Tuyển chon xạ khuẩn và phân tích đặc tính của hệ Enzyme amylase ngoại bào từ xạ khuẩn P3.

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1.

Phân lập và thuần khiết các chủng xạ khuẩn

Từ nhiều mẫu đất khác nhau, chúng tôi đã phân lập và thuần khiết được 20 chủng xạ
khuẩn. Các chủng này được quan sát đặc điểm hình thái trên mơi trường thạch Gause I sau
khi ủ 7 ngày ở 37C. Dựa vào sự khác nhau về hình dạng khuẩn lạc, màu sắc khuẩn ty và
sắc tố khuếch tán trên môi trường thạch nuôi cấy Gause I, các chủng xạ khuẩn phân lập
được kí hiệu lần lượt là RBXK2, RBXK3, RBXK4, RBXK5, RBXK7, RBXK8, RBXK9,
RBXK10, RBXK16, RBXK17, RBXK21, RBXK22, RBXK23, VTXK10, VTXK11,
VTXK17, VTXK19, VTXK20, VTXK21, VTXK22 và được thể hiện trong bảng 3.1 và hình
3.1.
Bảng 3.1: Đặc điểm hình thái đại thể của các chủng xạ khuẩn phân lập được trên mơi
trường Gause I.

STT

Tên xạ
khuẩn

Kích thước
khuẩn lạc
(mm)

Khuẩn ty

Khuẩn ty

sinh dưỡng

khí sinh

Sắc tố tiết

1

RBXK2

2,0a±0,16

Trắng vàng

Vàng nhạt

Khơng

2

RBXK3

4,0b±0,41

Trắng vàng

Vàng nhạt

Nâu nhạt

3

RBXK4

6,0c±0,82

Đỏ tím

Đỏ tím

Đỏ tím

4

RBXK5

1,0d±0,0

Trắng đục

Trắng đục

Khơng

5

RBXK7

3,0e±0,41

Trắng đục

Trắng đục

Khơng

6

RBXK8

0,93d±0,09

Nâu nhạt

Nâu đen

Nâu

7

RBXK9

2,0a±0,24

Nâu nhạt

Trắng ngà

Nâu nhạt

8

RBXK10

1,0d±0,0

Trắng ngà

Trắng

Không

9

RBXK16

4,0b0,82

Trắng trong

Trắng đục

Không

10

RBXK17

2,07a±0,09

Trắng trong

Vàng cam

Không

11

RBXK21

2,0a±0,82

Vàng cam

Trắng

Không

12

RBXK22

1,0d±0,0

Trắng đục

Trắng đục

Không

13

RBXK23

1,0d±0,0

Nâu nhạt

Nâu đậm

Nâu

14

VTXK10

1,0d±0,0

Cam

Trắng

Vàng nhạt

15

VTXK11

1,0d±0,0

Trắng

Trắng

Trắng

26


16

VTXK17

2,07a±0,09

Vàng nhạt

Trắng

Khơng

17

VTXK19

2,0a±0,82

Trắng vàng

Trắng

Nâu nhạt

18

VTXK20

2,0a±0,0

Vàng

Vàng nâu

Khơng

19

VTXK21

2,33f±0,85

Trắng

Trắng

Khơng

20

VTXK22

3,0e±0,82

Vàng nhạt

Trắng

Nâu vàng

Hình 3.1: Hình thái khác nhau của các chủng xạ khuẩn trên môi trường Gause I.
3.2. Tuyển chọn xạ khuẩn có khả năng sinh enzyme amylase ngoại bào
Các chủng xạ khuẩn sau khi được phân lập sẽ tiến hành khảo sát khả năng sản sinh
amylase ngoại bào dựa trên sự phân hủy cơ chất là tinh bột và được nhận diện bằng thuốc
thử lugol. Căn cứ vào vòng phân giải tinh bột và đường kính khuẩn lạc, hoạt tính amylase
của các chủng xạ khuẩn được xác định sơ bộ và thể hiện trong hình 3.2, 3.3 và bảng 3.2.
Bảng 3.2: Hoạt tính enzyme của các chủng xạ khuẩn sau 10 ngày nuôi cấy
Xạ khuẩn

Độ lớn vòng phân giải
tinh bột (mm)

RBXK2

23,0a±0,2

RBXK3

35,0b±0,2

RBXK7

17,0c±0,3

RBXK16

26,0a±0,3

RBXK17

21,0a±0,3
27


RBXK23

10,0d±0,2

VTXK10

11,0d±0,3

VTXK11

5,0e±0,1

VTXK17

4,0e±0,1

VTXK20

11,0d±0,1

Trong số 20 chủng xạ khuẩn phân lập được và được kiểm tra sơ bộ hoạt tính amylase,
10 chủng xạ khuẩn đã thể hiện khả năng phân giải tinh bột ở các mức độ mạnh yếu khác
nhau. Các chủng xạ khuẩn RBXK2, RBXK3, RBXK16, RBXK17 thể hiện hoạt tính
amylase mạnh mẽ với đường kính vịng phân giải từ 21,0±0,3 mm đến 35,0±0,2 mm, trong
đó chủng RBXK3 thể hiện hoạt tính amylase mạnh nhất với đường kính vịng phân giải lên
đến 35,0±0,2 mm. Hoạt tính amylase yếu nhất được quan sát thấy ở 2 chủng xạ khuẩn
VTXK11 và VTXK17 với đường kính vịng phân giải lần lượt là 5,0±0,1 mm và 4,0±0,1
mm. Các chủng xạ khuẩn RBXK7, RBXK23, VTXK10, VTXK20 thể hiện hoạt tính
amylase trung bình với vịng phân giải tinh bột trong khoảng 10,0±0,2 mm đến 17,0±0,3
mm. Với độ lớn vòng phân giải 4,0-35,0 mm, 10 chủng xạ khuẩn phân lập được thể hiện
khả năng sản sinh amylase ngoại bào cao hơn 8 chủng Streptomyces S1-S8 được phân lập
và chọn lọc từ biển trong nghiên cứu của Sathya Rengasamy và cộng sự (2018) với vòng
phân giải tinh bột được ghi nhận trong khoảng 4,0-20,0 mm [16], đồng thời so sánh độ lớn
vòng phân giải với chủng Streptomyces sp. SLBA-08 được chọn lọc từ 286 chủng xạ khuẩn
trong nghiên cứu của Santos và cộng sự (2012) thì chủng xạ khuẩn RBXK3 trong nghiên
cứu này có kết quả vịng phân giải tinh bột tương đương [25]. Như vậy, với sự thể hiện khả
năng sinh tổng hợp amylase cao, chủng xạ khuẩn RBXK3 được chọn làm đối tượng nghiên
cứu cho các thí nghiệm khảo sát điều kiện sinh tổng hợp amylase tiếp theo.

