Nghiên cứu chủng vi khuẩn có khả năng kháng vi khuẩn vibrio gây bệnh cho tôm

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC

KHĨA LUẬN TÓT NGHIỆP

Đề tài
NGHIÊN củu CHỦNG VI KHUẤN CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG

VI KHƯÁN Vibrio GÂY BỆNH CHO TƠM

Ngi hướng dẫn : TS. Kiều Thị Quỳnh Hoa

Sinh viên thực hiện : Nguyễn Thị Kim Dung
Lóp

: 13-02

Hà Nội-2017


VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI
NGHIÊN củu CHỦNG VI KHUÁN CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG

VI KHUẨN Vibrio GÂY BỆNH CHO TƠM

Ngi hướng dẫn

: TS. Kiều Thị Quỳnh Hoa

Sinh viên thực hiện : Nguyễn Thị Kim Dung

Lóp

: 13-02

Hà Nội-2017


LỜI CẢM ƠN

Trước tiên, em xin gửi lời cám ơn tới các thầy cô giảo Khoa Công nghệ
sinh học, Viện Đại học Mở Hà Nội đã cho em một cơ hội học tập với những

bài giảng hay và nhiệt tình, đã tận tình hướng dan và chi bão em trong thời
gian học tập tại trường.

Em xin bày tỏ lòng biết OTÌ chân thành đến TS. Kiêu Thị Quỳnh Hoa,
Trường phịng Vi sinh vật dầu mó, Viện Cơng nghệ sinh học, Viện Hàn lâm

Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã ln tận tình hướng dan, dìu dắt, giúp
đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình thực tập và làm

luận văn tốt nghiệp.

Em cũng xin gửi lời cám ơn tới tập thê cán bộ Phòng Vi sinh vật dầu
mỏ, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Cơng nghệ Việt
Nam đã nhiệt tình giúp đỡ em hoàn thành luận văn này.

Cuối cùng, em xin được bày tỏ lịng biết ơn tới gia đình, bạn bè và
những người thân đã luôn bên em, luôn ùng hộ, động viên khích lệ em trong

suốt q trình hục tập để em có được kết quả tốt nhất ngày hôm nay.

Hà Nội, ngày 10 tháng 04 năm 2017

Sinh viên

Nguyễn Thị Kim Dung


MỤC LỤC

CÁC CHŨ VIẾT TẤT TRONG LUẬN VÀN................................................. 6
DANH MỤC HÌNH.............................................................................................. 7

DANH MỤC BẢNG............................................................................................. 9
MỎ ĐÀU.............................................................................................................. 10
PHÀN I : TỐNG QUAN TÀI LIỆU................................................................. 3

1.1.

Tình hình ni tơm ở trên thế giới và Việt Nam...................................3

1.1.1.

Tình hình ni tơm trơn thế giới......................................................3

1.1.2.

Tình hình ni tơm ở Việt Nam.......................................................4

1.2.

Các yếu tố ảnh hưởng tới năng suất nuôi tôm....................................... 6

1.2.1.

Mật độ con giống............................................................................... 6

1.2.2.

Các yếu tố vật lý và hóa học............................................................. 6

1.2.3.

0 nhiễm nguồn nước........................................................................ 9

1.3.

Vi sinh vật gây hại trong nước nuôi tôm.............................................. 9

1.3.1.

Vi sinh vật gây hại trực tiếp cho tôm.............................................. 9

❖

Vi rút gây bệnh cho tôm.................................................................. 13

❖

Nấm gây bệnh cho tôm.................................................................... 13

❖

Ký sinh trùng gây bệnh cho tôm.....................................................13

1.3.2.

Tảo và các vi khn gây hại gián tiếp cho tơm.............................13

1.4.

Tình hình nghiên cứu vi khuẩn kháng Vibrio gây bệnh cho ni tơm. 14

1.4.1.

Tình hình nghiên cứu trên thế giới................................................. 14

1.4.2. Tình hình nghiên cứu vi khuẩn kháng Vibrio gây bệnh cho tôm ở
Việt Nam......................................................................................................... 15

PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cúu......................16

2.1.

VẬT LIỆU.............................................................................................. 16

2.1.1.

Chúng vi khuấn nghiên cứu............................................................ 16

2.1.2.

Hóa chất............................................................................................ 16

2.1.3.

Thiết bị và dụng cụ.......................................................................... 16


2.2.

Phương pháp nghiên cứu....................................................................... 17

2.2.1.

Môi trường nghiên cứu.................................................................. 17

2.2.2.

Phương pháp phân lập vi khuấn có khá năng kháng Vibrio....... 17

2.2.3. Phương pháp xác định hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào, xác
định Gram và sự hình thành bào tử của vi khuẩn nghiên cứu.................. 18
2.2.4.

Phương pháp bão quăn giông vi khuân........................................ 19

2.2.5.

Xác định sự phát triển của vi khuẩn theo mật độ quang.............. 19

2.2.6.
chọn

Phương pháp đánh giá khá năng kháng Vibrio cùa vi khuấn lựa
19

2.2.7. Phương pháp phân loại vi khuẩn kháng Vibrio bằng phân tích trình
tự gen 16S rRNA........................................................................................... 20
2.2.8. Phương pháp đánh giá các yếu tố ảnh hường đến khả năng kháng
Vibrio của vi khuẩn lựa chọn........................................................................20
PHẦN 3: KÉT QUẢ........................................................................................... 22

3.1.

Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào của vi khuẩn kháng Vibrio... 22

3.2.

Lựa chọn các chủng vi khuân có khả năng kháng Vibrio................... 23

3.2. Phân loại chủng vi khuẩn nghiên cứu bằng phân tích trinh tự gen 16S
rRNA.................... .....................
26
3.3. Động thái sinh trưởng và khả năng kháng Vibrio của chủng vi khuấn B.

amyloliquefaciens AH-VT3-6......................................................................... 26
3.4. Ánh hướng cùa các yếu tố đến khá năng kháng V. parahaemolyticus
của chúng vi khuan B. amyloliquefaciens AH-VT3-6................................. 29
3.4.1.

