Phân lập và tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn có khả năng sinh tổng hợp enzyme ngoại bào và đối kháng vi sinh vật

BỘ CÔNG THƯƠNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

VIỆN CƠNG NGHỆ SINH HỌC & THỰC PHẨM

BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC
KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI
NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG

TÊN ĐỀ TÀI

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG XẠ KHUẨN
CÓ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENZYME NGOẠI BÀO
VÀ ĐỐI KHÁNG VI SINH VẬT
Mã số đề tài: 19.2TP04SV
Chủ nhiệm đề tài: Đặng Bích Ngân
Hứa Trường Chinh
Đơn vị thực hiện: Viện Công nghệ Sinh học và Thực Phẩm

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, 2020


LỜI CẢM ƠN
Đề tài “Phân lập và tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn có khả năng sinh tổng hợp enzyme
ngoại bào và đối kháng vi sinh vật” là nội dung chúng em chọn để thực hiện đề tài nghiên
cứu cấp trường của mình. Để thực hiện tốt đề tài nghiên cứu này, chúng em xin gửi lời cảm
ơn chân thành đến Ban giám hiệu, phịng Quản lí Khoa học và Hợp tác Quốc tế trường Đại
học Công nghiệp TP.HCM đã tạo một môi trường học tập và nghiên cứu thân thiện cũng
như những hỗ trợ về mặt kinh phí để cho chúng em phát huy khả năng nghiên cứu khoa học
của mình.
Chúng em xin gửi lời cảm ơn đến Ban lãnh đạo Viện Công nghệ Sinh học và Thực phẩm

đã luôn hỗ trợ, giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi về cơ sở trang thiết bị cho chúng em trong
quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu.
Chúng em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS. Nguyễn Thị Diệu Hạnh. Cảm ơn cơ vì đã chỉ
bảo, hướng dẫn em tận tình, cung cấp cho chúng em những kiến thức sâu rộng trong suốt
quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu này.
Chúng em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS. Phạm Tấn Việt, TS. Nguyễn Ngọc Ẩn đã
ln cho em những lời khun, lời góp ý hữu ích, giúp cho chúng em tích lũy thêm nhiều
kiến thức, có cái nhìn sâu sắc hơn về các vấn đề trong nghiên cứu cũng như trong cuộc sống,
giúp chúng em hồn thành tốt nghiên cứu của mình.
Chúng em xin gửi lời cảm ơn ba mẹ vì đã ln u thương, quan tâm chăm sóc và tạo động
lực tiếp bước cho con trên đường học vấn.
Chúng em xin gửi lời cảm ơn đến các anh chị, bạn bè trong tập thể Lab vi sinh đã ủng hộ,
giúp đỡ chúng em trong suốt khoảng thời gian thực hiện đề tài nghiên cứu này.
Mặc dù đã cố gắng hoàn thành nghiên cứu trong phạm vi cho phép nhưng khả năng và kinh
nghiệm của bản thân có hạn, nên bài nghiên cứu chắc chắn sẽ không tránh khỏi những tồn
tại, hạn chế và thiếu sót. Chúng em rất mong nhận được sự thơng cảm, góp ý và tận tình chỉ
bảo của q thầy cơ và các bạn.

1


PHẦN I. THƠNG TIN CHUNG
I. Thơng tin tổng qt
1.1. Tên đề tài: Phân lập và tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn có khả năng sinh tổng
hợp enzyme ngoại bào và đối kháng vi sinh vật.
1.2. Mã số: 19.2TP04SV
1.3. Danh sách chủ trì, thành viên tham gia thực hiện đề tài
Họ và tên
TT

(học hàm, học vị)

1

TS. Nguyễn Thị Diệu Hạnh

2

Hứa Trường Chinh

3

Đặng Bích Ngân

Đơn vị cơng tác
Viện Cơng nghệ Sinh học và
Thực phẩm
ĐHSH12A, Viện Công nghệ
Sinh học và Thực phẩm
ĐHSH12A, Viện Cơng nghệ
Sinh học và Thực phẩm

1.4.

Đơn vị chủ trì: Viện Công nghệ Sinh học & Thực phẩm

1.5.

Thời gian thực hiện:

Vai trò thực hiện
đề tài
Cố vấn khoa học

Chủ nhiệm đề tài

Chủ nhiệm đề tài

1.5.1. Theo hợp đồng: từ tháng 10 năm 2019 đến tháng 3 năm 2020
1.5.2. Gia hạn (nếu có): 6 tháng
1.5.3. Thực hiện thực tế: từ tháng 10 năm 2019 đến tháng 9 năm 2020
1.6.

Những thay đổi so với thuyết minh ban đầu (nếu có): Khơng có

1.7.

Tổng kinh phí được phê duyệt của đề tài: 05 triệu đồng (số tiền bằng chữ: Năm
triệu đồng).

2


II. Kết quả nghiên cứu
1. Đặt vấn đề
Xạ khuẩn là nhóm vi khuẩn gram dương, hiếu khí, sống hoại sinh, thường có tỷ lệ GC trong
DNA cao hơn 55%. Trong chu trình sống, chúng thường sinh trưởng dưới dạng sợi khơng
có vách ngăn. Xạ khuẩn phân bố rộng rãi trong tự nhiên như đất, nước và các cơ chất hữu
cơ. Chúng được xem là sinh vật trung gian giữa nấm và vi khuẩn do vừa có đặc điểm giống
nấm, vừa giống vi khuẩn. Chúng có vai trị quan trọng trong chu trình tuần hồn vật chất

