Ề TÀI KHCN SINH HỌC NGHIÊN CỨU THAY THẾ CHỦNG NAKAYAMA BẰNG CHỦNG BEIJING-1 TRONG SẢN XUẤT VĂCXIN VIÊM NÃO NHẬT BẢN pot

viện vệ sinh dịch tễ trung ơng
công ty vắc xin và sinh phẩm số 1






báo cáo tổng kết đề tài KHCN cấp Nhà nớc

nghiên cứu thay thế chủng nakayama
bằng chủng Beijing-1 trong sản xuất
vắc xin viêm no Nhật bản

M số chơng trình : kc.10.22




chủ nhiệm đề tài: GS.TS Huỳnh phơng liên

5983
23/8/2006



Hà nội 2006



1
CHƯƠNG I
TỔNG QUAN
1. Lịch sử nghiên cứu bệnh viêm não Nhật Bản
- Bệnh viêm não Nhật Bản (VNNB) lần đầu tiên được ghi nhận năm 1871, với các triệu
chứng viêm não ở ngựa và ở người. Năm 1873, bệnh xuất hiện rải rác ở nhiều vùng
tại Nhật Bản. Năm 1924, một vụ dịch lớn xảy ra tại Nhật Bản với 6000 người mắc và
có đến 60% trong số này tử vong [62].
- Nă
m 1934, Hayashi đã gây bệnh thực nghiệm trên khỉ bằng cách lấy não người tử
vong do mắc viêm não tiêm vào não khỉ và sau thời gian ủ bệnh từ 10-14 ngày, thấy
xuất hiện các triệu chứng viêm não [57, 115].
- Năm 1935, lần đầu tiên phân lập được virut VNNB từ não một trẻ em bị chết do viêm
não tại Tokyo (Nật Bản), chủng được đặt tên là Nakayama [24, 183].
- Năm 1937, phân lập được virut gây viêm não ở ngựa, về sau virut này được xếp vào
ch
ủng viêm não ngựa miền Tây.
- Năm 1938, Mitamura đã phân lập được virut VNNB từ muỗi Culex
tritaeniorhynchus, mặc dù từ những năm 1930 người ta đã nghi ngờ sự lây truyền của
bệnh là do muỗi truyền [183].

- Năm 1936-1938, Mitamura và Takanouchi đã nghiên cứu sản xuất thử văcxin viêm
não từ não chuột, dù bước đầu nhưng là rất sớm sau khi đã phân lập được virut
VNNB [16]. Công nghệ này 40 năm sau mới được hoàn thiện. Văcxin bất hoạt tinh
khiết, an toàn cao và hiện đang có mặt trên thị trường quốc tế, đó là văcxin của hãng
Biken theo phương pháp hóa lý của Takaku Nhật Bản [111].

- Năm 1959, Buecher và Scherer đã nghiên cứu về sinh thái học bệnh VNNB ở Nhật
Bản và đã chứng minh chim và lợn là những vật chủ chính bị nhiễm virut huyết và
nhờ có muỗi là vectơ hút máu các động vật nhiễm truyền virut sang cho người. Từ đó
bệnh VNNB được nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu [21].

2. Phân loại virut VNNB
Virut VNNB là một thành viên của virut Arbo (arthropod borne viruses). Là
những virut do côn trùng tiết túc truyền cho động vật có xương sống qua đường máu. Tất
cả các virut arbo đều có hệ gen (genome) là ARN, hầu hết chúng đều có vỏ lipit và bị bất
hoạt bởi ether hoặc sodium deoxycholate [20, 24]. Việc đặt tên cho các virut arbo đôi khi
dựa vào bệnh như sốt Dengue, số vàng (yellow fever) hoặc theo vùng địa lý mà ở đó lần

2
đầu tiên phân lập được virut như viêm não Nhật Bản (Japanese encephalitis), St. Louis
encephalitis, West Nile fever
Có trên 350 loài trong nhóm virut arbo, trong đó arbo gây bệnh cho người có trên
75 thành viên, được sắp xếp theo mối quan hệ kháng nguyên. Một số tác giả nghiên cứu
để xếp loại theo các đặc tính địa lý. Nhiều virut arbo được xếp vào họ Togaviridae,
Bunyaviridae, Reoviridae, Rhabdoviridae Họ Togaviridae được chia thành 2 chi
(genus) là Alphavirus thuộc nhóm A trong đó điển hình là các loài Aura; Babanki;
Barmah Forest; Eastern equine encephalitis; Everglades; Western equine encephalitis;
Whataroa. Họ Flaviviridae thuộc nhóm B bao gồm: Japanese encephalitis (VNNB);
Dengue; Yellow fever; West Nile fever; Brazilian encephalitis…

