Ứng Dụng ‘Dấu’ Phân Tử Trong Công Tác Giống Cây Trồng pot

1
Chương
Chương
1
1
Ứ
Ứ
ng
ng
Dụ
Dụ
ng
ng
‘
‘
D
D
ấ
ấ
u
u
’
’
Phân
Phân
Tư
Tư
̉
̉
Trong
Trong

Công
Công
Tá
Tá
c
c
Gi
Gi
ố
ố
ng
ng
Cây
Cây
Tr
Tr
ồ
ồ
ng
ng
D
D
ấ
ấ
u
u
phân
phân
tư
tư

̉
̉
(Molecular Markers/DNA Markers)
(Molecular Markers/DNA Markers)
2
Sự khác biệt giữa cá thể/giống/loài = Polymorphism
Phân biệt/nhận diện  đặc điểm nhận diện – ‘Dấu’
‘DNA Marker’
Khá
Khá
i
i
ni
ni
ệ
ệ
m
m
:
:
D
D
ấ
ấ
u
u
(Marker)
(Marker)
=
=

đ
đ
ặ
ặ
c
c
đi
đi
ể
ể
m
m
dù
dù
ng
ng
đê
đê
̉
̉
phân
phân
bi
bi
ệ
ệ
t/nh
t/nh
ậ
ậ

n
n
di
di
ệ
ệ
n
n
Dấu di truyền (Genetic Marker) =
đ
đ
ặ
ặ
c
c
đi
đi
ể
ể
m
m
dù
dù
ng
ng
đê
đê
̉
̉
phân

phân
bi
bi
ệ
ệ
t/nh
t/nh
ậ
ậ
n
n
di
di
ệ
ệ
n
n
vê
vê
̀
̀
bả
bả
n
n
ch
ch
ấ
ấ
t

t
di
di
truy
truy
ề
ề
n
n
Dấu phân tử (DNA Marker) = đặc điểm ADN dùng để phân
biệt/nhận diện (về bản chất di truyền)
Ứng dụng: Dùng để phân biệt/nhận diện sự khác nhau (về bản chất
di truyền) giữa các cá thể/giống/loài
Yêu cầu:
+ Khác nhau (Polymorphism) giữa các cá thể/các giống/các loài
+ mang tính đặc trưng và ổn định, ít/không bị thay đổi bởi đk
ngoại cảnh
3
Đặc điểm của các loại ‘Genetic Marker’
++++++
Mức độ Polymorph.
+++++++++
Đòi hỏi kỹ thuật
+
+++
+
Hình thái
/Nông học
+++++++
Phản ánh b/chất DT

+++++
Chịu t/động ngoại
cảnh
+++++++
Số lượng Marker
ADNProteinIsozymeMarker
Dấu phân tử (Molecular Markers)
= Dấu ADN (DNA Markers)
Dấu phân tử được thiết lập và xác định dựa trên sự đa dạng
(Polymorphism) xuất hiện ngẫu nhiên (Naturally) trên
phân tử ADN (VD: mất, thay thế, thêm các base nitơ,
hay thay đổi về ‘trình tự sắp xếp đặc biệt’ (patterns) của
các base nitơ)
Phân loại: có 2 nhóm dấu ADN
- Dựa trên đột biến của 1 cặp base nitơ (thiếu, thay thế, thêm)
 làm thay đổi điểm nhận diện của Enz cắt giới hạn
(regconition sites) (RFLP, SCAR, SNP), hoặc thay đổi trình
tự vị trí gắn của ‘con mồi’ (primer) (RAPD), hoặc thay đổi
cả 2 (AFLP)
- Dựa vào sự thay đổi về số lượng đoạn lặp lại của 1 trình tự
sắp xếp đặc biệt của phân tử ADN (repetitive motif) (SSR)
4
Kỹ thuật phân tích Dấu phân tử
• Cắt ADN (Restriction Digestion)
• Phản ứng PCR
• Điện di ADN (Gel Electrophoresis)
Các dạng DNA Marker trên TV
Dựa trên kỷ thuật cắt bằng Enz. cắt giới hạn (Digestion):
- RFLP (Restricted Fragment Length Polymorphism)
- DArT (Diversity Array Technique)

