Tài liệu Ứng dụng chỉ thị phân tử DNA chọn lọc gen kháng bệnh bạc lá ở các dòng bố, mẹ phục vụ công tác chọn tạo giống lúa lai 2 dòng kháng bệnh bạc lá pot

NG DNG CH TH PHN T DNA CHN LC GEN
KHNG BNH BC L CC DềNG B, M PHC V CễNG
TC CHN TO GING LA LAI 2 DềNG KHNG BNH BC L
Phan Hu Tụn
1
, Tng Vn Hi
1
, guyn Vn Giang
1
,
H Hu h
2
, guyn Trớ Hon
2

SUMMARY
Application of DA marker for screening resistance gen to bacterial leaf bligh
in parents lines of hybrid rice
Bacterial leaf blight disease caused by Xanthomonas oryzea pv. oryzea is one of the
most serious diseases in rice -cultivating areas of Vietnam. To prevent this disease, the use
of resistant varieties offers the most economic efficiency. In order to breed resistant two
line hybrid rice varieties, the parental lines containing resistance genes plays a very
important role. In this study, DA markers were used for screening resistance gene to
bacterial leaf blight in parent rice lines. pb 181, RG556, P3 and pT818 marker were used
to select Xa4, Xa5 Xa7 and Xa21 respective. The results shown that, the resisitance genes
homozygote types were selected in 11 mother and 14 father populations. Three strains of
bacterial leaf blight were used innoculation on the individuals that contain resistance
genes homozygotes were resistant.
Keywords: DA marker, resistance gene, Bacterial leaf blight, Hybrid rice.
I. ĐặT VấN Đề
Mt trong nhng hng tng nng

sut lỳa go l s dng u th lai. Hin nay
chỳng ta ang s dng hai h thng: H
thng lỳa lai
hai dũng v
lỳa lai ba
dũng, trong ú lỳa lai hai dũng vt tri v
chim u th hn hn.
Theo số liệu thng kờ hng nm nng
sut lỳa ton th gii c tớnh gim t 10-
20% vỡ cỏc bnh vi khuNn, trong ú cú ti
50% l do bnh bc lỏ gõy nờn. min Bc
Vit N am bnh tr nờn nghiờm trng v phỏ
hoi nng c hai v, c bit đối với cỏc
ging nhp ni t Trung Quc. Hng chn
to ging khỏng bnh c coi l cú hiu
qu nhiu mt, va gim chi phớ, bo v
mụi trng li to ra sn phNm sch.
i vi lỳa lai 2 dũng, chn to ra t
hp cú kh nng khỏng bnh bc lỏ ch cn
mt trong hai b m phi cha gen khỏng
nu ú l gen tri, hoc c b m u cha
gen nu ú l gen ln. Cỏc tác gi cng ó
xỏc nh c gen Xa4, Xa5, Xa7 v Xa21
khỏng c hu ht cỏc chng bnh bc lỏ ở
min Bc Vit N am (Bùi Trọng Thuỷ và cs,
2007). a gen khỏng hu hiu vo mt
ging, phng phỏp truyn thng l lai
1
Trng i hc N ụng nghip H N i;
2

Vin Khoa hc N ụng nghip Vit N am
Backcross, chn cõy cú gen khỏng lai li
vi ging lỳa tt hoc trng F2 sau ú chn
cỏ th cha gen.
N gy nay vi s phỏt trin ca cụng
ngh sinh hc, k thut di truyn phõn t
ngi ta ó nh v c chớnh xỏc cỏc gen
và chỉ thị liờn kt vi chúng. õy cỏc tỏc
gi ó xỏc nh gen Xa4 liờn kt vi RFLP
locus XN pb181 v XN pb78 trờn N ST s
11, vi khong cỏch liờn kt u l 1,7 cM
(Yoshimura et al., 1992); Gen Xa5 liờn kt
vi ch th RZ390, RG556 v RG207 trờn
N ST s 5, vi khong cỏch liờn kt 0-1 cM
(Mc Couch et al., 1991); Gen Xa7 nm trờn
N ST s 6 liờn kt vi ch th Mp3 vi
khong cỏch di truyn 2,5 cM; Gen Xa21
liờn kt vi ch th pTA818 v pTA248 vi
khong cỏch di truyn 0-1cM (Ronal et al.,
1992)
N h vy ch cn dựng k thut PCR
chỳng ta cú th phỏt hin c s hin din
ca cỏc gen khỏng bệnh bạc lá trong cỏc th
h phõn ly nhất là cỏc dũng cú cha gen
khỏng dng ng hp tử phục vụ tốt hơn
cho công tác chọn giống lúa lai
II. VậT LIệU V PHƯƠN G PHáP N GHIÊN
CứU
1. Vt liu nghiờn cu
- 11 dũng m TGMS ó c chn ra