Hình 3.2: Khả năng sinh amylase của một số chủng xạ khuẩn phân lập được.
28


Hình 3.3: Hoạt tính amylase của các chủng xạ khuẩn dựa trên vịng phân giải tinh bột
Hình thái vi thể của các chủng xạ khuẩn cũng được tiến hành quan sát trên tiêu bản
phịng ẩm bằng kính hiển vi quang học. Kết quả quan sát cho thấy cuống sinh bào tử của các
chủng xạ khuẩn VTXK10, VTXK11, VTXK20 có dạng gấp khúc, phân nhánh trong khi
cuống sinh bào tử của các chủng xạ khuẩn RBXK2, RBXK3, RBXK7, RBXK16, VTXK17,
RBXK17, RBXK23 có dạng xoắn, với 2-5 vịng xoắn. Các chủng xạ khuẩn được tiến hành

định danh bằng phương pháp sinh học phân tử với việc giải trình tự vùng 16S rRNA. Kết
quả ban đầu xác định được chủng VTXK10 và VTXK11 có độ tương đồng cao tương ứng
với Amycolaptosis sp. CD-15 và Amycolaptosis sp. CD-17 là 99,35% và 98,28%, đồng thời
chủng RBXK3 có độ tương đồng với Streptomyces sp. với hệ số tương đồng 99%.

Hình 3.4: Hình thái vi thể của các chủng xạ khuẩn ở độ phóng đại X1000 (bar 0,02mm)
3.3 . Đặc điểm hình thái khuẩn lạc, vi thể và định danh xạ khuẩn RBXK3
Chủng xạ khuẩn RBXK3 được kiểm tra các đặc điểm đại thể về hình thái khuẩn lạc trên
môi trường Gause I sau 10 ngày nuôi ủ. Khuẩn lạc của RBXK3 trịn, có kích thước 4,0-6,0
29


mm, màu trắng vàng, bờ không đều, tâm màu vàng nhạt, khuẩn ty cơ chất bám sâu vào bề
mặt thạch, khuẩn ty khí sinh nằm sát bề mặt mơi trường (hình 3.5A). Kết quả vi thể trên tiêu
bản phịng ẩm được quan sát dưới kính hiển vi cho thấy cuống sinh bào tử của RBXK3 phân
nhánh, có dạng xoắn lị xo, với bào tử hình thành trên các cuống sinh bào tử ở dạng chuỗi
dài (hình 3.5B-C).

Hình 3.5: Hình thái đại thể và vi thể của xạ khuẩn RBXK3. (A) Hình thái khuẩn lạc trên
mơi trường Gause I sau 3 ngày ni ủ ở 37C. (B) Hình ảnh vi thể ở độ phóng đại X1000.
(C) Hình ảnh phóng đại của cuống sinh bào tử (mũi tên đen) và chuỗi bào tử (mũi tên
trắng).
Bên cạnh đó, một phần trình tự đoạn gen mã hóa cho16S-rRNA (900 bp) của xạ khuẩn
RBXK3 cũng được kiểm tra với trình tự mồi như trên và so sánh với ngân hàng dữ liệu trên
NCBI. Kết quả cho thấy gen mã hóa cho 16S-rRNA của chủng RBXK3 có sự tương đồng
với các chủng xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces. Dựa trên các kết quả thu được, cây phả hệ
của chủng xạ khuẩn RBXK3 với các loài gần được xây dựng và được xác định chủng xạ
khuẩn RBXK3 thuộc chi Streptomyces (hình 3.6).

30

Hình 3.6: Cây phả hệ thể hiện mối quan hệ di truyền (vùng vùng trình tự 16S ribosomal
RNA) giữa mẫu nghiên cứu và các taxa từ dữ liệu NCBI, được xây dựng bằng phần mềm
MrBayes theo phương pháp Bayesian với các nhánh có giá trị bootstrap > 50% được giữ lại.
3.4 . Ảnh hƣởng của nguồn cơ chất lên sự sinh tổng hợp amylase của xạ khuẩn RBXK3
Tương tự như các loại vi sinh vật khác, sự tổng hợp enzyme ngoại bào của xạ khuẩn
cũng chịu ảnh hưởng trực tiếp bởi các cơ chất tương ứng có trong mơi trường. Do đó, chúng
tơi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của các cơ chất tinh bột khác nhau (tinh bột tan, bột gạo,
bột mì, bột bắp) lên quá trình sinh tổng hợp amylase ngoại bào của xạ khuẩn RBXK3. Dịch
nuôi cấy xạ khuẩn sau mỗi 24 giờ nuôi ủ được thu nhận và kiểm tra hoạt tính amylase theo
phương pháp Bernfeld. Kết quả ảnh hưởng của các cơ chất tinh bột khác nhau theo thời gian
lên sự sinh tổng hợp amylase được trình bày ở hình 3.7.

