Phân lập và tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn có khả năng sinh tổng hợp enzyme ngoại bào và đối kháng vi sinh vật 2

CHƯƠNG 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Vật liệu
2.1.1 Đối tượng nghiên cứu
Xạ khuẩn có khả năng sinh tổng hợp amylase, cellulase, protease ngoại bào cũng như có
hoạt tính kháng khuẩn và kháng mốc được phân lập từ các mẫu đất thuộc xã Nhuận Phú
Tân, huyện Mỏ Cày, tỉnh Bến Tre và xã Long Hiệp, huyện Bến Lức, tỉnh Long An.
2.1.2 Hóa chất
STT

Mơi trường

Thành phần (g/l)
20g Starch; 0,5g MgSO4.7H2O; 0,5g KH2PO4; 1g

1

Gause I agar KNO3; 0,5g NaCl; 0,01g FeSO4; 20g Agar, nước cất 1 lít;
pH 7,0-7,2.

2

Gause I
Broth

20g Starch; 0,5g MgSO4.7H2O; 0,5g KH2PO4; 1g
KNO3; 0,5g NaCl; 0,01g FeSO4; nước cất vừa đủ 1 lít;
pH 7,2-7,4.
10g CMC; 0,5g MgSO4.7H2O; 0,5g KH2PO4; 1g KNO3;

3

Gause-CMC 0,5g NaCl; 0,01g FeSO4; nước cất vừa đủ 1 lít; pH 7,27,4.

4

GauseCasein

10g Casein; 0,5g MgSO4.7H2O; 0,5g KH2PO4; 1g
KNO3; 0,5g NaCl; 0,01g FeSO4; nước cất vừa đủ 1 lít;
pH 7,2-7,4.

5

PGA

6

LB

200g khoai tây; 20g Agar; 20g Glucose; 1 lít nước cất.
10g Peptone, 10g Nacl, 5g Yeast extract, 1 lít nước cất,
pH 7,0.

35


2.1.3. Dụng cụ, thiết bị
Dụng cụ: Que cấy (trịn, móc), que trang, đèn cồn, micropipet 1000 µl, đĩa petri, đầu típ,
ống đong, erlen, bercher, ống nghiệm, giá ống nghiệm, bơng không thấm.
Thiết bị: Autoclave, Microwave, máy Vortex, Micropipette, Tủ sấy, Tủ ủ, Máy lắc, Tủ an toàn
sinh học cấp II, Máy li tâm, Máy đo pH, Cân kĩ thuật, Bếp điện từ, Kính hiển vi quang học.

2.1.4. Nguyên liệu
Các mẫu đất được lấy ở độ sâu từ 10-15 cm tại các khu vực lấy mẫu.
Các chủng vi khuẩn và nấm mốc chỉ thị được cung cấp từ phịng Cơng nghệ Vi sinh, Viện
Công nghệ Sinh học và Thực Phẩm, Trường Đại học Công nghiệp TP.HCM.
2.2 Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp lấy mẫu
Chọn điểm thu mẫu đất: các mẫu đất được lấy ở những khu vực khác nhau (đất gò cao, khu
vực có nhiều gỗ cây bị hoai mục, đất khu vực ẩm ướt, bờ ruộng, khu vực xung quanh chuồng
gà, chuồng lợn,…) thuộc 2 tỉnh Bến Tre và Long An.
Cách lấy mẫu: dùng dao lấy khoảng 10-15g đất ở độ sâu 10-15 cm ở các vị trí trên, cho
vào túi nilon đã khử trùng, buộc kín, ghi ngày và vị trí lấy mẫu. Mẫu đất được bảo quản ở
4°C, sau 2 ngày tiến hành phân lập xạ khuẩn [7], [8].
2.2.2. Phân lập xạ khuẩn từ đất
Các mẫu đất được pha lỗng thập phân đến nồng độ thích hợp (10-2, 10-3...10-6) bằng nước
cất hoặc nước muối sinh lí vơ trùng. Từ mỗi nồng độ pha lỗng, 100µl dịch mẫu đã pha
lỗng chuyển sang đĩa Petri chứa mơi trường Gause I. Dùng que trang trải đều và ủ ở nhiệt
độ phòng trong 7 ngày. Tiến hành nhận diện khuẩn lạc đặc trưng của xạ khuẩn.
Từ các khuẩn lạc đã nhận diện, tiến hành làm thuần chúng bằng cách cấy ria trên môi trường
Gause I đến khi nhận được các khuẩn lạc thuần khiết. Bảo quản giống 4 °C và giữ giống
trong glycerol 40% ở -60°C để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo [9], [10].

