Thẩm định phương pháp định lượng oxostephanin trong dược liệu và ứng dụng khảo sát hàm lượng hoạt chất theo thời gian thu hái

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

BÙI VĂN SƠN

THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP
ĐỊNH LƯỢNG OXOSTEPHANIN
TRONG DƯỢC LIỆU VÀ ỨNG
DỤNG KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG
HOẠT CHẤT THEO THỜI GIAN
THU HÁI

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2022


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

BÙI VĂN SƠN
Mã sinh viên: 1701493

THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP
ĐỊNH LƯỢNG OXOSTEPHANIN
TRONG DƯỢC LIỆU VÀ ỨNG
DỤNG KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG
HOẠT CHẤT THEO THỜI GIAN
THU HÁI
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:

1. PGS.TS. Nguyễn Thị Thuận
2. ThS. Trần Thị Thu Hiền
Nơi thực hiện:
Bộ môn Hóa Dược, Đại học Dược Hà Nội

HÀ NỘI – 2022


LỜI CẢM ƠN
Trước khi trình bày những nội dung thuộc đề tài nghiên cứu của mình, tơi xin được
gửi lời cảm ơn chân thành đến những người đã luôn đồng hành, giúp đỡ tơi trong suốt
q trình nghiên cứu khoa học tại trường Đại học Dược Hà Nội.
Đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến giảng viên hướng dẫn của tôi là
PGS.TS Nguyễn Thị Thuận – giảng viên Bộ mơn Hóa Dược trường Đại học Dược Hà
Nội và ThS. Trần Thị Thu Hiền – Học viện Y Dược học cổ truyền Việt Nam đã tận
tình chỉ bảo hướng dẫn, động viên tơi trong q trình nghiên cứu, giúp tơi hồn thành
đề tài khóa luận tốt nghiệp.
Tơi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các giảng viên, kỹ thuật viên Bộ mơn Hóa Dược,
Trường Đại học Dược Hà Nội đã luôn giúp đỡ, tạo điều kiện cho tơi hồn thành khóa
luận tốt nghiệp Dược sĩ.
Cuối cùng, tơi xin dành lời cảm ơn chân thành nhất cho gia đình, bạn bè đã ln
ủng hộ và động viên tơi trong suốt những năm tháng học tập và nghiên cứu ở mái trường
này. Đặc biệt, tôi xin cảm ơn anh Dương Tiến Anh, chị Đinh Thị Lý, chị Trần Thị
Huyền Trang, bạn Phạm Thị Thu Trang, bạn Nguyễn Bình Minh, em Lã Hải Long,
em Phạm Thúy Hà, em Phạm Quỳnh Mai đã luôn đồng hành, chia sẻ buồn vui và giúp
đỡ tơi trong suốt q trình nghiên cứu ở bộ môn.

Hà Nội, ngày 01 tháng 06 năm 2022
Sinh viên

Bùi Văn Sơn


MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN
MỤC LỤC
DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC BẢNG BIỂU
DANH MỤC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ ........................................................................................................2
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ..................................................................................3
1.1. Tổng quan về củ dịm ..................................................................................3
1.1.1. Đặc điểm thực vật ................................................................................3
1.1.2. Thành phần hóa học .............................................................................3
1.1.3. Oxostephanin........................................................................................4
1.1.4. Tác dụng sinh học của S.dielsiana Y.C.Wu và oxostephanin .............4
1.1.4.1. Tác dụng sinh học của S.dielsiana ....................................................4
1.1.4. Các phương pháp định lượng oxostephanin ........................................5
1.2. Vài nét về thẩm định phương pháp phân tích..............................................7
1.2.1. Độ phù hợp hệ thống ............................................................................7
1.2.2. Độ đặc hiệu ..........................................................................................7
1.2.3. Độ đúng ................................................................................................ 8
1.2.4. Độ chính xác ........................................................................................8
1.2.5. Khoảng tuyến tính ................................................................................8
1.2.6. Khoảng xác định ..................................................................................9
1.2.7. Giới hạn định lượng và giới hạn phát hiện ..........................................9
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................11
2.1. Nguyên liệu, thiết bị và đối tượng nghiên cứu ..........................................11
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ........................................................................11

2.1.2. Ngun vật liệu, hóa chất, dung mơi .................................................11
2.1.3. Thiết bị, dụng cụ ................................................................................11
2.2. Nội dung nghiên cứu .................................................................................11
2.2.1. Khảo sát quá trình xử lý mẫu ............................................................. 11
2.2.2. Khảo sát lại phương pháp phân tích ...................................................11
2.2.3. Thẩm định lại phương pháp phân tích ...............................................12
2.2.4. Ứng dụng ............................................................................................ 12
2.3. Phương pháp nghiên cứu: ..........................................................................12
2.3.1. Xử lý mẫu ........................................................................................... 12
2.3.2. Lựa chọn phương pháp phân tích .......................................................13
2.3.3. Thẩm định quy trình phân tích ........................................................... 13
2.3.4. Ứng dụng thực tế:...............................................................................14
2.4. Phương pháp xử lý số liệu .........................................................................15
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .......................................................... 16
3.1. Khảo sát quá trình xử lý mẫu ....................................................................16
3.1.1. Khảo sát số lần chiết ..........................................................................16
3.1.2. Khảo sát lượng dung môi chiết .......................................................... 16
3.1.3. Khảo sát thời gian chiết......................................................................17
3.2. Khảo sát lại phương pháp phân tích .......................................................... 18
3.2.1. Lựa chọn pha động .............................................................................18
3.2.2. Khảo sát lại tỷ lệ pha động .................................................................19
3.2.3. Khảo sát bước sóng phát hiện ............................................................ 19
3.3. Thẩm định phương pháp định lượng oxostephanin bằng HPLC ..............20
3.3.1. Độ phù hợp hệ thống ..........................................................................20
3.3.2. Độ đặc hiệu ........................................................................................21
3.3.3. Khoảng tuyến tính và đường chuẩn ...................................................22
3.3.4. Độ đúng .............................................................................................. 23

