Các phương pháp proteomics tiếp cận virus sars coV 2

THUYẾT TRÌNH KẾT THÚC HỌC PHẦN: PROTEOMIC
Đề tài:
Proteomic Approaches to Study SARS-CoV-2 Biology and COVID-19 Pathology

8/11/22


8/11/22

I

TỔNG QUAN

II

CẤU TRÚC ĐỘNG HỌC CỦA PROTEIN VIRUT VÀ THÔNG TIN VỀ KHẢ NĂNG GÂY BỆNH CỦA VIRION

III

PROTEOMIC XÁC ĐỊNH CƠ CHẾ XÂM NHẬP TẾ BÀO

IV

THAY ĐỔI ĐƯỜNG TRUYỀN TÍN HIỆU TRONG TẾ BÀO KHI BỊ LÂY NHIỄM SARS-COV-2

V

CHIẾN LƯỢC THEO DÕI VÀ ĐIỀU TRỊ COVID-19


TỔNG QUAN

Phân nhóm vi rút Corona

•

Bảy coronavirus được biết đến là có thể lây nhiễm sang người:

- HCoV-299E,HCoVNL63,HCoV-OC 43 và HCoV-HKU1 thường xuyên lây nhiễm sang người
và gây ra các triệu chứng cảm lạnh thường khỏi nhưng có thể tiến triển thành viêm phế
quản hoặc viêm phổi.
- MERS-CoV, SARS-CoV-1 và SARS-CoV-2 có nhiều khả năng gây ra bệnh hơ hấp nghiêm
trọng hơn.


Vacxin và thuốc để điều trị COVID-19 được sử dụng


Cấu trúc bộ gen của vi rút SAR CoV-2

•

Bộ gen SARS-CoV2 là RNA cảm nhận dương dài khoảng 30kb

•

14 khung đọc mở(ORFs) mã hố 16 protein khơng cấu trúc(Nsp1-16); 4 protein
cấu trúc S,E,M,N và 9 protein phụ (Orf3a, Orf3b, Orf6, Orf7a, Orf7b, Orf8;
Orf9b,Orf9c và Orf10).


Các câu hỏi mở để làm rõ cấu trúc và tương tác virut - vật chủ

•

A: Vịng đời virus SARS-CoV-2

•

B: Các câu hỏi mở để hiểu thêm về sinh học SARS-CoV-2 và các kỹ
thuật proteomic có thể được sử dụng để giải quyết những câu hỏi này.


Cách tiếp cận trong nghiên cứu proteomic về SARS-CoV-2


Cấu trúc động học của protein virut và thông tin về khả năng gây bệnh của virion

Quy định hình dạng, cấu trúc của virion

Vai trò của protein virut
Đảm bảo cho hoạt động nhân lên của virut
Hiểu được chức năng phân tử

Nghiên cứu cấu trúc động học của protein SARSCoV-2
Tạo điều kiện thuận lợi để áp dụng liệu pháp phân tử nhỏ phá vỡ virion, ngăn chặn sự xâm nhập, nhân
lên của virut

X-ray crystallography

•

u cầu các phức chất đã hồn ngun thường được biểu hiện và tinh sạch từ vi khuẩn hoặc các hệ thống biểu
hiện khác

NMR

•
Cryo-electron microscopy

Có thể u cầu các chất đệm và điều kiện phi tự nhiên để đạt được sự xác định cấu trúc.


Cấu trúc động học của protein virut và thông tin về khả năng gây bệnh của virion

•

Cross-linking mass spectrometry (XL-MS),

•

Hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry (H/DX-MS)

•

Intact protein mass spectrometry

Có thể làm sáng tỏ các đặc điểm cấu trúc của protein và phức hợp protein dưới điều
kiện sinh lý hoặc thậm chí bên trong các tế bào sống có liên quan về mặt sinh học hoặc
các virion nguyên vẹn.