36


2.2.3. Quan sát đặc điểm hình thái của xạ khuẩn
Quan sát đại thể: Xạ khuẩn được cấy ria trên môi trường Gause I ở nhiệt độ phòng, quan sát
các đặc điểm về đại thể sau 4 ngày cấy: kích thước, hình dạng, đặc điểm của bề mặt, rìa, màu
sắc khuẩn lạc mặt trên, mặt dưới, sắc tố xạ khuẩn tiết ra môi trường nuôi cấy.
Quan sát vi thể: Xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi trường Gause I theo phương pháp tiêu bản
phịng ẩm. Sau 5-7 ngày ni ở nhiệt độ phòng, tiến hành quan sát đặc điểm vi thể của chúng

dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 1000 lần [11].
2.2.4. Khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzyme ngoại bào của xạ khuẩn
Nguyên tắc: nguồn cơ chất cảm ứng có trong mơi trường ni cấy sẽ bị phân giải khi có sự
hiện của enzyme thích hợp. Sau đó, nhận biết khả năng phân hủy cơ chất của enzyme bằng
thuốc thử đặc trưng. Xác định hoạt tính của enzyme thơng qua kích thước vịng phân giải
cơ chất.
Để khảo sát khả năng sinh tổng hợp amylase, cellulase ngoại bào: các chủng xạ khuẩn được
cấy chấm điểm trên môi trường Gause I có chứa các nguồn cơ chất cảm ứng tương ứng là
tinh bột và CMC (carboxy methyl cellulose). Kiểm tra hoạt tính amylase, cellulase bằng
cách nhuộm thuốc thử Lugol và đo kích thước vịng phân giải cơ chất sau 7 ngày ni ủ ở
nhiệt độ phịng [12]–[14].
Để khảo sát khả năng sinh tổng hợp protease, các chủng xạ khuẩn được cấy chấm điểm
trên mơi trường có bổ sung nguồn cơ chất cảm ứng là casein. Kiểm tra hoạt tính protease
bằng bằng TCA 10% và đo kích thước vịng phân giải cơ chất sau 7 ngày nuôi ủ ở nhiệt độ
phòng [15].
2.2.5. Sàng lọc, tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có khả năng đối kháng với vi khuẩn
gây bệnh
Các chủng xạ khuẩn và vi khuẩn được tăng sinh trên môi trường tương ứng là Gause I broth và LB
broth. Phương pháp khuếch tán đĩa thạch được sử dụng để kiểm tra khả năng kháng khuẩn của xạ
khuẩn. Cấy trải các chủng vi khuẩn vào đĩa Petri chứa môi trường LB agar và khoan giếng thạch.
Nhỏ 100µl dịch tăng sinh xạ khuẩn sau 7 ngày nuôi cấy vào các giếng thạch đã khoan. Đem các
37


đĩa đã cấy đi nuôi ủ và kiểm tra hoạt tính đối kháng của xạ khuẩn sau 24h [16].
2.2.6. Sàng lọc, tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có khả năng đối kháng với nấm mốc
gây bệnh
Từ ống thạch nghiêng, giống xạ khuẩn được cấy chuyền sang các ống nghiệm chứa 5ml
môi trường Gause I broth và nuôi lắc 150 rpm trong 7 ngày ở nhiệt độ phịng. Sau đó xác
định hoạt tính đối kháng nấm của dịch ni xạ khuẩn bằng phương pháp khuếch tán đĩa

thạch. Trên môi trường PGA, tiến hành cắt 1 cm2 mảnh thạch chứa tơ nấm và đặt vào phía
đối diện 2 lỗ thạch đã khoan. Hút 100µl dịch ni cấy xạ khuẩn nhỏ vào lỗ thạch mới khoan.
Để ở nhiệt độ phòng, sau 2 đến 3 ngày tiến hành kiểm tra kết quả dựa vào kích thước vịng
đối kháng (D-d, cm). Trong đó D là đường kính vịng đối kháng và d là đường kính lỗ thạch.
Sau đó chọn ra chủng xạ khuẩn có hoạt tính cao nhất thơng qua đường kính của vịng đối
kháng [9].
Mức độ đối kháng của xạ khuẩn với nấm bệnh được đánh giá dựa theo nghiên cứu của
Nguyễn Thới An (2014) ở mức độ kháng mạnh, kháng trung bình và kháng yếu với kính
thước vịng đối kháng lần lượt là: ≥ 20 mm, ≥ 15 mm và ≥ 10 mm [17].
2.7. Phương pháp xử lí số liệu
Sử dụng phần mềm Excel để tổng hợp tính tốn các số liệu từ kết quả thu nhận được trong
q trình thực hiện thí nghiệm.

38