MÔN VI SINH y học bài báo cáo THỰC HÀNH kỹ THUẬT cấy RIA là kỹ thuật cấy VSV từ môi trường hiện tại sang môi trường khác

ĐẠI HỌC ĐÔNG Á
KHOA DƯỢC

MÔN VI SINH Y HỌC
BÀI BÁO CÁO THỰC HÀNH
Lớp:
Nhóm II :

PH20A1A
1. Lê Thị Linh Chi
2. Nguyễn Thị Kiều Chinh
3. Nguyễn Thị Dung (51064)
4. Nguyễn Thị Dung (54729)

GVHD:

TS. Trần Khánh Linh
Đà Nẵng, 06/2022

1


MỤC LỤC

I.KỸ THUẬT CẤY RIA.............................................................................................................................3
1. Vật liệu – Dụng cụ - Thiết bị...............................................................................................................3
1.1.Vật liệu............................................................................................................................................3
1.2.Dụng cụ...........................................................................................................................................3
1.3.Thiết bị............................................................................................................................................3
2.Các bước thực hiện...............................................................................................................................3
3.Kết quả và biện luận.............................................................................................................................4

3.1.Kết quả...........................................................................................................................................4
3.2.Biện luận.........................................................................................................................................4
II.KẾT QUẢ ĐỊNH DANH.........................................................................................................................6
1.Xác định hình thái VK dựa vào đặc tính sinh lý................................................................................6
1.1.Vật liệu – Dụng cụ - Thiết bị.........................................................................................................6
2.Các bước thực hiện...............................................................................................................................7
3Kết quả và biện luận..............................................................................................................................8
3.1.Kết quả...........................................................................................................................................8
3.2.Biện luận.........................................................................................................................................8
2. Định danh được VSV theo PP sinh hoá..............................................................................................9
2.1.Khả năng sử dụng URE.................................................................................................................9
2.2. Thử nghiệm khả năng sử dụng acid amin chứ lưu huỳnh sinh H2S........................................10
2.3.Thử nghiệm MR (Methy red)......................................................................................................12
2.4.Thử nghiệm khả năng sử dụng citrate như nguồn carbon duy nhất của vi khuẩn.................13
III.KẾT QUẢ KHÁNG SINH ĐỒ - ETEST............................................................................................15
1.Phương pháp kháng sinh đồ:.............................................................................................................15
1.1: Vật liệu - dụng cụ - thiết bị........................................................................................................15
1.2: Các bước thực hiện.....................................................................................................................16
1.3: Kết quả và biện luận...................................................................................................................17
2.Phương pháp E-test............................................................................................................................18
IV.PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG TẾ BÀO VI KHUẨN..................................................................20
4.Mục đích thực hiện:................................................................................................................................20
4.1. Vật liệu- Dụng cụ- Thiết bị:.......................................................................................................20
4.2. Các bước thực hiện:....................................................................................................................21
4.3. Kết quả và biện luận:..................................................................................................................21
Tài liệu tham khảo.....................................................................................................................................23
2


BÀI BÁO CÁO KẾT QUẢ THỰC TẬP MÔN VI SINH

I.KỸ THUẬT CẤY RIA: là kỹ thuật cấy VSV từ môi trường hiện tại sang mơi
trường khác
Mục đích thực hiện: khảo sát hình thái, tính chất sinh lý, sinh hóa, thu hoạch
số lượng lớn vi sinh, giữ giống,..
1. Vật liệu – Dụng cụ - Thiết bị:
1.1.Vật liệu: Vi khuẩn 0,5F
1.2.Dụng cụ:
STT

Tên dụng cụ

1

Đèn cồn

2

Bình cồn 70 độ

3

Que cấy vịng

4

Becher 100ml

5

Bình tia nhựa

6

Pipet paster

7

Hộp rác

8

Giấy mềm không vân

9

Bật lửa

10

Bút lông dầu

11

Bao tay y tế

12

Đĩa thạch

1.3.Thiết bị: Tủ ấm, tủ an toàn sinh học

2. Các bước thực hiện:
Kỹ thuật cấy bề mặt đĩa thạch
Bước 1 :Ghi đầy đủ thông tin bệnh phẩm ( tên mẫu, tên nhóm-người thực hiện),
ngày ni cấy lên đĩa thạch.
3


