Phân lập, tuyển chọn xạ khuẩn có khả năng phân giải cellulose trong đất đồi đại lải

Khoá luận tốt nghiệp đại học

Đinh Thị Mỹ ánh

mở đầu
1. Lý do chọn đề tài
Vi sinh vật (Microorganisms) là tất cả các sinh vật có hình thể bé nhỏ,
muốn thấy rõ đợc ngời ta phải sử dụng tới kính hiển vi. VSV phân bố rộng
khắp mọi nơi trên Trái Đất, từ đáy biển sâu đến độ cao hàng nghìn mét trong
không khí, từ trong cơ thể thực vật, động vật đến các vật liệu khô cằn nh
kính, sắt đều phát hiện thấy sự sống của VSV. Tuy nhiên đất vẫn là nơi c
trú phổ biến nhất của các nhóm VSV kể cả thành phần và số lợng. Bởi thế
chúng đóng vai trò quan trọng, trớc hết là đối với quá trình hình thành và
phát triển của đất. Chính nhờ những VSV tự dỡng đầu tiên mà thành phần
của đá mẹ bị phân huỷ dần thành đất. Sự hoạt động tiếp theo của các nhóm
VSV khác đã hình thành và tích luỹ chất mùn làm nên độ phì nhiêu của đất.
VSV tham gia mạnh mẽ vào quá trình chuyển hoá vật chất trong đất, góp phần
khép kín các vòng tuần hoàn vật chất trong tự nhiên. Hầu hết các khâu của các
chu trình chuyển hoá vật chất trong đất đều có sự tham gia của VSV.
Trớc hết là nhóm VSV tham gia vào quá trình phân huỷ cellulose- một
hợp chất hữu cơ có khá nhiều trong đất, thành phần chính cấu tạo nên cơ thể
thực vật. ở cây bông cellulose chiếm 90% trọng lợng khô, ở các loài cây gỗ
khác cellulose chiếm 40-50%. Có nhiều nhóm VSV có khả năng phân giải
cellulose c trú trong đất nh vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc, niêm vi khuẩn.
Đáng chú ý nhất là xạ khuẩn (Actinomycetes). Chúng phân bố rộng rãi trong
đất, tham gia vào nhiều quá trình phân giải các hợp chất hữu cơ: cellulose,
tinh bột góp phần khép kín vòng tuần hoàn vật chất trong tự nhiên. Đặc tính
này đợc ứng dụng trong quá trình chế biến, phân huỷ rác, xử lý các bã thải
nông nghiệp, công nghiệp thực phẩm.
Từ những lý do trên với mục đích tìm hiểu, làm quen với phơng pháp nghiên
cứu VSV nói chung, phơng pháp nghiên cứu xạ khuẩn phân giải cellulose nói

Đại học s phạm H Nội 2

1

K31B Sinh


Khoá luận tốt nghiệp đại học

Đinh Thị Mỹ ánh

riêng, tôi chọn đề tài Phân lập, tuyển chọn xạ khuẩn có khả năng phân giải
cellulose trong đất đồi Đại Lải.
2. Mục tiêu của đề tài
- Phân lập, khảo sát mật độ phân bố của xạ khuẩn có khả năng phân giải
cellulose ở ba độ sâu: 5cm, 10cm, 20cm tại địa điểm là đồi Đải Lải thuộc
phờng Đồng Xuân - thị xã Phúc Yên - tỉnh Vĩnh Phúc.
- Đa ra một số nhận xét dẫn đến nguyên nhân có sự tập trung của xạ khuẩn
phân giải cellulose tại các vị trí.
- Thử hoạt tính enzym cellulase của một số chủng xạ khuẩn phân lập đợc.
- Nghiên cứu ảnh hởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp
cellulase của một số chủng thuộc chi Micromonospora.
- Nghiên cứu ảnh hởng của độ pH môi trờng đến khả năng sinh tổng hợp
cellulase của một số chủng thuộc chi Micromonospora.
3. Nội dung của đề tài
Nội dung của đề tài Phân lập, tuyển chọn xạ khuẩn có khả năng phân giải
cellulose trong đất đồi Đại Lải để tìm hiểu đặc điểm, sự phân bố của xạ
khuẩn, khẳng định đợc vai trò của chúng trong đất, đồng thời tìm hiểu các
điều kiện ảnh hởng: độ ẩm, độ pH, loại đất tới sự phân bố của xạ khuẩn

phân giải cellulose.
4. ý nghĩa của đề tài
Đề tài góp phần tạo cơ sở khoa học cho các phơng thức canh tác, cày xới,
cải tạo đất, bón phân theo hớng lợi dụng VSV phân giải cellulose, tăng
cờng các quá trình phân giải các hợp chất hữu cơ để làm giàu dinh dỡng cho
đất, tăng năng suất cho cây trồng. Mặt khác đề tài cho phép tuyển chọn những
chủng xạ khuẩn có khả năng phân giải cellulose mạnh, từ đó có thể tạo ra một
chế phẩm VSV chứa các chủng xạ khuẩn này phục vụ cho việc ủ rác sinh học.

Đại học s phạm H Nội 2

2

K31B Sinh


Khoá luận tốt nghiệp đại học

Đinh Thị Mỹ ánh
Chơng 1

tổng quan ti liệu
1.1. Sơ lợc về các nhóm vi sinh vật có khả năng phân giải cellulose
Tất cả các nhóm VSV phân giải cellulose đều thuộc nhóm dị dỡng,
hoại sinh. Chúng có khả năng này nhờ có hệ enzym cellulose ngoại bào.
Trong đất các nhóm VSV này gồm nhiều loại khác nhau: vi khuẩn, niêm vi
khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc
Vi nấm là nhóm có khả năng phân giải cellulose vì nó tiết ra môi trờng
một lợng lớn enzym đầy đủ các thành phần. Các nấm mốc có hoạt tính phân
giải các cellulose đáng chú ý là Tricoderma. Hầu hết các loài thuộc chi

Tricoderma sống hoại sinh trong đất và đều có khả năng phân giải cellulose.
Chúng tiến hành phân giải các tàn d của thực vật để lại trong đất góp phần
chuyển hoá một lợng hữu cơ khổng lồ. Trong nhóm vi nấm, ngoài
Tricoderma còn có nhiều giống khác có khả năng phân giải cellulose nh:
Aspergillus, Fusarium, Mucor Nhiều loài vi khuẩn có khả năng phân huỷ
cellulose, tuy nhiên cờng độ không mạnh bằng vi nấm. Do số lợng enzym
tiết ra môi trờng của vi khuẩn thờng nhỏ hơn, thành phần các loại enzym
không đầy đủ, ở trong đất thờng có ít loài vi khuẩn có khả năng tiết ra 4 loại
enzym trong hệ enzym cellulose. Nhóm này tiết ra một loại enzym, nhóm
khác tiết ra các loại khác, chúng phối hợp với nhau để phân giải cơ chất trong
mối quan hệ hữu sinh.
Nhóm vi khuẩn hiếu khí đại diện là: Cellulomonas, Pseudomonas,
Achromonobater, Bacillus Nhóm vi khuẩn kị khí Clostridium, đặc biệt là
những cầu khuẩn thuộc chi Ruminococcus có khả năng phân giải cellulose
thành đờng và axit hữu cơ, sống trong dạ cỏ của động vật nhai lại. Chính nhờ
nhóm này mà trâu bò có thể sử dụng đợc cellulose có trong cỏ, rơm rạ làm
thức ăn.