Dựa trên kỷ thuật PCR:
- RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA Marker)
- SSR (Simple Sequence Repeat)
- ISSR (Inter-Simple Sequence Repeat)
- SNP (Single Nucleotide Polymorphism)
Dựa trên Digestion + PCR:
- AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)
- SCAR (Sequence-Characterized Amplified Regions )
5
Các dạng DNA Marker trên TV
Dựa trên kỷ thuật Digestion:
- RFLP (Restricted Fragment Length Polymorphism)
- DArT (Diversity Array Technique)
Dựa trên kỷ thuật PCR:
- RAPD (Random Amplified Polymorphism DNA)
- SSR (Simple Sequence Repeat)
- ISSR (Inter-Simple Sequence Repeat)
- SNP (Single Nucleotide Polymorphism)
Dựa trên Digestion + PCR:
- AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)
- SCAR (Sequence-Characterized Amplified Regions )
RFLP
(Restriction Fragment Length Polymorphism)
Nguyên tắc: + Cắt ‘genomic ADN’ bằng Enz. cắt giới hạn
+ Điện di để phân tách các đoạn cắt
 Tìm và ghi nhận sự đa dạng (Polymorphism)
Điểm nhận diện của mỗi Enz giới hạn có:
+ Trình tự đặc biệt của các base nitơ
+ Không phụ thuộc vào bất kỳ loại gien nào
+ Phân bố ngẫu nhiên khắp toàn bộ bộ gien của SV

 Kiểu gien
≠
= vị trí điểm nhận diện của Enz giới hạn
≠
 Kết quả cắt
≠
(đoạn được cắt có chiều dài
≠
)
6
6 Nu-cutter GAATTC 4 Nu-cutter TCGA
CTTAAG AGCT
Enzymes cắt ADN ở vị trí chuyên biệt
Điểm nhận diện thường có trình tự đối xứng (palindromes):
RFLP (ttheo )
RFLP (ttheo.)
RFLP ↔ Đa dạng về
điểm nhận diện của
Enz. cắt giới hạn
Dạng k/quả:
Có // Không
7
RFLP (ttheo.)
RFLP = co-dominant (phân biệt được
Heterozygote/Homozygote)
Ưu điểm:
Mức độ đa dạng tương đối cao (Relatively High Polymorphism)
Marker mang tính đồng trội (Co-dominant)
Kết quả ổn định (Reproductive)
Không cần biết trước thông tin về đối tượng NC

Khuyết điểm:
Đòi hỏi nhiều thời gian, công sức và đắt tiền;
Đòi hỏi số lượng lớn ADN
Đòi hỏi ADN có độ sạch cao (tinh khiết)
RFLP (ttheo.)
8
RAPD
(Randomly Amplified Polymorphic DNA Markers)
Nguyên tắc:
+ Sử dụng 1 con mồi ngắn (~10 bp) (Primer F = Primer R)
+ Kỹ thuật PCR  Tổng hợp ngẫu nhiên các đoạn ADN
trên khắp bộ gien (đoạn tổng hợp có chiều dài <1 Kb)
+ Điện di để phân tách các đoạn được tổng hợp
 Tìm và ghi nhận sự đa dạng (Polymorphism)
RAPD = Đa dạng (Polymorphism) về vị trí gắn của con mồi
Kết quả điện di
RAPD (ttheo )
9
Cá thể 232 mang băng B
là đồng hợp tử hay dị hợp
tử ở locus B ?
 Trội hoàn toàn
(Có/không) ???
B
Hạn chế của PPháp
Băng B thực sự là do
khác biệt về di truyền hay
do sai sót về kỹ thuật ?
 Tính ổn định ???
RAPD (ttheo )