Bước 2: Sử dụng cồn 70 độ và giấy mềm khơng vân tiến hành làm sạch bề mặt
bàn thí nghiệm. Chuẩn bị số lượng đĩa petri ( đã ghi đầy đủ thông tin bệnh phẩm)
theo khối lượng môi trường đổ.
Bước 3: Làm sạch bao tay của người làm thí nghiệm bằng cồn và để bao tay khô
rồi tiến hành thực hiện.
Bước 4: Sử dụng que cấy vòng để lấy bệnh phẩm ra môi trường nuôi cấy và tiến
hành phân lập.
Bước 5: Hơ qua ống vi khuẩn trên đèn cồn ( không mở nắp ống vi khuẩn).
Bước 6: Đốt que cấy vịng cho nóng, làm nguội, lấy 1 vịng dây cấy vi khuẩn.
Bước 7: Hơ quanh đĩa petri
Bước 8:Trải VK đường số 1: trải vi khuẩn sang hai bên bằng đường zig-zag sát
nhau cho đến khi vệt vi khuẩn khô. Đốt dây cấy, để dây cấy nguội. Xoay đĩa
thạch 90 độ.
Bước 9: Trải VK đường số 2: trải vi khuẩn từ bước trên ra theo đường zig-zag,
chỉ chạm vào đường số 1( 3 đến 4 lần). Xoay đĩa thạch 90 độ
Bước 10: Trải VK đường số 3: trải vi khuẩn từ bước trên theo đường zig-zag
(bản to khác với đường cấy số 1) , chỉ chạm vào đường 2 ( 1 đến 2 lần) và không
chạm vào đường 1.
Bước 11: Đốt dây cấy.
Bước 12: Sau khi cấy xong thì cần giữ môi trường nuôi cấy trong tủ ấm 37 độ C.
Theo dõi sự phát triển của vi khuẩn sau 18 – 24h.
Lưu ý một số lỗi thường gặp:
- Vệ sinh sạch khu vực bằng cồn 70 độ và dùng giấy mềm lau sạch trước và sau

khi thực hiện thao tác cấy.
- Khi thao tác, tay trái cầm đĩa thạch và xoay đều để hơi xung quanh ngọn lửa
đèn cồn. Tay phải cầm dây cấy và hơ nóng xung quanh ( đợi 5 – 10 giây để dây
cấy nguội bớt) trước khi lấy vi khuẩn.
- Cấy mạnh rách thạch.
- Hơ que cấy quá nóng -> chết vi khuẩn
- Cấy sai đường cấy. Đường số 2 chạm vào đường số 1. Đường số 3 chạm đường
số 2. Đường số 1 và 3 không được chạm vào
- Khi trải vi khuẩn -> không khô -> chảy dịch vi khuẩn
4


- Không hơ que cấy sau đường cấy 1. Khi cấy đường số 2 thì tiếp tục cấy đường
số 3 và không được hơ que cấy.
- Không làm gần khu vực đèn cồn.
3. Kết quả và biện luận
3.1.Kết quả:
Với kỹ thuật cấy ria yêu cầu kết quả cần đạt được là : 3 đường cấy rõ ràng và
sự xuất shiện của các vi khuẩn lạc đơn lẽ ở môi trường số 3.
3.2.Biện luận
Hình 1: Kết quả kỹ thuật cấy ria
Quan sát hình 1 ta thấy:

-

Đĩa số 1 (BHI N2.1): Chỉ xuất hiện vi khuẩn ở đường cấy số 1, không nhìn
thấy ở đường cấy ở số 2 và số 3 vì khi bắt đầu cấy đường cấy số 2 khơng nối
với đường cấy số 1 dẫn tới không xuất hiện vi khuẩn ở 2 đường còn lại hoặc
5

sau đường cấy số 1 hơ que cấy quá nóng dẫn đến chết vi khuẩn tại nơi cấy
đưòng tiếp theo.
- Đĩa số 2 (BHI N2.2): Có sự xuất hiện của 3 đường cấy vì thực hiện tốt theo
đúng quy trình cấy 3 đường. Tuy nhiên đường cấy không đều và khơng được
đẹp.
- Đĩa số 3 (BHI N2.3): Có sự xuất hiện của 3 đường cấy. Ở môi trường số 3, ta
thấy sự xuất hiện của khuẩn lạc đơn lẽ tuy nhiên nó xuất hiện khơng nhiều vì
khi cấy đường 2 qua đường 3 ngắn.
- Đĩa số 4 (BHI N2.4): Chỉ xuất hiện đường cấy số 1 và 2 vì khi cấy từ đường
số 2 sang 3 đường cấy không nối liền.
Kết luận: Vì khuẩn lạc có bề mặt và màu sắc không đồng đều, thuần nhất
nên chứng tỏ giống mới phân lập khơng tinh khiết.
II.

