơ sở cho việc ứng dụng enzyme hiệu quả nhất trong các lĩnh vực khác nhau.
Hiện nay, những nghiên cứu về đặc tính hệ enzyme của xạ khuẩn tại Việt Nam cịn nhiều
hạn chế. Do đó, chúng tơi tiến hành nghiên cứu tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có khả năng
sản sinh amylase ngoại bào và tiến hành phân tích các đặc tính sinh học của hệ enzyme
ngoại bào từ chủng xạ khuẩn tuyển chọn được, cung cấp thêm đối tượng sản xuất amylase
cho các nghiên cứu trong nhiều mục đích khác nhau.
2. Mục tiêu
a. Mục tiêu đề tài
Phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có khả năng sản sinh enzyme
amylase ngoại bào và phân tích các đặc tính sinh học của hệ enyme amylase từ chủng xạ
khuẩn phân lập được.
b. Nội dung đề tài.
- Phân lập các chủng xạ khuẩn từ nhiều nguồn khác nhau và tuyển chọn các
chủng xạ khuẩn có hệ enzyme amylase ngoại bào.
- Khảo sát điều kiện thích hợp sinh tổng hợp amylase ngoại bào từ chủng xạ
khuẩn được chọn.
- Phân tích các đặc tính sinh học của hệ enzyme amylase của chủng xạ khuẩn.
3. Phƣơng pháp nghiên cứu
3.1. Phân lập và tuyển chọn xạ khuẩn sinh tổng hợp amylase
Các mẫu đất được thu thập từ nhiều địa phương khác nhau trên tỉnh Tiền Giang và Bến
Tre, Tây Ninh, Tp. Hồ Chí Minh. Mẫu đất sau đó được pha lỗng trong nước muối sinh lý
và trải trên môi trường thạch Gause I (20,0 g tinh bột tan; 0,5 g MgSO4.7H2O; 3,0 g
K2HPO4; 1,0 g KNO3; 0,5 g NaCl; 0,1 g FeSO4; 20,0 g agar; nước cất vừa đủ 1 lít; pH 7,27,4) ủ ở 37C trong 5 – 10 ngày. Các khuẩn lạc riêng rẽ có các đặc điểm đặc trưng của xạ
khuẩn có khả năng tạo vịng phân giải tinh bột khi có sự hiện diện của dung dịch lugol được
chọn và cấy ria liên tiếp 3 lần trong cùng môi trường và điều kiện như trên để làm thuần.
5


Các khuẩn lạc sau làm thuần được giữ giống trong glycerol 20% tại -46C cho các thí

nghiệm tiếp theo.
3.2 . Đánh giá sơ bộ khả năng sinh tổng hợp amylase
Khả năng sinh tổng hợp amylase của các chủng xạ khuẩn được đánh giá sơ bộ thơng
qua vịng phân giải tinh bột trên mơi trường thạch Gause I khi có sự hiện diện của dung dịch
lugol. Các chủng xạ khuẩn được nuôi cấy trong môi trường Gause I ở 37C trong 10 ngày.
Sau thời gian ni ủ, vịng phân giải được kiểm tra bằng thuốc thử lugol. Khả năng sản sinh
amylase để phân giải tinh bột của các chủng xạ khuẩn được xác định bằng cách so sánh độ
lớn vòng phân giải A = D – d với D là đường kính vịng phân giải và d là đường kính khuẩn
lạc của xạ khuẩn. Chủng xạ khuẩn có khả năng sinh tổng hợp amylase mạnh nhất sẽ được
chọn để nghiên cứu các điều kiện ni cấy thích hợp cho sự sinh tổng hợp amylase ngoại
bào.
3.3. Định danh xạ khuẩn
Căn cứ vào kết quả khảo sát sơ bộ về khả năng sinh tổng hợp amylase, chủng xạ khuẩn
được chọn sẽ được nuôi trên môi trường Gause I trong 10 ngày ở 37C và quan sát hình thái
đại thể. Cấu trúc cuống sinh bào tử được quan sát trên tiêu bản phòng ẩm bằng kính hiển vi
ở độ phóng đại 1000 lần. Chủng xạ khuẩn được định danh ở mức phân tử bằng phương pháp
giải trình tự đoạn gen 16S-rRNA với cặp mồi 27F 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'
và 1492R 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3' và phương trình PCR như sau 95°C - 5
phút, 30 chu kỳ tiếp theo (95°C - 30 giây; 55°C - 40 giây; 72°C - 90 giây) và 72°C - 5 phút
bởi công ty Nam Khoa Biotek (793/62 Trần Xuân Hưng, Quận 7, Hồ Chí Minh) và kết quả
giải trình tự được so sánh với cơ sở dữ liệu 16S-rRNA của xạ khuẩn có sẵn trên National
Center

for

Biotechnology

Information

(NCBI)