Ảnh hưởng của nhiệt độ.................................................................. 29

3.4.2.

Ảnh hưởng của pH...........................................................................30

3.4.3.

Ảnh hưởng của NaCl..................................................................... 32

TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................... 36


CÁC CHỮ VIẾT TẢT TRONG LUẬN VĂN
FAO

Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc

GOAL

Liên minh Nuôi trong thúy sản toàn cầu

EU

Liên minh các nước Châu Âu

BOD

Nhu cầu oxy sinh học

HKTS

Hiếu khí tống số

vsv

Vi sinh vật


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Sản lượng tơm của Việt Nam (2012-2014)........................................ 4
Hình 1.2. Hình thái tế bào vi khuẩn Vibrio spp. dưới kính hiến vi điện tú' qt
(SEM)................................................................................................................... 10

Hình 1.3. Biếu hiện cùa tơm bị bệnh EMS ......................................................11
Hình 3.1: Hình thái khuẩn lạc của chúng vi khuấn AH-VT3-6 trên môi
trường HKTS...................................................................................................... 25

Hình 3.2: Hình thái tế bào của chủng AH-VT3-6 dưới kính hiến vi quang học
Olympus (Nhật) (1000 x) .................................................................................. 25
Hình 3.3: Chủng AH-VT3-6 sinh trưởng và phát triển sau khi sốc nhiệt.... 26
Hình 3.4: Sự sinh trường và khà năng kháng V. parahaemolyticus cùa chủng

B. amyloliquefaciens AH-VT3-6 .......................................................................27

Hình 3.5: Khả năng đối kháng với V. parahaemolyticus cùa chúng

B. amyloliquefaciens AH-VT3-6 trên mơi trường thạch HKTS..................... 27
Hình 3.6: Sự sinh trường và khả năng kháng V. vulnificus cùa chúng

B. amyloliquefaciens AH-VT3-6 ...................................................................... 28
Hình 3.7: Khả năng đối kháng với V. vulnificus của chủng

B. amyloliquefaciens AH-VT3-6 trên môi trường thạch HKTS..................... 28

Hình 3.8: Sự sinh trưởng và khả năng kháng V. parahaemolyticus của chủng
B. amyloliquefaciens AH-VT3-6 ở các nhiệt độ khác nhau ........................... 29
Hình 3.9: Ánh hướng cùa nhiệt độ tới khá năng sinh trưởng và kháng

V.

parahaemolyticus của chúng B. amyloliquefaciens AH-VT3-6............ 30

Hình 3.10: Sự sinh trưởng và khá năng kháng V. parahaemolyticus của chúng

B. amyloliquefaciens AH-VT3-6 ở pH khác nhau.......................................... 31
Hình 3.1 ỉ: Ánh hưởng của pH tới sinh trưởng và khả năng kháng

V.

parahaemolyticus của chùng B. amyloliquefaciens AH-VT3-6............ 31

Hình 3.12: Sự sinh trưởng và khả năng kháng V. parahaemolyticus của chủng
AH-VT3-6 ở các nồng độ NaCl khác nhau.......................................................33
Hình 3.13: Ảnh hướng cùa nồng độ NaCl tới khá năng sinh trướng và kháng

V.

parahaemolyticus cúa chúng B. amyloUquefaciens AH-VT3-6............ 33


DANH MỤC BẢNG
Báng 3.1: Các chủng vi sinh vật thu được từ mẫu bùn và nước tại
Thanh Hóa....................................................................................................... 22

Báng 3.2. Các chúng vi sinh vật có khả năng kháng Vibrio........ 24


MỞ ĐẦU

Ngành thúy sàn nói chung và ngành ni tơm nói riêng có vị trí đặc biệt
quan trọng trong chiến lược phát triến kinh tế - xã hội ờ nước ta. Trong những
năm qua sản xuất thủy sân đã đạt được những thành tựu đáng kế góp phần
tăng trường GDP của cả nước. Năm 2016, tổng giá trị kim ngạch xuất khẩu

tính riêng ngành tơm là 3,1 tì USD tăng khoảng 4% so với năm 2015, đưa
tổng giá trị xuất khẩu thủy sản cả nước cán đích trên 7 ti USD. Tuy nhiên,

ngành nuôi tôm hiện đang gặp phải những vấn đề bất cập như: ô nhiễm nước

nuôi tôm do nước thãi dư thừa thức ăn, chất hữu cơ dẫn đến xuất hiện vi sinh

vật gây bệnh làm tôm chết hàng loạt. Các vi sinh vật (VSV) chú yếu gây bệnh
cho tôm phải kê đến là vi rát, vi khuấn, nguyên sinh động vật, các ký sinh

trùng... Trong đó, vi khuẩn Vibrio là một trong số vsv gây bệnh nguy hiếm
nhất. Hầu như tất cá các loài động vật thúy sán ni nước lợ và mặn đều có
thể bị nhiễm và chịu tác hại của bệnh do vi khuẩn Vibrio gây ra. Nhóm vi

khuấn này là yếu tố kìm hãm sự phát triển và mờ rộng sán xuất trong nuôi

trồng thủy sản nói chung và ni tơm nói riêng. Chúng gây ra các bệnh nguy
hiểm như bệnh phát sáng trên ấu trùng tôm, bệnh nhiễm khuẩn và hoại tử gan
tụy ở tơm.