KẾT QUẢ ĐỊNH DANH

Mục đích thực hiện:

1.Xác định hình thái VK dựa vào đặc tính sinh lý.
2. Định danh được VSV theo PP sinh hoá
1.Xác định hình thái VK dựa vào đặc tính sinh lý.
1.1.Vật liệu – Dụng cụ - Thiết bị:
a.Vật liệu:
- Vi khuẩn
- Môi trường cấy KIA
b. Dụng cụ:
STT

Dụng cụ

1

Que cấy tròn, que cấy thẳng

2

Đèn cồn

3

Bình cồn 70 độ

4

Bật lửa

5

Bút lơng dầu
6


c.Thiết bị:
2.Các bước thực hiện:
Bước 1 :Ghi đầy đủ thông tin bệnh phẩm ( tên mẫu, tên nhóm-người thực hiện).
Bước 2: Sử dụng cồn 70 độ tiến hành làm sạch bề mặt bàn thí nghiệm. Chuẩn bị các
ống KIA ( thạch nghiêng) đã ghi sẵn thông tin.
Bước 3: Làm sạch bao tay của người làm thí nghiệm bằng cồn và để bao tay khô rồi
tiến hành thực hiện.

Bước 4: Nếu ta quan sát thấy trong ống thạch có nước thì ta dùng giấy mềm làm
khơ phần nước trong đó đến khi bên trong ống thạch khơ hồn tồn thì ta mới tiến
hành cấy.
Bước 5: Tay trái cầm ống nghiệm chứa dung dịch VK và ống nghiệm môi trường.
Tay phải cầm que cấy vòng và khử trùng trên ngọn đèn cồn.
Bước 6: Dùng ngón út và áp út kẹp nắp ống nghiệm vào lòng bàn tay, xoay nhẹ mở
nắp ống nghiệm.
Bước 7: Hơ nóng để khử trùng phần miệng ống.
Bước 8: Đợi que cấy nguội, đưa que cấy vào bên trong tiếp xúc với dung dịch chứa
vi khuẩn.
Bước 9: Rút que cấy ra nhẹ nhàng không cho que cấy đụng vào thành ống nghiệm.
Bước 10: Đưa que cấy vào ống thạch nghiêng và sau đó vi khuẩn khảo sát được cấy
2 lần:
Lần 1: Dùng que cấy thẳng cấy đâm sâu vào giữa khối thạch đường cấy
thẳng và rút que cấy ra theo hướng cấy thẳng.
Lần 2: Cũng là que cấy thẳng đó, và cấy trên mặt lớp thạch nghiêng theo
đường zigzac.
Bước 11: Khử trùng que cấy.
Bước 12: Khử trùng phần miệng và đậy nắp 2 ống nghiệm.
Lưu ý: + Khi đưa que vào cấy nên nhẹ nhàng để tránh làm rách thạch.
7


+ Khơng sử dụng que cấy nóng để cho ống vi khuẩn để lấy vi khuẩn vì làm
như thế sẽ dẫn đến vi khuẩn chết và khi cấy vào thì vi khuẩn sẽ không xuất hiện trên
phần thạch.
3. Kết quả và biện luận:
3.1.

Kết quả:

- Phần thạch tròn: đọc phản ứng sử dụng glucose: (+) có màu vàng (lên men
glucose). Sự sinh gas: nếu có làm nứt thạch.
- Phần thạch nghiêng: đọc phản ứng sử dụng lactosec(+) có màu vàng (lactose
dương tính).
- Vùng tiếp giáp giữa 2 phần: đọc phản ứng sinh H2S, nếu dương tính có màu
đen.
3.2.