của tự nhiên, tạo độ phì nhiêu cho đất và đảm nhận nhiều chức năng trong việc làm màu
mỡ thêm cho đất, tham gia tích cực vào q trình chuyển hóa và phân giải nhiều hợp chất
hữu cơ phức tạp như là cellulose, tinh bột, lignin,… do chúng có khả năng sinh tổng hợp
nhiều loại enzyme ngoại bào như amylase, cellulase,… được ứng dụng rộng rãi trong xử lí
các chất thải cơng nghiệp có chứa hàm lượng tinh bột hay cellulose cao [1], [2].
Xạ khuẩn có khả năng sinh tổng hợp nhiều sản phẩm trao đổi chất quan trọng, đặc biệt là
các hợp chất kháng sinh. Các chất kháng sinh có nguồn gốc từ xạ khuẩn có phổ kháng khá
rộng nên được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực của đời sống như nông nghiệp, cơng
nghiệp thực phẩm, y tế,... Trong q trình trao đổi chất, xạ khuẩn có khả năng sinh ra các
hợp chất hữu cơ như các vitamin nhóm B (B1, B2, B6), một số acid hữu cơ như acid lactic,
acid acetic và nhiều acid amin như glutamic, methionin,… Một số khác cịn có khả năng
tạo thành những chất kích thích sinh trưởng của thực vật [3], [4].
Hiện tượng kháng kháng sinh và sự gia tăng các loại bệnh là mối quan tâm lớn của cộng
đồng. Việc nghiên cứu lựa chọn các tác nhân mới từ tự nhiên có khả năng đối kháng với
mầm bệnh được ưu tiên hàng đầu, trong đó xạ khuẩn là vi sinh vật tiềm năng. Xạ khuẩn là
lồi sinh vật có tính đa dạng cao, có khả năng sinh tổng hợp nhiều loại enzyme ngoại bào
và các hợp chất chuyển hóa thứ cấp đa dạng có khả năng đối kháng với nhiều mầm bệnh
khác nhau. Hiện nay, việc sử dụng các chất kháng sinh có nguồn gốc từ xạ khuẩn được ứng
dụng rộng rãi trong việc kháng khuẩn, kháng nấm, kháng khối u, kháng virus... [5], [6].
Do đó, đề tài nghiên cứu “Phân lập và tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn có khả năng sinh tổng
hợp enzyme ngoại bào và đối kháng vi sinh vật” được thực hiện với mục đích làm cơ sở đáp ứng
nhu cầu cuộc sống hiện nay.
3


2. Mục tiêu nghiên cứu
Phân lập và tuyển chọn được các chủng xạ khuẩn có hoạt tính sinh học cao (khả năng sinh
tổng hợp enzyme ngoại bào, kháng khuẩn, kháng mốc).
3. Nội dung nghiên cứu
-

Phân lập các chủng xạ khuẩn từ các nguồn khác nhau.

-

Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có hệ enzyme ngoại bào mạnh: amylase, cellulase,
protease.

-

Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn đối kháng với vi khuẩn và nấm mốc gây bệnh.

4. Phương pháp nghiên cứu
4.1. Phương pháp lấy mẫu
Chọn điểm thu mẫu đất: các mẫu đất được lấy ở những khu vực khác nhau (đất gò cao, khu
vực có nhiều gỗ cây bị hoai mục, đất khu vực ẩm ướt, bờ ruộng, khu vực xung quanh chuồng
gà, chuồng lợn,…) thuộc 2 tỉnh Bến Tre và Long An.
Cách lấy mẫu: dùng dao lấy khoảng 10-15g đất ở độ sâu 10-15 cm ở các vị trí trên, cho
vào túi nilon đã khử trùng, buộc kín, ghi ngày và vị trí lấy mẫu. Mẫu đất được bảo quản ở
4°C, sau 2 ngày tiến hành phân lập xạ khuẩn [7], [8].
4.2.

Phân lập xạ khuẩn từ đất

Các mẫu đất được pha loãng thập phân đến nồng độ thích hợp (10-2, 10-3...10-6) bằng nước
cất hoặc nước muối sinh lí vơ trùng. Từ mỗi nồng độ pha lỗng, hút 100µl dịch mẫu đã pha
lỗng chuyển sang đĩa Petri chứa môi trường Gause I. Dùng que trang trải đều và ủ ở nhiệt
độ phòng trong 7 ngày. Tiến hành nhận diện khuẩn lạc đặc trưng của xạ khuẩn.
Từ các khuẩn lạc đã nhận diện, tiến hành làm thuần chúng bằng cách cấy ria trên môi trường
Gause I, đến khi nhận được các khuẩn lạc thuần khiết. Bảo quản giống 4 °C và giữ giống

trong glycerol 40% ở -60°C để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo [9], [10].
4.3.

Quan sát đặc điểm hình thái của xạ khuẩn

Quan sát đại thể: Xạ khuẩn được cấy ria trên môi trường Gause I ở nhiệt độ phòng, quan sát
các đặc điểm về đại thể sau 4 ngày cấy: kích thước, hình dạng, đặc điểm của bề mặt, rìa, màu
4


sắc khuẩn lạc mặt trên, mặt dưới, sắc tố xạ khuẩn tiết ra môi trường nuôi cấy.
Quan sát vi thể: Xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi trường Gause I theo phương pháp tiêu bản
phịng ẩm. Sau 5-7 ngày ni ở nhiệt độ phòng, đặc điểm vi thể của xạ khuẩn được quan sát
dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 1000 lần [11].
4.4.

Khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzyme ngoại bào của xạ khuẩn

Nguyên tắc: nguồn cơ chất cảm ứng có trong mơi trường ni cấy sẽ bị phân giải khi có sự
hiện của enzyme thích hợp. Sau đó, nhận biết khả năng phân hủy cơ chất của enzyme bằng
thuốc thử đặc trưng. Xác định hoạt tính của enzyme thơng qua kích thước vịng phân giải
cơ chất.
Khảo sát khả năng sinh tổng hợp amylase, cellulase ngoại bào: các chủng xạ khuẩn được
cấy chấm điểm trên môi trường Gause I có chứa các nguồn cơ chất cảm ứng tương ứng là
tinh bột và CMC (carboxy methyl cellulose). Kiểm tra hoạt tính amylase, cellulase bằng
cách nhuộm thuốc thử Lugol và đo kích thước vịng phân giải cơ chất sau 7 ngày ni ủ ở
nhiệt độ phịng [12]–[14].
Khảo sát khả năng sinh tổng hợp protease: các chủng xạ khuẩn được cấy chấm điểm trên
mơi trường có bổ sung nguồn cơ chất cảm ứng là casein. Kiểm tra hoạt tính protease bằng
bằng TCA (Trichlo acetic acid) 10% và đo kích thước vịng phân giải cơ chất sau 7 ngày

ni ủ ở nhiệt độ phòng [15].
4.5.