Đại học s phạm H Nội 2

3

K31B Sinh


Khoá luận tốt nghiệp đại học

Đinh Thị Mỹ ánh

Niêm vi khuẩn (Myxobacteriales) là những vi khuẩn Gram (-) có khuẩn

lạc nhày ớt, tế bào hình que, nhỏ bé (0,3 - 0,4ì 0,7 - 10m), hơi uốn cong,
thờng có đầu nhọn, có thành tế bào mỏng và nhuộm màu kém hơn so với các
vi khuẩn khác. Niêm vi khuẩn phân giải cellulose đợc tìm thấy trong các
giống: Promyxobacterium, Cytophaga, Sporocytophaga, Sorangium. Chúng
sống trong môi trờng ít axit và ít kiềm. Trên bề mặt các vật liệu chứa
cellulose, niêm vi khuẩn phát triển trong dạng các thể nhày không có hình xác
định, lan rộng, có màu vàng, da cam hay đỏ. Màu sắc khuẩn lạc thờng tơng
ứng với các chỗ cellulose bị phân giải nhiều hay ít. Xạ khuẩn có khả năng
phân giải cellulose mạnh, nó tiết ra đầy đủ 4 thành phần của hệ enzym
cellulose. Vì vậy nó có khả năng phân giải cellulose mà không phải sống
trong mối quan hệ hỗ sinh với bất kì loài nào khác. Xạ khuẩn phân giải
cellulose gồm các giống: Proactinomyces, Actinomyces, Micromonospora,
Streptomyces
1.2. Sơ lợc về xạ khuẩn
1.2.1. Vị trí của xạ khuẩn trong hệ thống sinh giới
Xạ khuẩn (Actinomycetes) là một nhóm VSV lớn trong giới Bacteria.
Chúng thuộc nhóm VSV Gram (+) và là nhóm chuyển tiếp giữa Nấm (Fungi)
và vi khuẩn (Bacteria). Theo Krassilnikov (1970) xạ khuẩn (Actinomycetes)
đợc tách thành một lớp riêng gồm có xạ khuẩn bậc cao (có hệ sợi phát triển,
có cơ quan sinh sản riêng) và nhóm xạ khuẩn bậc thấp (có hệ sợi kém phát
triển, tế bào có dạng hình que hoặc hình cầu). Xạ khuẩn có hệ sợi ngắn nh họ
Mycobacteriaceae và Actinomycetaceae, hoặc hệ sợi dài nh họ
Streptomycetaceae. Xạ khuẩn đợc Bergey xếp vào bộ riêng Actinomycetales
(Bergeys Manual, 1989) thuộc siêu giới nhân sơ (Prokaryota), Giới Bacteria,
Ngành Firmicutes, Lớp Actinobacteria, Lớp phụ Actinobacteriaceae...
Theo hệ thống phân loại hiện nay, xạ khuẩn thuộc nhóm VSV nhân
nguyên thuỷ (Prokaryota) thuộc giới khởi sinh (Monera) trong hệ thống phân

Đại học s phạm H Nội 2

4

K31B Sinh


Khoá luận tốt nghiệp đại học

Đinh Thị Mỹ ánh

loại 5 giới hay trong hệ thống phân loại 7 giới thì xạ khuẩn thuộc giới vi
khuẩn chuẩn (Eubacteria) thuộc siêu giới nhân sơ.
Bộ xạ khuẩn gồm 10 họ: Actinomycetaceae, Actinoplanaceae,
Permatophilaceae,

Frankiaceae,

Micromonosporaceae,

Thermomonosporaceae,

Micobacteriaceae,

Nocarddiceae

và

Streptomycetaceae.
1.2.2. Đặc điểm sinh học của xạ khuẩn
1.2.2.1. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn
Tuỳ loại môi trờng mà xạ khuẩn có hình thái khác nhau. Trên môi

trờng đặc, xạ khuẩn phát triển thành những khuẩn lạc. Tuỳ theo loài, môi
trờng nuôi cấy mà kích thớc màu sắc khuẩn lạc có thể khác nhau nh: đỏ,
da cam, vàng, nâu, tím, hồng, xám Khuẩn lạc xạ khuẩn thờng chắc, xù xì,
có dạng da, dạng nhung tơ, hay dạng màng dẻo và thờng có cấu trúc ba lớp:
lớp ngoài có cấu trúc các sợi bền chặt, lớp giữa có cấu trúc tổ ong và lớp trong
có cấu trúc tơng đối xốp. Cấu trúc khuẩn lạc xạ khuẩn với hớng sinh trởng
trong môi trờng tạo ra hệ sợi cơ chất (HSCC) và ngoài mặt môi trờng tạo ra
hệ sợi khí sinh (HSKS). Đờng kính hệ sợi xạ khuẩn thay đổi trong khoảng
0,2-1,0m đến 2,0-3,0m. Đa số các xạ khuẩn có hệ sợi phân nhánh mạnh,
không có vách ngăn. Màu sắc hệ sợi đa dạng, có thể gặp các màu trắng, vàng,
da cam, đỏ, nâu, lục, tím, đen HSCC có thể sinh ra các sắc tố tan trong nớc
hoặc trong các dung môi hữu cơ. HSKS ở tận cùng thờng là các chuỗi bào tử
có dạng xoắn, lợn sóng, thẳng, vòng Đây là một đặc điểm khá quan trọng
để phân loại xạ khuẩn. Các bào tử xạ khuẩn có thể có hình tròn, hình bầu dục,
hình que, hay hình trụ Cấu trúc bề mặt bào tử có thể là nhẵn (Smooth), có
gai (Spinny), khối u (Warty), nếp nhăn (Rugose) hay dạng tóc (Hair- like)
Hình dạng, kích thớc, cấu trúc bề mặt bào tử cũng là một trong những chỉ
tiêu quan trọng để định loại xạ khuẩn.

Đại học s phạm H Nội 2

5

K31B Sinh


Khoá luận tốt nghiệp đại học

Đinh Thị Mỹ ánh

Khi nuôi cấy xạ khuẩn trong môi trờng dịch thể, xạ khuẩn có thể mọc
thành dạng màng hay dạng vòng trên thành bình nuôi cấy, trên bề mặt môi
trờng hay thành dạng bọt hoặc kết tủa kiểu vi khuẩn. Khi nuôi cấy chìm trên
máy lắc hoặc nồi lên men đợc khuấy đảo thì xạ khuẩn phát triển thành dạng
sợi bông hoặc cặn xốp. Nhng thờng gặp hơn cả là xạ khuẩn phát triển thành
những quả cầu nhỏ chứa đầy môi trờng, kích thớc từ 0,1mm đến 2- 3mm.
1.2.2.2. Cấu tạo xạ khuẩn
Xạ khuẩn có cấu tạo tơng đối giống vi khuẩn gồm có thành tế bào,
màng tế bào chất, vật chất nhân sơ và các hạt dự trữ. Xạ khuẩn thuộc nhóm
VSV Gram (+). Thành tế bào dày khoảng 20nm có vai trò duy trì hình dạng hệ
sợi và bảo vệ tế bào, đợc cấu tạo chủ yếu gồm các lớp glucopeptide, các gốc
N - Acetylglucosamine liên kết với N - Acetylmuramic (hoặc N Glycolylmuramic ví dụ nh chi Micromonospora).
Căn cứ vào kết cấu hoá học có thể chia thành tế bào xạ khuẩn thành 4
nhóm sau:
Nhóm 1 (Type I): Có chứa L-Diaminopimelic (L-ADP) và glycine.
Gồm

có

các

chi

Streptomyces,

Streptoverticillium,

Chairia,

Nocardioider.