Biện luận:

Hình 2: Kết quả cấy trong mơi trường KIA
Quan sát hình 2 ta thấy:

8


- Ống N2.1: Xuất hiện vi khuẩn vì ổng đổi màu từ đỏ sang vàng , ta thấy
đường cấy thẳng, thấy được đường zig – zic hơi mờ bởi vì trong q trình
lấy sinh viên lấy ít vi khuẩn.
- Ống N2.2: Phần thạch nghiêng : phản ứng có sử dụng lactose có màu
vàng (-) và xuất hiện rõ VK trên đường Zigzac. Phần thạch trịn : có hiện
tượng nứt thạch => có sự sinh Gas.
- Ống N2.3: Phần thạch nghiêng : phản ứng có sử dụng lactose có màu
vàng (-) và xuất hiện rõ VK trên đường Zigzac. Phần thạch tròn : có hiện
tượng nứt thạch và bị đẩy thạch lên => có sự sinh Gas
- Ống N2.4: Phần thạch nghiêng và thạch trịn có màu đỏ (-) và thấy rõ
đường cấy. Khơng xuất hiện vi khuẩn vì trong q trình lấy vi khuẩn , hơ
lửa nóng quá vi khuẩn bị chết nên vi khuẩn không mọc được.
=> Cả 4 ống nghiệm đều có phản ứng dương (-) vì mơi trường khơng xuất

hiện màu đen.
2. Định danh được VSV theo PP sinh hố :
2.1.Khả năng sử dụng URE:
Mục đích: Xác định vi khuẩn có enzyme urease thủy phân ure thành NH3 và CO2.
2.1.1.Vật liệu – Dụng cụ - Thiết bị:
a. Vật liệu:
- Vi khuẩn
- Môi trường cấy Ure Broth (MIU)
2.1.2. Dụng cụ:
STT

Dụng cụ

1

Que cấy thẳng

2

Đèn cồn

3

Cồn 70 độ

4

Bật lửa
9

5

Bút lông dầu

2.1.3.Các bước thực hiện:
Bước 1 :Ghi đầy đủ thơng tin bệnh phẩm ( tên mẫu, tên nhóm-người thực hiện).
Bước 2: Sử dụng cồn 70 độ tiến hành làm sạch bề mặt bàn thí nghiệm. Chuẩn bị các
ống đã ghi sẵn thông tin.
Bước 3: Làm sạch bao tay của người làm thí nghiệm bằng cồn và để bao tay khơ rồi
tiến hành thực hiện.
Bước 4: Làm nóng đầu que cấy thẳng trên ngọn lửa đèn cồn, để nguội và lấy 1
lượng vi khuẩn vừa đủ.
Bước 5: Dùng que cấy thẳng cấy đâm sâu vào giữa khối thạch tròn 1 đường cấy
thẳng. Hơ thành miệng bình ống vừa cấy xong trên ngọn lửa đèn cồn để tiệt các vi
khuẩn lỡ bám trên miệng ống sau đó đặp nắp lại.
Bước 6: Tiệt trùng que cấy trên ngọn lửa đèn cồn.
2.1.4.Kết quả và biện luận:
a. Kết quả
- Phản ứng âm (-): môi trường màu cam
b.. Biện luận: Vì mơi trường có phản ứng âm nên phản ứng trên không xảy ra phản
ứng  vi khuẩn khơng có enzyme urease thủy phân ure thành NH3 và CO2.
Lỗi gặp phải: Khi que cấy còn nóng đã vội lấy vi khuẩn  vi khuẩn chết  khơng
cịn tồn tại VK  phản ứng khơng xảy ra.
2.2 . Thử nghiệm khả năng sử dụng acid amin chứ lưu huỳnh sinh H2S
Mục đích: Khảo sát tính di động của vi khuẩn.
2.2.1.Vật liệu – Dụng cụ - Thiết bị.
a.Vật liệu:
- Môi trường nuôi cấy SIM (hydrogen sulfite-indol-motility)
- Vi khuẩn.