bằng

cơng

cụ

BLASTN

( Kết quả giải trình tự 2 chiều của vùng trình tự 16S
ribosomal RNA được kiểm tra độ chính xác và thiết lập trình tự consensus bằng phần mềm
FinchTV và Seaview. Các trình tự được sắp gióng bằng phần mềm ClustalX2.1. Cây phả hệ
thể hiện mối quan hệ di truyền giữa Mẫu nghiên cứu và các lồi thuộc chi Streptomyces hiện
có trên dữ liệu GenBank được xây dựng bằng phầm mềm MrBayes (hoặc Mega5) theo
phương pháp Bayesian (hoặc Neighbor joining).
3.4. Xác định hoạt độ amylase bằng phƣơng pháp Bernfeld
Hoạt độ amylase của enzyme ngoại bào từ xạ khuẩn được xác định thông qua lượng
đường khử tạo thành sau phản ứng giữa dịch enzyme thô và cơ chất tinh bột 1%. Phương
6


pháp này dựa trên cơ sở sử dụng thuốc thử 3,5-acid dinitrosalicylic (DNS) có màu vàng sau
khi cho phản ứng với đường khử (sản phẩm thủy phân của cellulose) sẽ tạo thành 3amino,5-nitro salicylic acid màu đỏ cam có khả năng hấp thụ cực đại bước sóng 540 nm
[20]. Dịch ni cấy xạ khuẩn trong điều kiện thích hợp được thu nhận và loại bỏ tế bào bằng
cách ly tâm (6.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4C) để thu nhận dịch enzyme thô amylase
ngoại bào. Dịch enzyme cho phản ứng với dung dịch tinh bột 1% trong 10 phút và thuốc thử
DNS được thêm vào để xác định lượng đường khử được giải phóng. Đơn vị hoạt tính (U)
của amylase được xác định bằng lượng enzyme cần thiết để giải phóng 1 micromole đường
khử ở 37℃ trong 1 phút.
3.5 . Khảo sát điều kiện ni cấy thích hợp cho sự sinh tổng hợp amylase của xạ khuẩn

Chủng xạ khuẩn được nuôi trong môi trường Gause I lỏng ở 37C, 150 vòng/phút trong
4 ngày và được sử dụng như nguồn giống tăng sinh cho các thí nghiệm khảo sát điều kiện
sinh tổng hợp enzyme này như ảnh hưởng của nguồn cơ chất, nitơ, điều kiện nhiệt độ, pH
khác nhau. Hoạt tính amylase của dịch nuôi cấy xạ khuẩn sau khi loại bỏ tế bào bằng
phương pháp ly tâm 6.000 vòng/phút tại 4C sẽ được xác định sau mỗi 24 giờ nuôi cấy bằng
phương pháp Bernfeld.
Để khảo sát ảnh hưởng của các nguồn cơ chất, môi trường Gause II với thành phần bao
gồm 3,0 g cao thịt; 5,0 g pepton; 5,0 g NaCl; nước cất vừa đủ 1 lít; pH 7,2-7,4 và bổ sung
10,0 g một trong các cơ chất khác nhau như tinh bột, bột gạo, bột mì, bột bắp. Cơ chất cho
kết quả tổng hợp enzyme cao nhất được sử dụng cho các thí nghiệm khảo sát tiếp theo.
Ảnh hưởng của nguồn nitơ lên sự sinh tổng hợp amylase được kiểm tra trong môi
trường Gause II với thành phần cacbon cho kết quả cao nhất trong thí nghiệm trên và thay
thế nguồn nitơ bằng 5 g tryptone, cao nấm men, NaNO3, (NH4)2SO4, NH4NO3, NH4Cl, ure.
Nguồn cơ chất và nitơ cho kết quả hoạt tính amylase của dịch ni cấy cao nhất sẽ được
chọn để tiếp tục khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy lên sự sinh tổng hợp amylase
của xạ khuẩn. Chủng xạ khuẩn được nuôi trong mơi trường thử nghiệm có nguồn cơ chất và
nitơ thích hợp và được nuôi ủ ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau 25C, 30C, 35C, 37C,
40C ± 0,1C.
Kết quả chọn lọc từ các điều kiện thích hợp về nguồn cơ chất, nitơ phù hợp sẽ được sử
dụng trong khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường lên sự sinh tổng hợp amylase của xạ
khuẩn. Môi trường thử nghiệm được điều chỉnh ở các giá trị pH ban đầu khác nhau 4,0; 5,0;
6,0; 7,0; 8,0; 9,0 ± 0,1 và được ni ủ tại nhiệt độ thích hợp đã được chọn lọc.
7


3.6 . Xác định đặc tính sinh hóa của amylase từ xạ khuẩn
Dung dịch ni cấy có chứa amylase từ xạ khuẩn được thu nhận và tủa bằng muối
(NH4)2SO4. Thu nhận tủa bằng phương pháp ly tâm 13.000 rpm tại 4C. Phần tủa được tái
hòa tan trong bằng dung dịch đệm A (glycerol 10%; Tris-Cl 50 mM pH 7,0; Mercapmetanol
2%). Dung dịch enzyme sau khi tái hòa tan được thẩm tách với màng dialysis có kích thước