Nhóm 2 (Type II): Có chứa Meso-Diaminopimelic (Meso-ADP) và
glycine. Gồm các chi Micromospora, Actinoplans, Ampullariella,
Dactilosporangium.
Nhóm 3 (Type III): Có chứa Meso- Diaminopimelic (Meso-DAP). Gồm
có Actinomadura, Actinobigfida, Dermatophilus, Geodermatophilus,
Nocardiopsis, Micronobispora
Nhóm 4 (Type IV): Có chứa Meso-Diaminopimelic (Meso-DAP). Gồm
có

Nocardia,

Oerskovia,

Promicromonospora,

Pseudonocardia,

Rhodococcus, Mycrobacterium

Đại học s phạm H Nội 2

6

K31B Sinh


Khoá luận tốt nghiệp đại học

Đinh Thị Mỹ ánh

1.2.2.3. Đặc điểm sinh lý, sinh hoá của xạ khuẩn
Xạ khuẩn là một nhóm cơ thể dị dỡng, chúng sử dụng đờng, rợu,
axít hữu cơ, lipit, protein và nhiều hợp chất khác để làm nguồn cacbon. Còn
nitrat, nitrit, muối amon, ure, axit amin, pepton, cao men, cao thịt để làm
nguồn nitơ.

ở các loài khác nhau thì khả năng hấp thụ các hợp chất này là

khác nhau. Phần lớn xạ khuẩn là VSV hiếu khí, a ẩm, nhiệt độ thích hợp cho
sinh trởng và phát triển là 25 - 300C. Đa số xạ khuẩn phát triển tốt trong môi
trờng có pH là 6,8 - 7,0, một số ít có khả năng phát triển tốt trong môi trờng
kiềm. Xạ khuẩn là nhóm vi khuẩn Gram (+), đặc biệt khác với các sinh vật
khác của nhóm nhân sơ là có tỉ lệ G + X cao (>70%), trong khi đó vi khuẩn
khá thấp (25% - 45%). Một trong những đặc điểm đáng lu tâm của xạ khuẩn
là chúng không bền vững về mặt di truyền và thờng xảy ra sự sắp xếp lại
trong phân tử ADN. Điều này đã gây ra tính đa dạng của hình thái, tính chất
sinh lí, sinh hoá của xạ khuẩn (khả năng đồng hoá các nguồn cacbon, khả
năng đồng hoá các nguồn nitơ, hoạt tính kháng sinh, tính kháng thuốc, khả
năng phân giải cellulose).
1.2.3. Phân bố của xạ khuẩn
Xạ khuẩn là nhóm VSV phân bố rộng rãi trong tự nhiên. Xạ khuẩn có
thể phân lập từ đất, nớc, không khí, bùn, rác Đặc biệt trong đất xạ khuẩn
chiếm số lợng rất lớn (Kuster, 1986). Theo Waksman thì trong đất xạ khuẩn
chiếm 9% - 45% tổng số các VSV. Và trong 1 gam đất có chứa tới 2900024.000.000 mầm xạ khuẩn. Tuy nhiên tuỳ các vùng đất khác nhau trên thế
giới mà có sự biến đổi lớn về số lợng xạ khuẩn trong đất. Số lợng xạ khuẩn
ở miền Nam bán cầu bao giờ cũng cao hơn miền Bắc bán cầu. Ngoài ra số
lợng xạ khuẩn trong đất còn phụ thuộc vào mức độ canh tác, độ phì nhiêu
của đất, mức độ che phủ của thực vật Đất giàu dinh dỡng, hữu cơ , khoáng
thì có nhiều xạ khuẩn hơn so với đất nghèo dinh dỡng. Trong 1 gam đất canh
tác có thể phân lập đợc 5.000.000 CFU/g xạ khuẩn. Đất vùng sa mạc khô

Đại học s phạm H Nội 2

7

K31B Sinh


Khoá luận tốt nghiệp đại học

Đinh Thị Mỹ ánh

nóng, nghèo dinh dỡng có số lợng xạ khuẩn ít hơn, dao động trong khoảng
10.000 - 100.000 CFU/g.
Xạ khuẩn là nhóm VSV a trung tính hay kiềm yếu, do đó sự phân bố
của xạ khuẩn trong đất còn phụ thuộc vào độ pH của đất. ở các đất có độ pH
trung tính hoặc hơi kiềm thì có mật độ xạ khuẩn cao hơn so với các vùng đất
có độ pH quá kiềm hoặc quá axit (chua). Đồng thời số lợng xạ khuẩn còn
phụ thuộc vào các thời điểm trong năm. Do đó khi lấy mẫu đất nghiên cứu cần
phải chú ý tới các điều kiện nh thành phần lớp đất, sinh cảnh, thời điểm lấy
mẫu, độ ẩm, nhiệt độ
1.2.4. Vai trò của xạ khuẩn
Xạ khuẩn là một trong nhiều loại VSV có ý nghĩa quan trọng trong tự
nhiên bởi vai trò tích cực trong việc tham gia vào các quá trình chuyển hoá
những hợp chất trong đất, nớc. Xạ khuẩn có khả năng sinh chất kháng sinh,
có 60%-70% xạ khuẩn phân lập từ đất có khả năng này nh: Atinoplanes,
Streptoverticinnium, Streptomyces các chất kháng sinh có giá trị do chúng
sinh ra đợc sử dụng rộng rãi trong y học. Mặt khác xạ khuẩn có khả năng
phân giải cellulose trong bã thải nông nghiệp, công nghiệp thực phẩm nhằm
ứng dụng trong chế biến thức ăn gia súc, phân bón hữu cơ.