10


2.2.1. Dụng cụ:
STT

Dụng cụ

1

Que cấy thẳng

2

Đèn cồn

3

Cồn 70 độ

4

Bật lửa

5

Bút lông dầu

2.2.2. Các bước thực hiện:
Bước 1 :Ghi đầy đủ thơng tin bệnh phẩm ( tên mẫu, tên nhóm-người thực hiện).

Bước 2: Sử dụng cồn 70 độ tiến hành làm sạch bề mặt bàn thí nghiệm. Chuẩn bị các
ống đã ghi sẵn thông tin.
Bước 3: Làm sạch bao tay của người làm thí nghiệm bằng cồn và để bao tay khơ rồi
tiến hành thực hiện.
Bước 4: Làm nóng đầu que cấy thẳng trên ngọn lửa đèn cồn, để nguội và lấy 1
lượng vi khuẩn vừa đủ.
Bước 5: Dùng que cấy thẳng cấy đâm vào giữa khối thạch tròn 1 đường cấy thẳng
(chỉ đâm ½ lọ tránh trường hợp chạm đáy lọ để quan sát rõ sự di động của vi khuẩn)
. Hơ thành miệng bình ống vừa cấy xong trên ngọn lửa đèn cồn để tiệt các vi khuẩn
lỡ bám trên miệng ống sau đó đặp nắp lại.
Bước 6: Tiệt trùng que cấy trên ngọn lửa đèn cồn.
2.2.3. Kết quả và biện luận:
a. Kết quả:
- Phản ứng dương (+): Vi khuẩn có thể di động xung quanh đường cấy, xoắn
ốc hoặc làm đục toàn bộ ống thạch (N6.2)
- Phản ứng âm(-): Vi khuẩn không di động chỉ mọc trên đường cấy (N6.5)
b. Biện luận:

11


- Khi cấy chỉ đâm 1 đường ngắn, nhưng sau một thời gian ủ trong nhiệt độ 37
độ, thì thấy đường cấy vi khuẩn có kéo dài xuống đáy lọ mơi trường → vi
khuẩn có khả năng di động. ( N6.2)
+ Vi khuẩn có khả năng di động vì vi khuẩn đang khảo sát là vi khuẩn E.coli
và vì E.coli có tiêm mao (thành phần chủ yếu là protein và các flagelin) 
giúp vi khuẩn di chuyển.
- Khi cấy chỉ đâm 1 đường ngắn, nhưng sau một thời gian ủ trong nhiệt độ 37
độ, thì thấy đường cấy vi khuẩn không kéo dài xuống đáy lọ môi trường , vi
khuẩn chỉ xuất hiện trên đường cấy→vi khuẩn khơng có khả năng di động.

(N6.5)
2.3.

Thử nghiệm MR (Methy red)

Mục đích: Khảo sát vi khuẩn lên men tạo hỗn hợp acid.
2.3.1. Vật liệu – Dụng cụ - Thiết bị
a. Vật liệu
- Môi trường nuôi cấy MR-VP
- Vi khuẩn
b. Dụng cụ
STT

Dụng cụ

1

Que cấy thẳng

2

Đèn cồn

3

Cồn 70 độ

4

Bật lửa

5

Bút lông dầu

2.3.2. Các bước thực hiện:
Bước 1 :Ghi đầy đủ thông tin bệnh phẩm ( tên mẫu, tên nhóm-người thực hiện).
Bước 2: Sử dụng cồn 70 độ tiến hành làm sạch bề mặt bàn thí nghiệm. Chuẩn bị các
ống đã ghi sẵn thông tin.
12


Bước 3: Làm sạch bao tay của người làm thí nghiệm bằng cồn và để bao tay khô rồi
tiến hành thực hiện.
Bước 4: Làm nóng đầu que cấy thẳng trên ngọn lửa đèn cồn, để nguội và lấy 1
lượng vi khuẩn vừa đủ.
Bước 5: Dùng que cấy vòng cấy vào môi trường
Bước 6: Tiệt trùng que cấy trên ngọn lửa đèn cồn.
2.3.3. Kết quả và biện luận:
a. Kết quả:
- Phản ứng âm (-): môi trường chuyển vàng nhạt
b. Biện luận:
Phản ứng âm vì mơi trường chuyển màu vàng nhạt. Theo lý thuyết, E.coli có dương
tính với thử nghiệm MR (mơi trường đổi sang màu hồng). Tuy nhiên trong quá trình
thực hành, có thể đã sử dụng que cấy cịn nóng lấy VK  VK chết  môi trường
không đổi màu ( vẫn màu vàng nhạt).  vi khuẩn không lên men tạo hỗn hợp acid.
2.4.

Thử nghiệm khả năng sử dụng citrate như nguồn carbon duy nhất của vi
khuẩn:

Mục đích: Xác định khả năng sử dụng citrate như nguồn carbon duy nhất
của vi khuẩn.