Vì vậy, việc nghiên cứu vi khuẩn kháng vi khn gây bệnh cho tơm nói

chung và kháng Vibrio nói riêng giúp nâng cao sán lượng tôm là cần thiết.
Xuất phát từ nhu cầu tìm kiếm các chúng vsv hữu ích ức chế sự phát triển

cùa vi khuấn gây bệnh cho tôm, đảm bảo cân bằng môi trường sinh thái giúp
nâng cao sán lượng tôm thương phàm, đề tài luận văn: “Nghiên cừu chủng vi
khuân có kha năng kháng vi khuẩn Vibrio gây bệnh cho tôm" được tiến

hành. Mục tiêu của đề tài nhằm lựa chọn chúng vi khuân kháng Vibrio gây
bệnh cho tơm nhằm giái quyết những khó khăn cúa ngành ni trồng thúy
sản nói chung và ngành ni tơm cơng nghiệp nói riêng.
❖ Mục tiêu nghiên cứu:

-

Lựa chọn được chủng vi khuẩn kháng Vibrio gây bệnh cho tôm


-

Xác định được các yếu tố ánh hướng đến khà năng kháng Vibrio cứa chúng

vi khuẩn lựa chọn.
-

Đánh giá được khá năng kháng Vibrio cùa chúng vi khuấn lựa chọn ớ các

điều kiện phù hợp.
❖

Nội dung nghiên cứu:

-

Phân lập và tun chọn một sơ chung vi khn có khả năng kháng vi khuân

gây bệnh Vibrio.

-

Phân loại chúng vi khuẩng kháng vi khuân Vibrio lựa chọn.

-

Nghiên cứu các yếu tố ảnh hướng đến khá năng kháng Vibrio cứa chúng vi

khuấn lựa chọn.

-

Đánh giá khá năng kháng Vibrio của chủng vi khuấn lựa chọn với các điều

kiện nuôi cấy phù họp.

2


PHẦN I : TĨNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Tình hình ni tơm ở trên thế giói và Việt Nam
1.1.1. Tình hình ni tơm trên thế giói
Ngành ni tơm thương mại trên thế giới bắt đầu vào những năm 1970

và tập trung chủ yếu ở các nước Châu Á và châu Mỹ La Tinh như Trung
Quốc, Thái Lan, Indonesia, Àn Độ, Việt Nam, Brazil, Ecuador và Mexico.

Sản lượng tôm tăng trưởng mạnh mẽ nhằm đáp ứng nhu cầu tiêu thụ lớn tại
thị trường các nước như Hoa Kỳ, Nhật Bản và Tây Âu. Sàn lượng tôm thế
giới dự kiến tăng 7,7%/năm trong giai đoạn từ năm 2013 đến năm 2017 và đạt

trên 4,5 triệu tấn. Tuy nhiên, tại hội thảo thị trường thủy sàn tồn cầu ở Miami
- Florida đã có những dự đốn khơng mấy lạc quan về sản lượng tơm năm

2016, sản lượng chỉ đứng ở mức khoảng 3,5 triệu tấn, do dịch bệnh và thời

tiết đã làm ảnh hưởng đến việc tăng trưởng tôm ở Án Độ và Indonesia. Hiện
nay, khoảng 75% tống sàn lượng tôm được nuôi ở Châu Á đặc biệt là ớ Trung
Quốc và Thái Lan, 25% tổng sản lượng tơm cịn lại được ni ở các nước

châu Mỹ La tinh như Brazil, Ecuador và Mexico [24].

Châu Á là lục địa có săn lượng và ti lệ ni tơm lớn nhất. Trước năm
2003, các nước có sản lượng tôm nuôi lớn nhất thế giới (Thái Lan, Trung
Quốc, Inđônêxia, Ản Độ) chú yếu nuôi tôm sú hay tơm bàn địa. Nhưng sau

đó, tơm thè chân trắng đã được tập trung phát triền mạnh. Theo Liên minh

Nuôi trồng thúy sản toàn cầu (GOAL), nếu như nãm 2003 sàn lượng tơm thẻ
chân trắng là 1 triệu tấn thì đến năm 2012 sản lượng tôm thẻ chân trắng tăng

lên là 4 triệu tấn tương đương 19,4 tý USD [24],
Theo số liệu cùa Tố chức Nông lương Liên hiệp quốc (FAO), Sán lượng
tôm nuôi thế giới năm 2016 giảm so với năm 2015 vì giá tơm thế giới giảm và

dịch bệnh xãy ra ở một số nước sản xuất chính (Trung Quốc, Ẩn Độ, Thái
Lan, Indonesia) [23],
3


1.1.2. Tình hình ni tơm ở Việt Nam

Việt Nam nằm bên bờ Tây cùa Biến Đông, là một bicn lớn thuộc Thái
Bình Dương, bờ biển dài 3260 km, vùng nội thuỷ và lãnh hài rộng 226.000

km2, vùng biển đặc quyền kinh tế rộng hơn 1 triệu km2 với hơn 4.000 hòn
đảo, tạo nên 12 vịnh, đầm phá với tống diện tích 1.160 km2 được che chắn tốt
dễ trú đậu tàu thuyền. Nước ta với hệ thống sơng ngịi dày đặc và có đường
biến dài rất thuận lợi phát triển hoạt động khai thác và ni trồng thúy sàn và

trong đó không thế thiếu nuôi tôm ven biến và nội địa [9].
Theo số liệu cùa Tồng cục thủy sản (Hình 1.1), năm 2014 sản lượng tơm

nước lợ ước đạt 660 nghìn tấn, tăng 22% so với năm 2013. mức tăng cao nhất
trong nhiều năm trở lại đây. Đặc biệt, sản xuất tơm chân trắng tăng trướng

mạnh cá về diện tích và sán lượng. Trong khi đó, diện tích và sàn lượng ni
tơm sú được duy trì ơn định so với năm trước. Giá trị xuât khâu mặt hàng tôm
tăng 26,9%, chiếm tỷ trọng 50,8% tổng giá trị xuất khấu thủy sản. Trong đó,
xuất khâu tơm chân trắng tăng 46,3% và tơm sú tăng 4,2% với giá trị tương

ứng đạt 2,31 tỷ USD và 1,39 tỷ USD.
Sàn lirọ ng tôm cùa Việt Nam, 2012- 2014 (tấn)

2012

2013

■ Tịm sú

2014

«T0m chán trang

Hình 1.1. Sàn lượng tôm của Việt Nam (2012-2014)