1.2.5. Phân loại xạ khuẩn
1.2.5.1. Sơ lợc lịch sử phân loại xạ khuẩn
Trớc thế kỉ XIX, ngời ta xếp xạ khuẩn vào giới nấm (Fungi). Về sau,
các nghiên cứu cho thấy chúng có nhân nguyên thuỷ, kích thớc bề ngang nhỏ
nh vi khuẩn nên ngời ta xếp vào giới vi khuẩn (Eubacteria).
Foster là ngời đầu tiên phân lập một loài xạ khuẩn từ tuyến mắt của
ngời và đợc John miêu tả năm 1874. Và đến năm 1977, Harz mô tả đầu tiên
một loài xạ khuẩn có hệ sợi rất điển hình, đựợc phân lập từ bệnh nấm sao
của trâu bò và đặt tên là Actinomyces bovis. Năm 1914, Krassinilcov lần đầu
tiên đề ra các chỉ tiêu mới trong việc phân biệt các loài khác nhau và sơ bộ

Đại học s phạm H Nội 2

8

K31B Sinh


Khoá luận tốt nghiệp đại học

Đinh Thị Mỹ ánh

phân loại 17 chủng thuộc chi Actinomyces. Ông coi các đặc điểm sinh lý là
mấu chốt trong nguyên tắc phân loại. Waksman và Curtis (1979) đã đề cập
đến các dạng trung gian trong mô tả phân loại của mình. Các ông coi đặc
điểm hình thái của bào tử là đặc tính quan trọng nhất của các cơ thể.
Năm 1926, Millard và Burr đã tìm ra 17 loài mới, Jensen (1930-1931)
tìm ra đợc 2 loài mới. Đến năm 1934, Dutche tìm ra 13 loài mới. Baldacci và
cộng sự nghiên cứu xạ khuẩn từ năm 1936-1953 công bố một khoá phân loại
chi Streptomyces dựa trên cơ sở HSKS, HSCC và một số đặc điểm trung gian

khác.
Waksman và Henrici (1953) đã đa ra một hệ thống phân loại, đến năm
1961 đợc sửa đổi lại. Trong hệ thống phân loại này, xạ khuẩn đựơc xếp thành
nhóm gồm 3 họ, chia nhỏ thành 10 chi và mô tả chi tiết hơn 250 loài thuộc chi
Streptomyces. Krassinilcov từ năm 1941-1949 đã phát hiện trên 38 loài mới.
Năm 1970, ông công bố hệ thống phân loại nấm tia mới dựa vào hệ thống
công bố năm 1949, trong đó xạ khuẩn đợc phân thành 6 họ gồm 26 chi.
Năm 1957, Gause và cộng sự đã công bố hệ thống phân loại mới. Hệ
thống phân loại mới này dựa vào màu sắc HSKS, HSCC, hình dạng màng bào
tử và cuống sinh bào tử. Hệ thống này đợc chỉnh lý và tái bản năm 1983.
Càng ngày, số lợng hệ thống phân loại xạ khuẩn càng nhiều nh hệ thống
phân loại của Prihan (1972), Nonomura (1972) và đáng chú ý hơn là hệ thống
phân loại của Goodfellow Stackebradt (1988). Và để thống nhất trong cách
mô tả, ISP (Iternational Streptomyces Project) đã nêu lên phơng pháp môi
trờng mô tả (Shirling và Gottlieb, 1966).
1.2.5.2. Một số phơng pháp cơ bản trong phân loại xạ khuẩn hiện nay
1.2.5.2.1. Dựa vào đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy
Hầu hết các chi xạ khuẩn đợc mô tả hiện nay phân chia khác nhau tuỳ
thuộc vào sự khác nhau về đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy nh: màu

Đại học s phạm H Nội 2

9

K31B Sinh


Khoá luận tốt nghiệp đại học

Đinh Thị Mỹ ánh

sắc của HSKS, HSCC và màu sắc của sắc tố tan, hình dạng cuống sinh bào tử,
hình dạng và kết cấu bề mặt bào tử
Dựa vào các đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy ngời ta chia xạ
khuẩn thành 4 nhóm chính sau:
Nhóm 1: Gồm các xạ khuẩn có bào tử rõ rệt. Đặc trng của nhóm này là
sinh sản bằng bào tử, có hệ sợi phân nhánh thành HSKS và HSCC.
Nhóm 2: Gồm các xạ khuẩn có các bào tử nang. Đặc trng của nhóm
này là hệ sợi phân chia theo hớng vuông góc với nhau tạo thành các cấu trúc
tơng tự nang bào tử.
Nhóm 3: Gồm các xạ khuẩn có dạng Nocardia. Đặc trng của nhóm
này là sinh sản bằng cách phân đốt hệ sợi.
Nhóm 4: Gồm các xạ khuẩn có dạng tơng tự Corynebacterium và dạng
hình cầu. Tế bào có hình chữ V, T hoặc dạng cầu, thờng không có hệ sợi.
Theo tài liệu của ISP đợc nêu lên bởi Shirling và Gottlieb (1968, 1969
và 1972) và trong cuốn Bergeys Manual đợc xuất bản lần thứ 8, ngời ta
chia xạ khuẩn thành 6 kiểu (Section) căn cứ vào hình dạng cuống sinh bào tử:
Section S: Type Spira = chuỗi bào tử xoắn.
Section SRA: Type Spira Retinaculum Apertum = Chuỗi bào tử xoắn
có khoá, có móc.
Section SRF: Type Spira Rectus Flexbilis = Chuỗi bào tử xoắn, cong
đến thẳng.
Section RA: Type Retinaculum Apertum = Chuỗi bào tử có móc, có
khoá.
Section RARF: Type Retinaculum Apertum Rectus Flexbilis = Chuỗi
bào tử có khoá, thẳng, lợn sóng.
Section RF : Type Rectus Flexbilis = Chuỗi bào tử thẳng đến lợn
sóng.

Đại học s phạm H Nội 2

10

K31B Sinh


Khoá luận tốt nghiệp đại học

Đinh Thị Mỹ ánh

Trớc đây, các đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy đợc coi là dữ
liệu cơ bản dùng trong phân loại xạ khuẩn nhng do chính cùng một loài có
thể biểu hiện khác nhau về mặt hình thái do biến dị tự nhiên hay những loài
khác nhau có thể giống nhau về mặt hình thái. Vì vậy ngày nay trong phân
loại xạ khuẩn phải dùng thêm các chỉ tiêu bổ sung khác nh: đặc điểm sinh lý,
sinh hoá, miễn dịch học, sinh học phân tử.
1.2.5.2.2. Đặc điểm hoá phân loại
Trong 20 năm trở lại đây việc sử dụng các thông tin về thành phần hoá
học của tế bào đã đợc ứng dụng rộng rãi để phân loại Procaryota. Hoá phân
loại chủ yếu dựa vào các đặc điểm sau:
Type thành tế bào: Dựa trên cơ sở phân tích axit amin trong thành phần
dây nối peptit, đờng trong thành tế bào hay các polysaccarit gắn vào thành tế
bào.
Type Peptidoglucan (PG).
Type phospholipit.
Trong các đặc điểm trên, type thành tế bào là đặc điểm quan trọng nhất
trong phân loại xạ khuẩn. Theo hớng phân loại sinh hoá, ngời ta chia thành
tế bào xạ khuẩn thành 4 type sau:
Type 1: Thành tế bào có LL- DAP và glixerin.
Type 2: Thành tế bào có m- DAP và glixerin.