t cỏc t hp lai gia cỏc dũng TGMS vi
ging cha gen khỏng bnh hu hiu:
V102; V115; V121; V122; V123; V125;
V128; V130; V133; V138; V140.
- 14 dũng b ln lt chn t 14 t hp:
BB5/R23; BB4/RTQ5; BB11/RTQ5; Cht
Ct/RTQ5; Cht ct/R838; BB11/R23;
BB21/c thanh; Chựm bụng/c thanh;
BB8/4492; BB5/Q99 BB13/Qu.
Ch th N pb181 phỏt hin gen Xa4
(Yoshimura et al., 1992) vi primer F5-
ATC-GAT-CGA-TCT-TCA-CGA-GG-
3vR5-GTG-CTA-TAA-AAG-GCA-
TTC-GGG-3,ch th RG556 chn lc gen
khỏng Xa5 (McCough et al., 1991) vớ
trỡnh t mi R5-AAT-ATT-TCA-GTG-
TGC-ATC-TC-3 v F5-TAG-CTG-CTG-
CCG-TGC-TGT-GC-3,ch th P3 chn
lc gen khỏng Xa7 (Taura et al.,) vi mi
R5-CAT-CAC-GGT-CAC-CGC-CAT-
ATC-GGA-3 v F5-CAG-CAA-TTC-
ACT-GGA-GTA-GTG-GTT-3và ch th
pTA818 chn lc gen khỏng Xa21 (Ronald
et al., 1992) vi trỡnh t mi F5 ATA GCA
ACT GAT TGC TTT GC 3 v R5 CGA
TCG GTA TAA CAG CAA AAC 3.
2. Phng phỏp nghiờn cu
Quy trỡnh chit tỏch DNA theo
N. Furuya v cng s, 2003: Mu lỏ của
dòng bố,mẹ đợc lấy ngẫu nhiên 10 cá thể

c ct v nghin nh trong 800l dung
dch chit tỏch DNA (tớnh cho 10ml hn
hp dung dch: 50mM Tris-HCl pH = 8.0;
0.25mM EDTA pH = 8.0; 300mM NaCl;
1% SDS cũn li l H
2
O), thờm 400l dung
dch 25:24:1 (Phenol: Chlorofom:
Isoaminalchohol) ly tõm 13000 vũng/phỳt
trong 5 phỳt hỳt phn dch phớa trờn. Thờm
vo ng nghim 400l dung dch 24:1
(Chlorofom:Isoaminalchohol) v ly tõm
13000 vũng/phỳt trong 5 phỳt, thu dch phớa
trờn. Kt ta DNA tng s bng 800l
ethanol hoc isopropanol, sau ú ly tõm 5
phỳt vi tc 13000 vũng/phỳt, phn
dung dch phớa trờn, gi li phn kt ta
di ỏy ng nghim. i cn bay hi, ho
tan kt ta bng 50l dung dch TE ri bo
qun nhit -20
0
C hoc 4
0
C.
Phản ứng PCR phát hiện gen kháng bạc
lá Xa4, Xa5 Xa7 và Xa21
Thành phn 20µl dung dch phn ng
PCR gm có: 12.24µl nưc ct, 0.1µl Taq
DNA Polymerase, 2.0µl 10X buffer, 1.5µl
of 50 mM MgCl2, 0.16µl of dNTPs 25 mM,