3kDa để loại bỏ muối trong dung dịch ở 4C qua đêm.
Dung dịch enzyme sau thẩm tách tiếp tục được tinh sạch bằng phương pháp sắc ký trao
đổi (HiTrap Q HP 5 × 5 mL; GE Healthcare). Dung dịch cân bằng là Buffer A (Tris-Cl 50
mM pH 7,0; Glycerol 10%; Mercapmetanol 2%) và dung dịch để rửa giải là Buffer B (TrisCl 50 mM pH 7,0; Glycerol 10%; Mercapmetanol 2%; NaCl 1,0M). Tổng thể tích gradient
nồng độ NaCl được sử dụng là 100 ml, tốc độ dòng chảy được giữ ở mức 2ml/phút; mỗi
phân đoạn với thể tích 2ml sẽ được thu nhận. Kết quả tinh sạch được kiểm tra trên gel SDSPAGE (Sodium Dodecyl Sulphate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis).
3.7. Xác định đặc tính sinh hóa của amylase từ xạ khuẩn
Đặc tính sinh hóa của amylase từ xạ khuẩn được kiểm tra trong các điều kiện phản ứng
khác nhau về nhiệt độ (25-80°C), về giá trị pH (3,0-12,0), về ảnh hưởng của ion kim loại
(Mg2+, Mn2+, Zn2+, Cu2+, Fe2+, Fe3+, K+, Na+, Ca2+) lên hoạt tính enzyme, về độ bền nhiệt
của enzyme trong các nhiệt độ khác nhau (25-85°C). Hoạt tính enzyme được xác định bằng
phương pháp Bernfeld (2.2.4).
3.8 . Động học enzyme
Động học enzyme được xác định dựa trên ái lực liên kết cơ chất và khả năng xúc tác
phản ứng thông qua các giá trị Km và Vmax bằng phương trình Mechalis-Menten, số liệu
được phân tích bằng phần mềm Prism 3.0.
3.9 . Ứng dụng xạ khuẩn xử lý nƣớc thải giàu tinh bột
Các chủng xạ khuẩn được ni trong mơi trường thích hợp sản sinh amylase ngoại bào.
Dịch nuôi cấy được sử dụng để xử lý nước thải giàu tinh bột từ các cơ sở sản xuất bún tại
tỉnh Tiền Giang. Kiểm tra các chỉ số BOD5, COD, pH, sự giảm hàm lượng tinh bột trong
nước thải sau quá trình xử lý với chế phẩm xạ khuẩn. Kiểm tra tác động của nước thải sau
xử lý bằng xạ khuẩn trên sự phát triển của hạt đậu xanh để khẳng định hiệu quả xử lý của xạ
khuẩn lên hệ sinh thái trong tự nhiên.
3.10. Phƣơng pháp thống kê và xử lý số liệu
8


Giá trị kết quả của các thí nghiệm là trung bình của 3 lần lặp lại. Số liệu được tính toán,
vẽ biểu đồ trên Microsoft Excel 2013 và được xử lý thống kê bằng phương pháp ANOVA
bằng phần mềm Statgraphics Centurion 18.

4. Tổng kết về kết quả nghiên cứu
Kết quả nghiên cứu của đề tài đã đạt được một số hiệu quả về mặt khoa học và đào
tạo như sau:
-

Phân lập các chủng xạ khuẩn từ nhiều nguồn khác nhau và tuyển chọn chủng xạ
khuẩn có hệ enzyme amylase ngoại bào mạnh với chủng RBXK3.

-

Khảo sát các điều kiện thích hợp sinh tổng hợp amylase ngoại bào từ chủng xạ
khuẩn được chọn và xây dựng được quy trình sinh tổng hợp amylase của xạ
khuẩn.

-

Tinh sạch amylase ngoại bào từ chủng xạ khuẩn với độ tinh sạch ~95%

-

Phân tích các đặc tính sinh học của hệ enzyme amylase của chủng xạ khuẩn với
đặc điểm sinh hóa và động học của enzyme.