4


Năm 2016, mặc dù tình hình hạn mặn và dịch bệnh làm ảnh hướng nhiều

tới nuôi tôm nước lợ trong 9 tháng đầu năm. Tuy nhiên, mưa nhiều trong

những tháng cuối năm, độ mặn giám, cùng với sự chi đạo sát sao của các cấp
trong việc kiếm soát dịch bệnh nên sản lượng thu hoạch tăng vào những tháng
cuối năm. Sản lượng tơm nước lợ cả nước ước tính đạt 650 nghìn tấn (tăng

3,2%).Tại các tỉnh đồng bằng sơng Cửu Long, diện tích tơm sú ước đạt
569.500 ha (tăng 1,8%), sản lượng ước đạt 251 nghìn tấn (tăng 2,1%). Diện

tích nuôi tôm thê chân trắng ước đạt 64.440 ha, tăng 11,5% so với năm 2015,

sản lượng ước tính đạt 253.1 nghìn tấn (tăng 15,6%) [3],
Theo số liệu của Tổng cục Hải quan, tính đen tháng 10/2016, kim ngạch
xuất khấu tơm vào thị trường Mỹ của Việt Nam đạt 604,4 triệu USD, chiếm tỷ

trọng 23,4% tổng kim ngạch xuất khẩu tôm trong 10 tháng đầu năm. Mỳ cũng
là thị trường nhập khẩu tôm chân trắng lớn nhất cùa Việt Nam chiếm tỷ trọng

75% tổng nhập khấu tôm từ Việt Nam; tôm sú chiếm 22% và tôm biến 3%

trong 9 tháng đầu năm nay [22],
Trong tháng 11/2016, xuất khẩu tôm sang EU đạt 50,5 triệu USD; tăng

14% so với cùng kỳ năm ngoái. Lũy kế tới tháng 11 năm nay, xuất khau sang
thị trường này đạt trên 548 triệu USD; tăng 7,3% so với cùng kỳ năm 2015.

EU vẫn là thị trường tiêu thụ tôm lớn thứ 2 của Việt Nam sau Mỹ, chiếm tỷ
trọng 19% trong tổng xuất khấu tôm của Việt Nam. EU ưa chuộng các sản

phẩm có giá họp lý như tôm thẻ chân trắng. Trong 9 tháng đầu năm, tôm thẻ

chân trắng chiếm 72% tổng giá trị tôm Việt Nam xuất khẩu sang EU, tôm sú
chiếm 18% và tơm biến chiếm 10% [22].

Năm 2016 cịn là năm đánh dấu thắng lợi của ngành tôm Việt Nam về

mặt mở rộng thị trường xuất khấu. Cíing với đó, các doanh nghiệp tơm cịn
đấy mạnh chế biến các sản phấm giá trị gia tăng để xuất khấu và cung ứng thị

trường nội địa. Sự đa dạng này sê tạo nên diện mạo mới cho ngành tôm trong
thời gian tới.
5


1.2. Các yếu tố ảnh hưởng tói năng suất ni tôm
1.2.1. Mật độ con giống

Mật độ con giống là số lượng tôm hoặc trọng lượng tôm thà trên 1 đơn vị

diện tích mặt nước (số con giống/1 m2). Đe xác định mật độ thả thích hợp cho
diện tích ni và từng phương thức nuôi, các yếu tố cần quan tâm đến là diện

tích mặt nước, nguồn thức ăn, năng lực người ni...cho tùng loại tơm khác

nhau vì mồi loại tơm đều có u cầu khác nhau về kích thước lẫn khả năng
sổng phù hợp [6].

Mật độ ni thích họp là tận dụng được nguồn thức ăn tự nhiên, diện tích
mặt nước, nhân công, nhưng hạn chế được ô nhiễm môi trường đế tơm khoẻ
mạnh, ít bị bệnh hoặc khi bị bệnh thì mức độ lây bệnh thấp. Mật độ ni phải

phù hợp với mơ hình ni, loại thức ăn sử dụng, điều kiện ao ni, trình độ

chun mơn qn lý, thiết bị phụ trợ [4].

Mật độ nuôi tôm dày sẽ khiến tôm phải cạnh tranh cao về nguồn thức ăn
cũng như chồ cư trú trong ao hoặc nơi nuôi. Điều này sẽ ảnh hưởng tới quá

trình sinh trưởng và phát triên cúa tơm làm tơm chậm lớn. Vì vậy, nêu lựa
chọn được mật độ tôm nuôi vừa phải, đồng đều, nguồn thức ăn cung cấp đú

cho tơm thì năng suất sẽ đạt yêu cầu trong thời gian nuôi.
Ở Việt Nam có nhiều hình thức ni tơm khác nhau như: ni quảng
canh cải tiến, nuôi thâm canh, nuôi bán thâm canh, nuôi sinh thái ... mồi

phương thức nuôi tôm khác nhau sẽ yêu cầu mật độ tôm khác nhau.
1.2.2. Các yếu tố vật lý và hóa học

V

Nhiệt dộ của nước

Tơm thuộc nhóm động vật biến nhiệt, nhiệt độ cơ thế chúng chú yếu phụ

thuộc vào nhiệt độ của môi trường nước ao nuôi. Nhiệt độ quá cao hoặc quá
thấp đều không thuận lợi cho hoạt động cùa tôm. Nếu nhiệt độ môi trường

nước nuôi tôm vượt quá giới hạn cho phép sẽ dẫn tới việc tôm chết hàng loạt.
6

Mồi loại tơm sẽ có một ngưỡng nhiệt độ thích hợp khác nhau. Nhiệt độ thích

hợp nhất đối với tơm sú ni thương phẩm là 28°-32°C [1]. Trong khi đó,
nhiệt độ thích hợp với tơm thẻ chân trắng là 25-30°C.
Trong q trình ni dưỡng và vận chuyển tơm cần lưu ý sự chênh lệch

nhiệt độ và nhất là sự thay đối nhiệt độ đột ngột. Nếu nhiệt độ chênh
5oC/ngày có thể khiến tơm sốc và chết. Vì vây, tốt nhất không đế nhiệt độ

chênh quá 3°c và biên độ dao động nhiệt trong ngày không quá 3°c.
V Độ mặn của nước