1µl mi mi, 1µl DNA nguyên bn. PCR
ca gen Xa4 và Xa 7 và Xa21 ưc thc
hin theo chu kì nhit như sau: 94ºC trong 4
phút, 30 chu kỳ: 94ºC trong 1 phút, 56ºC
trong 1 phút, 72º trong 2 phút và 72ºC trong
8 phút. PCR ca gen Xa5 ưc thc hin
theo chu kì nhit: 94ºC trong 4 phút, 34 chu
kỳ: 94ºC trong 1 phút, 55ºC trong 1 phút,
72ºC trong 1 phút 50 giây và 72ºC trong 7
phút. Sau ó, sn phNm PCR ưc ct bng
enzyme DraI như sau: 15µl phn ng gm
có 10µl sn phNm PCR, 0,3µl enzyme DraI
10unit/µl, 1,5µ buffer B và 3,2µl nưc. Hn
hp ưc   37ºC trong ít nht 6 gi. Sn
phNm PCR ưc in di trên gel agarose
1,5%. Bn gel ưc nhum bng Ethidium
bromide, chp nh dưi tia UV.
III. KÕT QU¶ V TH¶O LUËN
1. Kết quả chọn lọc gen Xa4
Gen kháng Xa4 là gen tri, theo Phan
Hu Tôn và cng s (2005) thì gen này
kháng ưc 6/10 chng bnh bc lá chính ca
min Bc Vit Nam. Chúng tôi ã s dng
ch th Npb181 (Yoshimura et al., 1992) 
chn lc gen Xa4.  trng thái ng hp t
tri in di sn phNm PCR thy xut hin 1
vt băng sáng kích thưc 150bp, trng thái
ng hp t ln là 130bp và trng thái d hp
xut hin 2 vt băng 130bp, 150bp.
Phân tích 11 qun th dòng b ã chn

ưc dng ng hp t gen kháng Xa4  3
qun th. Qun th BB4/RTQ5 chn ưc 2
cá th s 4 và 5. Qun th BB4/4492 chn
ưc 3 cá th, là các cá th s 2, 3 và 4.
Qun th BB4/R242 chn ưc 2 cá th 1
và 2. N hng cá th này mang gen kháng
Xa4 không phân ly qua các th na.
Tương t như dòng b chn lc gen
kháng Xa4  11 qun th dòng m chn
ưc 4 qun th cha gen ng hp t ó là
qun th V115 cây s 6, qun th V122 cây
s 3 và 4, qun th V123 cây s 2, 3 và 5,
qun th V138 cây s 2. Hai qun th
không chn ưc gen Xa4 ng hp, ch
chn ưc dng d hp t (Rr) ó là các
qun th V102 và V130. N hng cá th cha
gen kháng d hp này ưc trng theo dâi
tiÕp ë vô sau.

Hình 1. in di sn phNm PCR phát hin và chn lc gen kháng Xa4
Lane 1: Marker, lane 2 IR24 (/C âm trng thái ng hp ln), lane 3 BB4 (/C dương trng thái ng hp
tri), lane 4, 6 và 7 các cá th cha gen kháng ng hp, lane 5 và 9 cá th cha gen kháng ng hp ln,
lane 8 và 10 trng thái d hp t
2. Kết quả chọn lọc gen kháng Xa5
Gen kháng Xa5 là gen kháng ln vµ
kháng ưc 10 chng/10 chng bnh bc lá
ë min Bc Vit N am. Vì vËy mun s dng
ưc gen này thì c b và m u mang gen
 trng thái ng hp t ln. S dng ch th
RG556  chn lc gen Xa5. i vi ch th

này vt băng cha gen  trng thái ng hp
tri, ng hp ln cũng như d hp u cho
kt qu như nhau.  phân bit chúng tôi s
dng enzym DraI, sn phNm PCR ca mu
mang gen ln Xa5 sau khi ct bng enzyme
s xut hin vch băng kép ti kích thưc
khong 450bp (hình 2).
i vi qun th dòng b, tng s 10
qun th chn lc không chn ưc cây nào
 dng ng hp t ln tc ng hp kháng
(kt qu tng hp  bng 1), ch có 2 t hp
chn ưc cây mang gen d hp t ó là
qun th BB5/R23 cây s 3 và t hp
BB5/Qu 99 cây s 4, nhng cá th này
trng theo dâi tiÕp ë vô sau

Hình 2. in di sn phNm PCR phát hin và chn lc gen kháng Xa5
1. marker; 2. IR24 (/C âm gen  trng thái ng hp tri); 3. BB5 (/C gen  trng thái ng hp ln
kháng); 4-9. Các cá th trong t hp BB5/R23 ln lưt t cây 1-6; 10-18. Các cá th trong t hp BB5/Qu
99 ln lưt t cây 1-9
i vi qun th dòng m, 11 qun th
phân tích chn ưc 4 qun th cha có cá
th cha gen ng hp kháng. Qun th
V121 cây s 2, qun th V122 cây s 8, 9
và 10, qun th V128 cây s 3 và 4, qun
th V133 cây s 3 và 4. N goài các cá th
ng hp t kháng chúng tôi còn chn ưc
dng d hp t 4 qun th trên. Các t hp
còn li gen Xa5 ng hp kháng hay d hp
không ưc tìm thy.