Hình 1: Mô hình so sánh các virut trong nhóm Flavivirus dựa vào trình tự axit
amin của protein vùng vỏ (E-protein), s
ử dụng phần mềm Beckman Microgenie
Software package, Version 4.0 [101].
(DEN: Dengue; WN: West Nile; KVN: Kunjin; MVE: Murray Valley encephalitis; JE:
Japanese encephalitis; SLE: St. Louis encephalitis; YF: Yellow fever; POW: Powassan; LGT:
Langat; LI: Louping ill; TBE: Tick borne encephalitis)
Các tác giả phân tích trong 3 nhóm chính DEN, JE và TBE cho thấy: Phân tích
huyết thanh hỗn hợp JE và DEN thì tỷ lệ giống nhau là 46-53%. DEN1 và DEN3 có quan
hệ gần nhất (77% tương đồng); với DEN2 là 69% và DEN4 là 62%. JE và TBE có tỷ lệ
nucleotit cùng loại 72-77%, còn axit amin của protein E cùng loại là 40-44% [101].
93
82
77-78
72-74
CEE RSSE
96
46-53
40-44
77-78
85-89
91-94
40
50
60
70
80
90
100
E-Protein Amino Acid Homology (%)

JE
WN KUN MVE JE SLE
YF
TBE
POW LGT LI TBE
DEN
DEN
3 1 2 4
77
69
62

3
Hội nghị 1992 tại Geneve, Tổ chức Y tế thế giới (TCYTTG) đã xếp loại viêm não
do muỗi truyền và gây tổn thương thần kinh trung ương được ký hiệu như sau:
A83.0 Viêm não Nhật Bản
A83.1 Viêm não ngựa miền Tây
A83.2 Viêm não ngựa miền Đông
A83.3 Viêm não St. Louis
A83.4 Viêm não châu Úc
A83.5 Viêm não California
A83.6 Viêm não virut Nga
A83.7 Viêm não virut do muỗi truyền khác
A83.8 Viêm não virut do muỗi truyền không xác định
Viêm não Nhật Bản được xếp hàng đầu trong các loại viêm não do muỗi truyền,
bệnh để lại hậu quả nặ
ng nề nên đã có văcxin phòng bệnh từ 1954, và sớm có các phương
pháp chẩn đoán phòng thí nghiệm để xác định căn nguyên [31, 47, 95, 115, 120, 139,
148, 187].
3. Đặc điểm và cấu trúc của virut VNNB

Virut có hình cầu, đường kính trung bình 40-50nm, có màng lipid kép, gắn vào lớp
vỏ là glycoprotein E và protein màng (M). Vật liệu di truyền là 1 sợi ARN đơn phân cực
dương xoắn, được bao bọc bởi nucleocapsid. Hạt virut VNNB tinh khiết cho thấy sợi
ARN chiếm 6%, protein 66%, lipid 17% và carbonhydrate chiếm 9%, cấu trúc của lớp
lipid kép phụ thu
ộc vào tế bào chủ, nơi virut nhân lên [152, 180].
Cấu trúc phân tử của sợi ARN bao gồm 11000 nucleotid, tương ứng với 3400 axit
amin. Đây chính là yếu tố gây nhiễm của virut. Hệ gen của virut VNNB mã hóa cho 10
protein gồm 3 protein cấu trúc và 7 protein không cấu trúc trong một khung đọc mở liên
tục và trật tự từ đầu 5’ đến đầu 3’ và các vùng không mã hóa. Kết quả dịch mã để hình
thành một polyprotein đơn được giải phóng sau sự hoạt hóa của tế bào chủ và enzym
chuyển hóa tạ
o ra sự phân cắt của các protein [31].

4


Trên hình 2, cho ta thấy sắp xếp thứ tự các protein trong sợi ARN: Cap 5’-C-
preM-M-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5-3’. Đầu 3’ sợi ARN của virut
VNNB không chứa đuôi polyA nhưng được coi là làm khuôn mẫu cho các cấu trúc tiếp
theo. Từ đầu 5’ các gen được mã hóa cho protein vỏ capsid của ARN (C); protein tiền
màng (preM); hoặc protein màng (M) của virut trưởng thành và protein vỏ (E) là protein
cấu trúc chiếm 1/4 chiều dài của hệ gen. Các protein không cấu trúc là phần còn lại của
hệ gen [149, 181].
Vỏ (Envelope)
M (Membrane)
Lớp Lipit kép
N
ucleocapsi
d

5’
7-m
G
3’
Capsid preM E NS1 NS3 NS4 NS2 NS5
118 nt
51 nt
Sù phiªn m· vµ ph©n
c¾t protein
ORF ®¬n
(
10233 nt
)
NS4A
NS4B NS2BNS2A
Phiªn m· trªn m¹ng
l−íi néi chÊt h¹t

H
ình 2: Sơ đồ cấu trúc h
ạ
t virut VNNB
(
Flaviviruses
)