-

Kết quả của đề tài góp phần đào tạo 2 kỹ sư ngành Cơng nghệ sinh học thơng qua
khóa luận tốt nghiệp, đã bảo vệ thành công vào tháng 5/2019 của sinh viên
Nguyễn Thị Thanh Thúy (DHSH11ATT) và Nguyễn Thị Thu Trang (DHSH11A)

5. Đánh giá các kết quả đã đạt đƣợc và kết luận

Từ các nguồn mẫu đất khác nhau, 20 chủng xạ khuẩn đã được phân lập và kiểm tra sự
sinh tổng hợp amylase ngoại bào của các chủng xạ khuẩn này. Chủng xạ khuẩn RBXK3 thể
hiện sự sinh tổng hợp amylase cao nhất và được định danh bằng phân tích trình tự 16S
rRNA. So sánh với ngân hàng dữ liệu NCBI, chủng RBXK3 được xác định thuộc chi
Streptomyces. Điều kiện sinh tổng hợp amylase của chủng xạ khuẩn đã được kiểm tra và xác
định. Chủng xạ khuẩn RBXK3 thể hiện sự tổng hợp enzyme tốt nhất trong môi trường
Gause II có bổ sung 1% cơ chất tinh bột, 0,5% NH4NO3. Thời gian thích hợp cho sự sinh
tổng hợp enzyme cũng được kiểm tra trong các điều kiện khảo sát tương ứng và xác định
được thời gian tối thích là 96 giờ nuôi ủ trong điều kiện nhiệt độ 37C và pH mơi trường
thích hợp là 8,0. Khả năng hoạt động tốt của xạ khuẩn RBXK trong môi trường pH 8,0 cho
thấy tiềm năng cao trong việc ứng dụng tạo các chế phẩm sinh học để xử lý các chất thải
tinh bột hoặc giặt tẩy các chất bẩn có nguồn gốc từ tinh bột trong điều kiện kiềm hóa một
cách hiệu quả, đặc biệt hỗ trợ trong việc phát triển bền vững của môi trường và đời sống.
9


Về đặc tính sinh học của hệ enzyme amylase cũng được xác định. Amylase ngoại bào
của chủng xạ khuẩn RBXK3 đã được tinh sạch và thể hiện trọng lượng phân tử trong
khoảng 24kDa. Các đặc điểm sinh hóa của enzyme đã được xác định với điều kiện hoạt
động tốt nhất tại 65°C và pH 10,0. Sự hiện diện của ion kim loại Na+ với nồng độ thấp
(~1mM) trong điều kiện phản ứng cho hoạt tính cao nhất và enzyme này thể hiện sự bền
nhiệt cao với ~90% hoạt tính được duy trì khi xử lý với nhiệt độ 85°C. Các thông số động
học của amylase cho thấy khả năng xúc tác mạnh của enzyme với Vmax = 1,38 x 109 U/mg
và Km = 6,05 mg/ml.
Chế phẩm xạ khuẩn thô cũng được thử nghiệm xử lý với nước thải giàu tinh bột. Kết
quả cho thấy nước thải ở các nghiệm thức được xử lý với chế phẩm xạ khuẩn đã giảm các
chỉ số BOD5, COD, hàm lượng tinh bột tương đối và giá trị pH được cân bằng về gần trung
tính (6,0-6,9) khi thử nghiệm với chế phẩm xạ khuẩn ở các tỷ lệ 0,5%, 1,0%, 2,0%. Ngoài
ra, kết quả khảo sát ảnh hưởng của nước thải sau xử lý bằng xạ khuẩn lên sự phát triển của
hạt đậu xanh cũng khẳng định thêm tiềm năng ứng dụng của loại vi sinh vật này. Như vậy,

việc sử dụng xạ khuẩn hay các yếu tố sinh học trong xử lý nước thải, giúp giảm thiểu việc
sử dụng các hóa chất trong xử lý mơi trường, góp phần tạo nên mơi trường sống bền vững.
6. Tóm tắt kết quả (tiếng Việt và tiếng Anh)
Tiếng Việt: Vi sinh vật có vai trị quan trọng trong việc phân hủy các hợp chất hữu cơ trong
tự nhiên và là đối tượng cho việc sản xuất enzyme trên thế giới. Trong đó, amylase là một
trong ba enzyme được sử dụng nhiều nhất trên thị trường enzyme công nghiệp và việc tìm
kiếm các đối tượng vi sinh vật sản xuất amylase mạnh và có khả năng hoạt động tốt trong
các điều kiện cực đoan là cần thiết, đặc biệt xạ khuẩn là đối tượng tiềm năng cho sự sản xuất
amylase công nghiệp. Trong nghiên cứu này, 20 chủng xạ khuẩn đã được phân lập từ nhiều
mẫu đất khác nhau, trong đó chủng xạ khuẩn RBXK3 đã được tuyển chọn và định danh
thuộc chi Streptomyces. Chủng xạ khuẩn này thể hiện khả năng sinh tổng hợp amylase tốt
trong môi trường Gause II chứa 1% cơ chất tinh bột và 0,5% NH4NO3 với pH 8,0 tại 37C
trong thời gian lên men là 96 giờ. Amylase từ chủng RBXK3 có trọng lượng phân tử
khoảng 24kDa và hoạt động tốt nhất tại 65°C, pH 10,0 trong sự hiện diện của ion kim loại
Na+ với nồng độ ~1mM. Enzyme thể hiện sự bền nhiệt cao với ~90% hoạt tính được duy trì
khi xử lý với nhiệt độ 85°C. Giá trị Vmax và Km cũng được xác định tương ứng là 1,38 x 109
U/mg và 6,05 mg/ml. Chế phẩm xạ khuẩn thô giảm các chỉ số BOD5, COD, hàm lượng tinh
bột tương đối và giá trị pH được cân bằng về gần trung tính khi ứng dụng xử lý nước thải
10