3. Kết quả chọn lọc gen kháng Xa7
Gen kháng Xa7 là gen tri, do vËy ch cn
mt trong hai b m cha gen này thì con lai
F1 cũng có th kháng ưc các chng bnh
bc lá. Gen Xa7 kháng ưc 9/10 chng bnh
chính ang tn ti  min Bc Vit N am.
 chn lc gen kháng Xa7 ã s dng
ch th P3. on DN A nhân lên có kích
thưc vt băng nu mu cha gen Xa7 ng
hp t tri là 297bp, ng hp ln Xa7 là
262bp, d hp bao gm c hai vt (hình 3).

Hình 3. in di sn phNm PCR phát hin và chn lc gen kháng Xa7qun th V140
1. Marker; 2. IRBB7 (/C dương cha gen ng hp tri); 3. IR24 (/C âm không cha gen ng hp ln)
4-11. Các cá th ca t hp V140 ln lưt t cây s 1-8
Phân tích 7 qun th dòng b  chn
lc gen kháng ng hp t tri nhưng c 7
t hp không chn ưc cá th nào mang
gen ng hp tri. Tt c các cá th u
mang gen ng hp t ln. (bng 1)
Tương t, phân tích 11 qun th dòng
m gen kháng Xa7 ng hp tri cũng
không tìm thy. Tuy nhiên chúng tôi ã
chn ưc các cá th dng d hp t  các
qun th V115, V123 và V140. ây là
ngun vt liu quý  chn ưc dòng m
cha gen kháng Xa7  nhng v tip theo.
4. Kết quả chọn lọc gen kháng Xa21
Gen Xa21 là gen tri, kháng ưc 7
chng trong s 10 chng bÖnh b¹c l¸

 xác nh và chn lc gen kháng
Xa21 trong các t hp ã s dng ch th
pTA818. Vi ch th này vt băng nhân lên
ca gen Xa21 ng hp tri là 1100bp,
ng hp ln 980bp, d hp có c 2 vt
băng (hình 4).
i vi các qun th dòng b ® sµng
lc ®−îc 1 t hp cã cây d hp t, ó là
BB21/c thanh víi cây s 1 và 3.
Trong 11 qun th dòng m không tìm
thy kiu gen ng hp t tri. Tuy nhiên
dng d hp thì ã ưc tìm thy  qun th
V135 cây s 2, 3 và 4. Qun th V120 cây
s 2, 3 và 4, qun th V133 cây s 1, 2 và
10, qun th V138 cây s 1, 2 và qun th
V140 cây s 4, 5, 6 và 7. Các qun th còn
li gen u  trng thái ng hp ln.

Hình 4. in di sn phNm PCR phát hin và chn lc gen kháng Xa21
1. Marker; 2. BB21 (/C cha gen); 3. IR24 (/C không cha gen)
3-11. Các cá th trong qun th BB21/c thanh cây t 1-8
Bảng 1. Tổng hợp kết quả chọn lọc gen kháng bạc lá ở các quần thể dòng bố
Tổ hợp
Số cây
phân tích

Gen Xa4 Gen Xa5 Gen Xa7 Gen Xa21
- - + + - - + + - - + + - - + +
BB5/R23 6 5 1
BB4/RTQ5 10 8 2

BB11/RTQ5 6 6 6 6 6
Chệt Cụt/RTQ5 7 7 7 7 7
Chệt cụt/R838 8 8 8 8 8
BB11/R23 7 7 7 7 7
BB21/Đặc thanh 8 6 2
Chùm bông/Đặc thanh 6 6 6 6 6
BB8/4492 8 7 1 8 8 8
BB5/Q99 9 6 3
BB13/Quế 99 7 7 7 7 7
BB4/4492 9 4 2 3
BB4/R242 10 7 1 2
BB15/Trắc 64 8 8 8 8 8
Ghi chú: -: Không cha gen +: Cha gen-+: Dng d hp t.
Bảng 2. Tổng hợp kết quả chọn lọc gen kháng bạc lá ở các quần thể dòng mẹ
Tổ hợp
Số cây
phân tích