Type 3: Thành tế bào có m- DAP.
Type 4: Thành tế bào có m- DAP, đờng arabinose, galactose.
1.2.5.2.3. Đặc điểm sinh lý, sinh hoá
Khi phân loại xạ khuẩn đến loài, ngời ta sử dụng hàng loạt các đặc
điểm sinh lý, sinh hoá nh: khả năng sử dụng nguồn C và N, nhu cầu về nhân
tố sinh trởng, khả năng sinh các enzym dezoxyribonuclease, nitrat reductase,
phosphatase, catalase, amylase, protase, cellulase; nhu cầu về oxi, pH, nhiệt
độ tối u, khả năng chịu mặn, khả năng sinh chất kháng sinh

Đại học s phạm H Nội 2

11

K31B Sinh


Khoá luận tốt nghiệp đại học

Đinh Thị Mỹ ánh

Tuy nhiên, theo Hopwood và cộng sự (1975) thì hầu hết các đặc điểm
sinh lý, sinh hoá rất dễ biến dị do mức độ ổn định di truyền không cao. Vì
vậy, ngày nay để phát hiện những loài mới trên cơ sở khác nhau về đặc điểm
sinh lý, sinh hoá, ngời ta cũng sử dụng các phơng pháp nh: phơng pháp
phân loại số dựa trên sự giống nhau giữa các VSV theo một số lớn các đặc
điểm, chủ yếu là các đặc điểm hình thái, sinh lý- hoá sinh; phơng pháp
nghiên cứu chủng loại phát sinh và phơng pháp sinh học phân tử nh lai axit
nucleic ADN và ARN, protein và đặc biệt là so sánh trình tự ARN 16S
* Phân loại số: Phơng pháp này dựa trên sự đánh giá về mức độ giống
nhau giữa VSV trong một số lớn các đặc điểm chủ yếu là đặc điểm hình thái,

sinh lý, sinh hoá để so sánh các chủng với nhau từng đôi một theo công thức
sau:
SAB= S*100/(nS +nd)
Trong đó:
SAB: Mức độ giống nhau giữa hai cá thể
nS: Tổng số các đặc điểm dơng tính của hai chủng so sánh
nd: Tổng các đặc điểm dơng tính của chủng này mà âm tính của chủng
kia
Kết quả của sự so sánh này đợc biểu hiện trên sơ đồ nhánh và tuỳ thuộc vào
mức độ giống nhau mà các VSV đợc xếp vào các nhóm.
* Nghiên cứu về phát sinh chủng loại: Nhờ sự sắp xếp phát sinh chủng
loại mà các VSV đợc xếp vào hệ thống phân loại gần nh tự nhiên hơn. Các
nghiên cứu về di truyền phân tử nhằm xây dựng cây phát sinh chủng loại bằng
cách tiến hành so sánh các cao phân tử ADN, ARN, protein mà quan trọng
hơn cả là sự sắp xếp các nucleotit của rARN 16S. Mức độ giống nhau giữa hai
cá thể so sánh thể hiện mối quan hệ giữa chúng.

Đại học s phạm H Nội 2

12

K31B Sinh


Khoá luận tốt nghiệp đại học

Đinh Thị Mỹ ánh

1.3. Cellulose và Cellulase
1.3.1. Cellulose

Cellulose là một polysaccarit mạch thẳng gồm từ 1400-12000 gốc -Dglucose liên kết với nhau bởi các liên kết -1,4-glucosit. Trong phân tử
cellulose các phân tử -D-glucose có cấu trúc không gian dạng ghế bành. Hai
phân tử khác nhau quay góc với nhau 1800. Cellulose là loại hợp chất hữu cơ
dồi dào trong tự nhiên chiếm tới 40%-50% hydratcacbon. Cellulose có cấu
trúc dạng sợi song song, dài khoảng 5m với đờng kính 3nm. Các sợi này
liên kết với nhau bởi các liên kết hydro và các liên kết Vandervan tạo thành
các bó sợi nhỏ có đờng kính 10-40nm gọi là vi sợi (microfibrin). Các vi sợi
có cấu trúc không đồng nhất tạo nên cấu trúc mixen của cellulose, cellulose
dạng mixen gồm hai vùng:
Vùng kết tinh (Crystolline regions): Có các sợi chặt chẽ, đậm đặc ngăn
cản sự hấp thụ nớc và ít chịu tác động phân giải. Vùng này chiếm 3/4
cấu trúc cellulose.
Vùng vô định hình (Amorphous regions): Có cấu trúc kém chặt chẽ, dễ
bị trơng lên và dễ bị phân giải.
Trong tự nhiên cellulose khá bền vững, không tan và bị trơng lên khi hấp thụ
nớc. Cellulose bị thuỷ phân khi đun nóng với axit hay kiềm ở nồng độ khá
cao, hoặc bị phân giải bởi các cellulose sinh ra từ nhiều loại sinh vật.

Hình 1.1. Cấu trúc không gian lập thể của cellulose

Đại học s phạm H Nội 2

13

K31B Sinh


Khoá luận tốt nghiệp đại học

Đinh Thị Mỹ ánh

1.3.2. Cellulase
Enzym cellulase xúc tác cho quá trình chuyển hoá cellulose thành các
sản phẩm hoà tan, dễ sử dụng (hấp thu). Hệ thống cellulase bao gồm 3 loại
chính sau:
Endo--glucanase

hay

1,4--D-glucan

glucan

hydrolase,

cellobiohydrolase (CBH), CMC- ase (Cx): Enzym này tấn công vào các điểm
khác nhau trên chuỗi cellulose của CMC, cellulose trơng phồng, các cellooligosaccarit. Chúng phân cắt các chuỗi cellulose một cách ngẫu nhiên, sản
phẩm tạo thành là glucose và các oligosacarit (có thể từ 3-6C hoặc nhiều hơn).
Sự phân cắt này hình thành các đầu khử tự do, tạo điều kiện cho exo glucanase
hoạt động. Bởi vậy cellulose vùng kết tinh đợc phân giải triệt để, hiệu quả.
Exo--glucanase hay 1,4--D-glucan cellobio hydrolase, Avicelase:
enzym này tấn công vào đầu không khử (non-reducing end) của cellulose và
kết quả là tạo ra các cellobiose.
-glucosidase hay cellobiose: Thuỷ phân cellobiose và một vài cellooligosaccarit thành glucose. Hoạt tính của -glucosidase mạnh nhất trên
cellobiose và giảm dần theo chiều dài của chuỗi.
1.3.3. Hệ enzym phân giải cellulose
Sở dĩ một số nhóm VSV phân giải đợc cellulose là nhờ phức hệ enzym
cellulose gồm 4 enzym khác nhau tác dụng với các mối liên kết của đại phân
tử cellulose. Đầu tiên enzym cellobiohydrolase (enzym C1) có tác dụng cắt đứt
liên kết hydro, biến cellulose tự nhiên có cấu hình không gian thành dạng

cellulose vô định hình không có cấu trúc lớp. Enzym thứ hai là endoglucanase
có khả năng cắt đứt các liên kết -1,4-glucozit tạo thành những chuỗi dài.
Enzym thứ ba là exogluconase tiến hành phân giải các chuỗi trên thành
disaccarit gọi là cellobiose. Cả hai loại enzym endoglucanase và exogluconase

Đại học s phạm H Nội 2

14

K31B Sinh


Khoá luận tốt nghiệp đại học

Đinh Thị Mỹ ánh

gọi chung là Cx. Enzym thứ t là -glucosidase tiến hành thuỷ phân cellobiose
thành glucose.