3.3.5. Độ chính xác (độ lặp lại và độ chính xác trung gian) ........................25
3.3.6. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) .................27
3.4. Kết luận về phương pháp định lượng oxostephanin trong dược liệu ........28
3.5. Ứng dụng thực tế .......................................................................................29
3.6. Bàn luận .....................................................................................................30
3.6.1. Về phương pháp xử lý mẫu ................................................................ 30
3.6.2. Về lựa chọn và xác định phương pháp ...............................................30
3.6.3. Về thẩm định phương pháp phân tích ................................................31
3.6.4. Về ứng dụng thực tế ...........................................................................31
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ........................................................... 33
4.1. Kết luận .....................................................................................................33
4.2. Đề xuất.......................................................................................................33
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
Ký hiệu

Tên đầy đủ

ACN

Acetonitril

AOAC

Hiệp hội các nhà phân tích hóa học chính thức

CHCL3

Cloroform

C8

Octylsilan

C18

Octadecylsilan

EtOH

Ethanol

H358

Tế bào ung thư biểu mô cuống phổi và phế nang ở người

HeLa

Tế bào ung thư cổ tử cung

Hep-2

Tế bào ung thư gan

H2 O

Nước

HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng

HPTLC

Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao

IC50

Nồng độ ức chế tối đa 50%

LD50

Liều gây chết 50%

LOD

Giới hạn phát hiện

LOQ

Giới hạn định lượng

LU

Tế bào ung thư phổi

MDA

Tế bào biểu mô được phân lập từ mô vú bệnh nhân ung thư

MeOH

Methanol

OVCAR-8

Tế bào ung thư buồng trứng

OXO

Oxostephanin

R

Hệ số tương quan

RD

Tế bào ung thư cơ vân

RSD

Độ lệch chuẩn tương đối (Relative standard deviation)

S

Diện tích pic

S. dielsiana

Stephania dielsiana

TEA

Triethylamin

TB

Trung bình


DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 1. 1: Các phương pháp định lượng oxostephanin .........................................6
Bảng 3. 1: Kết quả hàm lượng oxostephanin với số lần chiết khác nhau…….....16
Bảng 3. 2: Kết quả hàm lượng oxostephanin với lượng dung môi khác nhau.....17
Bảng 3. 3: Kết quả khảo sát thời gian chiết .........................................................17
Bảng 3. 4: Kết quả độ phù hợp hệ thống.............................................................. 21
Bảng 3. 5: Kết quả khảo sát độ tuyến tính ........................................................... 22
Bảng 3. 6. Kết quả độ thu hồi của OXO .............................................................. 24
Bảng 3. 7: Kết quả độ lặp lại giữa các ngày phân tích .........................................25
Bảng 3. 8: Kết quả độ chính xác trung gian khác người phân tích ......................26
Bảng 3. 9: Kết quả thẩm định độ lặp lại LOD .....................................................27
Bảng 3. 10: Kết quả độ lặp lại LOQ ....................................................................27
Bảng 3. 11: Kết quả định lượng Oxostephanin trong mẫu dược liệu ..................29

DANH MỤC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ
Hình 1.1:Cấu trúc hóa học của oxostephanin .................................................................4
Hình 3.1: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn OXO khi chạy pha động gradient ACN và đệm
phosphat – TEA pH = 3,0 .............................................................................................. 18
Hình 3.2: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn OXO khi chạy MeOH: acid formic 0,1% (35:65)
(v/v) ............................................................................................................................... 18
Hình 3.3: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn OXO khi chạy MeOH: acid formic 0,1% (v/v)
(40:60) ........................................................................................................................... 19
Hình 3.4: Sắc ký đồ dung dịch thử OXO khi chạy MeOH: acid formic 0,1% (v/v) (40:60)
.......................................................................................................................................19
Hình 3.5: Phổ hấp thụ tử ngoại của oxostephanin ........................................................20
Hình 3.6: Sắc ký đồ thẩm định độ đặc hiệu ..................................................................21
Hình 3.7: Chồng phổ UV OXO của dung dịch thử so với dung dịch chuẩn ................22
Hình 3.8: Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ của
OXO............................................................................................................................... 23
Hình 3.9: Đồ thị biểu thị hàm lượng oxostephanin theo thời gian thu hái ...................29


ĐẶT VẤN ĐỀ
Theo báo cáo của tổ chức y tế thế giới (WHO) ung thư hiện nay là nguyên nhân
gây tử vong thứ hai trên thế giới với gần 9,8 triệu ca tử vong (tức 1/6 số ca tử vong)
[16]. Trong đó tình trạng kháng thuốc là một trong những nguyên nhân dẫn đến thất bại
điều trị, do đó việc tìm những liệu pháp điều trị mới trở nên cấp thiết trong việc điều trị
ung thư hiện nay.
Trong đó oxostephanin là một trong những hoạt chất được phân lập trong củ và
lá của lồi Stephania dielsiana Y.C.Wu (củ dịm) có khả năng kháng mạnh các dòng tế
bào ung thư như: HeLa (tế bào ung thư cổ tử cung), HepG2, OVCAR-8 (tế bào ung thư
buồng trứng), MDA và H358 (tế bào ung thư biểu mô cuống phổi và phế nang ở người)
với giá trị IC50 nằm trong khoảng từ 1,66 đến 4,35 µM [1, 14]. Do đó với những nghiên
cứu về oxostephanin đang ngày càng thu hút được nhiều sự quan tâm của các nhà khoa

học. Hiện nay mức độ quan tâm về oxostephanin chỉ tập trung về tác dụng của chúng
trên lâm sàng mà chưa có nhiều nghiên cứu định lượng oxostephanin trong dược liệu.
Đáp ứng nhu cầu này và dựa trên một số nghiên cứu khả quan của một số tác giả
đã tiến hành trên Stephania dielsiana Y.C.Wu, cùng với điều kiện phịng thí nghiệm, đề
tài: “Thẩm định phương pháp định lượng oxostephanin trong dược liệu và ứng dụng
khảo sát hàm lượng hoạt chất theo thời gian thu hái” được thực hiện với những mục
tiêu sau:
1. Thẩm định lại phương pháp định lượng oxostephanin trong dược liệu bằng
phương pháp HPLC.
2. Ứng dụng khảo sát hàm lượng oxostephanin trong dược liệu thu hái tại các thời
điểm khác nhau trong năm.