Các lồi tơm khác nhau thích ứng với độ mặn khơng giống nhau. Tơm sú

thích hợp với độ mặn là 5-31 700, tơm chân trắng thích họp với độ mặn là 1525°/oo [!]• Khi độ mặn của nước thấp hơn 1 °/00 tôm sẽ mất thăng bàng trong

khoảng 1 giờ.
V Độ đục của nước

Độ đục cùa nước có thể là kết quả từ nhiều nguyên nhân khác nhau: do

nguồn nước, nước rứa trơi, bụi phóng xạ từ khơng khí, do chuyến động của

dòng nước, sự phát triển của tào, do thức ăn dư thừa hay do chất thải của
tôm... Độ đục sẽ khác nhau phụ thuộc vào vị trí ao, nguồn cấp nước, đối
tượng nuôi trong ao khác nhau.

Độ đục làm giảm ánh sáng mặt trời xâm nhập vào nước qua đó ức chế sự
tàng trướng cùa thực vật phù du, giám sán xuất oxy trong ao. Neu nước quá
đục có the gây ra chênh lệch nhiệt độ và phân tầng oxy hịa tan trong ao. Nó

cũng có thế gây tắc nghẽn mang tôm hoặc gây chấn thương trực tiếp đến các
mị cùa tơm. Ngược lại, nếu nước q trong chứng tỏ nghèo dinh dưỡng làm
giảm năng suất trong ao ni tơm.
V Hàm lượng oxy hịa tan

Hàm lượng oxy hịa tan trong nước rất cần thiết cho sự sinh trướng và

phát triển của tôm. Nhu cầu oxy phụ thuộc vào từng loài, từng giai đoạn phát
triển, trạng thái sinh lý và nhiệt độ. Khi nhiệt độ tăng thỉ nhu cầu oxy của tơm

cũng tăng lên. Nhu cầu oxy hịa tan tối thiểu với tôm là 5 mg/1. Trường họp
7


oxy quá thấp, dưới mức giới hạn cho phép tôm sẽ bị sốc ảnh hướng xấu sự
tăng trưởng và phát dục của chúng. Giới hạn gây chết của hàm lượng oxy hịa
tan đối với giống tơm sú và tơm thẻ chân trắng là 1,17-1,21 mg/1 [ 1 ].

J Độ pH của nước

Các lồi tơm khác nhau có thể sống được trong môi trường nước với dải
pH không giống nhau. Phần lớn pH phù hợp cho tôm sinh trướng và phát

triển là 6,5-9,0. Ngồi giá trị pH trên, tơm chậm phát triển, còi cọc. pH dưới
4,0 hoặc trên 11 là giới hạn gây chết cho tôm.
Trong ngày pH biến thiên theo ánh sáng và cường độ nắng cúa mặt trời

do liên quan tới sự quang hợp của thực vật trong nước. Trong ao nuôi tôm pH

tốt nhất từ 7,5-8,5 và không biến thiên quá 0,5 [1].
J Nồng độ H2S trong nước
H2S là hợp chất sinh ra do quá trình phân hùy các chất hữu cơ chứa lưu
huỳnh trong lớp bùn ở điều kiện yếm khí. Khí H2S ánh hướng tới sức khỏe

cùa tôm, phụ thuộc vào mức độ ô nhiễm trong môi trường nuôi tôm ở lớp bùn
đáy và pH cúa nước. Neu pH thấp thì H2S sẽ rất độc, đây là một trong những

nguyên nhân gây cho tôm nuôi bị sốc, dẫn đến tôm yếu và chết. Nồng độ H2S
trong ao cho phép là 0,02 mg/l [1],
Nồng độ Ammoniac (NH3)
Ammoniac (NH3) được tạo thành trong môi trường nước nuôi tôm do

các chất thài của nhà máy hóa chất, nước thái khu đô thị, dân cư gần địa bàn
nuôi tôm cũng như sự phân giái các chất hữu cơ trong nước và sản phẩm trao
đổi chất cùa vi sinh vật nói chung, tơm ni trong ao nói riêng.

Sự tồn tại NH3 trong nước nuôi tôm phụ thuộc rất nhiều vào nhiệt độ,
pH, độ mặn của nước ni. Nước càng mang tính axit (độ pH thấp) NH3 có

xu thế chuyến hóa thành NH4+ sẽ ít độc, mơi trường càng kiềm NH3 càng

bền vũng và gây độc cho tôm. Nồng độ NH3 thấp ớ 0,09 mg/1 đã gây cho tôm
càng xanh chậm phát triển và nồng độ 0,45 mg/1 sẽ là giảm tốc độ sinh trưởng

8


của tôm he đi 50%. Nồng độ NH3 giới hạn an tồn trong ao ni là 0,13mg/l
[!]■

1.2.3. Ơ nhiễm nguồn nước

Nước nuôi tôm đàm bảo chất lượng nước sạch, không bị ơ nhiễm, khơng
chứa các loại hóa chất, vi khuẩn, vi trùng gây bệnh sẽ giúp cho tơm có thể

tăng trướng và phát triển nhanh, ti lệ tôm nuôi bị chết, bị nhiễm bệnh thấp từ
đó cho năng suất thu hoạch cao trong cùng một diện tích ao ni.