Hình 3.7: Ảnh hưởng của các nguồn cơ chất lên sự tổng hợp amylase của xạ khuẩn
RBXK3 theo thời gian (A) và tại thời điểm 96 giờ nuôi cấy (B)
31


Kết quả cho thấy chủng xạ khuẩn RBXK3 đều có khả năng sinh tổng hợp amylase trong
môi trường Gause II với các cơ chất bổ sung là tinh bột, bột gạo, bột mì, bột bắp với các
mức độ khác nhau (hình 3.7A). Trong 48 giờ ni ủ ban đầu, RBXK3 thể hiện sự tổng hợp
enzyme không đáng kể. Sau 72 giờ nuôi ủ, cả bốn loại cơ chất đều cho thấy sự sinh tổng
hợp amylase vượt trội, nguồn cơ chất tinh bột và bột bắp cho kết quả tốt nhất với hoạt tính
là 2895 ± 56,5 U/ml và 2660 ± 97,8 U/ml, trong khi hoạt tính amylase thu được trong điều
kiện bột gạo và bột mì chỉ đạt 1221 ± 64,2 U/ml và 1683 ± 147,6 U/ml. Tuy nhiên, sau thời
gian ni ủ là 96 giờ, hoạt tính amylase trong môi trường bổ sung cơ chất là bột gạo cho kết
quả tăng cao với 3266 ± 138,1 U/ml, tương tự như hoạt tính đạt được trong mơi trường có
nguồn cơ chất tinh bột 3248 ± 91,9 U/ml, trong khi các mơi trường có cơ chất là bột mì và
bột bắp cho kết quả chỉ đạt được 2189 ± 74,2 U/ml và 1574 ± 24,3 U/ml (hình 3.7B). Sự gia

tăng thời gian ni ủ cho thấy sự giảm hoạt tính amylase của dịch ni cấy, ngồi trừ mơi
trường có nguồn cơ chất là tinh bột, nguyên nhân có thể do các nguồn cơ chất này khơng
phải là mơi trường thích hợp cho sự sinh trưởng của xạ khuẩn, do đó, sự hạn chế về mật độ
xạ khuẩn cũng sẽ hạn chế sự sinh tổng hợp enzyme của vi sinh vật này. Bên cạnh đó, kết
quả phân tích thống kê cho thấy có sự khác biệt đáng kể của nguồn cơ chất tinh bột với các
nguồn cơ chất bột bắp, bột mì và khơng có sự khác biệt đối với nguồn cơ chất bột gạo lên sự
sinh tổng hợp amylase của chủng xạ khuẩn RBXK3 sau 96 giờ nuôi ủ (ANOVA, n=3, độ tin
cậy 95%). Do đó, để ổn định q trình sinh tổng hợp enzyme, tinh bột được chọn làm cơ
chất cho các thí nghiệm khảo sát tiếp theo lên quá trình sinh tổng hợp amylase của xạ khuẩn
RBXK3 với thời gian nuôi ủ là sau 96 giờ.
3.5 . Ảnh hƣởng của nguồn nitơ lên sự sinh tổng hợp amylase của xạ khuẩn RBXK3
Bên cạnh nguồn cơ chất cacbon, nitơ là thành phần không thể thiếu trong sự sinh trưởng
và phát triển của các loại sinh vật. Sự sinh tổng hợp enzyme ngoại bào của các vi sinh vật
cũng bị ảnh hưởng bởi thành phần này. Do đó, để xác định ảnh hưởng của nitơ lên sự sinh
tổng hợp amylase của xạ khuẩn RBXK3, chúng tôi tiến hành khảo sát các nguồn nitơ khác
nhau là (NH4)2SO4, NH4NO3, NH4Cl, NaNO3, ure, cao nấm men, tryptone lên sự sản sinh
amylase ngoại bào của xạ khuẩn. Hoạt tính amylase của dịch ni cấy được kiểm tra sau
mỗi 24 giờ nuôi ủ và được thể hiện ở hình 3.8.

32


Hình 3.8: Ảnh hưởng của các nguồn nitơ lên sự tổng hợp amylase của xạ khuẩn
RBXK3 theo thời gian (A) và tại thời điểm 96 giờ ni cấy (B)
Hoạt tính amylase của chủng RBXK3 được ghi nhận cho kết quả cao nhất trong mơi
trường ni cấy có bổ sung nguồn nitơ NH4NO3 với 4161,9 U/ml ± 140,2 U/ml sau 96 giờ
lên men và duy trì hoạt tính cao nhất theo trong khoảng thời gian lên men tiếp theo đến 144
giờ (hình 3.8A). Hoạt tính amylase trong các mơi trường lên men có bổ sung (NH4)2SO4 và
ure lần lượt được ghi nhận là 3980,9 ± 185,4 U/ml và 3827,1 ± 84,1 U/ml tại thời điểm lên
men là 96 giờ và chênh lệch không đáng kể khi so sánh với môi trường lên men có chứa

NH4NO3 (ANOVA, n=3, độ tin cậy 95%). Tuy nhiên, sau thời gian tiếp tục lên men đến 144
giờ thì hoạt tính amylase giảm và cho thấy có sự ảnh hưởng của các sản phẩm trao đổi thứ
cấp trong mơi trường lên men lên hoạt tính của amylase sinh tổng hợp từ xạ khuẩn RBXK3.
Ngồi ra, hoạt tính amylase của dung dịch enzyme trong các môi trường bổ sung các nguồn
nitơ khác cũng được kiểm tra, hoạt tính thể hiện thấp hơn với các giá trị lần lượt là 3275,2 ±
267,4 U/ml, 2732,4 ± 209,3 U/ml, 3438,1 ± 140,2 U/ml, 3166,7 ± 85,3 U/ml tương ứng với
NH4Cl, NaNO3, Tryptone, cao nấm men (hình 3.8B). Sự gia tăng thời gian nuôi cấy đến 144
giờ cũng ảnh hưởng đến chất lượng của dung dịch enzyme trong các môi trường lên men
này và cho thấy hoạt tính amylase giảm mạnh so với hoạt tính được ghi nhận trước đó. Căn
cứ trên các kết quả thu nhận được, nguồn nitơ NH4NO3 được chọn bổ sung vào môi trường
sinh tổng hợp amylase của xạ khuẩn RBXK3 với thời gian lên men được xác định là sau 96
giờ.
3.6 . Ảnh hƣởng của điều kiện nhiệt độ lên sự sinh tổng hợp amylase của xạ khuẩn
RBXK3
Nhiệt độ lên men là một trong những yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme cũng như
khả năng sản sinh enzyme của các vi sinh vật, đặc biệt là xạ khuẩn. Ảnh hưởng của nhiệt độ
33