A
Ưu điểm:
Phương pháp đơn giản, rẽ tiền và ít tốn thời gian nhất
Không cần biết trước thông tin về đối tượng NC
Không đòi hỏi số lượng lớn ADN
Không đòi hỏi ADN có độ sạch cao (tinh khiết)
Khuyết điểm:
Marker không chuyên biệt (Unspecific)
Marker mang tính trội (Dominant)
Kết quả không ổn định (UnReproductive)
RAPD (ttheo )
10
AFLP
(Amplified Fragment Length Polymorphism)
= RFLP + RAPD
Nguyên tắc:
+ Cắt ‘Genomic ADN’ bằng Enz giới hạn
+ Gắn Adaptor ở 2 đầu mỗi đoạn được cắt
+ Kỹ thuật PCR với con mồi = Adaptor
+ Điện di để phân tích các đoạn ADN được tổng hợp
 Tìm và ghi nhận sự đa dạng (Polymorphism)
AFLP = Đa dạng về điểm nhận diện của Enz giới hạn
+ Đa dạng về vị trí gắn của con mồi
AFLP
(Các bước cơ
bản)
Mẫu A
Mẫu B
Mẫu
A B

Adaptor
11
AFLP
(cont.)
Polymorph.
(Đa hình)
Ưu điểm:
Không cần biết trước thông tin về đối tượng NC
Mức độ đa dạng rất cao (High Polymorphism)
Marker tương đối chuyên biệt (specific)
Kết quả rất ổn định (Reproductive)
 được áp dụng trên nhiều loài SV khác nhau
Khuyết điểm:
Phương pháp tương đối phức tạp và tốn kém
Marker mang tính trội (Dominant)
Đòi hỏi số lượng ADN tương đối lớn
Đòi hỏi ADN có độ sạch cao (tinh khiết)
AFLP (ttheo )
12
VNTR: Variable Number Tandem Repeats
• Vùng không mang thông tin DT (Non-coding)
• Nhiều đoạn lặp (copy) của cùng 1 trình tự đặc biệt (Motifs)
• Đa dạng (Polymorphism) rất cao giữa các cá thể cùng loài
= Khác biệt về số lượng đoạn lặp của 1 trình tự đặc biệt
 SSR (Simple Sequence Repeat = MicroSatellite)
VNTR
13
SSR
(Simple
S

Sequence Repeats/Microsatellites)
SSR có trong bộ gien của tất cả SV nhân thật (Eukaryote) và có
chứa từ vài đến vài trăm đoạn lặp (Copies) của 1 trình tự đặc
biệt (Motif) từ 1-4 base nitơ
• Rất đa dạng (nhiều alen/locus)
• Rất nhiều locus SSR (hàng
1000 locus) trong mỗi loài SV
Nguyên tắc:
+ Kỹ thuật
PCR với 2
con mồi
(F/R) tương
ứng với 2
đầu của SSR
+ Điện di để
phân tách các
đoạn được
tổng hợp
 Tìm và
ghi nhận sự
đa dạng
14
• Thường sử dụng đề tìm sự
đa dạng trong cùng loài;
• Thường sử dụng để tìm
quan hệ gia phả
SSR (ttheo )
Ưu điểm:
Mức độ đa dạng rất cao (High Polymorphism)
Phương pháp nhanh và rẽ tiền

Marker mang tính đồng trội (Co-Dominant)
Không đòi hỏi số lượng và chất lượng ADN
Marker chuyên biệt (specific)
Kết quả rất ổn định (Reproductive)
Khuyết điểm:
Cần biết trước thông tin về đối tượng NC  Đối tượng
áp dụng có giới hạn
Cần nhiều thời gian và công sức để thu thập thông tin
trước về đối tượng NC
SSR (ttheo )
15
SNP
(Single Nucleotide Polymorphism)
Các dạng SNP
16
MicroArray
subarray
Slide
gene
spot
pingroup
SNP (ttheo )
Stable
(L.kết bền)
Unstable
(L.Kết không bền)