Ngược lại, chất lượng nguồn nước không đàm bào, bị ô nhiễm, chứa
nhiều hóa chất và các loại vi sinh vật gây bệnh cao sẽ ngăn cán quá trình tăng
trưởng và phát triển của tơm ni, tơm bị cịi, chậm lớn, tỉ lệ tơm mắc bệnh

cao qua đó ánh hướng tới năng suất thu hoạch của đơn vị chăn nuôi.
1.3. Vi sinh vật gây hại trong nước nuôi tôm
Trong môi trường nuôi tơm tồn tại rất nhiều vi sinh vật có lợi cũng như có

hại cho tơm ni. Vi sinh vật gây bệnh cho tôm bao gồm vi khuấn, virut, ,

nguyên sinh động vật....
1.3.1. Vi sinh vật gây hại trực tiếp cho tôm
❖ Vi khuẩn gây bệnh cho tôm

V Vi khuan Vibrio

Vibrio là nhóm vi khn gây bệnh trực tiếp cho tơm. Vibrio thuộc họ

Vibrionaceae,

bộ

Vibrionales,

lóp

Gammaproteobacteria,

ngành

Proteobacterìa. Đặc diêm chung của nhóm vi khn này là gram (-), hình que
thắng hoặc hơi uốn cong, kích thước 0,3-0,5 X 1,4-2,6 pm, khơng hình thành
bào tử và chuyến động nhờ một tiên mao hoặc nhiều tiên mao mảnh. Vibrio

spp. không chi gây bệnh cho tôm mà còn gây bệnh cho cá, giáp xác, nhuyễn
thể...

9


Hình 1.2. Hình thái tế bào vi khuẩn Vibrio spp. dưới kính hiền vi điện tử quét

(SEM)
Vi khuan Vibrio gây bệnh phát sáng, đó dọc thân, ăn mịn vó kitin trên

tơm. Tơm bị nhiễm bệnh có hiện tượng biến đổi màu đỏ hay màu xanh, và ở
trạng thái khơng bình thường như: nối lên mặt ao, dạt bờ, kéo đàn bơi lịng

vịng. Ngồi ra cịn có trạng thái hơn mê, lờ đờ, kém ăn hoặc bỏ ăn, xuất hiện
các vết thương hoại tử, ăn mòn trên vỏ và các phần phụ.

> Một số bệnh cua tôm do vi khuẩn Vibio gây ra

Một số ví dụ điên hình về bệnh do Vibrio gây ra như V. anguillarum và
V. vulnificus gây bệnh nhiễm khuẩn máu cá trinh, V. salmonicida gây bệnh ờ

vùng nước lạnh, V. parahaemolyticus gây bệnh phát sáng ở ấu trùng tơm sú,
V. alginolyticus gây bệnh đó dọc thân ấu trùng tôm, V. parahaemolyticus, V.
harvey, V. vulnificus, V. anguillarum... gây bệnh đõ thân ớ tơm sú thịt, ăn

mịn vỏ ở giáp xác.

•

Bệnh hoại tử gan tụy cấp tính ( EMS/AHPND )
Nguyên nhân: Do chủng vi khuấn Vibrio parhaemolyticus có độc lực cao

gây nên. Khi mắc bệnh tôm sẽ bị teo gan tụy, gan tụy có màu nhợt nhạt đến
trắng, ruột tơm khơng có thức ăn hoặc đứt đoạn, tơm thường mềm vỏ, tỷ lệ

tôm chết cao. Tôm sú mắc bệnh EMS (Early Mortality Syndrome) thường có
màu đậm, chậm lớn (tương tự như bệnh tơm cịi MBV- Monodon Baculovirus

) các bicu hiện trên gan tụy tương tự như trên tôm thè chân trắng như màu sắc
nhợt nhạt, gan tụy teo, ruột khơng có thức ăn.
10


Biểu hiện bèn ngối của EMS

Tõm ni bình
thường

Bao từ đây thức ân

Tõm ni nhiễm EMS
Bao tứ trổng rịng

Gan tụy teo nhó và nhạt
màu

Gan tụy binh thường
vá khơng nhat màu

Đưịng ruột khơng chứa
thức ân

Đường ruột có chứa
thức ân

Hình 1.3. Biếu hiện của tơm bị bệnh EMS
•

Bệnh phát sáng ờ tơm
Bệnh phát sáng trên tơm do nhóm vi khuan Vibrio gây nên, trong đó

nguy hiểm nhất là Vibrio harveyi. Bệnh phát sáng xuất hiện quanh năm trên
các lồi tơm sú, thé chân trắng, càng xanh...

Bệnh phát sáng có thể xảy ra trong tất cả các giai đoạn ương nuôi từ

trứng đến tôm trưởng thành hoặc có thể lây nhiễm từ mơi trường nước khi ao

bị ô nhiễm. Trong sản xuất giống, mầm bệnh được lây lan chú yếu bằng
đường ruột từ tôm mẹ sang ấu trùng trong giai đoạn sinh sản. Bệnh phát sáng
phát trien mạnh trong môi trường nước giàu dinh dưỡng, nhiều chất hữu cơ ở

độ mặn cao, thiếu oxy hịa tan, lây lan nhanh trong mùa nóng. Tơm nhiễm

bệnh, cơ the SC phát sáng, yếu, bơi không định hướng, tấp mé bờ, phản ứng
chậm chạp, bó ăn, chết rải rác. Mang và thân tơm có màu sẫm, bấn, thịt đục

màu, mất chức năng tiêu hóa, gan viêm và tco nhở. Tơm ấu trùng nhiễm bệnh

có màu trắng đục, nhiễm bệnh phát sáng nặng thì lắng dưới đáy bể ương và
chết hàng loạt. Ớ Thái Lan (1996), bệnh phát sáng đã gây chết hàng loạt tôm
ớ nhiều trang trại người dân buộc phái ngừng nuôi thà tôm [13].

11


•

Bệnh đỏ dọc thân
Tác nhân chính gây bệnh đó dọc thân ớ tôm thẻ chân trắng nuôi thương

phâm là

wssv {White spot syndrome virus) cùng với

các tác nhân gây bội

nhiễm là các lồi vi khuẩn Stapphylococus spl, Vibrio vulnificus, Vibrio,

anginolyticus...