lên sự sinh tổng hợp amylase được kiểm tra trong môi trường Gause II với nguồn nitơ là
NH4NO3 tại các điều kiện nhiệt độ khác nhau (25, 30, 35, 37, 40C), 150 vịng/phút. Hoạt
tính amylase trong các dung dịch ni cấy tại các nhiệt độ khác nhau được kiểm tra tương tự
như các thí nghiệm trên sau mỗi 24 giờ cho đến khi hoạt tính khơng tăng đáng kể và kết quả
được thể hiện ở hình 3.9 bên dưới.
Chủng xạ khuẩn RBXK3 thể hiện hoạt tính khác nhau tại điều kiện nhiệt độ khác nhau
sau 144 giờ lên men (hình 3.9A), trong đó hoạt tính cao nhất là điều kiện nhiệt độ 37C với
4478,6 ± 42,0 U/ml trong khi các điều kiện nhiệt độ khác thể hiện thấp hơn tương ứng là
380,0 ± 24,3 U/ml, 633,3 ± 70,1 U/ml, 841,4 ± 64,2 U/ml, 2542,4 ± 85,3 U/ml ở các nhiệt
độ 25C, 30C, 35C, 40C. So sánh hoạt tính thể hiện theo thời gian ở các nhiệt độ khác
nhau, kết quả cho thấy khả năng sinh tổng hợp amylase của chủng xạ khuẩn RBXK3 khơng

thích hợp ở các nhiệt độ thấp như 25C, 30C trong khi nhiệt độ ấm 35C-40C thích hợp
cho sự tổng hợp amylase hơn. Điều này cũng phù hợp cho đặc tính sinh trưởng và phát triển
ưa nhiệt của các chủng xạ khuẩn.

Hình 3.9: Ảnh hưởng của điều kiện nhiệt độ khác nhau lên sự sinh tổng hợp amylase
của xạ khuẩn RBXK3 theo thời gian (A) và tại thời điểm 96 giờ nuôi cấy (B)
Tại các điều kiện 35C, 37C, 40C, sau 96 giờ lên men, hoạt tính amylase thể hiện
tương ứng là 3429,0 ± 78,0 U/ml, 3600,9 ± 28,0 U/ml, 3492,4 ± 85,3 U/ml và kết quả phân
tích thống kê cho thấy khơng có sự khác biệt đáng kể về sự sinh tổng hợp amylase ở các
điều kiện nhiệt độ này sau 96 giờ nuôi ủ (ANOVA, n=3, độ tin cậy 95%) (hình 3.9B). Tuy
nhiên, khi thời gian ni ủ tăng lên, hoạt tính amylase trong các điều kiện 35C và 40C
giảm, trong khi hoạt tính amylase tại 37C thì khơng có xu hướng giảm và tiếp tục tăng nhẹ.
Kết quả này có thể là nguyên nhân của sự giảm khả năng sinh trưởng của xạ khuẩn trong
môi trường nhiệt độ thấp, hoặc do ảnh hưởng của các chất trao đổi thứ cấp của xạ khuẩn
trong quá trình sinh trưởng hình thành. Kết quả tương tự cũng được quan sát thấy trong sự
34


sinh tổng hợp amylase của xạ khuẩn Streptomyces spp. PDS1 trong nghiên cứu của
Ragunathan và cộng sự (2013) [17]. Ngoài ra, kết quả cho thấy chủng xạ khuẩn RBXK3 này
sinh tổng hợp amylase tốt sau 96 giờ nuôi ủ tương tự như các dòng xạ khuẩn Streptomyces
S1-S8 trong nghiên cứu của Sathya Rengasamy và cộng sự (2018) [16], chủng Streptomyces
gancidius_ASD-KT852565 trong nghiên cứu của Ashwini Krishnan và cộng sự (2015) [11]
và nhanh hơn chủng Streptomyces spp. PDS1 với thời gian thích hợp là 120 giờ
(Ragunathan và cộng sự-2013) [17], trong khi chủng Streptomyces sp. D1 có thời gian lên
men tạo amylase thích hợp là 10 ngày trong nghiên cứu của Chakraborty và cộng sự (2009)
[31]. Dựa vào các kết quả thu nhận được, nhiệt độ 37C được chọn cho sự sinh tổng hợp của
amylase của xạ khuẩn RBXK3 và thời gian nuôi ủ được xác định tương tự như các kết quả
nghiên cứu trước là sau 96 giờ.
3.7. Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng lên sự sinh tổng hợp amylase của xạ khuẩn

RBXK3
Ngoài việc chịu ảnh hưởng bởi các thành phần cơ chất cacbon, nitơ, và điều kiện nhiệt
độ môi trường, sự sinh tổng hợp amylase ngoại bào của các vi sinh vật cũng bị ảnh hưởng
bởi các yếu tố pH của môi trường cấy. Để khảo sát ảnh hưởng của yếu tố pH lên sự sinh
tổng hợp amylase của xạ khuẩn RBXK3, môi trường Gause II với thành phần cơ chất tinh
bột và nguồn nitơ NH4NO3 được điều chỉnh ở các giá trị pH ban đầu khác nhau 4,0, 5,0, 6,0,
7,0, 8,0, 9,0 ± 0,1 và xạ khuẩn được nuôi cấy tại nhiệt độ 37C trong điều kiện lắc 150
vòng/phút. Dung dịch enzyme được thu nhận và kiểm tra hoạt tính sau mỗi 24 giờ ni cấy.

Hình 3.10: Ảnh hưởng của điều kiện pH khác nhau lên sự sinh tổng hợp amylase của xạ
khuẩn RBXK3 theo thời gian (A) và tại thời điểm 96 giờ nuôi cấy (B).
Kết quả thể hiện ở hình 6 cho thấy chủng xạ khuẩn RBXK3 có khả năng tổng hợp
amylase tốt nhất trong mơi trường ni cấy có giá trị pH ban đầu trong khoảng 6,0-8,0 và
35