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về củ dòm
1.1.1. Đặc điểm thực vật
Cây củ dịm có tên khoa học Stephania dielsiana Y.C.Wu thuộc chi Stephania
Lour., họ Tiết dê (Menispermaceae) [4, 11].
Chúng có một số đặc điểm thực vật như: cây thảo leo, có củ thn dài hơn củ
bình vơi, mọc nổi, ngang mặt đất, hình giống tư thế con gà mái đang ấp trứng, củ cắt
ngang có màu vàng rõ hơn, ít xơ hơn, có vị đắng và tê hơn so với củ bình vơi [10], phiến
lá hình khiên; gốc bằng hoặc hơi lõm, đầu nhọn, mép nguyên hoặc có ít răng rất nhỏ ở
phía đầu lá, hơi lượn, bấm sóng, bấm lá có nhựa màu tím hồng, cuống lá dài 4,5 - 8,5
cm, đính vào 2/3 phiến lá; gân lá xếp dạng chân vịt, nửa cuống lá phía trên và gân lá mặt
sau có màu tím hoặc màu hồng [11].
Hoa nhỏ, đơn tính, khác gốc; hoa đực tụ hợp thành tán giả, có 6 lá đài màu tím
xếp thành hai vịng; 3 cánh hoa màu vàng cam; nhị đính trên mơi trụ ngắn; hoa cái thành
dang đầu, có 1 lá đài màu tím, 2 cánh hoa màu vàng cam có vân tím, đầu nhụy chia thùy.
Quả hình trứng, dẹt, dài 0,8 - 0,9 cm; hạt có 4 hàng gai cong và có lỗ ở giữa. Mùa hoa:
tháng 4 - 5; mùa quả: tháng 6 - 7 [11].

Chi Stephania Lour. gồm các lồi là dây leo, rụng lá mùa đơng; phân bố chủ yếu
vùng nhiệt đới và á nhiệt đới châu Á, có 10 - 12 lồi, trong đó có 2 - 3 lồi khơng có rễ
phình thành củ [11]. Củ dịm có thể sống cả ở vùng núi đá lẫn rừng núi đất, cả ở nơi có
nhiều đá lộ đầu, phân bố nhiều tại các tỉnh Lào Cai, Yên Bái, Ba Vì, Hà Bắc, Quảng
Ninh, ngồi ra chúng cũng có thể tìm thấy tại Trung Quốc [10].
1.1.2. Thành phần hóa học
Năm 2009, Zhang Yi và các cộng sự đã cơng bố phân lập được 12 hợp chất từ
lồi Stephania dielsiana là sinoacutin, stephanin, ayuthianin, dehydrostephanin,
cephamorphinanin, aknadinin, liriodenin, sinomenin, L-tetrahydropalmatin, (-)
corydalmin, oxocrebanin, nor-canelillin [8, 17].
Năm 2011, Yecheng Deng và các cộng sự đã công bố phân lập được các alkaloid
từ thân của Stephania dielsiana Y.C.Wu trong đó stephanin và crebanin thuộc nhóm
aporphin được chứng minh có khả năng kháng khuẩn phổ rộng trên nấm gây bệnh và vi
khuẩn Gram (+). Ngoài ra các nhà khoa học cũng nhận thấy rằng các chất thuộc nhóm
aporphin cũng có tính ức chế chống lại nấm và vi khuẩn gây bệnh thực vật [13].

3


Năm 2009, Nguyễn Quốc Huy và các cộng sự đã phân lập được 21 hợp chất có
trong Stephania dielsiana Y.C.Wu trong đó có chủ yếu là các alcaloid, một số là
flavonoid và terpenoid. Trong đó, dehydrocrebanin và oxostephanin lần đầu tiên được
phân lập từ loài S. dielsiana [5].
Năm 2020, James Knockleby và các cộng sự đã công bố tiến hành phân lập được
và đánh giá hoạt tính gây độc tế bào và chống co thắt của 7 alkaloid có trong Stephania
dielsiana Y.C.Wu bao gồm: oxostephanin, thailandin, stephanin, crebanin, O methylbulbocapin, palmatin clorid, tetrahydropalmatin. Kết quả cho thấy oxostephanin,
thailandin, stephanin, crebanin, O -methylbulbocapin có khả năng chống lại sự tăng sinh
của các dòng tế bào ung thư [14].
1.1.3. Oxostephanin
Sau khi được phân lập, một số đặc tính lý hóa của oxostephanin đã được nghiên

cứu và có đặc điểm như sau:

Hình 1.1:Cấu trúc hóa học của oxostephanin
• Danh

pháp

IUPAC:

9-methoxy-8H-[1,3]dioxolo[4',5':4,5]benzo[1,2,3-

de]benzo[g]quinolin-8-on.
• Cơng thức phân tử: C18H11NO4 [15].
• Khối lượng phân tử: 305,3 đvC [15]
• Cảm quan: tinh thể hình kim, màu vàng [6, 8]
• Điểm chảy: 160-162oC [6, 8].
• Độ tan: khơng tan trong nước, tan được trong methanol, diclomethan. Tuy nhiên
khi acid hóa dịch chiết, chúng dễ dàng chiết tách được bằng ethanol hoặc
methanol, ít tan trong nước và không tan trong diclomethan [6-8].
1.1.4. Tác dụng sinh học của S.dielsiana Y.C.Wu và oxostephanin
1.1.4.1. Tác dụng sinh học của S.dielsiana Y.C.Wu
Theo Nguyễn Quốc Huy và các cộng sự [5] dịch chiết S.dielsiana Y.C.Wu có một
số tác dụng như :
4


- Tác dụng giảm đau ngoại biên theo kiểu aspirin nhưng khơng có tác dụng giảm
đau trung ương theo cơ chế tương tự morphin.
- Tác dụng chống viêm xuất hiện sau 24 giờ, tác dụng chống viêm này chậm và
không giống tác dụng của indomethacin.