giàu tinh bột. Chủng xạ khuẩn RBXK3 cho thấy tiềm năng sản xuất amylase trong mơi
trường kiềm thay vì trung tính như các chủng xạ khuẩn khác và có thể ứng dụng trong nhiều
lĩnh vực khác nhau.
Từ khóa: xạ khuẩn, amylase, phân giải tinh bột, Streptomyces, tinh sạch, đặc tính sinh hóa.
Tiếng Anh: Microorganisms play an important role in the breakdown of organic
compounds in nature and are the object of enzyme production in the world. In particular,
amylase is one of the three largest used groups in the industrial enzymes, and it is always
necessary to select high amylase-producing microorganisms that can work under extreme
conditions. Notably, actinomycetes are the potential targets for industrial amylase

production. In this study, 20 strains of actinomycetes were isolated from many different soil
samples, of which RBXK3 was selected and identified as Streptomyces sp.. This strain
showed high amylase biosynthesis in Gause II medium containing 1% starch substrate and
0.5% NH4NO3 with pH 8.0 at 37C for 96 hours. Amylase from RBXK3 has a molecular
weight of about 24kDa and catalyzes starch hydrolysis at condition of 65C, pH 10.0 in the
presence of ~1mM Na+. The enzyme exhibits high thermal stability with ~ 90% of the
reduced activity after treated with 85°C. Vmax and Km values were also determined as 1.38 x
109 U/mg and 6.05 mg/ml, respectively. Crude culture of actinomyces decreased the value
of BOD5, COD, relative starch content and balanced pH value to near neutral when applied
to treat starch-rich wastewater. The RBXK3 strain shows superior potential to produce
amylase in an alkaline environment instead of the neutral one like other actinomycetes and
thus can be applied in many different fields.
Key words: Actinomyces, amylase, starch hydrolysis, Streptomyces, purification,
biochemical characteristics.
III. Sản phẩm đề tài, công bố và kết quả đào tạo
3.1. Kết quả nghiên cứu (sản phẩm dạng 1,2,3)
Yêu cầu khoa học hoặc/và chỉ tiêu
TT

kinh tế - kỹ thuật

Tên sản phẩm
Đăng ký

Đạt đƣợc

11


1

Giống vi sinh vật (xạ Ít nhất 5 chủng có hoạt

-10 chủng xạ khuẩn có

khuẩn)

hoạt tính về sản sinh

tính sinh học

enzyme. 6 chủng đã
được định danh bằng
phương pháp sinh học
phân tử.
2

Qui trình sản xuất amylase

Đầy đủ các thơng số kỹ Qui

ngoại bào từ xạ khuẩn

thuật của qui trình, thu

amylase ngoại bào từ xạ

được 10 ml dung dịch

khuẩn với các thông số

enzyme amylase (15-

về nguồn cơ chất, nitơ,

20U/ml)

nhiệt độ pH.

trình

sản

xuất

10ml dung dịch enzyme
amylase (>2000U/ml)
3

Bài báo IUH
Tham gia đào tạo

4

2 bài báo khoa học cấp

Đã được chấp nhận đăng

Trường

2 bài của Tạp chí IUH

2 Sinh viên đại học

2 Sinh viên đại học đã
bảo vệ Khóa luận tốt
nghiệp

Ghi chú:
-

Các ấn phẩm khoa học (bài báo, báo cáo KH, sách chuyên khảo…) chỉ được chấp

nhận nếu có ghi nhận địa chỉ và cảm ơn trường ĐH Cơng Nghiệp Tp. HCM đã cấp kính phí
thực hiện nghiên cứu theo đúng quy định.
-

Các ấn phẩm (bản photo) đính kèm trong phần phụ lục minh chứng ở cuối báo cáo.

(đối với ấn phẩm là sách, giáo trình cần có bản photo trang bìa, trang chính và trang cuối
kèm thông tin quyết định và số hiệu xuất bản)
3.2. Kết quả đào tạo

TT

Họ và tên

Thời gian

Tên đề tài

thực hiện đề tài

Tên chuyên đề nếu là NCS

Đã bảo vệ

Tên luận văn nếu là Cao học
Sinh viên Đại học
12


Nguyễn Thị

6 tháng

Tuyển chọn chủng xạ khuẩn sinh
tổng hợp enzyme amylase và

Thanh Thúy

khảo sát điều kiện sinh tổng hợp

X

hệ enzyme này
Nguyễn Thị Thu

6 tháng

Tuyển chọn chủng xạ khuẩn sinh
tổng hợp enzyme amylase và

Trang

khảo sát điều kiện sinh tổng hợp

X

hệ enzyme này
Ghi chú:
- Kèm bản photo trang bìa chuyên đề nghiên cứu sinh/ luận văn/ khóa luận và bằng/giấy
chứng nhận nghiên cứu sinh/thạc sỹ nếu học viên đã bảo vệ thành công luận án/ luận
văn;( thể hiện tại phần cuối trong báo cáo khoa học)
IV. Tình hình sử dụng kinh phí
T

Nội dung chi

T

Kinh phí

Kinh phí

đƣợc duyệt

thực hiện

(triệu đồng)

(triệu đồng)

A

Chi phí trực tiếp

1

Th khốn chun mơn

2

Ngun, nhiên vật liệu, cây con..