Tơm bị hội chứng đỏ thân có biểu hiện bên ngồi rất rõ: tôm ăn yếu, tấp
bờ, cơ thể tôm bệnh chuyến sang màu hồng hoặc đó bầm. Có các đốm trắng

với đường kính 0,5 - 2 mm. Khi giải phẫu thấy gan tụy một số con có màu

trắng xám. Khi nhiễm bệnh tơm chết rải rác hoặc hàng loạt. Thậm chí có thể
chết 100% sau 4-8 ngày cám nhiễm bệnh. Đây được coi là bệnh nghiêm

trọng trong ngành nuôi tôm. Trong điều kiện mơi trường có nhiều vi khuẩn
gây bệnh, tơm nhanh chóng bị bội nhiễm, bùng phát hội chứng chết đó.
V Vi khuẩn Aeromonas

Aeromonas là vi khuẩn Gram (-), dạng hình quc ngắn, hai đầu trịn, sống
trong điều kiện yếm khí tuỳ tiện, thường gây bệnh đốm nâu, đen mang, đốm
đen trên vỏ cho tôm càng xanh.

Vi khuân Aeromonas chia thành hai nhóm chính:
+ Nhóm 1: Aeromonas khơng di động (A. salmonicida) thường gây bệnh ở

nước lạnh.

+ Nhóm 2: Là các loài Aeromonas di động, bao gồm A. hydrophyla, A.

caviae và A. sobria. Đặc tính chung cúa ba lồi vi khuẩn này là di động nhờ
có 1 tiên mao.
V Vi khuẩn Pesudomonas
Pseudomonas là nhóm vi khuẩn thuộc họ Pesudomonadaceae, Gram (-),

dạng hình que, khơng sinh bào tứ, chuyền động bàng một hoặc nhiều tiên
mao. Chúng phân bố khắp trong môi trường đất và nước.Vi khấn này là

nguyên nhân gây bệnh đốm nâu ở tôm càng xanh cùng với Aeromonas [3],
V

Vi khuẩn Escherichia coli (E.coli)

12


Tại Brazil, Teophilo và cộng sự (năm 2002) đã phân lập được các chúng

E.coli gây bệnh cho tôm [15], Năm 2014, tại Nevada (Mỹ) một báo cáo đã

chi ra rằng độc tố trong E.coli là nguyên nhân gây bệnh bơi bướm ở tôm [18],

Tại Án độ, (năm 2010) bệnh đốm đỏ do E. coli gây ra trên tôm lần đầu tiên
được báo cáo bởi Surcndraraj và cộng sự . Bệnh này đã gây thiệt hại đáng kể

về chất lượng tôm xuất khấu ớ nước này [16],
❖ Vi rút gây bệnh cho tôm

Vi rút Taura syndrome (TSV) gây bệnh cho tôm thẻ chân trắng và tôm

sú. Các dấu hiệu nhận biết bệnh do vi rút TSV gây ra là: Tôm thê chân trang
và tôm sú nhiễm hội chứng Taura do vi rút TSV gây ra có màu đỏ nhạt, mềm
vỏ và ruột rỗng. Hội chứng Taura làm tôm chết với tỷ lệ cao (thường tỷ lộ gây
chết từ 40% đến 90%) và lây lan nhanh
❖ Nấm gây bệnh cho tôm

Một số loài nấm thuộc chi Fusarium như Fusarium solani, F. moniliforme
và F. oxysporum là tác nhân gây bệnh đen mang ờ tôm he p. ịaponicus.Ạốm sú

p. monodon và tôm hùm Homarus americanus.
Nấm Acremonium gây bệnh đen mang ở tơm tít Oratosquilla oratoria và
tôm he p.japonicus [8],
❖ Ký sinh trùng gây bệnh cho tôm

Kỷ sinh trùng Microsporidian gây bệnh hoại tứ ớ tôm. Sau 30 ngày

nhiễm ký sinh trùng Microsporidian, ống gan tụy của những con tôm bị bệnh

nhiễm giãn rộng và bắt đầu hoại tử [8],

1.3.2. Tảo và các vi khuấn gây hại gián tiếp cho tôm
❖ Tảo

Tảo phát triển rất phổ biến trong các ao, hồ...Ngồi những mặt lợi thì tảo

cũng có tác hại rất lớn tới các sinh vật thúy sinh nói chung và tơm nói riêng.
Hiện tượng tảo nở hoa ảnh hưởng trực tiếp tới chất lượng nước như làm

cho pH thay đổi, oxy hòa tan dao động lớn theo chu kỳ ngày - đêm, tăng hàm
13


lượng ammoniac, cạnh tranh dinh dưỡng. Khi táo tàn dễ gây hiện tượng thiếu
oxy cục bộ trong ao nuôi, tăng hàm hàm lượng các khí độc gây chết trực tiếp

đối với tơm. Trong ao, táo nở hoa có thế gây bệnh đốm nâu hoặc gây thiếu
oxy cục bộ vào ban đêm từ đó dẫn đến sự thiếu oxy trong máu làm tôm chết

hàng loạt.
❖

Vi khuân khử sulfate
Ờ điều kiện yếm khí, vi khuấn khử sulfate oxy hóa các chất hữu cơ lắng

tụ trong các ao nuôi tôm tạo thành hydrogen sulfide (H2S). H2S tạo ra rất độc
đối với tôm bời vì nó cán trớ q trình hơ hấp cùa tơm. Ái lực của H2S mạnh

hơn 02 do vậy được ưu tiên gắn vào hemoglobin ngăn cản việc vận chuyển
oxy trong máu dẫn tới tôm thiếu oxy vàchết tôm. Các chủng vi khuẩn khử

sulfate điển hình được phân lập từ các ao nuôi tôm là: Desulfovibrio,

Desulfotomaculum, Desunlfobacter, Desulfonema [1],
❖

Vi khuân sinh methan (CH4)
Thành phần lóp bùn trong ao ni tơm chủ yếu là các chất hữu cơ như

protein, lipit, axit béo, các hoocmon, cacbonhydrate, chất khống và vitamin,
vỏ tơm lột xác... Trong lớp bùn đó vi khuẩn sinh methan có khá năng phân

hủy các họp chất trên tạo thành khí mctan (CHẠ Khí methan rất độc đối với
tơm. Khi hàm lượng khí metan vượt quá mức cho phép sẽ làm cho tơm bị sốc,
tê liệt và gây chết tơm.