- Tác dụng gây độc tế bào: đã thử tác dụng gây độc tế bào trên 3 dịng ung thư thì
chỉ có hợp chất oxostephanin dương tính với cả 3 dịng tế bào thử nghiệm là tế bào ung
thư gan (Hep-2) và ung thư cơ vân (RD), tế bào ung thư phổi (LU) [5, 14].
1.1.4.2. Tác dụng sinh học của oxostephanin
Trong các alkaloid được phân lập từ Stephania dielsiana Y.C.Wu thì oxostephanin
có hoạt động chống lại mạnh nhất các dòng tế bào ung thư, mặc dù thailandin và
stephanin cũng cho khả năng ức chế mạnh [14].
Oxostephanin có khả năng kháng mạnh các dịng tế bào ung thư như: HeLa (tế bào
ung thư cổ tử cung), HepG2 (tế bào ung thư gan), OVCAR-8 (tế bào ung thư buồng
trứng), MDA và H358 (tế bào ung thư biểu mô cuống phổi và phế nang ở người) với giá
trị IC50 nằm trong khoảng từ 1,66 đến 4,35 µM [1, 14].
1.1.5. Các phương pháp định lượng oxostephanin
Hiện nay trong các dược điển chưa có chun luận về củ dịm cũng như
oxostephanin. Bên cạnh đó các bài báo các cơng bố khoa học về định lượng
oxostephanin vẫn còn hạn chế về mặt số lượng. Qua tìm hiểu nhóm nghiên cứu nhận
thấy có hai phương pháp đã được áp dụng định lượng oxostephanin đó là HPLC và
HPTLC (Bảng 1.1). Tuy nhiên HPTLC lại có độ lặp lại kém và sai số lớn hơn so với
HPLC, ngồi ra khi phân tích bằng HPTLC kết quả phụ thuộc vào nhiều yếu tố như
nhiệt độ, độ ẩm…

5


Bảng 1. 1: Các phương pháp định lượng oxostephanin
Tài

Phương pháp

liệu

phân tích

[7]

HPTLC

Điều kiện phân tích
- Bản mỏng: silica gel 60 F254.
- Hệ dung mơi: CHCl3 : MeOH (9:1)
- Bước sóng phát hiện: 366 nm
- Cột Apollo C18 (250 mm x 4,6 mm, 5µm)
- Detector PDA, bước sóng phát hiện 254 nm
- Thể tích tiêm: 20 µL
- Tốc độ dịng: 1,3 ml/phút
- Pha động: hỗn hợp dung môi A (ACN) và dung môi B
(dung dịch đệm KH2PO4 20 mM : TEA (100:0,3)), điều

[5]

[8]

HPLC

HPLC

chỉnh đến pH = 3 bằng H3PO4 đặc), chương trình gradient
dung mơi.
- Chương trình gradient:
Thời gian
Dung mơi A

Dung mơi B
(phút)

(%)

(%)

0-21

20

80

21-22

20-40

80-60

22-29

40

60

29-30

40-20

60-80

30-35

20

80

- Cột Supelco C18 (5µm, 250mm x 4,6mm)
- Detector DAD, bước sóng 254nm.
- Pha động: MeOH : HCOOH 0,1% (v/v) = 35:65
- Thể tích tiêm mẫu 10µl
- Tốc độ dịng: 1 ml/phút
- Thời gian sắc ký: 50 phút

Với điều kiện có sẵn máy tại phịng thí nghiệm chúng tơi sử dụng HPLC làm thiết
bị phân tích. Nhận thấy với 2 phương pháp HPLC được sử dụng như trên thì đều dùng
sắc ký pha đảo với cột pha tĩnh C18 và detector DAD để phân tích.
Nhóm nghiên cứu tiến hành khảo sát lại hai pha động theo các tài liệu tham khảo,
lựa chọn phương pháp thích hợp và thẩm định lại phương pháp lựa chọn.
6


1.2. Vài nét về thẩm định phương pháp phân tích
Việc thẩm định quy trình phân tích nhằm chứng minh quy trình đó có phù hợp với
mục đích ứng dụng khơng. Trong nghiên cứu này, việc thẩm định lại phương pháp phân
tích được tiến hành theo “Hướng dẫn Asean về thẩm định quy trình phân tích” [3] và
AOAC [12]. Theo hướng dẫn này đối với phương pháp phân tích định lượng cần thẩm
định lại các chỉ tiêu sau:
- Độ phù hợp hệ thống
-

Độ đặc hiệu
Độ đúng

-

Độ chính xác (độ lặp lại và độ chính xác trung gian)
Khoảng tuyến tính

- Khoảng xác định
- Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng
1.2.1. Độ phù hợp hệ thống
Độ phù hợp hệ thống là phép thử để đánh giá độ ổn định của toàn hệ thống phân
tích như máy móc, thiết bị.
Độ phù hợp hệ thống được tiến hành bằng cách tiêm lặp lại nhiều lần một dung
dịch chuẩn đồng nhất chứa hoạt chất phân tích. Độ thích hợp hệ thống cho biết hiệu
năng của thiết bị và hệ thống sắc ký trong ngày tiến hành thí nghiệm. Mẫu đánh giá tính
thích hợp hệ thống thường sử mẫu có nồng độ 100% nồng độ định lượng, tuy nhiên vẫn
có thể sử dụng các mẫu nồng độ khác miễn là mẫu đó vẫn thuộc khoảng tuyến tính.
Yêu cầu: Giá trị độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của diện tích (chiều cao) và thời
gian lưu của chất phân tích nhỏ hơn 2%.
1.2.2. Độ đặc hiệu
Là khả năng đánh giá rõ ràng chất cần phân tích khi có mặt các chất khác như tạp
chất, chất phân hủy, chất nền…
Để thẩm định độ đặc hiệu của phương pháp HPLC cần tiến hành chuẩn bị một số
dung dịch sau:
- Mẫu dung môi
- Mẫu nền (giả dược - placebo): mẫu giả dược bao gồm các thành phần tương tự
như chế phẩm thuốc nhưng khơng chứa chất phân tích, được chuẩn bị giống như mẫu
thử.