7,6

7,6

3

Thiết bị, dụng cụ

29,4

29,4

4

Cơng tác phí

5

Dịch vụ th ngồi

6

Hội nghị, hội thảo,thù lao nghiệm thu giữa kỳ

7

In ấn, Văn phịng phẩm

3,0

3,0

8

Chi phí khác

B

Chi phí gián tiếp

1

Quản lý phí

2

Chi phí điện, nước

Ghi
chú

Tổng số

13


V. Kiến nghị (về phát triển các kết quả nghiên cứu của đề tài)
- Tiếp tục nghiên cứu thêm các đặc tinh sinh học về enzyme cũng như khả năng sản sinh
kháng sinh của các chủng xạ khuẩn khác trong bộ sưu tập đạt được.
- Amylase của chủng xạ khuẩn RBXK3 có tính bền nhiệt cao và khả năng hoạt động trong
mơi trường tính kiềm cao, mở ra khả năng ứng dụng trong công nghiệp của enzyme từ
chủng xạ khuẩn này, do đó cần nghiên cứu thêm việc ứng dụng enzyme này trong các lĩnh
vực cụ thể như chăn nuôi, môi trường…
VI. Phụ lục sản phẩm (liệt kê minh chứng các sản phẩm nêu ở Phần III)
-

Quy trình sản xuất amylase ngoại bào từ xạ khuẩn RBXK3

-

Kết quả định danh các chủng xạ khuẩn

-

Giấy chấp nhận đăng 2 bài báo tại Tạp chí IUH

-

Kết quả đào tạo 2 Sinh viên Đại học.
Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 10 tháng 12 năm 2020

Chủ nhiệm đề tài

Phịng QLKH&HTQT

Viện Cơng nghệ Sinh học & Thực Phẩm

14


PHẦN II. BÁO CÁO CHI TIẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC
(báo cáo tổng kết sau khi nghiệm thu, đã bao gồm nội dung góp ý của hội đồng nghiệm thu)
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Xạ khuẩn
Xạ khuẩn (Actinomycetes) thuộc nhóm Procaryotes, là một nhóm vi khuẩn Gram
dương, trong chu trình sống có hình thành hệ sợi khuẩn ty, khơng vách ngăn, đầu cuống bào
tử có thể hình thành bào tử riêng lẻ hoặc chuỗi. Đa số xạ khuẩn có cấu tạo dạng sợi (khuẩn
ty), các khuẩn ty liên kết với nhau tạo thành khuẩn lạc có nhiều màu sắc khác nhau như
trắng, vàng, nâu, tím, xám..... Màu sắc của xạ khuẩn là một đặc điểm phân loại quan trọng.
Đường kính khuẩn ty của xạ khuẩn khoảng từ 0,1 – 0,5 μm. Xạ khuẩn hình thành hai loại
khuẩn ty khác nhau. Khuẩn ty khí sinh là hệ sợi mọc trên bề mặt môi trường tạo thành bề
mặt của khuẩn lạc xạ khuẩn, từ đây phát sinh ra bào tử. Khuẩn ty cơ chất là hệ sợi cắm sâu
vào môi trường làm nhiệm vụ hấp thu chất dinh dưỡng. Khuẩn ty cơ chất có thể sinh ra sắc
tố thấm vào mơi trường, sắc tố này thường có màu khác với màu của khuẩn ty khí sinh. Đây
cũng là một đặc điểm phân loại quan trọng.

Hình 1.1: Hình dạng khuẩn lạc xạ khuẩn với màu sắc khuẩn ty cơ chất và khuẩn ty
khí sinh cũng như sắc tố tạo thành khác nhau từ các chủng xạ khuẩn Streptomyces spp. [21]
Khuẩn lạc xạ khuẩn thường rắn chắc, xù xì, có thể có dạng da, dạng phấn, dạng
nhung, dạng vôi phụ thuộc vào kích thước bào tử. Trường hợp khơng có khuẩn ty khí sinh,
khuẩn lạc có dạng màng dẻo. Kích thước khuẩn lạc thay đổi tuỳ loài xạ khuẩn và tuỳ điều
15