ỉ.4. Tình hình nghiên cứu vi khuẩn kháng Vibrio gây bệnh cho nuôi tơm
1.4.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giói

Garriques và Arevalo (1995) đã sử dụng V. alginolyticus để tăng khả
năng sống sót và sự tăng trường của ấu trùng tơm p. vannamei như là một vi

khuan probiotic đe loại trừ việc sử dụng kháng sinh trong hệ thống ao nuôi ấu
trùng tôm mật độ cao [18],

14


Jiravanichpaisal và Chuaychuwong (1997) đã thông báo việc sử dụng
Lactobacillus như là vi khuẩn probiotic đê kháng lại các vi khuẩn gây bệnh
Vibrio và vi rút gây bệnh đốm trắng ớ tôm sú (P. tnonodon Fabricius) [ 18],
Hernandez và cộng sự (2005) đã sứ dụng chủng vi khuân Lactobacillus

plantarum TF711 kháng vi khuẩn Vibrio gây bệnh làm chế phẩm đế nâng cao

năng suất ở các ao hồ nuôi tôm [11].
1.4.2. Tình hình nghiên cứu vi khuẩn kháng Vibrio gây bệnh cho tơm ờ
Việt Nam
Chế phấm

BioF: Có chứa Lactobacillus acidophillus được sử dụng

trong ni trồng thúy sản có khá năng tăng hấp thụ thức ăn và hạn chế bệnh

do Aeromonas, Vibrio.. .gây ra. Ket quá của bước đầu cho thấy sử dụng chế
phấm để nuôi tôm giống rất hiệu quả, tôm tăng trưởng nhanh, đồng đều [10],

Che pham CNSH-KK cúa Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa

học và Công nghệ Việt Nam chứa các vi khuân hữu ích thuộc nhóm Bacillus
và Lactobacillus phân lập từ ao ni tơm có khả năng chuyển hóa các hợp

chất chứa nito và ức chế vi khuấn gây bệnh Vibrio đã được ứng dụng thành

công ở các ao nuôi tôm công nghiepj tại Thanh Hóa và Huế [12].

15


PHÀN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN củu
VẬT LIỆU

2.1.

2.1.1.

-

Chủng vi khuấn nghiên cún

Mẩu bùn và nước: Các mầu bùn và nước được lấy ớ các địa điếm khác

nhau tại các ao ni tơm cơng nghiệp ờ Hồng Phụ, Hồng Hóa, Thanh Hóa.

Mầu được đựng trong bình Duran vơ trùng và được báo qn lạnh đến khi về
phịng thí nghiệm được bảo quán tiếp ớ 4°c. Mầu được phân tích trên mơi
trường hiếu khí tổng số (HKTS) trong vịng 24 giờ lấy mẫu.

-

Chủng vi khuan Vibrio’. Hai chủng Vibrio parahaemolyticus và Vibrio

vulnificus sừ dụng trong nghiên cứu đối kháng được lấy từ bộ sưu tập chúng

giống cùa Phòng Vi sinh vật dầu mỏ, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm
Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam.

2.1.2.

Hóa chất

Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu đều là những hóa chất có tiêu chuẩn
chất lượng cao.

2.1.3.

Thiết bị và dụng cụ

Nghiên cứu được thực hiện tại Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm

Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Các thiết bị chuyên môn dùng trong
nghiên cứu đạt tiêu chuẩn quốc tế
-

Cân phân tích Sartorius (Đức)

-

Máy đo quang phố SP - 3000 Nano (Nhật)

-

Máy đo pH Test (Đức)

-

Kính hiến vi quang học Olympus (Nhật)

-

Máy li tâm Eppendoft (Đức)

-

Máy lọc nước khử ion AQUAMAX Ultra 370 Series ( Ấn Độ )

-

Máy Voltex (Đức)

-

Nồi hấp khử trùng (Mỹ)

-

Thiết bị ổn nhiệt Techne OSI (Nhật)
16

-

Tú ấm (Hungari)

-

Tủ cấy vô trùng hồi lưu (Việt Nam)

-

Tú hút (Việt Nam)

-

Tú lạnh sâu (-20°C, -80°C) (Đức)

-

Máy lắc Bcckman (Đức)
Phuong pháp nghiên cứu

2.2.

2.2.1.

Môi trường nghiên cứu

Môi trường nuôi cấy vi sinh vật hiếu khí tổng số (g/1)

Glucose

1

KC1

0.25

Cao men

0.2

NaCl

5

Cao thịt

3

MgCl2

1.2

Pepton

5

KH2PO4

1

NH4NO3

2

Thạch

18

pH = 7-7,2

Môi trường được khử trùng ờ 121°c trong 20 phút.
Tất cả các thí nghiệm đều được ni cấy trong mơi trường hiếu khí tong số

với 2 - 3% giống ban đầu đang ớ pha log.
2.2.2.

Phuong pháp phân lập vi khuẩn có khả năng kháng Vibrio

Mơi trường HK.TS sau khi được khử trùng trong các bình tam giác được

đồ ra đĩa pctri vơ trùng. Bao gói đĩa đố vào tủ ấm 24 giờ cho khô mặt thạch và

kiếm tra mức độ vô trùng của môi trường. Chi những đĩa không bị nhiễm mới
được sử dụng để phân lập.

Các mầu dược pha loãng ớ các nồng độ khác nhau bằng dung dịch muối
sinh lý 0,85%. Lấy 0,5 ml mẫu vào 4,5 ml nước muối sinh lý được độ pha

loãng 10’1. Lấy tiếp 0,5 ml dung dịch đó chuyển sang lọ chứa 4,5 ml muối

17