Sàng lọc, tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có khả năng đối kháng với vi khuẩn

gây bệnh
Các chủng xạ khuẩn và vi khuẩn được tăng sinh trên môi trường tương ứng là Gause I broth
và LB broth. Phương pháp khuếch tán đĩa thạch được sử dụng để kiểm tra khả năng kháng
khuẩn của xạ khuẩn. Dịch nuôi cấy vi khuẩn được cấy trải vào đĩa Petri chứa môi trường
LB agar và tiến hành khoan giếng thạch. Nhỏ 100µl dịch tăng sinh xạ khuẩn sau 7 ngày
ni cấy vào các giếng thạch đã khoan. Đem các đĩa đã cấy đi ni ủ và kiểm tra hoạt tính
đối kháng của xạ khuẩn với vi khuẩn chỉ thị sau 24h [16].

5


4.6.

Sàng lọc, tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có khả năng đối kháng với nấm mốc

gây bệnh
Từ ống thạch nghiêng, giống xạ khuẩn được cấy chuyền sang các ống nghiệm chứa 5ml
môi trường Gause I broth và nuôi lắc 150 rpm trong 7 ngày ở nhiệt độ phịng. Hoạt tính đối
kháng với nấm mốc của dịch nuôi xạ khuẩn được xác định bằng phương pháp khuếch tán
đĩa thạch. Trên môi trường PGA, 1 cm2 thạch chứa tơ nấm được cắt và đặt vào phía đối
diện 2 lỗ thạch đã khoan. Hút 100µl dịch ni cấy xạ khuẩn nhỏ vào lỗ thạch. Để ở nhiệt
độ phòng, sau 2 đến 3 ngày tiến hành kiểm tra kết quả dựa vào kích thước vịng đối kháng
(D-d, mm). Trong đó D là đường kính vịng đối kháng và d là đường kính lỗ thạch [9].
Mức độ đối kháng của xạ khuẩn với nấm mốc gây bệnh được đánh giá dựa theo nghiên cứu
của Nguyễn Thới An (2014) ở mức độ kháng mạnh, kháng trung bình và kháng yếu với

kính thước vịng đối kháng lần lượt là: ≥ 20 mm, ≥ 15 mm và ≥ 10 mm [17].
4.7.

Phương pháp xử lí số liệu

Sử dụng phần mềm Excel để tổng hợp tính tốn các số liệu từ kết quả thu nhận được trong
quá trình thực hiện thí nghiệm.
5.

Tổng kết về kết quả nghiên cứu

Đề tài “Phân lập và tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn có khả năng sinh tổng hợp enzyme
ngoại bào và đối kháng vi sinh vật” đã được một số kết quả như sau:
+ 40 chủng xạ khuẩn được phân lập và làm thuần.
+ 19/40 chủng xạ khuẩn có khả năng sinh tổng hợp amylase ngoại bào, 5 chủng được ghi
nhận có hoạt tính cao.
+ 21/40 chủng xạ khuẩn được ghi nhận là có khả năng sinh tổng hợp cellulase ngoại bào, 5
chủng có hoạt tính cellulase ngoại bào mạnh.
+ 20/40 chủng xạ khuẩn được ghi nhận là có khả năng sinh tổng hợp protease ngoại bào, 5
chủng có hoạt tính protease ngoại bào mạnh.
+ 5/40 chủng xạ khuẩn có khả năng đối kháng với Bacillus subtilis, 12/40 chủng xạ khuẩn
có khả năng đối kháng với Bacillus cereus, 1/40 chủng xạ khuẩn có khả năng đối kháng với
Escherichia coli và 4/40 chủng xạ khuẩn có khả năng đối kháng với Staphylococcus aureus.
6


+ 15/40 chủng xạ khuẩn có khả năng đối kháng với Fusarium sp., 7/40 chủng xạ khuẩn có
khả năng đối kháng với Fusarium equiseti, 12/40 chủng có khả năng đối kháng với nấm
Neoscytaidium dimidiatum, 9/40 chủng xạ khuẩn có khả năng đối kháng với Aspergilus sp.,
5/40 chủng xạ khuẩn có khả năng đối kháng với Aspergilus fumigatus, 8/40 chủng xạ khuần

có khả năng đối kháng với Colletotrichum sp. và có 9/40 chủng xạ khuẩn có khả năng đối
kháng với Penicillum chermesinum.
6.

Đánh giá các kết quả đã đạt được và kết luận

Các chủng xạ khuẩn có khả năng sinh tổng hợp enzyme ngoại bào cao là cơ sở để ứng dụng
trong sản xuất enzyme thương mại có nguồn gốc từ vi sinh vật, đáp ứng được nhu cầu sử
dụng enzyme hiện nay.
Bên cạnh đó, các chủng xạ khuẩn có khả năng đối kháng với vi khuẩn và nấm mốc gây
bệnh có tiềm năng ứng dụng trong việc sản xuất các hợp chất đối kháng mới có nguồn gốc
từ tự nhiên, ứng dụng rộng rãi trong các lĩnh vực của đời sống.
7.