2.4.1. Vật liệu-Dụng cụ- Thiết bị:
a. Vật liệu:
- Vi khuẩn
- Môi trường Simmon citrate agar
b. Dụng cụ:
STT

Dụng cụ

1

Que cấy thẳng

2

Đèn cồn

3

Cồn 70 độ
13


4

Bật lửa

5

Bút lông dầu

c. Thiết bị:
2.4.2. Các bước tiến hành:
Bước 1 :Ghi đầy đủ thông tin bệnh phẩm ( tên mẫu, tên nhóm-người thực hiện).
Bước 2: Sử dụng cồn 70 độ tiến hành làm sạch bề mặt bàn thí nghiệm. Chuẩn bị các
ống đã ghi sẵn thông tin.
Bước 3: Làm sạch bao tay của người làm thí nghiệm bằng cồn và để bao tay khô rồi
tiến hành thực hiện.
Bước 4: Làm nóng đầu que cấy thẳng trên ngọn lửa đèn cồn, để nguội và lấy 1
lượng vi khuẩn vừa đủ.
Bước 5: Dùng que cấy thẳng cấy vào môi trường.
Bước 6: Tiệt trùng que cấy trên ngọn lửa đèn cồn.
2.4.3. Kết quả và biện luận:
a. Kết quả:
- Phản ứng âm (-): mơi trường màu xanh rêu.
- Biện luận: Vì phản ứng xảy ra âm nên E.coli không khả năng sử dụng
citrate như nguồn carbon duy nhất.

14


Hình 3: Kết quả định danh bằng đặc tính sinh hố
BẢNG TỔNG KẾT ĐỊNH DANH MƠI TRƯỜNG CỦA VI KHUẨN
Mơi trường
MR
SIM

Biện luận
Phản ứng âm (-) : Mơi trường cấy có màu vàng nhạt
Phản ứng dương (+): Vi khuẩn có thể di động xung quanh đường
cấy, xoắn ốc và làm đục tồn bộ ống thạch
Phản ứng âm (-): vi khuẩn khơng có khả năng di động xung
quanh đường cấy, xoắn ốc và làm đục tồn bộ ơng thạch.

Simmon citrate agar
Urea Broth
III.

Phản ứng âm (-): môi trường màu xanh rêu.
Phản ứng âm (-): Môi trường màu cam

KẾT QUẢ KHÁNG SINH ĐỒ - ETEST

1. Phương pháp kháng sinh đồ:
Mục đích thực hiện: Quy trình thực hiện kháng sinh đồ, MIC.
1.1: Vật liệu - dụng cụ - thiết bị
1.1.1: Vật liệu
- Vi khuẩn pha loãng 0,5 McFarland
15


- Đĩa giấy kháng sinh đã tẩm kháng sinh
1.1.2: Dụng cụ:
STT

Dụng cụ

1

Qua tăm bông

2

Đèn cồn

3

Cồn 70 độ

4

Nước javen

1.1.3: Thiết bị:
1.2: Các bước thực hiện:
Bước 1 :Ghi đầy đủ thông tin bệnh phẩm ( tên mẫu, tên nhóm-người thực hiện).
Bước 2: Sử dụng cồn 70 độ tiến hành làm sạch bề mặt bàn thí nghiệm. Chuẩn bị các
ống đã ghi sẵn thông tin.
Bước 3: Làm sạch bao tay của người làm thí nghiệm bằng cồn và để bao tay khơ rồi
tiến hành thực hiện.
Bước 4: Trải vi khuẩn : Dùng que bông vô trùng thấm dung dịch vi khuẩn đã được
pha lỗng 0,5 McFarland, ép sát que bơng vào thành ống eppendorf cho bớt lượng
dịch chứa VK rồi trải lên mặt thạch thật đều, kín và khơ. Khi trải được ½ đĩa, xoay
60° đĩa và trải lần 2, xoay đĩa petri 60° và trải lần 3. Cuối cùng, dùng que bông quét
1 vòng xung quanh thành đĩa petri.
Bước 5: Sau khi trải vi khuẩn, ấp khô mặt thạch ở 37°C trong quá trình 15 phút.
Bước 6: Đặt kháng sinh: Dùng kẹp được tiệt trùng (đốt trên đèn cồn, làm nguội) kẹp

khoanh giấy (kháng sinh) rồi đặt lên mặt thạch sao cho tiếp xúc đều, các đĩa cách
nhau tối thiếu 2,5 cm vat cách thành đĩa tối thiểu 2 cm, không được xê dịch đĩa
kháng sinh sau khi đặt. Chỉ được phép đặt khi bề mặt thạch đã khô.
Bước 7: Tiệt trùng kẹp.
Bước 8: Ủ ở 37°C trong 24 giờ