mạnh nhất ở pH 8,0 với hoạt tính 4379,0 ± 78,0 U/ml trong khi hoạt tính ở điều kiện pH 6,0
và 7,0 là 3392,9 ± 64,2 U/ml và 3528,6 ± 24,3 U/ml sau 96 giờ nuôi ủ. Kết quả phân tích
thống kê cho thấy khơng có sự khác biệt đáng kể về sự sinh tổng hợp amylase sau 96 giờ
với 120 và 144 giờ nuôi ủ (ANOVA, n=3, độ tin cậy 95%) (hình 3.10A). Bên cạnh đó, hoạt
tính enzyme thu nhận ở các mơi trường ni cấy có điều kiện pH 4,0, 5,0 và 9,0 thể hiện
hoạt tính thấp và chỉ đạt 2099,0 ± 61,1 U/ml ở pH 4,0, 2859,0 ± 114,7 U/ml ở pH 5,0 và
1954,3 ± 121,4 U/ml trong điều kiện pH 9,0 sau 96 giờ nuôi ủ, đồng thời hoạt tính giảm
mạnh theo thời gian ni ủ và chỉ đạt dưới 1076,7 U/ml sau 144 giờ nuôi ủ (hình 3.10A).
Ngồi ra, sự giảm hoạt tính enzyme trong các điều kiện pH acid mạnh (4,0 – 5,0) hoặc pH
kiềm (9,0) do điều kiện bất lợi của môi trường ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng và phát
triển của xạ khuẩn, từ đó ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp enzyme của xạ khuẩn. Kết
quả khảo sát cho thấy sự sinh tổng hợp amylase của RBXK3 thích hợp trong điều kiện pH
trung tính, acid yếu hoặc kiềm yếu (6,0-8,0), kết quả phân tích thống kê cho thấy có sự khác
biệt đáng kể về hoạt tính amylase thu nhận tại pH 8,0 với các điều kiện pH 6,0 và 7,0 sau 96

giờ nuôi ủ (ANOVA, n=3, độ tin cậy 95%) (hình 3.10B). Như vậy, chủng xạ khuẩn RBXK3
thích hợp sinh tổng hợp amylase trong mơi trường có pH kiềm, trong khi phần lớn các
chủng xạ khuẩn được nghiên cứu trước đây thể hiện tốt điều kiện pH trung tính 7,0 như
chủng Streptomyces sp. SLBA-08, chủng Streptomyces spp. PDS1 trong các nghiên cứu
tương ứng của Santos và cộng sự (2012) [25], Ragunathan và cộng sự (2013) [17], hoặc
chủng xạ khuẩn Streptomyces gancidius_ASD-KT852565 được phân lập từ biển trong
nghiên cứu của Ashwini Krishnan và cộng sự (2015) [11]. Ngoài ra, sự sinh tổng hợp
amylase từ các chủng xạ khuẩn ưa kiềm cũng được ghi nhận trong nghiên cứu của
Chakraborty S và cộng sự (2012) [32].
3.8. Tinh sạch amylase của xạ khuẩn RBXK3
Chủng xạ khuẩn RBXK3 được ni trong mơi trường thích hợp cho sự sinh tổng hợp
amylase sau 96 giờ và tiến hành thu dịch ni cấy có chứa enzyme ngoại bào. Các tế bào xạ
khuẩn được loại bỏ bằng phương pháp ly tâm 6.000 vòng/phút tại 4°C trong 15 phút. Dung
dịch nổi được thu nhận và tiến hành tủa bằng muối (NH4)2SO4 và tinh sạch bằng sắc ký trao
đổi ion. Kết quả phân tích các giai đoạn tinh sạch amylase trên SDS-PAGE được thể hiện
trong hình 3.11. Kết quả phân tích trên SDS-PAGE cho thấy amylase của xạ khuẩn RBXK3
sau khi được tinh sạch với sắc ký trao đổi ion, phân đoạn protein thu được cho trọng lượng
36


phân tử trong khoảng 24kDa. Trọng lượng phân tử của amylase thu được tương tự như
amylase của chủng Bacillus licheniformis CUMC305 (~28kDa) trong nghiên cứu của T.
Krishnan [33] và thấp hơn amylase được thu nhận từ chủng xạ khuẩn Streptomyces sp. AlDhabi-46, Streptomyces fragilis DA7-7 và Streptomyces gulbargensis với trọng lượng phân
tử tương ứng 44kDa, 51kDa và 55kDa [23, 24, 27]. Enzyme sau tinh sạch được tiến hành
kiểm tra các đặc tính sinh hóa trong các điều kiện phản ứng khác nhau.

Hình 3.11: Kết quả tinh sạch amylase ngoại bào của xạ khuẩn RBXK3. Kết quả điện
di trên sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) 12% của
dung dịch enzyme thô (A), dung dịch sau khi tủa với (NH4)2SO4 (B) và sau khi tinh sạch với
sắc ký trao đổi ion (C). M là thang chuẩn protein.

3.9 . Ảnh hƣởng của nhiệt độ và pH lên hoạt tính amylase của xạ khuẩn RBXK3
Hoạt tính xúc tác của enzyme bị ảnh hưởng bởi các yếu tố trong mơi trường phản ứng,
trong đó nhiệt độ và pH có tác động mạnh mẽ lên cấu trúc của enzyme làm ảnh hưởng đến
hoạt tính của enzyme. Hoạt tính amylase của xạ khuẩn RBXK3 được kiểm tra trong dung
dịch phản ứng đệm phosphate 50 mM pH 7,0 tại các điều kiện nhiệt độ khác nhau 25-80°C.
Hoạt tính enzyme được xác định thông qua lượng đường khử tạo thành và thể hiện trong
hình 3.12A. Kết quả kiểm tra cho thấy enzyme thể hiện khả năng chịu nhiệt khi có hoạt tính
cao trong điều kiện phản ứng trên 40°C và tăng dần khi nhiệt độ tăng cao và đạt hoạt tính
cao nhất tại nhiệt độ 65°C (1,1x107±2,5x104 U/mg). Ngồi ra, kết quả phân tích thống kê cho
thấy sự khác biệt đáng kể giữa nhiệt độ phản ứng 65°C với các nhiệt độ phản ứng khác (ANOVA,
n=3, độ tin cậy 95%) Sự tiếp tục gia tăng nhiệt độ phản ứng làm giảm hoạt tính của enzyme,

đạt 8,5x105±1,2x104U/mg tại 70°C và 7,0x105±4,2x104/mg tại 80°C. Tuy nhiên, sự giảm
37


hoạt tính tại nhiệt độ cao 80°C tương tự trong điều kiện thí nghiệm tại 37°C đạt
7,6x105±6,7x104 U/mg. Hoạt tính enzyme thu được của amylase sau quá trình tinh sạch cho
thấy khả năng xúc tác mạnh mẽ của enzyme từ chủng xạ khuẩn RBXK3 và cao hơn 573 lần
so với amylase của xạ khuẩn Streptomyces gulbargensis trong nghiên cứu của Dastager G.
Syed và cộng sự (2009) [27]. Ngoài ra, khả năng xúc tác trong điều kiện nhiệt độ cao của
amylase này cũng được quan sát thấy trong nghiên cứu hoạt tính amylase của chủng xạ
khuẩn Streptomyces fragilis DA7-7 và Streptomyces sp. MSC702 với nhiệt độ tối thích
tương ứng tại 50°C và 60°C [19, 24], tuy nhiên, hoạt tính thu được của amylase từ RBXK3
cao hơn nhiều lần so với amylase của các chủng xạ khuẩn này.