Tóm tắt kết quả

Tóm tắt: Xạ khuẩn thuộc nhóm vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp đa dạng các loại
enzyme ngoại bào và các hợp chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính sinh học cao. Từ các
mẫu đất thu nhận ở 2 tỉnh Bến Tre và Long An, 40 chủng xạ khuẩn đã được phân lập và làm
thuần. Hơn 50% trong số đó có khả năng sinh tổng hợp 4 loại enzyme ngoại bào: amylase,
cellulase, protease và chitinase. Dịch nuôi cấy của 17 chủng xạ khuẩn thể hiện hoạt tính đối
kháng với Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Escherichia coli và Staphylococcus. Trong khi
đó, dịch ni cấy của 22 chủng xạ khuẩn có khả năng đối kháng với 7 chủng nấm mốc kiểm
định: Fusarium oxysporum, Fusarium equiseti, Neoscytalidium dimidiatum, Aspergillus sp.,
Aspergillus fumigatus, Colletotrichum siamence và Penicillium chermesinum. Nghiên cứu
này cho thấy tiềm năng ứng dụng các hợp chất chuyển hóa từ xạ khuẩn trong sản xuất công
nghiệp, trong đối kháng với vi khuẩn gây bệnh và quản lý nấm bệnh trên cây trồng, góp
phần bảo vệ mơi trường và sức khỏe con người.
Abstract: Actinomycetes belong to a group of microorganisms that can be producing a
variety of extracellular enzymes, and secondary metabolic compounds with high biological

activity. From soil samples collected in two provinces of Ben Tre and Long An, forty strains
actinomycetes were isolated. More than 50% of them are capable of biosynthesizing of 4
7


extracellular enzymes: amylase, cellulase, protease, and chitinase. The crude extract of 17
strains actinomycetes showed antagonistic activity against Bacillus subtilis, Bacillus cereus,
Escherichia coli, and Staphylococcus. Meanwhile, the crude extract of 22 strains
actinomycetes was able to resistant to 7 tested microfungi strains: Fusarium oxysporum,
Fusarium equiseti, Neoscytalidium dimidiatum, Aspergillus sp., Aspergillus fumigatus,
Colletotrichum siamence, and Penicillium chermesinum. This study showed the potential
for the application of antibacterial metabolites in industrial production, in antagonism with
pathogenic bacteria, and managing fungi caused disease in plants, contributing to
environmental protection and health people.
8. Sản phẩm đề tài, công bố và kết quả đào tạo
Yêu cầu khoa học hoặc/và chỉ tiêu
kinh tế - kỹ thuật

Tên sản phẩm

TT

Đăng ký

+ Phân lập được 20 chủng
xạ khuẩn.

+ Đã phân lập và làm thuần
đươc 20 chủng xạ khuẩn như
đã đăng kí.

+ Thu được 5 chủng xạ
khuẩn có khả năng sinh
tổng hợp enzyme ngoại
bào cao.
1

Đạt được

+ Đã sàng lọc, tuyển chọn
đươc 5 chủng xạ khuẩn có khả
năng sinh tổng hợp ezyme
ngoại bào cao.

Giống xạ khuẩn
+ Thu được 5 chủng xạ
khuẩn có khả năng kháng
khuẩn.

+ Đã sàng lọc, tuyển chọn
được 5 chủng xạ khuẩn kháng
khuẩn mạnh.

+ Thu được 5 chủng xạ
khuẩn có khả năng kháng
mốc.

+ Đã sàng lọc, tuyển chọn
được 5 chủng xạ khuẩn kháng
mốc mạnh.

8


9. Tình hình sử dụng kinh phí
T

Nội dung chi

T
A

Chi phí trực tiếp

1

Th khốn chun mơn

2

3

Ngun liệu
+ Tinh bột
+ Khoai tây
+ Agar
+ KNO3
+ MgSO4.7H2O
+ FeSO4.7H2O
+ NaCl

+ Casein
+ CMC (Carboxymethyl cellulose)
+ TCA (Triclo acetic acid)
+ Cồn
+ Yeast extract
+ Meat extract
+ Peptone
+ Glucose
Thiết bị, dụng cụ
+ Ống nghiệm
+ Đĩa Petri
+ Bơng gịn khơng thấm / thấm
+ Curvet nhựa
+ Đầu típ xanh 1ml
+ Đầu típ vàng 0,1ml
+ Chai thủy tinh

4

Cơng tác phí

5

Dịch vụ th ngồi

6

Hội nghị, hội thảo,thù lao nghiệm thu
9

Kinh phí

Kinh phí

được duyệt

thực hiện

(triệu đồng)

(triệu đồng)

2,51

2,51

2,15

2,15

Ghi
chú


giữa kỳ
7

In ấn, Văn phịng phẩm

8

Chi phí khác

B

Chi phí gián tiếp

1

Quản lý phí

2

Chi phí điện, nước
Tổng số

0,34

0,34

5,0

5,0

10. Kiến nghị
Cần có các nghiên cứu tiếp theo để xác định môi trường lên, các điều kiện môi trường nuôi
cấy: nguồn C, N; nhiệt độ, pH,…thích hợp cho các chủng xạ khuẩn CNXK sinh tổng hợp
enzyme ngoại bào có hoạt tính sinh học cao, cũng như sinh tổng hợp được nhiều hợp chất
kháng khuẩn và nấm mốc gây bệnh.
Đánh giá sự tác động của dịch nuôi cấy xạ khuẩn lên sự nảy nầm và hệ sợi tơ của nấm mốc,

khảo sát nồng độ dịch nuôi cấy tối thiểu để ức chế sự nảy mầm của bào tử và tác động đến
sự trương phình hệ sợi tơ nấm mốc.
Tinh sạch các loại enzyme ngoại bào có hoạt tính cao từ các chủng xạ khuẩn CNXK. Xác
định mốc nhiệt độ và pH phản ứng cho amylase, cellulase, protease hoạt động mạnh nhất.
Đồng thời đánh giá khả năng bền nhiệt, bền pH, và sự tác động của ion kim loại lên hoạt
tính của các loại enzyme này.
Đánh giá khả năng bền nhiệt, bền pH và sự tác động của proteinase K lên hoạt tính đối
kháng của dịch nuôi cấy của các chủng xạ khuẩn CNXK đối với vi khuẩn và nấm mốc gây
bệnh. Tách chiết và xác định được các hợp chất có khả năng kháng khuẩn và kháng mốc.