- Mẫu chuẩn: có chứa chất phân tích bằng với lượng mẫu thử được chuẩn bị giống
mẫu thử.
- Mẫu thử: mẫu thử tại nồng độ 100%.

7


- Mẫu thử thêm chuẩn: mẫu thử được thêm chính xác một lượng chuẩn sao cho
tổng hàm lượng chất phân tích sau khi thêm chuẩn bằng với lượng chất phân tích có
trong mẫu thử.
u cầu: sắc ký đồ mẫu thử, mẫu chuẩn và mẫu thử thêm chuẩn có cùng thời gian
lưu của chất phân tích. Mẫu dung mơi và mẫu trắng không xuất hiện pic tại thời gian
lưu của chất phân tích trong mẫu chuẩn và mẫu thử.
1.2.3. Độ đúng
Độ đúng chỉ mức độ gần nhau giữa giá trị trung bình của các kết quả thử nghiệm
và giá trị thực hoặc giá trị được chấp nhận là đúng.
Đối với các mẫu dược liệu độ đúng được làm theo phương pháp thử thêm chuẩn.
Thêm chuẩn được thực hiện ở 3 mức nồng độ thấp, trung bình và cao (ví dụ 60%, 100%,
120% so với hàm lượng lý thuyết trong mẫu thử) và cả 3 mức nồng độ phải nằm trong
khoảng tuyến tính.
Tại mỗi nồng độ trên thực hiện ít nhất 4 lần độc lập, phân tích mẫu theo quy trình
phân tích. Tiến hành sắc ký, tính lượng thu hồi chuẩn thêm vào. Độ đúng được đánh giá
thông qua giá trị thu hồi trung bình tại các mức nồng độ và RSD của các mẫu.
1.2.4. Độ chính xác
Độ chính xác của một quy trình phân tích diễn tả sự thống nhất (mức độ phân tán)
kết quả giữa một loạt phép đo từ nhiều lần lấy mẫu trên cùng một mẫu thử đồng nhất
dưới những điều kiện mơ tả. Độ chính xác có thể chia làm 3 cấp: độ lặp lại, độ chính
xác trung gian và độ tái lặp. Độ chính xác được tiến hành trên mẫu thử.
+ Độ lặp lại: diễn tả độ tái lặp diễn tả độ chính xác của một quy trình phân tích
trong cùng điều kiện thí nghiệm, trong khoảng thời gian ngắn. Đánh giá độ lặp lại bằng

cách tiến hành tiêm sắc ký 6 mẫu thử độc lập có nồng độ tương ứng với 100% giá trị ghi
trên nhãn.
+ Độ chính xác trung gian: độ chính xác trung gian diễn tả mức độ dao động của
kết quả trong cùng một phịng thí nghiệm được thực hiện ở các ngày khác nhau, kiểm
nghiệm viên khác nhau và thiết bị khác nhau.
+ Độ tái lặp: diễn tả độ chính xác giữa các phịng thí nghiệm
1.2.5. Khoảng tuyến tính
Tính tuyến tính của một quy trình phân tích diễn tả kết quả phân tích thu được tỷ
lệ với nồng độ (trong khoảng nhất định) của chất phân tích.
Xác định khoảng tuyến tính trong HPLC bằng cách tiến hành sắc ký các dung dịch
chuẩn theo quy trình phân tích. Xây dựng phương trình hồi quy biểu diễn mối quan hệ
giữa nồng độ với diện tích pic của các dung dịch chuẩn. Tính hệ số tương quan R.

8


u cầu: Phương trình hồi quy có dạng đường thẳng và 0,995 ≤ R ≤ 1, phần trăm
hệ số chắn ≤ 2 % so với đáp ứng của mẫu tại nồng độ 100% và độ chệch (bias) tại mỗi
điểm không quá ± 15 %.
1.2.6. Khoảng xác định
Khoảng xác định của một quy trình phân tích là khoảng cách giữa nồng độ trên và
dưới của chất phân tích trong mẫu thử (bao gồm cả các nồng độ này), trong khoảng nồng
độ này, quy trình phân tích đã được chứng minh đáp ứng độ chính xác, độ đúng và tính
tuyến tính.
1.2.7. Giới hạn định lượng và giới hạn phát hiện
Giới hạn phát hiện (LOD) là giới hạn thấp nhất của hoạt chất cần phân tích trong
mẫu mà phương pháp phân tích có thể phát hiện được. Giới hạn định lượng (LOQ) là
lượng nhỏ nhất của chất phân tích trong mẫu thử để có thể định lượng được với độ đúng
và độ chính xác thích hợp. Khơng có mức giới hạn bắt buộc phải đạt được đối với các
giá trị LOD và LOQ của mỗi phương pháp.