16


Bảng: Tiêu chuẩn đọc kết quả đường kính vùng kháng khuẩn đối với nhóm vi khuẩn
Acinetobacter spp. Và khoảng chấp nhận về đường kính của chủng E.coli ATCC
25922
STT

1
2
3
4
5
6

Kháng sinh

Hàm lượng
kháng sinh

Ceftazidine
Imipenem
Meropenem
Tobramycin

Gentamicin
Ciprofloxacin

CAZ
IMP
MEM
TM
GM
CIP

30
10
10
10
10
5

Đường kính tiêu
chuẩn
S
≥ 18
≥22
≥18
≥15
≥15
≥21

I
15-17
19-21

15-17
13-14
13-14
16-20

R
≤14
≤18
≤14
≤12
≤12
≤15

E.coli ATCC
25922
25-32
26-32
28-34
18-26
19-26
30-40

1.3: Kết quả và biện luận
a. Kết quả:
BẢNG KẾT QUẢ KHÁNG SINH ĐỒ
STT
1
2
3
4

5
6
7
8
9
10
11
12

Nhóm kháng
sinh
1(N2.1)
2(N2.2)
3(N2.3)
4(N2.4)

Kháng sinh
Ertapenem
Kanamycin
Tobramycin
Cefoxitin
Colistin
Imipenem
Amoxicillin/Clavulanic
Ciprofloxacin
Gentamicin
Cefuroxime
Ceftazidine
Meropenem

Ký
hiệu
En
Kn
Tb
Cn
Co
Im
Ac
Ci
Ge
Cu
Cz
Me

Đường kính
vi khuẩn
26
20
18
24
15
33
20
23
17
22
28
30

b. Biện luận:
17


- N2.1: Tb=18 mm > 15mm (đường kính tiêu chuẩn) => nhạy(S) và nằm trong
khoảng cho phép (18-26) => đáng tin cậy.
- N2.2: Im= 33 mm > 22mm(đường kính tiêu chuản) => nhạy(S) và chủng chuẩn
E.coli ATCC nằm trong khoảng cho phép (26 - 32) => không đáng tin cậy.
- N2.3: + Ge= 17 mm > 15mm(đường kính tiêu chuẩn) => nhạy(S) và chủng chuẩn
E.coli ATCC nằm trong khoảng cho phép (19-26) => không đáng tin cậy.
+ Ci= 23 mm > 21mm(đường kính tiêu chuẩn) => nhạy(S) và chủng chuẩn
E.coli ATCC nằm trong khoảng cho phép (30-40) => không đáng tin cậy.
-N2.4: + Cz = 28 mm >18mm (đường kính tiêu chuẩn) => nhạy (S) và chủng
chuẩn E.coli ATCC nằm trong khoảng cho phép (25-32) => đáng tin cậy.
+ Me = 30 mm > 18 mm ( đường kính tiêu chuẩn) => nhạy (S) và chủng
chuẩn E.coli ATCC nằm trong khoảng cho phép (28-34) => đáng tin cậy.

Hình 4: Kết quả kháng sinh đồ MIC

2. Phương pháp E-test:
18


- Vi khuẩn được phát sinh trên môi trương BHA, ủ 18 -24 giờ cho chủng vi
khuẩn phát triển.
- Pha lỗng vi khuẩn với nước muối sinh lí đến độ chuẩn 0,5 McFarland.
- Trải đĩa, để khô mặt thạch trong 3-5 phút.
- Đặt que E-test lên mặt thạch đã trải vi khuẩn, ủ ở 37oC.
- Sau 16-18 giờ, đọc kết quả đường kính vịng vơ khuẩn trên các đĩa bằng
thước đo.