10


11. Phụ lục sản phẩm
Phụ lục 1: Hình ảnh đại thể của 20 chủng xạ khuẩn

11


Phụ lục 2: Hình ảnh vi thể của 20 chủng xạ khuẩn

Phụ lục 3: Hình ảnh 5 chủng xạ khuẩn có khả năng sinh tổng hợp enzyme ngoại bào mạnh

12


Phụ lục 4: Hình ảnh 5 chủng xạ khuẩn có khả năng kháng khuẩn mạnh

Phụ lục 5: Hình ảnh 5 chủng xạ khuẩn có khả năng kháng nấm mốc mạnh

Tp. HCM, ngày 01 tháng 10 năm 2020
Chủ nhiệm đề tài

Phòng QLKH&HTQT

(ĐƠN VỊ)
Trưởng (đơn vị)
(Họ tên, chữ ký)

13


PHẦN II. BÁO CÁO CHI TIẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC
MỤC LỤC
CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN ........................................................................................... 17
1.1 Đặc điểm hình thái xạ khuẩn ..................................................................................... 17
1.1.1 Sợi cơ chất ............................................................................................................ 18
1.1.2 Sợi khí sinh ........................................................................................................... 18
1.1.3 Bào tử và chuỗi bào tử .......................................................................................... 19
1.2 Đặc điểm sinh lí-sinh hóa của xạ khuẩn .................................................................. 21
1.3 Vai trò và ứng dụng của xạ khuẩn ........................................................................... 21
1.4 Khả năng đối kháng của xạ khuẩn với vi khuẩn và nấm mốc gây bệnh ................. 28
1.4.1 Sự hình thành khả năng đối kháng của xạ khuẩn ................................................. 28
1.4.2 Cơ chế tác động của xạ khuẩn đối với vi khuẩn ................................................... 28
1.4.3 Cơ chế tác động của xạ khuẩn đối với nấm mốc .................................................. 30
1.5 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng các đặc tính sinh học của xạ khuẩn hiện nay..... 31
1.5.1

Xạ khuẩn sinh tổng hợp enzyme .......................................................................... 31

1.5.2 Xạ khuẩn sinh kháng sinh và hợp chất đối kháng ................................................ 32
CHƯƠNG 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................................................... 35
2.1 Vật liệu........................................................................................................................ 35
2.1.1 Đối tượng nghiên cứu .............................................................................................. 35
2.1.2 Hóa chất ................................................................................................................... 35
2.1.3 Dụng cụ, thiết bị ...................................................................................................... 36
2.1.4 Nguyên liệu.............................................................................................................. 36
2.2 Phương pháp nghiên cứu ............................................................................................ 36
2.2.1 Phương pháp lấy mẫu .............................................................................................. 36
2.2.2 Phương pháp phân lập ............................................................................................. 36
2.2.3 Phương pháp quan sát hình thái xạ khuẩn ............................................................... 37
2.2.4 Khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzyme ngoại bào của xạ khuẩn ........................ 37
2.2.5 Sàng lọc, tuyển chọn chủng xạ khuẩn đối kháng với vi khuẩn gây bệnh................ 37
2.2.6 Sàng lọc, tuyển chọn chủng xạ khuẩn đối kháng nấm mốc gây bệnh ..................... 38
2.2.7. Phương pháp xử lí số liệu ....................................................................................... 38
14


CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ..................................................................... 39
3.1 Phân lập xạ khuẩn ....................................................................................................... 39
3.2. Khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzyme ngoại bào của xạ khuẩn .......................... 41
3.2.1 Khả năng sinh tổng hợp amylase ngoại bào của xạ khuẩn ...................................... 42
3.2.2 Khả năng sinh tổng hợp cellulase ngoại bào của xạ khuẩn ..................................... 44
3.2.3 Khả năng sinh tổng hợp protease ngoại bào của xạ khuẩn ...................................... 46
3.3 Sàng lọc, tuyển chọn chủng xạ khuẩn đối kháng với vi khuẩn gây bệnh................... 48
3.4 Sàng lọc, tuyển chọn chủng xạ khuản đối kháng với nấm mốc gây bệnh .................. 51
CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................. 56
4.1 Kết luận....................................................................................................................... 56
4.2 Kiến nghị .................................................................................................................... 56
PHỤ LỤC ........................................................................................................................ 58

TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................. 62

15


DANH SÁCH HÌNH ẢNH
Hình 1.1: Mặt cắt ngang của khuẩn lạc xạ khuẩn cho thấy sợi cơ chất và sợi khí sinh
với chuỗi bào tử đính ....................................................................................................... 17
Hình 1.2: Vi thể của một số chủng xạ khuẩn được quan sát dưới kính hiển vi quang học
…………………………………………………………………………………………..18
Hình 1.3: Hình dạng bào tử ở một số chi xạ khuẩn ......................................................... 20
Hình 1.4: Đặc điểm hình thái chuỗi bào tử chi Streptomyces.......................................... 20
Hình 1.5: Các chất kháng sinh có vai trị ức chế các cấu trúc chức năng của tế bào vi khuẩn
.......................................................................................................................................... 28
Hình 3.1: Hình ảnh một số chủng xạ khuẩn được phân lập ............................................ 38
Hình 3.2: Hình ảnh vi thể của một số chủng xạ khuẩn được quan sát dưới kính hiển
vi quang học vật kính 100X ............................................................................................. 40
Hình 3.3: Khả năng sinh tổng hợp amylase ngoại bào của một số chủng xạ khuẩn sau
7 ngày nuôi cấy trên môi trường Gause I......................................................................... 43
Hình 3.4: Khả năng sinh tổng hợp cellulase ngoại bào của một số chủng xạ khuẩn sau
7 ngày ni cấy trên mơi trường Gause-CMC................................................................. 45
Hình 3.5: Khả năng sinh tổng hợp protease ngoại bào của một số chủng xạ khuẩn sau
7 ngày nuôi cấy trên môi trường Gause-Casein............................................................... 47
Hình 3.6: Khả năng đối kháng của dịch ni cấy xạ khuẩn với vi khuẩn ....................... 50
Hình 3.7: Khả năng kháng mốc của dịch nuôi cấy xạ khuẩn .......................................... 54
DANH SÁCH BẢNG BIỂU
Bảng 1.1: Sự đa dạng của các hợp chất kháng sinh được phát hiện là sản phẩm của
Streptosporangium spp. ................................................................................................... 13
Bảng 3.1: Khả năng sinh tổng hợp enzyme ngoại của xạ khuẩn ..................................... 41
Bảng 3.2: Khả năng sinh tổng hợp amylase ngoại bào của xạ khuẩn (đơn vị: mm) ....... 43