5

3.1 Protein C
Protein C rất nhỏ, chỉ 9-12 KDa gồm 112-127 axit amin được tạo thành rất vững
chắc gồm một số lớn axit amin Lys và Arg. Các axit amin trong protein C liên kết với
nhau rất chặt chẽ, có thể loại trừ khả năng trung hòa của phân tử ARN của virut với các
tác nhân liên quan [106, 148].
3.2 Protein M
Protein M có 2 dạng: protein preM chưa trưởng thành trong tế bào chủ và quan sát
thấy có 165 axit amin không trùng lặp với protein E. Từ đó một số tác giả nghiên cứu sử
dụng protein E trong sản xuấ
t văcxin VNNB tái tổ hợp để tổng hợp preM của virut với
mục đích tạo các nếp gấp chính xác ở tại protein M và lắp ráp vào protein E của 1
flavivirus nào đó (như yellow fever). Trước khi virut được giải phóng ra ngoài tế bào,
preM được phân cắt bởi một phân tử protease (furin-like) để tạo thành protein M hoàn
chỉnh. PreM chưa trưởng thành không tự tiến tới tế bào đích nhưng lại rất cần thiết cho
hoạt động chức năng duy trì nòi giố
ng của virut trưởng thành [148, 170, 189].
Protein M có trong virut trưởng thành ngoài tế bào. Hạt virut trưởng thành có khả
năng kháng axit kém hơn hạt virut chưa trưởng thành khoảng 400 lần khi nghiên cứu so
sánh trên hạt virut chưa hoàn chỉnh, vì vậy khả năng tiếp cận với tế bào đích dễ dàng hơn.
Sự ly giải preM khi ra ngoài tế bào tạo ra sự sắp xếp lại các cấu trúc oligo trên bề mặt hạt
virut do đó làm tăng khả năng gây nhiễm của virut trưở
ng thành tới vật chủ [58, 104].
3.3 Protein E
Có trọng lượng phân tử 55-60KDa, là một glycoprotein bao gồm khoảng 494-501
axit amin là thành phần cấu tạo chính của vỏ (E). So sánh các chuỗi axit amin tương đồng
cho thấy protein E là một protein cấu trúc có tính bảo tồn cao trong các virut thuộc nhóm
flavivirus. Protein E có liên quan chặt chẽ đến chức năng sinh học của virut như chức
năng bám dính, thụ cảm thể, ngưng kết hồng cầu, trung hòa kháng thể, điều chỉnh pH nội
nguyên sinh chấ
t của tế bào chủ [56, 59, 115, 139, 147, 149].

3.4 Các protein không cấu trúc (NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5)
- NS1: có trọng lượng phân tử 42-50KDa, là một glycoprotein gồm 353-354 axit
amin. Chức năng chưa rõ, có thể như một bổ thể hòa tan cố định kháng nguyên khi bộc lộ
trên tế bào cảm nhiễm, có thể NS1 như là đích của đáp ứng miễn dịch chăng? [86, 88,
148].

6
- NS3: có trọng lượng phân tử 67-70 KDa gồm 618-623 axit amin và có tính bảo
tồn cao trong chuỗi nucleotid của nhóm flavivirus, đóng vai trò mã hóa cho enzym
proteaza và helicaza [31, 101, 148].
- NS5: có trọng lượng phân tử 104-106 KDa gồm 900-905 axit amin và cũng có
tính bảo tồn cao trong chuỗi nuleotid. Một số nghiên cứu khác cho thấy NS5 gắn liền với
sự tạo vỏ capsid của ARN. Các nghiên cứu invitro polymeraza đã thẩm định và cho thấy
NS3 và NS5 được sử dụng khi ARN của virut nhân lên [148, 149, 176, 179, 181].
- NS2A-NS2B-NS4A và NS4B: đều rất nhỏ bé, có tính chất bảo tồn kém trong
chuỗi nucleotid, có thể nghĩ đến sự mã hóa của chúng có liên quan đến protein M.
Những năm gần đây, các nghiên cứu về sinh học phân tử của virut VNNB đã có
những bước tiến đáng kể. Định loại cấu trúc 3 protein của virut VNNB là M, C và E.
Protein E phân lập được từ bề mặt của hạt virut. Thử nghiệm trên động vật có vú cho thấy
protein E tạo ra kháng thể trung hòa sau khi tiêm và các động vật này (chuột nhắt trắng)
đã sống sót sau khi thử thách b
ằng chủng độc lực. Khả năng bảo vệ của protein E được
thử nghiệm và phân tích bằng thử nghiệm kháng thể đơn dòng (MAb) để định loại nhiều
epitop có phản ứng chéo với các flavivirus và cũng giống nhau về đặc tính sinh học [23,
24, 31].
3.5 Tính chất hóa lý và bền vững của virut VNNB [31, 82]
- Virut VNNB có tỷ trọng 1,19-1,20g/cm
3
trong đường và 1,22-1,24g/m
3