Giá trị LOD và LOQ có thể được xác định bằng một số phương pháp sau:
+ Dựa trên độ lệch chuẩn: Làm mẫu trắng, phân tích 10 lần song song, tính độ lệch
chuẩn, độ lệch chuẩn phải khác 0.
Trong đó:
𝑥0 Trung bình của mẫu trắng
̅̅̅:
LOD = ̅̅̅
𝑥0 + 3𝑆𝐷0
LOQ = ̅̅̅
𝑥0 + 10𝑆𝐷0 hoặc LOQ = 10𝑆𝐷

SD0: Độ lệch chuẩn của mẫu
trắng
SD: Độ lệch chuẩn của mẫu thử

+ Dựa vào đường tuyến tính và độ lệch chuẩn của đáp ứng
LOD có thể được xác định dựa vào độ dốc của đường chuẩn và độ lệch chuẩn của tín
hiệu đo.
LOD =
LOQ =

3,3 × 𝑆𝐷
𝑎
10 × 𝑆𝐷
𝑎

Trong đó:
SD là độ lệch chuẩn của tín hiệu
a là độ dốc của đường chuẩn
+ Dựa vào tỷ lệ đáp ứng so với nhiễu đường nền:

Tiến hành phân tích mẫu (mẫu thực, mẫu thêm chuẩn hoặc mẫu chuẩn) ở nồng
độ thấp cịn có thể xuất hiện tín hiệu của chất phân tích. Số lần phân tích lặp lại 4 lần.

9


Xác định tỷ lệ tín hiệu chia cho nhiễu (S/N). Trong đó S là chiều cao tín hiệu của chất
phân tích và N là nhiễu đường nền
Nhiễu đường nền được tính về hai phía của đường nền và tốt nhất là tính nhiễu
lân cận hai bên pic, bề rộng mỗi bên tối thiểu gấp 10 lần chiều rộng của pic tại nửa
chiều cao.
LOD được chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 2-3 lần nhiễu đường
nền, thông thường lấy S/N = 3. Trong khi LOQ được chấp nhận tại nồng độ lớn gấp
10-20 lần nhiễu đường nền, thông thường lấy S/N = 10.

10


CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu, thiết bị và đối tượng nghiên cứu
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Oxostephanin có trong dược liệu là thân lá cây củ dịm (S. dielsianna Y.C.Wu).
2.1.2. Ngun vật liệu, hóa chất, dung môi
- Chuẩn đối chiếu Oxostephanin: chuẩn đối chiếu oxostephanin do Học viện Y Dược
học cổ truyền Việt Nam cung cấp có độ tinh khiết 99,0% (HPLC).
- Acid formic: nhà sản xuất Xilong Scientific Co., Ltd.
- Methanol (HPLC), hãng sản xuất: Merk KGaA, Đức.
- Nước cất hai lần.
2.1.3. Thiết bị, dụng cụ
- Thiết bị:

+ Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao: Hãng Shimadzu, model: L20155518195
+ Cột Shim-pack GIST C18 (250 x 4,6mm; 5µm).
+ Bộ lọc dung mơi (màng lọc 0,45 µm).
+ Máy lọc hút chân khơng Gast Manufacturing, INC, Mỹ
+ Cân phân tích Mettler Toledo 21 XPE 105, Mỹ.
+ Máy đo pH Eutech, Singapore
+ Tủ lạnh Sanyon MDF U333, Nhật Bản.
+ Tủ sấy Memmert ULM 500, Đức.
+ Máy siêu âm Sonirex Bandelin, Đức
+ Máy cất nước hai lần Hamilton, Anh.
- Dụng cụ: Bình định mức, pipet chính xác, bình nón 100 ml, quả bóp cao su và các
dụng cụ thủy tinh khác.
2.2. Nội dung nghiên cứu
2.2.1. Khảo sát quá trình xử lý mẫu
Tiến hành khảo các điều kiện chiết (số lần chiết, lượng dung môi chiết và thời gian
chiết), phân tích mẫu thử bằng HPLC và đánh giá sơ bộ để chọn điều kiện chiết tối ưu
cho hoạt chất oxostephanin.
2.2.2. Khảo sát lại phương pháp phân tích
Trên cơ sở phương pháp do nhóm nghiên cứu của Tống Minh Thảo [9] và nhóm
nghiên cứu của Nguyễn Quốc Huy [8] đã xây dựng trước đó nên đề tài tiến hành khảo
sát lại để lựa chọn phương pháp định lượng oxostephanin trong Stephania dielsiana
Y.C.Wu.
Sau khi lựa chọn được phương pháp, nhóm nghiên cứu sẽ khảo sát lại một số tiêu
chí như tỷ lệ pha động và bước sóng phát hiện.
11


2.2.3. Thẩm định lại phương pháp phân tích
Thẩm định lại phương pháp phân tích theo “Hướng dẫn của ASEAN về thẩm định
quy trình phân tích” [3] và AOAC [12] với các tiêu chí sau:

- Độ phù hợp hệ thống
- Độ đặc hiệu
- Khoảng tuyến tính và đường chuẩn
- Độ đúng
- Độ chính xác (độ lặp lại và độ chính xác trung gian)
- Giới hạn phát hiện (LOD)
- Giới hạn định lượng (LOQ)
2.2.4. Ứng dụng
Ứng dụng phương pháp đã thẩm định lại để xác định hàm lượng của oxostephanin
trong dược liệu được thu hái ở các thời điểm khác nhau trong năm.
2.3. Phương pháp nghiên cứu:
2.3.1. Xử lý mẫu
2.3.1.1. Chuẩn bị mẫu chuẩn
- Dung dịch chuẩn gốc oxostephanin khoảng 1000 µg/ml: Cân chính xác khoảng
0,0200 g chuẩn oxostephanin vào bình định mức 20,0 ml; thêm khoảng 15 ml
MeOH, siêu âm 30 phút, thêm MeOH vừa đủ đến vạch, lắc đều. Chuẩn gốc được
bảo quản trong ở điều kiện 0 - 4℃.
- Dung môi pha mẫu: MeOH
- Từ dung dịch chuẩn gốc oxostephanin pha loãng 10 lần bằng MeOH để được dung
dịch chuẩn làm việc oxostephanin có nồng độ chính xác khoảng 100 µg/ml tương
ứng.
- Từ dung dịch chuẩn làm việc OXO pha lỗng bằng dung mơi pha mẫu thành dung
dịch chuẩn OXO có nồng độ phù hợp, lọc qua màng lọc 0,45 µm trước khi tiêm
sắc ký.
2.3.1.2. Chuẩn bị mẫu thử
- Dược liệu sau khi được thu hái, được phơi khô hoặc sấy ở điều kiện khơng q 60
độ, sau đó xay nhỏ. Tiến hành chiết tách oxostephanin bằng phương pháp siêu âm.
- Cân chính xác khoảng 0,5000 g dược liệu cho vào bình nón, thêm MeOH, siêu âm
trong 1 giờ. Lọc lấy dịch trong. Phần tủa được thêm MeOH (thể tích khảo sát) và
tiến hành như trên 1 hoặc 2 lần nữa (theo khảo sát). Gộp dịch lọc các lần vào bình