L
L

.k
.k
ế
ế
t không b
t không b
ề
ề
n c
n c
ó
ó
th
th
ể bị
ể bị
c
c
ắ
ắ
t b
t b
ằ
ằ
ng Enz.
ng Enz.
S1
S1
ho
ho

ặ
ặ
c b
c b
ị tá
ị tá
ch
ch
thà
thà
nh m
nh m
ạ
ạ
ch đơn
ch đơn
ở
ở
nh
nh
ữ
ữ
ng đk đ
ng đk đ
ặ
ặ
c bi
c bi
ệ
ệ

t
t
17
DArT = AFLP + Array
DArT = Đa dạng về điểm nhận diện của Enz cắt giới hạn
(Thay đổi 1 Nu hay mất đoạn, thêm đoạn)
DArT
(Diversity Array Technique Marker)
Nguyên t
Nguyên t
ắ
ắ
c:
c:
+ T
+ T
hi
hi
ế
ế
t k
t k
ế
ế
Chip d
Chip d
ự
ự
a trên c
a trên c

á
á
c thông tin đ
c thông tin đ
ã
ã
bi
bi
ế
ế
t tr
t tr
ướ
ướ
c
c
(
(
đ
đ
oạ
oạ
n bi
n bi
ế
ế
t tr
t tr
ướ
ướ

c)
c)
+
+
Đ
Đ
oạ
oạ
n chưa bi
n chưa bi
ế
ế
t đ
t đ
ượ
ượ
c nhân lên v
c nhân lên v
à
à
g
g
ắ
ắ
n m
n m
à
à
u h
u h

uỳ
uỳ
nh quang
nh quang
+ C
+ C
ho lai đ
ho lai đ
oạ
oạ
n chưa bi
n chưa bi
ế
ế
t /
t /
/
/
đ
đ
oạ
oạ
n đ
n đ
ã
ã
bi
bi
ế
ế

t
t
+
+
R
R
ữ
ữ
a v
a v
à
à
đ
đ
ọ
ọ
c k
c k
ế
ế
t q
t q
uả
uả
A Diversity Array Panel of 4 parents of CIAT
A Diversity Array Panel of 4 parents of CIAT
’
’
s 2 cassava mapping
s 2 cassava mapping

populations onto which was hybridized Cy3
populations onto which was hybridized Cy3
-
-
and Cy5
and Cy5
-
-
labeled
labeled
cloned amplicons of 2 of these parents.
cloned amplicons of 2 of these parents.
18
Nguyên t
Nguyên t
ắ
ắ
c p
c p
há
há
t hi
t hi
ệ
ệ
n đa
n đa
dạ
dạ
ng

ng
(Diversity
(Diversity
Arrays)
Arrays)
A
B
C
D
E
F
G
H
Genotype1
Genotype2
Cần có 5 ưu điểm:
• Có mức độ đa dạng từ cao  rất cao
• Mang đặc tính đồng trội
• Phân bố ngẫu nhiên và rộng khắp bộ gien của SV
• Dễ thực hiện và rẽ tiền
• Có tính ổn định cao
Dấu phân tử ‘lý tưởng’ ???
19
Đặc điểm của các dấu ADN (DNA Markers)
-
+++
+
+
++
RFLP

+++++++
Technical Facilities
-+
Prior Information
++++/-+/-+/-
Automation
+
++
RAPD
++++++++
Reproductivity
++++++++
Polymorphisme
DArTSSRAFLP
(Karp et al., 1997; O’Hanlon et al., 2000 )
Dấu phân tử được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực:
– Nghiên cứu và phân tích ngân hàng vật liệu di truyền,
– ChNn oán về di truyn,
– Kho sát và lp lý lch ging hoc các SV chuyn gien
– N ghiên cu bộ gien
– Phân tích phả hệ và sự quan hệ gia các SV trong quá
trình tin hóa
– Tìm sự liên kt gia du phân tử và các c im mong
mun  chn ging
ng dng ca du phân tử
20
Câu hi ???