Cellulose
tự nhiên

C1

Cellulose
vô định

Đại học s phạm H Nội 2

Cx

15

Cellobiose

-1,4glucozit

Glucose

K31B Sinh


Khoá luận tốt nghiệp đại học

Đinh Thị Mỹ ánh
Chơng 2

vật liệu v phơng pháp
2.1. Vật liệu
2.1.1. Nguyên liệu
Các mẫu đất lấy từ đất đồi Đại Lải thuộc phờng Đồng Xuân- thị xã
Phúc Yên- tỉnh Vĩnh Phúc.
2.1.2. Hoá chất
Các hoá chất: KH2P04, MgSO4. 7H20, NH4Cl, KN03, NaN03, (NH4)2SO4,
NH4NO3, NaCl, NaOH, HCl, FeSO4. 7H20, CaC03
Tinh bột tan, cao nấm men, pepton, thạch, cazein, CMC (Cacboxyl
Methyl Cellulose), cao thịt
2.1.3. Dụng cụ và thiết bị nghiên cứu
- Dụng cụ: Đĩa petri, ống nghiệm, bàn trang, pipet, đèn cồn, bình tam giác,
giá đựng ống nghiệm.

- Thiết bị: Tủ ấm vi sinh (Heraeus- Đức), tủ sấy (Heraeus- Đức), nồi hấp
(TOMY- Nhật), cân Sartorius, tủ cấy vô trùng, tủ lạnh, máy đo pH hãng
Horiba.
2.1.4. Môi trờng phân lập xạ khuẩn
- MT Czapeck-tinh bột:
Tinh bột tan

: 20g

CaCO3

KCl

: 0,5g

FeSO4.7H2O : 0,01g

MgSO4.7H2O

: 0,5g

Thạch aga

: 20g

NaNO3

: 3g

Nớc cất

: 1 lít

K2HPO4

: 1g

pH

: 7,0

Glucose

: 30g

FeSO4.7H2O

: 0,01g

KCl

: 0,5g

Thạch aga

: 20g

CaCO3

: 3g

Nớc cất

: 1lít

: 3g

- MT Czapeck-glucose:

Đại học s phạm H Nội 2

16

K31B Sinh


Khoá luận tốt nghiệp đại học

Đinh Thị Mỹ ánh

MgSO4.7H2O

: 0,5g

NaNO3

: 3g

K2HPO4

: 1g

pH

: 6,8

- MT Czapeck (nguyên gốc)
Sacarose

: 30g

KCl

: 0,5g

FeSO4

: 0,01g

NaNO3

: 3g

K2HPO4

: 1g

Nớc cất

: 1000ml

MgSO4.7H2O

: 0,5g

Thạch aga

: 20g

pH

: 7,2-7,4

- MT Gause I
Tinh bột tan

: 20g

NaCl

: 0,5g

KNO3

: 0,1g

FeSO4

: 0,01g

K2HPO4

: 0,5g

Thạch aga

: 20g

MgSO4.7H2O

: 0,05g

Nớc cất

: 1000ml

pH

: 7,4

* MT nuôi cấy để kiểm tra xạ khuẩn có khả năng phân giải cellulose
- Môi trờng 1:
Pepton

: 5g

Nớc cất

: 1000ml

Cao thịt bò : 3g

pH

: 6,8-7,0

NaCl

: 5g

Thạch aga

: 20g

Glucoza

: 1g

Nớc chiết đất : 100ml

K2HPO4

: 0,5g

Nớc cất

: 900ml

Thạch aga

: 20g

pH

: 6,5- 7,0

- Môi trờng 2:

Chuẩn bị nớc chiết đất:
1kg đất+ 1 lít nớc sạch
Hấp khử trùng 30 phút trong nồi hấp
Bổ sung thêm 1g CaCO3 rồi lọc lấy nớc trong

Đại học s phạm H Nội 2

17

K31B Sinh


Khoá luận tốt nghiệp đại học

Đinh Thị Mỹ ánh

2.2. Phơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Phơng pháp lấy mẫu (Nguyễn Thành Đạt 1990)
Trên mỗi loại đất dùng dụng cụ lấy đất ở các độ sâu theo thứ tự 5cm,
10cm, 20cm. Sau mỗi lần lấy một mẫu đất thì lấy khoảng 100g cho vào túi
nilon, trên túi có ghi độ sâu lấy mẫu sau đó buộc túi lại để tránh bay hơi nớc
và tránh các VSV lạ xâm nhập vào. Các mẫu đất lấy ở một địa điểm cho chung

vào 1 túi, có ghi đầy đủ ngày lấy mẫu nơi lấy mẫu, loại đất, đặc điểm sinh
cảnh. Mẫu sau khi đợc thu thập cần phải tiến hành phân lập ngay. Nếu cha
phân lập đợc thì phải bảo quản mẫu trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4-50C.
2.2.2. Xác định độ ẩm của đất
Đất thu đợc cho vào túi nilon buộc chặt đem về phòng thí nghiệm cân,
sau đó cho vào tủ sấy, sấy ở 1050C đến khô kiệt nớc. Độ ẩm tuyệt đối của đất
đợc tính theo công thức:
a
W % = 100%
b

Trong đó:
W%: Độ ẩm tuyệt đối.
a: Khối lợng nớc
b: Khối lợng đất khô tuyệt đối
2.2.3. Xác định pH của đất
* Nguyên tắc
Dùng một muối trung tính dễ phân li (ví dụ KCl để trao đổi với ion H+
bám trên keo đất theo phơng trình phản ứng:
2H+
+ nKCl (PHHP)nK+ + CaCl2 + MgCl2 + AlCl3 + 2HCl + (n-9) Cl-

Al3+
Mg2+
Ca2+

Sau đó xác định ion H+ bằng phơng pháp đo độ pH bằng máy.

Đại học s phạm H Nội 2

18

K31B Sinh


Khoá luận tốt nghiệp đại học

Đinh Thị Mỹ ánh

* Cách tiến hành: Cân 10g đất khô trong không khí, cho vào bình tam
giác có dung tích 250ml, rót thêm vào đó 50ml dung dịch KCl 1N, lắc đều
trong 30 phút. Để yên cho lắng trong, lọc gạn trên giấy lọc xếp nếp. Lấy phần
nớc trong đem đo pH trên máy đo hãng Horiba (độ chính xác đến 0,01).
2.2.4. Chuẩn bị môi trờng phân lập và bảo quản
Đầu tiên, bao gói các dụng cụ thí nghiệm đã đợc rửa sạch và làm khô.
Tiến hành khử trùng bằng nồi hấp (ở áp suất 0,8-1atm trong thời gian 3045 phút) rồi đa sang tủ sấy. Cùng với thời gian đó tiến hành cân các hợp chất
để làm môi trờng, chọn môi trờng Czapeck-tinh bột, bình đựng môi trờng
phải đảm bảo đã đợc rửa sạch và khử trùng trớc đó, độ cao của môi trờng
trong bình chỉ chiếm 2/3, sau đó nút bông và bao miệng bình. Tiếp theo cho
bình đựng môi trờng vào nồi hấp, khử trùng theo phơng pháp Pasteur. Giấy
lọc đợc cắt tròn có diện tích bằng diện tích đáy hộp petri, rồi cho vào hộp
lồng bao gói cẩn thận đem khử trùng cùng với các dụng cụ thí nghiệm. Tất cả
các dụng cụ thí nghiệm và môi trờng hấp, sấy liên tiếp trong 3 ngày:
Ngày 1: Để tiêu diệt VSV
Ngày 2: Để tiêu diệt các bào tử
Ngày 3: Đảm bảo điều kiện vô trùng
Môi trờng sau khi khử trùng đổ ngay ra hộp petri đã khử trùng, bề dày
của môi trờng trong mỗi hộp petri khoảng 3- 4mm là đủ. Sau khi đông, trên
bề mặt thạch thờng có một số giọt nớc cần tiến hành sấy khô bề mặt thạch
trớc khi cấy bằng cách: Cho nhiệt độ tủ sấy lên cao để khử trùng tủ, sau đó

hạ xuống đến 800C thì đa các đĩa thạch vào, úp ngợc hộp petri lại rồi ghếch
đáy hộp kênh trên thành của nắp hộp để dễ thoát hơi nớc và tránh bụi rơi vào
bề mặt thạch. Tắt tủ ấm và đợi cho khi nào nhiệt độ tủ hạ xuống nhiệt độ
phòng thì đậy từng hộp petri lại và lấy ra. Cũng có thể sấy khô mặt thạch ở
nhiệt độ 60-700C trong vòng 15 phút.