Bảng 3.3. Khả năng sinh tổng hợp cellulase ngoại bào của xạ khuẩn (đơn vị: mm) ...... 45
Bảng 3.4. Khả năng sinh tổng hợp protease ngoại bào của xạ khuẩn (đơn vị: mm) ....... 47
Bảng 3.5: Bảng tổng hợp khả năng kháng khuẩn của các chủng xạ khuẩn ..................... 49
Bảng 3.6: Bảng tổng hợp khả năng kháng mốc của các chủng xạ khuẩn ........................ 52
16


CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN
1.1. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn
Xạ khuẩn (Actinomycetes) thuộc nhóm sinh vật Gram dương, có cấu trúc tế bào điển hình
của nhóm sinh vật Prokaryote, là sinh vật hiếu khí, sống hoại sinh, phân bố rộng rãi trong
các mơi trường tự nhiên. Trong chu trình sống, xạ khuẩn thường sinh trưởng dưới dạng sợi
khơng có vách ngăn, ở đầu cuống bào tử có thể hình thành các bào tử riêng lẻ hoặc chuỗi
bào tử. Đa số xạ khuẩn sinh sản bằng bào tử vơ tính, tuy nhiên một số xạ khuẩn thuộc chi
Corynebacteria sinh sản bằng cách phân chia tế bào [18]. Khi nuôi cấy xạ khuẩn trên môi
trường thạch, chúng cũng tạo thành khuẩn lạc. Khuẩn lạc của xạ khuẩn thường rắn chắc,
xù xì, có nhiều dạng khác nhau như: dạng nhung, dạng vơi, dạng màng dẻo; bề mặt khuẩn
lạc có thể nhẵn, sần sùi hoặc có mấu lồi…Khuẩn lạc xạ khuẩn thường có nhiều màu sắc
khác nhau như: đỏ, cam, vàng, nâu, tím,… với đường kính từ 0,5-2,0 mm. Xạ khuẩn có thể
được coi là sinh vật trung gian giữa nấm và vi khuẩn, do chúng có những đặc điểm vừa
giống nấm (phát triển bằng cách phân nhánh thành những sợi nhỏ, dài được gọi là khuẩn
ty với đường kính sợi từ 0,1-0,5 μm) vừa giống vi khuẩn (có kích thước nhỏ, chưa có nhân
thật mà chỉ là thể nhân, màng tế bào không chứa cellulose hay chitin…) [2], [19]. Theo sự
khác biệt về hình thái và chức năng, hệ sợi tơ của xạ khuẩn có thể được chia thành sợi cơ
chất và sợi khí sinh (Hình 1.1). Sự phát triển hệ sợi tơ, sự đứt gãy của sợi cơ chất, vị trí, số
lượng, cấu trúc bề mặt, hình dạng của bào tử, bào tử di động hay không di động đều là
những đặc điểm quan trọng trong việc phân loại xạ khuẩn [20].

Hình 1.1: Mặt cắt ngang của khuẩn lạc xạ khuẩn cho thấy sợi cơ chất và sợi khí sinh với
chuỗi bào tử đính [20]

17


1.1.1. Sợi cơ chất
Vịng đời của xạ khuẩn khi ni cấy trên mơi trường thạch bao gồm sự hình thành 2 hệ sợi
khác biệt là sợi cơ chất và sợi khí sinh. Sợi cơ chất phát triển bên trên và trong mơi trường
ni cấy. Chức năng chính của sợi cơ chất là hấp thụ các chất dinh dưỡng để cho xạ khuẩn
phát triển. Sợi khí sinh phát triển trong khơng khí và cuối cùng sẽ hình thành các bào tử.
Tổ chức phức tạp này cho phép xạ khuẩn thích nghi khi chúng phát triển ở mơi trường trên
cạn. Do đó, sợi cơ chất phải có khả năng bám chặt với cơ chất của nó để sử dụng đầy đủ
các vật liệu rắn có trong đất [20], [21].
Dưới kính hiển vi quang học, sợi cơ chất mảnh, trong suốt, pha tối và phân nhánh nhiều
hơn sợi khí sinh, các sợi đơn dày khoảng 0,4-1,2 µm, thường khơng hình thành vách ngăn
và gãy khúc, có khả năng phát triển các nhánh. Sợi cơ chất thường phân mảnh tại chỗ,
không di động cho đến khi phát triển đến một giai đoạn nhất định [21].

Hình 1.2 Vi thể của một số chủng xạ khuẩn được quan sát dưới kính hiển vi quang học
A) Sự phân mảnh của sợi cơ chất và sự phân nhánh thực sự của Nocardiaasteroides [20] B) Sợi
cơ chất của Thermoacrinomyces sp. được nuôi cấy trên môi trường thạch với gel polyol Lutrol
FC127 được quan sát dưới kính hiển vi điện tử quét [22]
Sợi cơ chất thường có nhiều màu sắc như: trắng, vàng, cam, đỏ, xanh lá cây, xanh dương,
tím, nâu…, một số sợi cơ chất có thể tạo ra sắc tố tan trong nước hoặc tan trong chất béo.
Các sắc tố tan trong nước có thể thấm vào mơi trường ni cấy tạo cho mơi trường có màu
tương ứng. Ngược lại, các sắc tố không tan trong nước (hoặc không tan trong chất béo) tạo
ra khuẩn lạc với màu tương ứng. Màu sắc của sợi cơ chất và các sắc tố hòa tan cũng là một
trong những đặc điểm quan trọng trong việc xác định các loài xạ khuẩn mới [20].
18