•

XL-MS

•

Bao gồm khả năng

Khắc phục một số hạn chế về sinh học cấu trúc

Thăm dò mạng lưới và giao diện tương tác protein-protein (PPI)

•

Nắm bắt thơng tin cấu trúc từ các PPI động, PPI tức thời và các dạng ràng buộc PPI.

•

Khơng chỉ chứa các tạp chất mẫu mà cịn cả sự khơng đồng nhất về cấu trúc, tính linh hoạt và thành phần của tiểu đơn vị.

•

Được áp dụng cho các ứng dụng tế bào sống và in vivo

Tần số thấp của các peptit liên kết chéo trong một hỗn hợp phức tạp gồm chủ yếu là các peptit chưa biến đổi.

Tìm kiếm và xác
định peptit liên kết
chéo phức tạp bởi
hai thách thức chính:

Sự phức tạp của phổ peptit liên kết chéo có hai liên kết cộng hóa trị phân phối trong chuỗi peptide


Cross-linking mass spectrometry (XL-MS)

(1) Chuyển đổi các tương tác phi cộng hóa trị trong hoặc giữa các protein ở trạng thái nguyên bản của chúng thành liên kết cộng hóa trị,
(2) Cắt protein của mẫu liên kết chéo,
(3) Sắc ký lỏng-khối phổ (LC-MS / MS) phân tích các đoạn peptit được tạo ra.
(4) Xác định các loại peptit liên kết chéo và các vị trí liên kết của chúng. Thơng tin về các tương tác không gian / khoảng cách có thể được sử dụng thêm trong xác nhận cấu trúc, mơ hình tích hợp
hoặc dự đốn cấu trúc de novo.


H / DX-MS

H / DX-MS

Đo lường sự thay đổi về khối lượng liên quan đến sự trao đổi giữa khung hydro amide của protein và deuterium từ D 2 O xung quanh.

Tốc độ trao đổi phụ thuộc vào

Nó được sử dụng để

•

Cấu trúc

•

Khả năng tiếp cận bề mặt

•

Hiệu ứng cảm ứng của các nhóm lân cận

•

Tính ổn định của mạng lưới liên kết hydro

•

Các đặc tính hóa học nội tại của trình tự axit amin cơ bản

•

Kiểm tra sự phù hợp của các protein riêng lẻ hoặc phức hợp protein lớn

•

Xác định vị trí protein trực tiếp hoặc gián tiếp liên quan đến liên kết

•

Thăm dị các hiệu ứng allosteric

•

Theo dõi động lực gấp khúc của các vùng protein

•

Kiểm tra rối loạn nội tại và cung cấp hiểu biết sâu sắc về tương tác protein-màng


H / DX-MS
Để đo mức dư bằng H/DX-MS, ta áp dụng sự phân mảnh pha khí thích hợp của các peptit được deute hóa bằng:
- Phân ly truyền điện tử (ETD);
- Phân ly bắt điện tử (ECD): Sử dụng hoạt độ phóng xạ beta do deteri phát ra để ion hóa các khí mang và phát sinh dịng điện ở giữa cặp điện cực, phân tử có nhóm elcteron mag điện tích di qua
detector, nó bắt 1 vài electoron dẫn tới thay đổi số đo của dòng điện giữa các điện cực
Cả ETD và ECD đều tạo ra các ion phân mảnh với năng lượng lạnh dao động, giảm thiểu sự tranh giành hydro, một hiện tượng được thấy khi sử dụng các chiến lược phân mảnh khác như phân ly do
va chạm (CID)


H / DX-MS
Tất cả các thí nghiệm H/DX-MS đều liên quan đến việc đánh dấu đơteri trước khi phân tích MS:

•

Protein được ủ trong bộ đệm deuterium, cho phép các hydrogen amide có trên khung của protein trao đổi với bộ đệm deuterium.

•

Phương pháp đánh dấu được sử dụng phổ biến nhất là đánh dấu liên tục, trong đó một protein ở trạng thái ổn định được ủ trong đệm deuterium liên tục trong các khoảng thời gian khác nhau
và sự trao đổi hydro thành deuterium được đo dưới dạng một hàm của thời gian.