Hình 3.12: Ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng (A) và pH phản ứng (B) lên hoạt tính
amylase ngoại bào của xạ khuẩn RBXK3.
Để kiểm tra ảnh hưởng của pH phản ứng lên hoạt tính của enzyme, dung dịch đệm
cho phản ứng được thiết kế theo các giá trị pH khác nhau 3,0 đến 10,0, tương ứng đệm

citrate (pH 3,0-6,0), đệm phosphate (6,0-8,0), đệm Tris-HCl (pH 8,0-10,0), và sử dụng
NaOH 1N để chỉnh pH phản ứng trong khoảng pH 10-12. Ảnh hưởng của điều kiện pH lên
hoạt tính enzyme được thể hiện trong hình 3.12B. Kết quả cho thấy amylase này khơng thể
hiện hoạt tính xúc tác trong điều kiện pH 3,0 và pH 4,0. Hoạt tính xúc tác thể hiện trong
điều kiện pH 5,0-10,0 và giảm trong pH 12,0. Hoạt tính enzyme thể hiện cao nhất trong
phản ứng với dung dịch đệm Tris-HCl với pH 10,0 (2,2x107±4,4x105U/mg). Như vậy,
amylase của chủng xạ khuẩn có khả năng xúc tác trong điều kiện phản ứng có pH kiềm cao,
kết quả tương tự được quan sát thấy trong nghiên cứu amylase từ chủng Streptomyces
gulbargensis của tác giả Dastager G. Syed và cộng sự với khoảng pH tối ưu 8,5-11, tuy
nhiên hoạt tính của enzyme này từ RBXK3 cao hơn 10.000 lần so với hoạt tính của amylase
từ chủng xạ khuẩn này [27]. Như vậy, enzyme ngoại bào amylase của chủng xạ khuẩn
RBXK3 đã cho thấy điều kiện phản ứng thích hợp tại 65°C và pH 10,0, thể hiện khả năng
38


xúc tác phản ứng trong môi trường cực đoan và cho thấy tiềm năng ứng dụng trong các
dung dịch tẩy rửa công nghiệp hoặc các điều kiện phản ứng ở nhiệt độ cao trong các ngành
công nghiệp khác nhau.
3.10. Độ bền nhiệt của amylase của xạ khuẩn RBXK3
Bên cạnh ảnh hưởng của yếu tố nhiệt độ và pH lên hoạt tính của enzyme, độ bền nhiệt
của enzyme trong các điều kiện nhiệt độ khác nhau cũng cần xác định để có sơ sở cho việc
bảo quản cũng như ứng dụng trong thực tế. Để kiểm tra độ bền nhiệt của enzyme, amylase
của xạ khuẩn RBXK3 được ủ trong các điều kiện nhiệt độ khác nhau (25-85°C) và kiểm tra
hoạt tính trong mơi trường phản ứng thích hợp với nhiệt độ 65°C và pH 10,0. Hoạt tính
enzyme sau phản ứng được so sánh với điều kiện đối chứng enzyme được lưu tại 4°C. Kết
quả hoạt tính thu được sau phản ứng được trình bày trong hình 3.13.

Hình 3.13: Độ bền nhiệt của amylase ngoại bào từ xạ khuẩn RBXK3.
Kết quả cho thấy amylase ngoại bào của xạ khuẩn RBXK3 có khả năng bền nhiệt
trong khoảng thí nghiêm 25-85°C. Hoạt tính enzyme khi được xử lý trong môi trường nhiệt

độ cao (55-65°C) cho hiệu quả xúc tác cao nhất và đạt 130-132% khi so sánh với thí nghiệm
đối chứng. Ở điều kiện nhiệt độ xử lý 30-50°C và 70°C, hoạt tính enzyme thu được trong
khoảng 121-125% hoạt tính so với đối chứng, trong khi hoạt tính enzyme ở nhiệt độ xử lý
25°C và 75°C đạt tương ứng 111% và 116%. Khi xử lý enzyme ở nhiệt độ 80-85°C, hoạt
tính enzyme giảm nhẹ và đạt 89-95% so với đối chứng. Khả năng sinh tổng hợp enzyme
chịu nhiệt của xạ khuẩn cũng được quan sát thấy trong nghiên cứu của Krishnasamy Nithya
và cộng sự (2017) với chủng xạ Streptomyces fragilis DA7-7 có sự bền nhiệt trong 40-70°C
với hoạt tính duy trì trong khoảng 90-100% [24]. Như vậy, kết quả kiểm tra độ bền nhiệt
cho thấy amylase ngoại bào của chủng xạ khuẩn RBXK3 có khả năng bền nhiệt cao, đồng
thời, việc xử lý nhiệt cũng làm tăng hoạt tính của enzyme. Khả năng bền nhiệt cũng như
39


chịu nhiệt của enzyme sẽ là yếu tố quan trọng cho việc ứng dụng enzyme trong các lĩnh vực
công nghiệp khác nhau và là cơ sở cho việc bảo quản enzyme trong thực tế.
3.11 Ảnh hƣởng của các ion kim loại lên hoạt tính amylase của xạ khuẩn RBXK3
Các ion kim loại có vai trị quan trọng trong hoạt động của enzyme, là các cofactor
thúc đẩy hoạt tính xúc tác của enzyme. Việc xác định cofactor thích hợp cho enzyme sẽ là
cơ sở để thiết lập điều kiện phản ứng enzyme hoạt động tốt nhất. Trong thí nghiệm này,
amylase của xạ khuẩn RBXK3 được kiểm tra hoạt tính trong mơi trường phản ứng có các
thành phần ion kim loại khác nhau, mẫu đối chứng được thực hiện không bổ sung ion kim
loại, tuy nhiên sau quá trình tinh sạch bằng sắc ký ion, mẫu enzyme có chứa ~1mM NaCl.
Để loại bỏ hết các ion trong mẫu, EDTA được thêm vào phản ứng với nồng độ cuối 10mM.
Hàm lượng các ion kim loại khác nhau được bổ sung vào phản ứng với nồng độ cuối là
5mM. Ảnh hưởng của ion kim loại lên hoạt tính enzyme được thể hiện trong hình 3.14.