Đại học s phạm H Nội 2

19

K31B Sinh


Khoá luận tốt nghiệp đại học

Đinh Thị Mỹ ánh

Để có môi trờng giữ giống trong ống thạch nghiêng ta rót 3- 4 ml môi
trờng vào mỗi ống nghiệm, đậy nút bông và khử trùng nh phơng pháp nêu
trên. Sau khi khử trùng xong đặt nghiêng ống nghiệm đựng môi trờng khi
đang còn nóng.
2.2.5. Phơng pháp phân lập xạ khuẩn từ mẫu đất
Mỗi mẫu đất cân lấy 10g cho vào cối sứ nghiền kĩ, trộn đều. Sau đó cho
vào bình tam giác vô trùng có dung tích 500ml chứa sẵn 100ml nớc cất vô
trùng, lắc đều trong 10-15 phút để lắng. Dùng pipet hút lấy 100ml dung dịch
đất này cho sang ống nghiệm có chứa sẵn 9ml nớc cất đã khử trùng, lắc trộn
đều, lúc này ta có dịch đất với độ pha loãng 10-2. Lại lấy tiếp 1ml dịch pha
loãng ở nồng độ 10-2 cho sang ống nghiệm chứa 9ml nớc cất đã vô trùng thu
đợc dung dịch pha loãng có nồng độ 10-3. Cứ tiếp tục nh vậy với những ống
nghiệm tiếp theo ta có dung dịch đất với độ pha loãng 10-4, 10-5, 10-6... Tuỳ

theo mật độ phân bố của xạ khuẩn trong mẫu đất mà ta chọn dịch đất có độ
pha loãng thích hợp. ở đây tôi chọn dịch đất có độ pha loãng 10-5. Dùng pipet
vô trùng hút 0,5ml dung dịch đất có độ pha loãng 10-5 nhỏ lên bề mặt thạch
trong hộp petri, lấy bàn trang thuỷ tinh gạt đều giọt dịch này lên khắp bề mặt
thạch. Sau đó đặt một miếng giấy lọc đã vô trùng lên trên và dùng bàn trang
thuỷ tinh vô trùng làm cho giấy lọc dính sát vào bề mặt thạch. Với độ sâu
5cm, 10cm, 20cm, ở mỗi độ sâu tiến hành cấy vào 5 đĩa petri nh vậy có 15
đĩa petri. Sau đó dùng giấy báo gói các hộp petri, đánh dấu và đa vào giữ
trong tủ ấm ở nhiệt độ 28-300C. Sau 7 ngày mang các hộp petri ra qua sát
khuẩn lạc trên môi trờng thạch. Ta có thể thấy những chỗ xuất hiện khuẩn
lạc giấy lọc bị bào mòn, nhìn thấy cả sợi giấy. Đếm số lợng các khuẩn lạc xạ
khuẩn mọc trên khoang giấy lọc.
* Cách đếm khuẩn lạc
Dùng bút chì chia đáy hộp thành nhiều phần sau đó lần lợt đếm số
lợng khuẩn lạc theo từng phần nhỏ. Cũng có thể dùng những thiết bị đặc biệt

Đại học s phạm H Nội 2

20

K31B Sinh


Khoá luận tốt nghiệp đại học

Đinh Thị Mỹ ánh

để đếm số lợng khuẩn lạc một cách thuận lợi hơn. Các thiết bị này có thể chỉ
là một bản gỗ chia ra thành nhiều ô nhỏ có thể lắp một kính lúp phía trên,
cũng có thể lắp một bút điện hoặc máy bấm đặc biệt giúp cho việc ghi một

cách tự động. Số lợng xạ khuẩn trong 1g đất khô đợc tính theo công thức:
X =

a.b
c.d

Trong đó :
X : Số lợng xạ khuẩn trung bình trong 1g đất đó
a : Số lợng khuẩn lạc trung bình trên một hộp petri
b : Độ pha loãng của dung dịch đất phân lập
c : Số ml dịch đất phân lập trên một hộp petri
d : Số gam đất khô từ một gam mẫu đất phân lập
Cấy truyền những khuẩn lạc xạ khuẩn mọc riêng biệt không bị nhiễm
sang các ống thạch nghiêng có chứa môi trờng Czapeck- tinh bột. Các giống
này đợc gói lại bằng giấy báo và đợc đa vào tủ ấm và giữ ở nhiệt độ 28300C. Sau 5-7 ngày mang ra kiểm tra lại, nếu thấy ống nghiệm nào không mọc
hoặc bị nhiễm thì loại bỏ hay cấy truyền lại để cuối cùng ta đợc các ống
nghiệm có các chủng xạ khuẩn thuần chủng.
2.2.6. Phơng pháp bảo quản và sử dụng giống (Nguyễn Thành Đạt, 1974)
Dùng que cấy vô trùng tách xạ khuẩn từ các khuẩn lạc riêng rẽ sang các
ống môi trờng thạch nghiêng Gause I đã chuẩn bị sẵn. Sau 7-14 ngày nuôi
cấy, lấy ra kiểm tra và loại bỏ những ống nhiễm sau khi đã tách loại xạ khuẩn
sang các ống khác, cuối cùng thu đợc các ống giống thuần. Các ống giống
thuần đợc bảo quản ở tủ lạnh 2- 40C. Cấy truyền định kỳ 1 tháng một lần.
Trớc khi tiến hành nghiên cứu các đặc điểm sinh lý- hoá sinh cần phải hoạt
hoá các chủng xạ khuẩn và cấy truyền giữ giống.