định mức 100,0 ml, thêm MeOH đến vạch. Lọc qua màng lọc kích thước 0,45 µm
và tiến hành tiêm sắc ký.

12


2.3.1.3. Chuẩn bị mẫu thử thêm chuẩn
Dung dịch thử được chuẩn bị như trên, thêm chính xác một lượng dung dịch chuẩn
oxostephanin vào dung dịch thử đã chuẩn bị trước để được các dung dịch có nồng độ
80 %, 100 %, 120 % so với mẫu thử. Lọc qua màng lọc kích thước 0,45 µm và tiến hành
tiêm sắc ký.
2.3.2. Lựa chọn phương pháp phân tích
Tiến hành khảo sát lại 2 phương pháp phân tích như tài liệu tham khảo [8, 9] để
lựa chọn phương pháp phân tích phù hợp với điều kiện. Sau khi lựa chọn được phương
pháp nhóm nghiên cứu sẽ khảo sát lại một số điều kiện:
- Khảo sát lại pha động: khảo sát tỷ lệ pha động đã lựa chọn ở trên để thu được sắc
ký đồ phù hợp nhất.
- Bước sóng phát hiện: lấy phổ tử ngoại của pic oxostephanin trên sắc ký đồ dung
dịch chuẩn, lựa chọn bước sóng thích hợp.
2.3.3. Thẩm định quy trình phân tích
Tiến hành thẩm định phương pháp định lượng theo “Hướng dẫn của ASEAN về
thẩm định quy trình phân tích” [3] và AOAC [12].
2.3.3.1. Độ phù hợp hệ thống:
Phân tích sắc ký lặp lại 6 lần mẫu chuẩn OXO, có nồng độ nằm trong khoảng tuyến
tính, ghi lại sắc ký đồ.
Đánh giá tính thích hợp của hệ thống về thời gian lưu, diện tích pic, số đĩa lý thuyết,
độ phân giải (RS), hệ số đối xứng pic của OXO.
Yêu cầu: RSD của thời gian lưu, diện tích pic ≤ 2,0% nếu khơng có quy định khác.
2.3.3.2. Độ đặc hiệu:
Phân tích trong cùng điều kiện và so sánh đáp ứng của các mẫu sau:

- Mẫu dung môi.
- Mẫu chuẩn OXO.
- Mẫu thử thêm chuẩn OXO.
- Mẫu thử.
Yêu cầu: Mẫu dung mơi khơng xuất hiện pic của chất phân tích tại thời gian lưu
của chất phân tích trong mẫu chuẩn, mẫu thử và mẫu thử thêm chuẩn. Mẫu chuẩn, mẫu
thử, mẫu thử thêm chuẩn có thời gian lưu của chất phân tích giống nhau. Pic của mẫu
thử và thử thêm chuẩn phải tách hoàn toàn với pic khác trong nền mẫu. Độ phân giải
giữa các pic chính khơng nhỏ hơn 1,5.
2.3.3.3. Khoảng tuyến tính và đường chuẩn
Từ dung dịch chuẩn làm việc nồng độ chính xác khoảng 100 µg/ml OXO pha lỗng
với dung mơi pha mẫu để được dãy dung dịch có nồng độ chính xác khoảng 2 ppm,
13


5 ppm, 10 ppm, 20 ppm, 25 ppm, 50 ppm, 100 ppm. Tiến hành sắc ký trong cùng điều
kiện, xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính và tính hệ số tương quan R.
Yêu cầu: Đường hồi quy có dạng đường thẳng và hệ số tương quan nằm trong
khoảng 0,995 ≤ R ≤ 1 (hoặc bình phương hệ số tương quan 0,99 ≤ R2 ≤ 1) và độ chệch
(bias) tại các điểm đều khơng q ± 15%.
2.3.3.4. Độ đúng
Thêm chính xác khoảng lượng dung dịch chuẩn OXO vào mẫu thử sao cho tổng
nồng độ sau khi thêm chuẩn tương ứng khoảng 20 ppm (80 %), 25 ppm (100 %),
30 ppm (120 %) nồng độ định lượng oxostephanin trong mẫu thử.
Tại mỗi nồng độ làm 6 mẫu độc lập, tiến hành tương tự như mẫu thử, phân tích
mẫu và ghi lại sắc ký đồ và tính độ thu hồi của OXO.
Yêu cầu: Phần trăm tìm lại của OXO ở mỗi nồng độ phải trong khoảng 95,0 % –
105,0 % và RSD của phần trăm tìm lại ở mỗi nồng độ ≤ 3,7%.
2.3.3.5. Độ chính xác (độ lặp lại, độ chụm trung gian):
- Độ lặp lại: Tiến hành phân tích độc lập 6 thử (kết hợp ở phần độ chính xác), tính