Hình 3.14: Ảnh hưởng của các ion kim loại khác nhau lên hoạt tính của amylase
ngoại bào từ xạ khuẩn RBXK3.
Amylase của xạ khuẩn RBXK3 đã cho thấy hoạt tính xúc tác cao nhất đạt được trong
phản ứng không bổ sung thêm các ion kim loại (3,02x108U/mg). Trong môi trường khơng

có sự hiện diện của ion kim loại, hoạt tính của amylase thể hiện thấp hơn trong môi trường
chứa 5 mM các ion Na+, K+, Ca2+, Mg2+, Zn2+. Hoạt tính của enzyme khơng được quan sát
thấy trong mơi trường có sự hiện diện của các ion Mn2+ và Fe2+. Như vậy, hoạt tính của
amylase từ xạ khuẩn RBXK3 cho hoạt tính cao nhất trong mơi trường khơng bổ sung thêm
các ion kim loại, tương ứng với sự hiện diện của ~1mM Na+ trong phản ứng. Kết quả thu
40


được tương ứng với hoạt dộng của các amylase từ các chủng Streptomyces sp. Al-Dhabi-46,
Streptomyces gulbargensis [23, 27]. Sự gia tăng nồng độ ion Na+ lên 5mM đã làm giảm
hoạt tính của enzyme (1,71x108U/mg). Sự giảm hoạt tính enzyme khi môi trường chứa nồng
độ ion kim loại cao cũng được quan sát thấy trong nghiên cứu của nhóm tác giả Yasser R.
Abdel-Fattah (năm 2013) với amylase từ vi khuẩn Bacillus licheniformis AI20 [26].
3.12 Động học enzyme
Hoạt tính xúc tác của enzyme được kiểm tra thông qua việc xác định động học của
enzyme. Ái lực liên kết với cơ chất và khả năng phân giải cơ chất được xác định theo
phương trình Mechalis-Menten bằng phần mềm Prism 3.0. Kết quả thể hiện trong hình 3.15.

Hình 3.15: Hoạt tính của amylase ngoại bào từ xạ khuẩn RBXK3 ở các nồng độ cơ
chất khác nhau.
Kết quả khảo sát ở các nồng độ cơ chất khác nhau (0-20 mg/ml), hoạt tính enzyme
tăng dần theo nồng độ cơ chất và giá trị Vmax cũng như Km đã được xác đinh với các giá trị
tương ứng Vmax = 1,38 x 109 U/mg và Km = 6,05 mg/ml. Giá trị Vmax của amylase từ
RBXK3 thể hiện cao hơn hầu hết các amylase thu nhận từ các chủng xạ khuẩn đã được
nghiên cứu trước đây như các amylase từ chủng Streptomyces fragilis DA7-7
(0,624mU/mg), chủng Streptomyces gulbargensis (1341U/mg) [24, 27]. Tuy nhiên, ái lực
liên kết cơ chất thấp hơn khi so sánh với amylase của xạ khuẩn Streptomyces gulbargensis
(Km = 5,0 mg/ml) hoặc amylase từ chủng nấm mốc Trichoderma pseudokoningii (Km = 4,0
mg/ml) [27, 34]

41


3.13. Đáng giá sơ bộ một số chỉ tiêu nƣớc thải giàu tinh bột đƣợc xử lý bằng xạ khuẩn
Từ các kết quả khảo sát sơ bộ khả năng sinh enzyme amylase, các chủng xạ khuẩn có
khả năng sinh amylase được nuôi tăng sinh trong môi trường Gause II ở nhiệt độ phòng
trong 7 ngày. Kiểm tra mật độ tế bào xạ khuẩn bằng phương pháp đếm khuẩn lạc. Dung
dịch nuôi cấy xạ khuẩn được sử dụng làm chế phẩm để ứng dụng xử lý nước thải giàu tinh
bột có mật độ 5 x 107 CFU/ml.
Mẫu nước thải giàu tinh bột được bổ sung chế phẩm xạ khuẩn theo các tỷ lệ khác nhau
(0,5%, 1,0%, 2,0%). Mẫu nước thải ban đầu không bổ sung chế phẩm xạ khuẩn được sử
dụng như nghiệm thức đối chứng. Các thử nghiệm được tiến hành ủ tại nhiệt độ phòng, lắc
150 vòng/phút trong 10 ngày. Các chỉ tiêu BOD5, COD, hàm lượng tinh bột sau xử lý, giá
trị pH được kiểm tra và được thể hiện trong bảng 3.3 và hình 3.16.
Bảng 3.3: Giá trị BOD5, COD, tinh bột, pH của nước thải giàu tinh bột sau khi được xử
lý với chế phẩm xạ khuẩn.
Hàm lượng

Tỷ lệ chế phẩm

BOD5

xạ khuẩn (%)

(mg/l)

Control

5600a±163

18720ab±216

32,3ac±2,7

3,2ad±0,6

0,5%

2150b±204

9544bb±283

22,2bc±3,1

6,0bd±0,5

1,0%

2210b±82

8640cb±283

20,7bc±3,0

6,7bd±0,7

2,0%

2010b±82

9600bb±82

19,9bc±3,2

6,9bd±0,8

COD (mg/l)

tinh bột tương

Giá trị pH

đối (mg/l)