1.1.2 Sợi khí sinh
Khi sợi cơ chất phát triển đến một giai đoạn nhất định và bắt đầu phát triển trong khơng
khí thì được gọi là sợi khí sinh. Đơi khi, sợi khí sinh và sợi cơ chất rất khó phân biệt. Dưới
kính hiển vi quang học: sợi cơ chất mỏng, trong suốt và pha tối; sợi khí sinh thơ, khúc xạ
và pha sáng. Sự hình thành sợi khí sinh phụ thuộc vào đặc điểm của loài, điều kiện dinh
dưỡng hoặc yếu tố mơi trường. Sợi khí sinh của một số chi xạ khuẩn phát triển đến một
giai đoạn nhất định thì bắt đầu hình thành chuỗi bào tử ở đầu gọi là khuẩn ty sinh sản [20].
Trong nghiên cứu của Joanne Willey và cộng sự (1993) về các tín hiệu ngoại bào chi phối sản
xuất một loại protein hình thái có liên quan đến sự hình thành sợi khí sinh ở Streptomyces
coelicolor đã chỉ ra rằng: sự hình thành sợi khí sinh ở chủng xạ khuẩn này bị chi phối bởi gene
bld (bald gene). Đột biến gene bld gây ra sự hình thành các khuẩn lạc mà chỉ có sợi cơ chất. Một
loại protein nhỏ có cấu trúc bất thường gọi là SapB (Spore-asociated protein B) có liên quan trực
tiếp đến việc tạo nên sợi khí sinh. SapB được tiết ra từ các khuẩn lạc khi bắt đầu phân hóa, có
vai trị bao bọc sợi tơ ở bề mặt khuẩn lạc xạ khuẩn, nhờ đó giúp sợi tơ thốt ra khỏi môi trường
nước của khuẩn lạc và phát triển trong khơng khí [23].
1.1.3 Bào tử và chuỗi bào tử
Sợi khí sinh phát triển trực tiếp từ sợi cơ chất trên cùng, bào tử bắt đầu hình thành ngay
sau khi sợi khí sinh đầu tiên xuất hiện thơng qua việc hình thành vách ngăn trên sợi khí
[24]. Mỗi chi xạ khuẩn khác nhau thì sẽ có hình dạng bào tử khác nhau. Ví dụ, đối với chi
Streptomyces thì đã có đến 4 loại bào tử khác nhau như: bào tử có bề mặt mịn, sần sùi, có
gai hoặc có lơng [25].
Chuỗi bào tử của mỗi lồi xạ khuẩn đều có những đặc điểm riêng biệt. Trong nghiên cứu
về xạ khuẩn chịu cực đoan ở vùng đất mặn của Wen Jun Li và cộng sự (2003), 2 chủng xạ
khuẩn Prauserella halophila sp. nov. và Prauserella alba sp. nov. có chuỗi bào tử dài,
thẳng đến uốn cong và bào tử không di động [26]. Trong nghiên của M.N.Zin và cộng sự
(2010) về đặc tính ni cấy của các chủng xạ khuẩn nội sinh thì nhận thấy rằng: 66 chủng
xạ khuẩn phân lập được hầu hết chuỗi bào tử của chúng đều có đặc điểm giống chủng
Streptomyces, hình thái bào tử của các chủng xạ khuẩn này có dạng: Rectusflexibilis (RF),
Retinaculumapertum (RA), Spira (S), Verticallate (V) theo như mô tả của Shirling và
19

Gottleib (1966) [11], [18]. Các chuỗi bào tử trần có thể chỉ là 1 bào tử như
Thermoactinomyces, Saccharomonospora, Promicromonospora,... có thể có 2 bào tử như
Microbispora, có thể là chuỗi bào tử ngắn như chi Nocardia, Pseudonocardia,
Streptoverticilium, Sporichthya, Actinomadura, Microtetraspora,... có thể là chuỗi bào tử
dài như chi Kibdelosporangium, Kitasatosporia, Saccharothrix, có thể các bào tử trần nằm
trên bó sợi, tương tự bó sợi của nấm như chi Actinosynnema, Actinomadura... Các chuỗi
bào tử có thể thẳng, xoắn, ở dạng lượn sóng, có thể mọc đơn hay mọc vịng. Cuống sinh
bào tử và cuống sinh nang bào tử có thể riêng rẽ hoặc phân nhánh. Các đặc điểm hình thái
này rất quan trọng khi tiến hành định danh xạ khuẩn [1].

Hình 1.3 Hình dạng bào tử ở một số chi xạ khuẩn [8] (A) Micromonospora sp.;
(B) Thermobifida alba; (C) Saccharomonospora viridis; (D) Thermoactinomyces daqus;
(E) Microbispora rosea; (F) Nocardia brevicatena,

(G) Catellatospora sp.

Hình 1.4: Đặc điểm hình thái chuỗi bào tử chi Streptomyces [44]
20


1.2 Đặc điểm sinh lý-sinh hóa của xạ khuẩn
Trong đất, bào tử của chi Streptomycetes hầu như ở trạng thái nghỉ trong một khoảng thời
gian dài và chúng chỉ bắt đầu nảy mầm khi có sự hiện diện của chất dinh dưỡng. Các bào
tử Streptomycete có thể được phân tán trên mặt đất khi có các tác nhân bên ngồi tác động
vào như gió hoặc mưa. Việc bổ sung có chủ ý hoặc vơ tình các vật liệu hoặc chất lạ vào
đất của con người cũng có thể ảnh hưởng đến sự xuất hiện và hoạt tính của xạ khuẩn. Giống
như nhiều vi khuẩn trong đất, hầu hết xạ khuẩn ưa nhiệt độ trung bình, với sự tăng trưởng
tối ưu ở mức nhiệt từ 25-30°C. Tuy nhiên, các nghiên cứu trên thế giới cũng chỉ ra rằng