Đại học s phạm H Nội 2

21

K31B Sinh


Khoá luận tốt nghiệp đại học

Đinh Thị Mỹ ánh

2.2.7. Phơng pháp xử lý số liệu bằng thống kê toán học
Tính giá trị trung bình
n

X=M=
i =1

Xi
n

Trong đó:
M: Giá trị trung bình tổng thể
Xi: Giá trị của mỗi kết quả thí nghiệm từ 1 n
n: Số lần thí nghiệm
2.2.8. Phơng pháp quan sát hình thái xạ khuẩn (Krassinicov 1970, Gause
1983, Waksman 1961)
2.2.8.1. Phơng pháp xẻ rnh thạch
Cấy xạ khuẩn lên môi trờng dinh dỡng trong hộp petri bằng cách trải
dày bằng que trang. Dùng dao vô trùng xẻ một rãnh thạch trong hộp petri. Đặt
một hoặc hai lá kính vô trùng lên bờ của rãnh thạch vừa xẻ, đậy nắp hộp petri
để vào tủ ấm 280-300C trong 7-14 ngày. Lấy ra quan sát và chụp ảnh cuống
sinh bào tử, hệ sợi dới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400-1000 lần.
2.2.8.2. Phơng pháp khối thạch

Đổ môi trờng Gause I vô trùng vào hộp petri sao cho thành một lớp
mỏng (1-1,5mm). Đổ khô môi trờng, dùng khoan nút chai ( = 0,9mm)
khoan các khối thạch. Đặt các khối thạch lên lam kính vô trùng đã chuẩn bị
sẵn, đặt trong hộp petri vô trùng (trong mỗi hộp petri có một cục bông ẩm).
Cấy xạ khuẩn lên khối thạch. Đặt vào tủ ấm 280-300C trong 7-14 ngày. Quan
sát hệ sợi và cuống sinh bào tử dới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại
400-1000 lần.
2.2.9. Quan sát đặc điểm khuẩn lạc
Nuôi cấy xạ khuẩn trên môi trờng Gause I thạch đĩa hoặc thạch
nghiêng. Quan sát hình thái và mô tả màu sắc khuẩn lạc xạ khuẩn theo thang
màu chuẩn của Bondarsev (1954), qua đó sơ bộ phân nhóm xạ khuẩn.

Đại học s phạm H Nội 2

22

K31B Sinh


Khoá luận tốt nghiệp đại học

Đinh Thị Mỹ ánh

2.2.10. Xác định hoạt tính enzym cellulase
Cấy chấm điểm xạ khuẩn trên môi trờng thạch đĩa có các cơ chất
tơng ứng. Sau 7 ngày thử hoạt tính enzim bằng thuốc thử đặc trng và đo
vòng phân giải (D-d, mm) với D: Vòng phân giải cơ chất, d: Đờng kính xạ
khuẩn. Xác định hoạt tính enzim cellulose bằng môi trờng chứa 0,5% bột
giấy và CMC, thử bằng thuốc thử lugol.

Đại học s phạm H Nội 2

23

K31B Sinh


Khoá luận tốt nghiệp đại học

Đinh Thị Mỹ ánh
Chơng 3

Kết quả v thảo luận
3.1. Kết quả phân lập xạ khuẩn
Theo phơng pháp lấy mẫu nh trên tôi đã thu thập đợc 3 mẫu đất ở 3 độ
sâu khác nhau trong khu vực đất đồi Đại Lải:
1. Độ sâu 5cm
1. Độ sâu 10cm
2. Độ sâu 20cm
Sau khi thu mẫu tôi đã tiến hành xác định độ ẩm, độ pH của các mẫu
đất phân lập xạ khuẩn (theo phơng pháp của Nguyễn Lân Dũng) tại phòng thí
nghiệm vi sinh, khoa sinh- KTNN trờng ĐHSP Hà Nội 2. Căn cứ vào mật độ
xạ khuẩn trong các mẫu, tôi chọn dịch đất có độ pha loãng 10-5 của các mẫu
đất để phân lập, mỗi mẫu đất đợc phân lập trên 5 hộp petri. Sau 5- 7 ngày lấy
ra quan sát những khuẩn lạc mọc đợc trên giấy lọc tức có khả năng phân giải
cellulose vì giấy lọc có cấu tạo từ cellulose, các VSV này đã tiết ra hệ enzym
cellulose để đồng hoá nên phát triển đợc trên giấy lọc.
Theo lý thuyết, trên môi trờng Czapeck, cả xạ khuẩn, nấm mốc và một
số vi khuẩn đều mọc. Nguyên nhân là các loại VSV này đều có khả năng phân
giải cellulose. Nhng có thể phân biệt rõ ràng các khuẩn lạc này: khuẩn lạc vi

khuẩn thờng nhày, ớt và nhẵn; khuẩn lạc xạ khuẩn thì bông, xốp, khô, rắn
chắc, xù xì, dạng da, dạng nhung, dạng phấn, trờng hợp không có sợi khí
sinh khuẩn lạc có dạng màng dẻo; khuẩn lạc của nấm mốc cũng có nhiều màu
sắc nh màu sắc khuẩn lạc của xạ khuẩn nhng khác ở chỗ nó phát triển
nhanh hơn thờng to hơn khuẩn lạc xạ khuẩn nhiều lần, dạng xốp hơn do kích
thớc sợi nấm to hơn. Thờng thì mỗi khuẩn lạc sau 3 ngày phát triển có kích
thớc 5-10mm, trong khi đó khuẩn lạc xạ khuẩn chỉ khoảng 0,5-2mm.

Đại học s phạm H Nội 2

24

K31B Sinh


Khoá luận tốt nghiệp đại học

Đinh Thị Mỹ ánh

Bảng 3.1. Sự phân bố của xạ khuẩn phân giải cellulose trong đất đồi Đại Lải

Tháng

8

9

10

Số lợng khuẩn

Số lợng xạ

Số lợng

lạc trung bình

khuẩn trong

xạ khuẩn

trong 1 hộp petri

1g đất khô

trung bình

6,0

1

2,10.105

7,2

6,05

1

2,15. 105

20

7,3

6,05

1,3

2,56. 105

5

7,6

6,1

1,2

2,56. 105

10

7,7

6,08

1,2

2,60. 105

20

7,9

6,1

1,3

3,02. 105

5

8,1

6,2

1,4

3,45. 105

10

8,2

6,2

1,6

3,85. 105

20

8,3

6,2

1,8

4,26. 105

Độ

Độ

sâu

ẩm

(cm)

%

5

7,1

10

pH

2,27. 105

2,71. 105

3,85. 105

Qua kết quả phân lập xạ khuẩn phân giải cellulose trong đất đồi Đại Lải
đợc thống kê ở bảng 3.1 có thể rút ra một số nhận xét sau:
Sự phân bố của một số nhóm xạ khuẩn phân giải cellulose trong đất đồi
Đại Lải là rộng. Số lợng của các nhóm này trong 1g đất khô dao động từ
2,10.105- 4,26.105. Theo những kết quả nghiên cứu về xạ khuẩn đã đợc
khẳng định từ trớc tới nay của nhiều tác giả trong và ngoài nớc thì xạ khuẩn
là VSV hoại sinh, hiếu khí. Nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trởng và phát triển
của xạ khuẩn là 25-300C, độ ẩm thích hợp từ 40-55%, độ pH trung tính hoặc
kiềm nhẹ. Trên cơ sở này tôi phân tích lý giải sự khác nhau của mật độ xạ
khuẩn phân giải cellulose trong các mẫu đất nh sau:
Đất đồi Đại Lải là loại đất feralit đỏ vàng, bị xói mòn, rửa trôi mạnh,
kết von và trơ đá. Loại đất này rất nghèo chất dinh dỡng, ít cây cối mọc
đợc, chỉ có bạch đàn, keo lá tràm và một lớp cỏ mọc thấp, tha thớt. Đất lại

Đại học s phạm H Nội 2

25

K31B Sinh