kiện ni cấy. Khuẩn lạc thường có dạng phóng xạ (vì thế mà gọi là xạ khuẩn), một số có
dạng những vòng tròn đồng tâm cách nhau một khoảng nhất định. Nguyên nhân của hiện
tượng vòng tròn đồng tâm là do xạ khuẩn sinh ra chất ức chế sinh trưởng, khi sợi mọc qua
vùng này chúng sinh trưởng yếu đi, qua được vùng có chất ức chế chúng lại sinh trưởng
mạnh thành vòng tiếp theo, vòng này lại sinh ra chất ức chế sinh trưởng sát với nó khiến
khuẩn ty lại phát triển yếu đi. Cứ thế tạo thành khuẩn lạc có dạng các vịng trịn đồng tâm.
Xạ khuẩn sinh sản sinh dưỡng bằng bào tử. Bào tử được hình thành trên các nhánh
phân hố từ khuẩn ty khí sinh gọi là cuống sinh bào tử. Cuống sinh bào tử ở các lồi xạ
khuẩn có kích thước và hình dạng khác nhau, có lồi dài tới 100 - 200 nm, có lồi chỉ
khoảng 20 - 30 nm, có lồi cấu trúc theo hình lượn sóng, có lồi lị xo hay xoắn ốc. Đồng
thời, sự sắp xếp của các cuống sinh bào tử cũng khác nhau. Các cuống sinh bào tử có thể
sắp xếp theo kiểu mọc đơn, mọc đơi, mọc vịng hoặc từng chùm. Đặc điểm hình dạng của
cuống sinh bào tử là một tiêu chuẩn để phân loại xạ khuẩn. Bào tử được hình thành từ cuống
sinh bào tử theo kiểu kết đoạn (fragmentation) hoặc cắt khúc (segmentation). Ngoài hình
thức sinh sản bằng bào tử, xạ khuẩn cịn có thể sinh sản bằng khuẩn ty. Các đoạn khuẩn ty
gãy ra mơi trường phát triển thành hệ khuẩn ty. [21]

Hình 1.2: Hình dạng cuống sinh bào tử của Streptomyces spp. bằng sơ đồ và SEM [21]
Xạ khuẩn là nhóm vi sinh vật phân bố rộng rãi trong tự nhiên, có nhiều trong đất,
chúng tham gia vào các quá trình phân giải mạnh các hợp chất hữu cơ như cellulose, tinh
bột, protein, chitin, keratin, pectin, lignin,... góp phần khép kín vịng tuần hồn vật chất

trong tự nhiên. Đặc tính này cịn được ứng dụng trong quá trình chế biến, phân huỷ chất
thải. Nhiều xạ khuẩn có khả năng tổng hợp mạnh các enzyme như protease, amylase,

16


chitinase, cellulase. Đặc điểm này được sử dụng trong nghiên cứu sản xuất các chế phẩm
dùng trong nông nghiệp, bảo quản thực phẩm và xử lý môi trường [22].
1.2 Enzyme amylase
Amylase là một loại enzyme thuỷ phân tinh bột quan trọng nhất trong cơng nghệ sinh
học, có khả năng phân cắt các liên kết trong cơ chất amylose và amylopectin, làm tăng tốc
độ đường hoá tinh bột của nguyên liệu giúp các phản ứng xảy ra nhanh chóng, rút ngắn thời
gian hình thành sản phẩm.
Amylase thu nhận từ vi sinh vật nói chung, từ xạ khuẩn nói riêng có nhiều ưu điểm
nổi bật hơn các loại amylase từ thực vật và động vật như hoạt tính cao hơn, khả năng chịu
nhiệt cao, có thể sản xuất ở quy mơ cơng nghiệp với nguồn nguyên liệu đơn giản và rẻ tiền.
Với những ưu thế nổi trội, xạ khuẩn trở thành nguồn nguyên liệu dồi dào, đầy hứa hẹn cho
ngành công nghiệp sản xuất enzyme. Do đó, trong vịng các những năm gần đây, các chế
phẩm enzyme từ xạ khuẩn đã dần thay thế enzyme từ động vật.
Với phạm vi ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau như công nghệ thực phẩm,
dược phẩm, công nghệ lên men, công nghệ dệt nên khối lượng chế phẩm amylase được sản
xuất hàng năm trên thế giới lên tới hàng chục vạn tấn và ngày một gia tăng. Chính vì vậy,
việc tìm kiếm các chủng xạ khuẩn sinh amylase cao luôn thu hút sự quan tâm của nhiều nhà
khoa học trong và ngồi nước.


