PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH DẤU ACID NUCLEIC pptx

BỘ CÔNG THƯƠNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP TP. HỒ CHÍ MINH
Viện: Công Nghệ Sinh Học và Thực Phẩm
Bộ môn: Hóa sinh động vật

GVHD: Th.S Trần Hồng Bảo
Quyên
DANH SÁCH NHÓM
DANH SÁCH NHÓM
TT HỌ TÊN SINH VIÊN
1 Trương Văn Hiền
2 Nguyễn Xuân Giang
3 Hoàng Thị Lộc
4 Trương Thị Thúy Nga
5 Mai Nguyễn Bảo Ngân
6 Bùi Thị Hồng Ngọc
7 Nguyễn Kiều Oanh
NỘI DUNG CHÍNH
NỘI DUNG CHÍNH
I. Mục đích đánh dấu
II. Tác nhân đánh dấu
III. Phương pháp đánh dấu
IV. Các enzyme tham gia
I. MỤC ĐÍCH ĐÁNH DẤU
I. MỤC ĐÍCH ĐÁNH DẤU
Tạo mẫu dò cho lai phân tử để xác nhận sự
hiện diện của yếu tố đặc hiệu của sinh vật
đích dựa vào đặc tính bắt cặp bổ sung của
acid nucleic.
II. TÁC NHÂN ĐÁNH DẤU
II. TÁC NHÂN ĐÁNH DẤU

2.1. BẰNG ĐỒNG VỊ PHÓNG XẠ
2.1.1. Nguyên tắc làm việc
Với phương pháp đánh dấu bằng đồng vị phóng
xạ, người ta thường dùng
32
P,
35
S,
3
H phát ra tia
Beta năng lượng cao. Việc phát hiện các mẫu dò
được tiến hành nhờ kĩ thuật phóng xạ tự ghi.
II. TÁC NHÂN ĐÁNH DẤU
II. TÁC NHÂN ĐÁNH DẤU
2.1. BẰNG ĐỒNG VỊ PHÓNG XẠ
2.1.2. Ưu – nhược điểm

Ưu điểm:

Có độ nhạy cao

Cho tín hiệu mạnh với thời gian phơi sáng ngắn

Nhược điểm:

Có hại cho sức khỏe của con người

Đòi hỏi nhiều biện pháp an toàn, tốn kém trong thao tác
và xử lí chất thải.


Các mẫu dò không dùng được trong thời gian dài do
chu kì bán rã của các đồng vi phóng xạ.
II. TÁC NHÂN ĐÁNH DẤU
II. TÁC NHÂN ĐÁNH DẤU
2.2. BẰNG PHƯƠNG PHÁP HÓA HỌC
2.2.1. Sử dụng avidine – biotine:

Avidine được gắn với một nhóm phát huỳnh
quang hay một enzim xúc tác cho phản ứng tạo
màu.

Biotine được gắn vào DNA nhờ phản ứng hóa
học hoặc DNA được tổng hợp từ những
nucleotide có gắn biotine
II. TÁC NHÂN ĐÁNH DẤU
II. TÁC NHÂN ĐÁNH DẤU
2.2. BẰNG PHƯƠNG PHÁP HÓA HỌC
2.2.1. Sử dụng avidine – biotine:

Sau đó, biotine hiện diện trong phân tử lai được
phát hiện khi cho ligand của nó là avidine vào
phản ứng. Kết quả là những tín hiệu màu nhận
được trên màng lai.
II. TÁC NHÂN ĐÁNH DẤU
II. TÁC NHÂN ĐÁNH DẤU
2.2. BẰNG PHƯƠNG PHÁP HÓA HỌC
2.2.2. Dựa trên sự phát quang sinh học:

Đầu tiên mẫu dò được đánh dấu bằng
peroxidase


Sau đó cho tiếp xúc với một cơ chất của
peroxidase có khả năng phát sáng khi bị biến
đổi.

Ánh sáng sẽ phát sáng lên phim và kết quả thu
nhận là những chấm trên phim.
II. TÁC NHÂN ĐÁNH DẤU
II. TÁC NHÂN ĐÁNH DẤU
2.2. BẰNG PHƯƠNG PHÁP HÓA HỌC
2.2.3. Ưu – nhược điểm:

Ưu điểm:

Không gây hại cho sức khỏe của con người,

Ít tốn kém

Nhược điểm: độ nhạy kém
III. PHƯƠNG PHÁP DÁNH DẤU
III. PHƯƠNG PHÁP DÁNH DẤU
3.1. PHƯƠNG PHÁP NICK – TRANSLATION
III. PHƯƠNG PHÁP DÁNH DẤU
III. PHƯƠNG PHÁP DÁNH DẤU
3.2. PHƯƠNG PHÁP RANDOM PRIMING
III. PHƯƠNG PHÁP DÁNH DẤU
III. PHƯƠNG PHÁP DÁNH DẤU
3.3. PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH DẤU CÁC
OLIGONUCLEOTIDE
III. PHƯƠNG PHÁP DÁNH DẤU

III. PHƯƠNG PHÁP DÁNH DẤU
3.4. PHƯƠNG PHÁP TẠO MẪU DÒ RNA
(a)Gắn DNA vào vùng PCS
(b)Cắt plasmid ở vị trí ngay sau
đoạn gene (so với promoter
định sử dụng), tạo dạng thẳng
(c)Thêm SP6 hoặc T7 RNA pol và
các nucleotide tự do, trong đó
có 1 loại nucleotide đánh dấu
(d)Chọn lại các phân tử đánh dấu
có trình tự và kích thước mong
muốn
IV. CÁC ENZYME THAM GIA
IV. CÁC ENZYME THAM GIA
DNAse I có tác dụng:
•
Loại DNA tạp nhiễm trong các phân đoạn RNA hay protein
•
Tạo các chỗ đứt (nick) trên DNA trong kĩ thuật đánh dấu mẫu
dò kiểu Nick – translation.
•
Phát hiện các gen hoạt động trên nhiễm sắc chất.
IV. CÁC ENZYME THAM GIA
IV. CÁC ENZYME THAM GIA
DNA polymerase I có hoạt tính:
•
Exonuclease: thủy giải dần liên kết giữa các nucleotide từ đầu
phân tử DNA theo 2 chiều 5’ – 3’ và 3’ – 5’
•
Polymerase: tổng hợp theo chiều 5’ – 3’

Klenow của DNA pol I
•
Có hoạt tính polymerase và exonuclease
•
Mất đi hoạt tính 5’ – 3’ không mong muốn
IV. CÁC ENZYME THAM GIA
IV. CÁC ENZYME THAM GIA
Enzim t4 polynucleotid kinase: xúc tác sự chuyển nhóm
gama-phosphate của ATP cho đầu 5’ của DNA hay RNA. Có
hai kiểu phản ứng:
•
Nhóm gama- phosphate được chuyển đến đầu 5’ của một
DNA đã mất nhóm phosphate
•
Khi có một lượng thừa ADP, DNA chuyển nhóm phosphate
cho ADP và nhận nhóm gama- phosphate
T4 DNA ligase: nối 2 trình tự DNA đầu bằng
IV. CÁC ENZYME THAM GIA
IV. CÁC ENZYME THAM GIA
T7 RNA polymerase: có nguồn gốc từ phage xâm nhiễm
E.coli, xúc tác sự tổng hợp RNA từ một mạch của một phân tử
DNA mạch đôi theo chiều 5’ – 3’.
SP6 RNA polymerase: có nguồn gốc từ phage xâm nhiễm
Salmonella Typhimurium, có chức năng giống với T7