•

Khoảng thời gian có thể kéo dài từ vài giây đến vài giờ hoặc vài ngày. Sau khi đánh dấu, các mẫu được hạ nhiệt độ xuống 0 ° C và pH của phản ứng xuống 2,5.

/>

Intact Protein Mass Spectrometry

Cho phép phân tích protein nguyên vẹn và phức hợp protein duy trì tương tác
Intact Protein Mass Spectrometry

phi cộng hóa trị và đo phân vị của phức hợp protein trong pha khí trong khi biến đổi cách tiếp cận top-down MS(TDMS).

Phá vỡ các tương tác không cộng hóa trị giữa các tiểu đơn vị protein

nMS

+

CID

Có thể giúp giải mã phép đo phân vị và cấu trúc liên kết của các phức hợp protein

Các ứng dụng kết hợp với ion mobility-MS (IMMS) đã cho phép lĩnh vực này khám phá các chi tiết cấu trúc lớn hơn của các cụm đại phân tử
lớn


Intact Protein Mass Spectrometry

Các chất phân tích pha rắn được ion hóa bằng phương pháp matrix-assisted laser desorption ionization (MALDI) đối với các phân tử có khối lượng lớn hoặc laser desorption ionization (LDI) đối với các
phân tử có khối lượng nhỏ hơn.
IMMS cho phép:

•

Phân tách và mơ tả đặc điểm của phức hợp protein và tiểu đơn vị protein trong pha khí dựa trên kích thước và hình dạng của chúng.

•

Mở ra các con đường để phân tích cấu trúc của các phức hợp protein khơng đồng nhất

•

Cho phép đánh giá phân tích, cấu trúc liên kết và mặt cắt của các tập hợp và tiểu đơn vị của chúng


Proteomic xác định cơ chế xâm nhập tế bào

1

Affinity Purification – Mass Spectrometry (AP-MS)

2

Proximity – Dependent Labeling (PDL)

3

Complex Centric Proteome Profiling (CCPP)


1

Affinity Purification – Mass Spectrometry (AP-MS)

Là một kỹ thuật hiện đại trong việc thu hồi sinh hoá của các protein liên kết và phức hợp protein từ tế bào và phân tích chúng bằng

phương pháp khối phổ


2

Proximity – Dependent Labeling (PDL)


3

Complex Centric Proteome Profiling (CCPP)


Thay đổi đường truyền tín hiệu trong tế bào khi bị lây nhiễm SARS-COV-2

Mục đích

 Tái bản trong vật chủ
 Tránh được phản ứng miễn dịch của vật chủ
Đích ảnh hưởng

 Phosphorylation
 Ubiquitylation
Phát triển thuốc or Tái sử dụng thuốc


Thay đổi đường truyền tín hiệu trong tế bào khi bị lây nhiễm SARS-COV-2

Phosphorylation

 PTM thuận nghịch, nhanh chóng
 Điều chỉnh protein virus
 Thay đổi hoạt tính enzyme vật chủ
Hỗ trợ virus tái bản


Thay đổi đường truyền tín hiệu trong tế bào khi bị lây nhiễm SARS-COV-2

Phosphoproteomics







Trypsin
Lys C

IMAC
MOAC




SCX
RPLC


Thay đổi đường truyền tín hiệu trong tế bào khi bị lây nhiễm SARS-COV-2

Ubiquitylation

 PTM thuận nghịch, nhanh chóng
 Thối biến or thay đổi hoạt động protein
 Virus không chứa gen mã hóa ubiquitin
 Chúng tận dụng UPS của vật chủ
Loại bỏ các yếu tố ức chế sự xâm
nhập của virus


Thay đổi đường truyền tín hiệu trong tế bào khi bị lây nhiễm SARS-COV-2

Ubiquitomics

Độ nhạy phát hiện phụ thuộc vào 4 yếu tố:

 Mức độ làm giàu protein được tạo ra
 Nồng độ tạp chất và peptides khơng phân tích
 Tính nhạy của hệ thống
 Tính phức tạp của hỗn hợp peptides