kết quả dựa vào điểm chuẩn tiến hành trong cùng điều kiện. Xác định độ lặp lại
bằng cách tính RSD giá trị các lần định lượng.
- Độ chính xác trung gian: Tiến hành tương tự độ lặp lại ở 3 ngày khác nhau và 2
người khác nhau. Dựa theo điểm chuẩn, tính nồng độ hoạt chất có trong các mẫu
thử. Xác định độ lặp lại trong ngày, khác ngày, khác người bằng cách tính tốn độ
lệch chuẩn tương đối (RSD %) giữa giá trị các lần định lượng.
Yêu cầu: RSD hàm lượng của OXO ≤ 3,7%.
2.3.3.6. Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng
Pha loãng mẫu chuẩn (để xác định LOD) và mẫu thử (để xác định LOQ) bằng dung
môi pha mẫu. Tiến hành phân tích các dung dịch pha lỗng trên. Trên sắc ký đồ thu
được, xác định đáp ứng pic (chiều cao) tương ứng với mỗi mức nồng độ. Xác định LOD
của phương pháp dựa vào tỷ lệ đáp ứng so với nhiễu. Trong đó LOD là giá trị nồng độ
mà ở đó có đáp ứng pic oxostephanin gấp khoảng 3 lần giá trị nhiễu đường nền. LOQ
có đáp ứng pic oxostephanin gấp khoảng 10 lần giá trị nhiễu đường nền.
Yêu cầu: RSD S/N của các dung dịch LOQ ≤ 8,0%.
2.3.4. Ứng dụng thực tế:
Ứng dụng phương pháp đã thẩm định lại để định lượng oxostephanin có trong dược
diệu được thu hái tại các thời điểm trong năm.
14


2.4. Phương pháp xử lý số liệu
Kết quả thực nghiệm được xử lí bằng thống kê trên phần mềm Microsoft Office
Excel 2019.

15


CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Khảo sát quá trình xử lý mẫu

3.1.1. Khảo sát số lần chiết
- Khảo sát hàm lượng oxostephanin sau các lần với dung môi là MeOH và sử dụng
sóng siêu âm để hỗ trợ chiết.
- Số lần khảo sát: 1 lần, 2 lần, 3 lần, 4 lần.
- Thời gian chiết mỗi lần: 1 giờ.
- Lượng dược liệu cân chính xác khoảng: 0,2500 g
- Lượng dung môi chiết mỗi lần: 50 ml, sau mỗi lần chiết lọc dịch chiết vào bình 50
ml là làm đầy bằng MeOH.
Kết quả khảo sát được trình bày trong bảng 3.1:
Bảng 3. 1: Kết quả hàm lượng oxostephanin với số lần chiết khác nhau
Tổng hàm lượng sau các

Số lần chiết

Hàm lượng (%)

Lần 1

0,347 ± 0,013

0,347

Lần 2

0,076 ± 0,003

0,423

Lần 3

0,033 ± 0,001

0,456

Lần 4

0,006 ± 0,000

0,462

lần chiết được (%)

Nhận xét: Nhìn vào bảng kết quả ta có thể thấy hàm lượng oxostephanin chiết được
sau 4 lần là lớn nhất. Tuy nhiên tổng hàm lượng chiết được sau 3 lần và 4 lần không
chênh lệch nhau quá nhiều (1,3 %) và nhiều hơn so với lần 2 (7,8 %). Do đó đề tài lựa
chọn số lần chiết 3 lần để đảm bảo lượng oxostephanin chiết được là tối ưu.
Kết luận: đề tài lựa chọn chiết 3 lần cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.1.2. Khảo sát lượng dung môi chiết
Khảo sát lượng oxostephanin chiết được với các lượng dung môi khác nhau.
Dung môi chiết là MeOH, số lần chiết 3 lần, mỗi lần 1 giờ.
Tổng lượng dung môi khảo sát: 25 ml/0,25 g dược liệu; 50 ml/0,25 g dược liệu,
100 ml/0,25 g dược liệu.
Kết quả khảo sát được thể hiện trong bảng 3.2:

16


Bảng 3. 2: Kết quả hàm lượng oxostephanin với lượng dung môi khác nhau
Tổng lượng dung môi chiết
(ml)

Hàm lượng (%)

25

0,362 ± 0,006

50

0,423 ± 0,001

100

0,425 ± 0,002

Nhận xét: hàm lượng oxostephanin khi chiết tỉ lệ dung môi/ dược liệu (ml/g) là
200 : 1 và 400 : 1, hàm lượng oxostephanin chiết được cao hơn đáng kể so với 100 : 1.
Điều này chứng tỏ với tỷ lệ 100 : 1 oxostephanin vẫn chưa được chiết kiệt. So sánh tỷ
lệ 200 : 1 và 400 : 1 hàm lượng oxostephanin chiết được không nhiều sự khác biệt.
Như vậy đề tài lựa chọn tổng lượng dung môi chiết/ dược liệu là 200 : 1 (ml/g) cho
các nghiên cứu tiếp theo
3.1.3. Khảo sát thời gian chiết
- Khảo sát lượng oxostephanin chiết được theo thời gian, với cùng lượng dung môi
và số lần chiết.
- Dung môi chiết: MeOH.
- Số lần chiết: 3 lần, sử dụng sóng siêu âm để hỗ trợ chiết xuất.
- Thể tích mỗi lần chiết lần lượt khoảng 40 ml, 30 ml, 30 ml. Gạn dịch chiết mỗi lần
vào bình định mức 100,0 ml, định mức đến vạch bằng MeOH. Lọc qua màng lọc
kích thước 0,45 µm và tiến hành tiêm sắc ký.
- Tổng thời gian khảo sát: 1 giờ, 2 giờ, 3 giờ, 4 giờ.

- Lượng cân chính xác khoảng 0,5000g.
Kết quả khảo sát được thể hiện trong bảng 3.3:
Bảng 3. 3: Kết quả khảo sát thời gian chiết
Tổng thời gian chiết

Hàm lượng trung bình (%)

1 giờ

0,321 ± 0,005

2 giờ

0,370 ± 0,029

3 giờ

0,442 ± 0,013

4 giờ

0,443 ± 0,021

17