Sau thời gian xử lý với chế phẩm xạ khuẩn, kết quả cho thấy các giá trị BOD5, COD,
tinh bột giảm mạnh. Giá trị BOD5 giảm 61,6-65,1%, giá trị COD giảm 48,7-53,8%, hàm
lượng tinh bột tương đối được cho thấy giảm 31,1-38,4% sau khi được xử lý với chế phẩm
xạ khuẩn ở các tỷ lệ khác nhau. Sự thay đổi các giá trị khơng có khác biệt nhiều khi xử lý
nước thải giàu tinh bột với tỷ lệ chế phẩm xạ khuẩn 0,5%, 1,0%, 2,0%. Các chỉ tiêu BOD5,
COD giảm đã thể hiện các nhu cầu oxy sinh học và oxy hóa học cần thiết để oxy hóa lượng
chất hữu cơ hòa tan trong nước thải giàu tinh bột giảm, điều này cho thấy chế phẩm xạ
khuẩn có hoạt tính amylase cao đã tham gia mạnh mẽ vào việc chuyển hóa các chất hữu cơ
có trong nước thải này, tương tự như trong nghiên cứu sử dụng các chủng xạ khuẩn
Streptomyces indiaensis ACT 7 và Streptomyces hygroscopicus ACT 14 để xử lý nước thải
từ nhà máy sữa với việc giảm các giá trị BOD5 và COD tương ứng là 56,37-59,95% và
42


51,53% 55,32% sau 10 ngày xử lý [35] và thấp hơn trong nghiên cứu xử lý nước thải bằng
xạ khuẩn của Wael N. Hozzein và cộng sự (2012) với việc giảm các giá trị BOD5 và COD

tương ứng là 68,1-95,4% và 47,7-84,7% [36], cũng như trong nghiên cứu của More và cộng
sự (2001) với sự giảm COD 70-80% [37]. Ngoài ra, giá trị pH của nước thải ban đầu từ 3,2
đã dần điều chỉnh và tăng về mức acid yếu (pH 6,0) và gần trung tính (pH 6,9) khi được xử
lý với các tỷ lệ chế phẩm xạ khuẩn khác nhau. Sự điều chỉnh giá trị pH về mức cần bằng
cũng được ghi nhận trong nghiên cứu sử dụng chủng xạ khuẩn để xử lý nước thải của
Amany G. Madkour và cộng sự (2019) với giá trị pH được điều chỉnh từ pH 9,32 thành pH
8,283 [38]. Bên cạnh đó, kết quả hàm lượng tinh bột tương đối trong nước thải giảm cũng
chứng minh được khả năng chuyển hóa hợp chất hữu cơ này để phục vụ cho sự sinh trưởng
và phát triển của xạ khuẩn, giảm thiểu các chất hữu cơ gây ơ nhiễm trong nước thải. Ngồi
ra, kết quả phân tích thống kê cho thấy khơng có sự khác biệt đáng kể giữa các nghiệm thức
bổ sung tỉ lệ chế phẩm xạ khuẩn khác nhau (0,5%-2,0%) (ANOVA, n=3, độ tin cậy 95%)
lên sự thay đổi các giá trị BOD5, tinh bột và pH của nước thải sau xử lý. Do đó, với các kết
quả thu nhận được đã cho thấy hiệu quả tích cực của đối tượng vi sinh vật này trong việc xử
lý nước thải giàu tinh bột.

Hình 3.16. Các chỉ tiêu của nước thải giàu tinh bột sau khi được xử lý với chế phẩm xạ
khuẩn. (A) Chỉ tiêu BOD5 tại 20C; (B) Chỉ tiêu COD tại 20C; (C) Sự thay đổi của hàm
lượng tinh bột và (D) Sự thay đổi của giá trị pH sau khi xử lý bằng chế phẩm xạ khuẩn.
43


Ngoài ra, ảnh hưởng của nước thải giàu tinh bột được xử lý với chế phẩm xạ khuẩn lên
sự phát triển của hạt đậu xanh cũng được kiểm tra để đánh giá tác động lên sự sinh trưởng
của sinh vật. Nước thải từ nhiều nguồn khác nhau sẽ được thải ra môi trường, thấm vào đất,
mạch nước ngầm, vào các ao, hồ, sông, suối và sẽ ảnh hưởng lớn đến sự sinh trưởng và phát
triển của nhiều loài sinh vật khác. Để đánh giá hiệu quả xử lý nước thải giàu tinh bột của
chế phẩm xạ khuẩn, chúng tôi tiến hành nuôi ủ các hạt đậu xanh và quan sát sự phát triển
của chúng khi được tưới bằng nước thải không xử lý, nước thải xử lý với các tỷ lệ chế phẩm
xạ khuẩn khác nhau 0,5%, 1,0%, 2,0%, mẫu được tưới bằng nước cất là nghiệm thức đối
chứng dương. Sau 3 ngày nuôi ủ, kết quả phát triển của các hạt đậu xanh được quan sát thấy

như được thể hiện ở hình 3.17.

Hình 3.17: Đặc điểm phát triển của hạt đậu xanh được tưới bằng nước thải sản xuất bún
sau khi xử lý với chế phẩm xạ khuẩn.
Kết quả quan sát sự phát triển của những hạt đậu xanh được tưới với nước thải xử lý chế
phẩm xạ khuẩn cho kết quả tốt hơn một cách rõ rệt khi không xử lý với xạ khuẩn. Sự phát
triển của các hạt đậu xanh khi được tưới với nước thải không xử lý với chế phẩm xạ khuẩn
với thân ngắn, cong, rễ ngắn, phần lớn lá mầm bị nhiễm khuẩn, thối nhũn. Quan sát sự phát
triển của các hạt đậu xanh khi được tưới với nước thải xử lý với chế phẩm xạ khuẩn ở tỷ lệ
1,0% và 2,0% cho thấy thân cây dài xấp xỉ mẫu đối chứng (75%-100% chiều dài thân so với
đối chứng), sự nhiễm khuẩn và thối nhũn trên bề mặt lá mầm giảm đáng kể với số lượng và
diện tích thối nhũn trên bề mặt giảm (1 cây/13 cây bị thối nhũn). Mặc dù sự phát triển của
các hạt đậu xanh khơng hồn tồn tương tự như đối chứng nhưng kết quả xác nhận được
hiệu quả xử lý nước thải giàu tinh bột của chế phẩm xạ khuẩn. Việc sản sinh ra các chất trao
đổi thứ cấp có khả năng ức chế sự phát triển vi khuẩn của xạ khuẩn đã được quan sát thấy
trong nhiều nghiên cứu khác nhau, cũng như ứng dụng sản xuất kháng sinh từ xạ khuẩn, do
đó sự giảm thiểu các hiện tượng nhiễm khuẩn cũng như sự thối nhũn trên bề mặt của lá

44