một số loài xạ khuẩn có thể sinh trưởng và phát triển tối ưu ở mức nhiệt cao hơn lên đến
40°C (chẳng hạn như Nocardiae được phân lập ở vùng đất của New Zealand). Đa số xạ
khuẩn trong đất hoạt động ở phổ pH rộng từ 5,0-9,0, nhưng chủ yếu phát triển tối ưu ở pH
trung tính. Độ ẩm cũng là một yếu tố tác động đến sự phân bố cũng như hoạt tính của xạ
khuẩn. Xạ khuẩn cũng được chứng minh là sinh vật nhạy cảm với nồng độ CO2 cao và
nồng độ O2 thấp, điều này xảy ra khi đất bị ngập nước [27].
1.3 Vai trò và ứng dụng của xạ khuẩn
 Vai trị của xạ khuẩn
Xạ khuẩn có vai trị rất quan trọng trong thế giới tự nhiên cũng như trong đời sống của con
người. Chúng đảm nhận nhiều chức năng khác nhau như: làm màu mỡ thêm cho đất, có
tiềm năng chuyển hóa và phân giải nhiều hợp chất hữu cơ phức tạp, cải thiện chất thải nông
nghiệp và chất thải đô thị không được sử dụng thành những sản phẩm có giá trị cao, cải
thiện mơi trường sống. Nhiều lồi xạ khuẩn có giá trị trong sản xuất cơng nghiệp cũng như
có lợi cho con người [11].
Xạ khuẩn ln được chú trọng trong các nghiên cứu giữa các nhóm vi sinh vật do chúng
có khả năng sản xuất kháng sinh, 75% thuốc kháng sinh hiện nay đều có nguồn gốc từ xạ
khuẩn. Bên cạnh đó, chúng cịn được chứng minh là có khả năng sản xuất đa dạng các hợp
chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính sinh học cao như chất chống ung thư, thuốc ức chế
miễn dịch và enzyme, các chất chuyển hóa này có tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm, chống
oxy hóa, chống ung thư, chống giun sán, chống sốt rét và chống viêm,… Các sản phẩm
21


được tạo ra từ xạ khuẩn được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực bao gồm nông nghiệp,
công nghiệp, thú y và y tế… [7], [28].
 Ứng dụng của xạ khuẩn trong công nghệ sản xuất kháng sinh
Fusarium là một chi nấm lớn có khả năng gây bệnh trên nhiều loại cây trồng. Hiện nay, có
khoảng 17 lồi được phát hiện là có khả năng gây bệnh trên thực vật, phá hoại mùa màng
và tạo ra độc tố mycotoxin có hại cho con người, động vật và các loại nơng sản [29].
Trong vài thập kỉ qua, việc kiểm sốt nấm bệnh trên cây trồng chủ yếu dựa vào thuốc hóa

học. Tuy nhiên, hầu hết các loại thuốc trừ sâu, thuốc diệt nấm tổng hợp đều bị cấm do ảnh
hưởng xấu đến sức khỏe con người, gây độc tế bào và có những tác động xấu với mơi
trường, nguồn nước ngầm và các lồi vi sinh vật có ích trong đất. Vì những lo ngại về chất
lượng mơi trường và thực phẩm trong những năm trở lại đây, các biện pháp sinh học thân
thiện với môi trường và con người đã được áp dụng. Việc sử dụng vi sinh vật có ích để
quản lí nấm bệnh trên cây trồng đã mang đến sự thay thế hấp dẫn của việc sử dụng các chất
hóa học tổng hợp. Trong đó xạ khuẩn được biết đến là sinh vật tiềm năng [30].
Các chương trình nghiên cứu để phát hiện ra kháng sinh và các chất chuyển hóa có hoạt
tính sinh học cao có nguồn gốc từ vi sinh vật đã mang lại một số lượng hợp chất ấn tượng
trong 50 năm qua, được ứng dụng mạnh mẽ trong y học và nông nghiệp. Xạ khuẩn là loại
sinh vật có khả năng sản xuất các hợp chất kháng sinh phong phú nhất. Hầu hết các kháng
sinh mới được phát hiện từ xạ khuẩn thông qua q trình sàng lọc từ mơi trường sống tự
nhiên như đất và các vùng nước. Vào thời điểm hiện tại, hàng nghìn chất chuyển hóa của
xạ khuẩn được mơ tả, chiếm một phần đáng kể các chất chuyển hóa của vi sinh vật. Trong
số đó, Streptomyces là chi phổ biến nhất [31], [32].
Việc phát hiện ra các phân tử mới từ xạ khuẩn đã đánh dấu một kỷ nguyên mới trong
nghiên cứu kháng sinh và những phát triển tiếp theo trong hóa trị liệu bằng kháng sinh. Kể
từ khi phát hiện ra Streptomycin, một số lượng lớn kháng sinh cũng đã được tìm thấy bao
gồm amino glycoside, chloramphenicol, tetracyclines, macrolide và gần đây là nhóm βlactam cephamycin có nguồn gốc từ Streptomyces và Streptoverycillium [33].

22


Bảng 1.1: Sự đa dạng của các hợp chất kháng sinh được phát hiện là sản phẩm của
Streptosporangium spp. [33].

23


 Ứng dụng của xạ khuẩn trong phân hủy các hợp chất biopolymer

Hệ sinh thái đất là nơi diễn ra các quá trình sinh học phức tạp, được điều chỉnh bởi hệ vi
sinh vật của nó. Sự có mặt của chất lạ trong môi trường đất sẽ dẫn đến sự biến động về chất
lượng và số lượng vi sinh vật, ảnh hưởng đến cân bằng sinh thái đất. Do đó, quần thể vi
sinh vật phản ánh những thay đổi môi trường và có thể được coi là một chỉ số để đánh giá
tác động của các phần tử ngoại sinh. Một số nghiên cứu đã báo cáo tác dụng của nhiều loại
thuốc diệt cỏ đối với vi khuẩn và trên một số nhóm nấm cụ thể. Tuy nhiên, sự tác động của
chúng lên xạ khuẩn có trong đất vẫn cịn ít được khám phá. Trên thực tế, xạ khuẩn có tiềm
năng đáng kể về biến đổi và phân hủy sinh học của thuốc trừ sâu, do khả năng sản xuất các
24