Hình 5: Kết quả E-Test
Kết quả: Đường kính vịng vơ khuẩn( E-test) = mm
19


IV .PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG TẾ BÀO VI KHUẨN
Mục đích thực hiện: Xác định số lượng vi khuẩn/ vi sinh vật tổng số hay số lượng
vi khuẩn/ vi sinh vật riêng biệt trên một đơn vị vật phẩm đem nghiên cứu (trên g
hoặc ml dung dịch).
4.1. Vật liệu- Dụng cụ- Thiết bị:
4.1.1. Vật liệu:
- Môi trường sử dụng: Thạch lỏng
- Nước muối sinh lý 0.9%
- Nước cất vô trùng 1ml
4.1.2. Dụng cụ:
STT

Dụng cụ

1

Micropipet 1000 um

2

Đèn cồn

3

Cồn 70 độ

4

Bật lửa

5

Bút lông dầu

6

Đĩa petri

7

Ống nghiệm

8

Gía đỡ ống nghiệm

9

Que cấy gạt thủy tinh.

10

Cốc có mỏ

4.1.3. Thiết bị:
+ Máy ủ nhiệt độ
4.2. Các bước thực hiện:
4.2.1. Lấy mẫu:
Quy trình lấy mẫu có những u cầu sau:
20


+ Lấy các mẫu có tính chất đại diện
+ Dụng cụ lấy mẫu, chứa mẫu phải vô tùng
+ Mẫu lấy xong, phải phân tích ngay, khơng để q 24h
+ Mẫu lấy phải có nhãn ghi ký hiệu đồng thời phải ghi vào sổ những đặc
điểm của mẫu và nơi thu mẫu.
4.2.2. Pha loãng mẫu và thực hiện thao tác:
- Pha loãng mẫu:
+ Ta đồng nhất mẫu bằng cách pha 1ml (1000 um) dung dịch nước cất vào
9ml dd nước muối sinh lý 0.9%
+ Lắc đều ống nghiệm
=> Ta được độ pha loãng 10−1 và lần lượt lấy từ mẫu này sang mẫu kế tiếp 1ml cho
đến mẫu cuối cùng 10−4.
 Lưu ý: Từ ống nghiệm thứ 2 tức từ 10−2, ta phải tráng mẫu trước.
- Thực hiện thao tác:
+ Dùng micropipet hút 0,1ml dd pha loãng (cho 2-3 đĩa vào mơi tường) vào
đĩa petri có sẵn thạch lần lượt và
+ Dùng que cấy gạt thủy tinh đã nhúng cồ và hơ qua lửa đèn cồn trải đều
trên mặt thạch sau đó đem ủ ở nhiệt độ 37° C trong 24h.
+ Cho số khuẩn lạc thích hợp vào đĩa ( 25-250 khuẩn lạc/ đĩa).
 Lưu ý: Khi đưa khuẩn lạc vào đĩa ta phải luôn chắc chắn rằng đĩa luôn ở gần
đèn cồn.
4.3. Kết quả và biện luận:

4.3.1. Kết quả: Ta có thể xác định gián tiếp số lượng tế bào bằng cách đếm số
lượng khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch.
4.3.1. Biện luận:
Nhìn vào hình 6 ta thấy mật độ càng thấp thì vi khuẩn sẽ xuất hiện rõ hơn và có thể
đếm được.
21


- Đĩa N2.1 có lượng vi khuẩn dày đặc, nhỏ li ti, rất nhiều nên không thể đếm
được và trải trên bề mặt đĩa thạch.
- Đĩa N2.2 VK bắt đầu to hơn, thưa dần ra và số lượng giảm so với N2.1.
- Đĩa N2.3 Vi khuẩn to ra, ít dần ( lượng VK đã dần biến mất chỉ còn 1
lượng nhỏ xuất hiện trên bề mặt thạch) và rời rạc dần so với đĩa N2.2
- Đĩa N2.4 Vi khuẩn đã ít dần và có thể đếm được số lượng VK so với đĩa
N2.3.
 Vì dung dịch pha lỗng từ dung dịch gốc có nồng độ giảm dần từ 10−1 −10−4 nên
khi đưa vào các đĩa thì lượng vi khuẩn cũng giảm dần.

Hình 6: Kết quả của phương pháp trải vi khuẩn

Tài liệu tham khảo
22


 Giáo trình thực tập vi sinh học của GV. TS. Trần Khánh Linh.

23