Phân Loại

Hình 1.3: Phân loại amylase
Enzyme α-amylase (1,4-α-D-glucan glucanohydrolase; glycogenase)

17


α-amylase xúc tác thủy phân ngẫu nhiên các liên kết α-1,4-glycoside trong tinh bột
và trong các polysaccharide khác. α-amylase có nguồn gốc khác nhau có nhiều điểm rất
giống nhau. Dưới tác dụng của α-amylase, cơ chất bị chuyển hóa thành maltose, glucose và
dextrin có khối lượng phân tử thấp. Tuy nhiên, sản phẩm thủy phân thông thường bằng αamylase chủ yếu là dextrin có khối lượng phân tử thấp (khơng cho màu với iodine) và một ít
maltose. Khả năng dextrin hóa cao được xem là tính chất đặc trưng của α-amylase. Vì vậy,
α-amylase cịn được gọi là amylase dextrin hóa hay amylase dịch hóa.
Enzyme β-amylase (1,4-α-D-glucan maltohydrolase; glycogenase)
β-amylase xúc tác thủy phân liên kết α-1,4-glycoside thứ hai của mạch tinh bột để tạo
thành các đường đôi maltose. β-amylase xúc tác q trình thủy phân bắt đầu từ đầu khơng
khử ở các nhánh ngoài cùng của cơ chất. β-amylase xúc tác quá trình thủy phân các liên kết
α-1,4-glycoside nhưng khi gặp liên kết α-1,4-glycoside đứng kế cận liên kết α-1,6-glycoside
thì sẽ ngừng xúc tác. Tinh bột bị thuỷ phân khoảng 95% khi có xúc tác bởi cả α-amylase và
β-amylase.
Enzyme γ-amylase (Glucan 1,4-α-glucosidase; amyloglucosidase; Exo-1,4-α-glucosidase;
1,4-α-D-glucan glucohydrolase):
γ-amylase giúp xúc tác thủy phân liên kết α-1,6-glycoside và cả liên kết cuối cùng α1,4-glycoside của mạch polysaccharide từ đầu không khử, tách tuần tự từng gốc glucose từ
đầu không khử của mạch để tạo ra các gốc glucose tự do.
1.3 Một số nghiên cứu và thực tiễn
Ứng dụng của xạ khuẩn đã được nghiên cứu trong nhiều lĩnh vực khác nhau như về
hệ enzyme như amylase, protease… Hệ enzyme phong phú của xạ khuẩn đã được nghiên
cứu trong nhiều lĩnh vực như xử lý rác thải mơi trường, xử lí nước thải, thuốc kháng sinh
[5]. Nhiều nghiên cứu đã được thực hiện để tìm ra các chủng xạ khuẩn có khả năng sản sinh
các enzyme ngoại bào cao, đặc biệt là amylase.
Nhóm tác giả Sathya Rengasamy đã tuyển chọn được 8 chủng xạ khuẩn có khả năng
phân giải tinh bột trong tổng số 65 chủng phân lập được từ các mẫu nước biển khác nhau
[16]. Chủng xạ khuẩn Streptomyces sp. Al-Dhabi-46 với khả năng sinh tổng hợp amylase
cao đã được tuyển chọn từ 17 chủng xạ khuẩn trong nghiên cứu của Naif Abdullah AlDhabi và công sự (2020) [23], chủng Streptomyces fragilis DA7-7 được sàng lọc từ 134

18


chủng phân lập từ các mẫu đất sa mạc trong nghiên cứu của Krishnasamy Nithya và cộng sự
[24] hoặc chủng Streptomyces sp. SLBA-08 được chọn lọc từ 286 chủng xạ khuẩn trong
nghiên cứu của Santos và cộng sự (2012) [25]. Bên cạnh các nghiên cứu tuyển chọn các
chủng xạ khuẩn có khả năng sinh tổng hợp amylase, nhiều nghiên cứu cũng đã được thực
hiện để khảo sát các điều kiện môi trường cho sự sinh tổng hợp enzyme từ các chủng xạ
khuẩn tiềm năng [18, 25, 26].
Ngoài ra, các nghiên cứu về tinh sạch và kiểm tra các đặc tính sinh hóa của amylase
từ xạ khuẩn cũng được thực hiện trong những năm gần đây [19, 23, 24, 27]. Các nghiên cứu
cho thấy tiềm năng ứng dụng amylase của các chủng xạ khuẩn trong các lĩnh vực khác nhau
trong thực tiễn.
Wael N. Hozzein, Mohammed Bastawy Ahmed and Marzouka Shaban Abdel Tawab
(2012) đã phân lập và tuyển chọn được một số chủng xạ khuẩn có khả năng xử lý và loại bỏ
kim loại nặng từ nước thải [2].
Ở Việt Nam cũng đã có nhiều nghiên cứu về ứng của xạ khuẩn trong các lĩnh vực
nông nghiệp, y học, môi trường và gần đây nhất trong năm 2018 đã có sinh viên Bùi Thảo
Vy, Đặng Lương Phương Thảo và cộng sự đã sản xuất được chế phẩm bước đầu xử lí nước
thải của nghề làm bún giàu tinh bột và các thành phần khác tại trường Đại Học Cơng
Nghiệp TP. HCM (Khố luận tốt nghiệp sinh viên Bùi Thảo Vy, Đặng Lương Phương Thảo,
năm 2018).

19