Gen Xa4 Gen Xa5 Gen Xa7 Gen Xa21
- - + + - - + + - - + + - - + +
V102 10 7 3 10 10 10
V115 9 6 2 1 9 8 2 9
V121 7 7 4 2 1 7 7
V122 10 5 3 2 5 2 3 10 10
V123 11 6 2 3 11 8 3 11
V125 6 6 6 6 3 3
V128 10 10 6 2 2 10 10
V130 7 5 2 7 7 4 3
V133 10 10 5 3 2 10 7 3
V138 5 1 3 1 5 5 3 2

V140 11 11 11 5 6 7 4
Ghi chú: -: Không cha gen +: Cha gen-+: Dng d hp t
T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam
8
IV. KÕt luËn
Trên cơ s kt qu s dng ch th phân t sàng lc  mt s qun th ã chn ưc
các dòng b, m mang gen kháng bc lá sau:
Có 7 dòng b mang gen kháng bc lá Xa4  dng ng hp t là dòng s 4, 5 thuc
t hp BB4/RTQ5; Dòng s 2, 3, 4 thuc t hp BB4/4492 và dòng s 1, 2 thuc t hp
BB4/R242.
Có 2 dòng b mang gen kháng bc lá Xa21 là các dòng s 1, 2 thuc t hp lai
BB21/c thanh, ng thi cũng ã chn lc ưc mt s cá th cha hai gen kháng  trng
thái d hp t trên các qun th dòng m như: Cây s 4 cha hai gen  trng thái d hp Xa4
và Xa7 thuc qun th V115; Cây s 6 cha 2 gen Xa4 và Xa5  trng thái d hp thuc qun
th V122. Qun th V123 cây s 1 cha gen kháng Xa4 và Xa7 d hp. Qun th V130 và
V138 cây s 2 cha gen Xa4 và Xa21 d hp. Qun th V140 cây s 5, 6 và 7 cha gen Xa7
và Xa21.
Nhng cá th cha 2 gen khác nhau  trng thái d hp là ngun vt liu vô cùng quý
giá  to ra ging cha a gen kháng, phc v c lc trong công tác chn to ging lúa
lai kháng bnh bc lá.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Phan Hữu Tôn, 2005. Phân b, c im gây bnh các chng vi khuNn bc lá lúa và
phát hin ngun gen kháng bng k thut PCR. Khoa hc Công ngh và Phát trin
nông thôn 20 năm i mi, tp 1, tr 311-325.
2. Bùi Trọng Thủy, Furuya, ., Taura, S., Yoshimura, A., Lê Lương Tề, Phan Hữu
Tôn, 2007. Mt s nhn xét v s a dng ca các nhóm nòi vi khuNn
Xanthomonas oryzae pv. oryzae gây bnh bc lá lúa  min Bc Vit Nam (2001-
2005). Tp chí BVTV, ISSN 0868-2801, s 3(213)-2007. tr 19-26.
3. Furuya, ., Taura, S., Bui Trong Thuy, Phan Huu Ton, guyen Van Hoan &
Yoshimura, A., 2003. “Experimental technique for Bacterial Blight of Rice”. HAU-

JICA ERCB Project, Hanoi, 2003, 42 pages.
4. aruto Furuya, Bui Trong Thuy, Matsaru Matsumoto, Seint San Aye & Phan Huu
Ton, 2002. “Isolation and preservation of Xanthomonas oryzae pv. oryzae from
Vietnam in 2001-2002”. Kyushu Uni. Institute of Tropical Agricaltural, Bull.
Vol.25,pp.43-50, Japan.
5. McCouch, S.R., Abenes, M.L., Angeles, R., Khush, G.S. & Tanksley, S.D., 1991.
Molecular tagging of a recessive gene Xa5, for resistance to bacterial blight of rice.
Rice Genet. Newsl., 8: 143-145.
6. Ronald, P.C., Albano, B., Tabien, R., Abenes, L., Wu, K., McCouch, S.R. & Tanksley,
S.D., 1992. Genetic and physical analysis of the rice bacterial blight resistance locus,
Xa21. Mol. Gen. Genet., 236: 113-120.
7. Yoshimura, S., Yoshimura, A., Saito, A., Kishimoto, ., Kawase, M., Yano, M.,
akagahra, M., Ogawa, T. & Iwata, ., 1992. RFLP analysis of introgressed
chromosomal segments in three near-isogenic lines of rice bacterial blight resistance
genes, Xa1, Xa3 and Xa4. Jpn. J. Genet., 67: 29-37
gười phản biện:
T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam
9
PGS. TS. Nguyn Văn Vit