trong cesium
chlorid.
- Hệ số lắng 200S.
- Trọng lượng phân tử 60-70 x 10
6
dalton.
- Độ bền vững: với độ pH giao động từ 7-9. Thích hợp nhất là pH 8.
- Virut dễ bị bất hoạt bởi nhiệt độ cao: 50
o
C trong 50 phút ; 37
o
C trong vài giờ. Nhiệt
độ thấp như -80
o
C, -20
o
C virut tồn tại trong nhiều năm và trong nitơ lỏng (-196
o
C)
virut tồn tại vĩnh cửu.
- Virut VNNB rất nhạy với dung môi hòa tan như ether, sodium deoxycholate, dễ dàng
bị bất hoạt bởi tia cực tím, formaldehyt
3.6 Thành phần và quyết định kháng nguyên
Theo nhiều nghiên cứu đã cho thấy kháng nguyên của flavivirus có phản ứng chéo
với nhau, 3 nhóm kháng nguyên quan hệ mật thiết và rất khăng khít với nhau đó là sốt
Tây sông Nile (West Nile fever), viêm não Louis (Louis encephalitis) và viêm não Nhật
Bản (Japanese encephalitis) [29, 140]. Bằng các phản ứng huyết thanh với kháng thể đa
dòng rất khó phân biệ
t. Riêng phản ứng trung hòa (NT) là nhạy nhất tiếp đến là phản ứng

7
kết hợp bổ thể (CF), rồi miễn dịch huỳnh quang (IF). Vậy đánh giá đáp ứng miến dịch
sau khi tiêm văcxin bằng ký thuật trung hòa là đặc hiệu nhất, đặc biệt là trung hòa giảm
50% đám hoại tử (PRNT) trên tế bào [126, 127]. Hoặc dùng kháng thể đơn dòng để định
loại flavivirus và phân biệt với virut VNNB [59, 68, 74, 102, 104, 123, 126, 127, 128,
139, 151].
Những năm cuối thập kỷ 90, công nghệ sinh học phân tử phát triển không ngừng
và chỉ cần sử dụng kỹ thuật phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR), với cặp mồi (primer) đặc
hiệu thì rất nhanh chóng định loại được typ virut trong các flavivirus [118, 133]. Hoặc xa
hơn còn phân tích được đặc tính di truyền của các virut VNNB lưu hành ở các vùng khác
nhau bằng phương pháp phân tích trình tự gen (sequencing), so sánh trình tự các
nucleotid của các chủng virut VNNB khác nhau [134, 185] Ngày nay, nhờ công nghệ
này mà nhiều nhà khoa học đã cố gắng chế tạo các văcxin tái tổ hợp ADN nh
ằm cải thiện
một bước công nghệ gen trong việc bảo vệ sức khỏe cộng đồng [65].
3.7 Khả năng bảo vệ của kháng nguyên
Kháng nguyên tạo ra kháng thể tương ứng, nhưng không phải tất cả các kháng
nguyên đều liên quan đến việc gây bệnh và sinh miễn dịch. Thường có 1-2 kháng nguyên
quyết định tính sinh miễn dịch và cũng là kháng nguyên bị kháng thể trung hòa nếu xâm
nhập vào cơ thể đã được miễ
n dịch. Kháng nguyên này nằm ngay trên bề mặt của hạt
virut. Đó là kháng nguyên chịu trách nhiệm tiếp xúc đầu tiên trên tế bào chủ. Với hạt
virut VNNB thì kháng nguyên ngưng kết hồng cầu (HA) và hoạt tính trung hòa là
glycoprotein trên preM và E (vỏ và tiền màng của virut), cũng chính 2 thành phần
glycoprotein này sinh kháng thể ƯCNKHC (HI) và kết hợp bổ thể (CF), kháng thể trung
hòa (NT) [31, 96, 111, 151]. Để chứng minh đều này khi Kitano và Suzuki đã tách chiết
ngưng kết tố hồng cầu trên bề mặt hạt virut VNNB rồ
i gây miễn dịch cho chuột nhắt
trắng. Kết quả là kháng thể trung hòa ở chuột được gây miễn dịch với hạt virut VNNB
nguyên vẹn và bằng kháng nguyên HA đều có hiệu giá như nhau. Từ đó hai tác giả kết

luận yếu tố ngưng kết hồng cầu (HA) là kháng nguyên kích thích tạo ra kháng thể trung
hòa [82].
4. Sự nhân lên của virut trên tế bào
4.1 Chu kỳ nhân lên của virut ARN
Khi virut gặp tế bào cảm thụ và nhận biết các thụ th
ể trên màng tế bào, tiến đến và
bám vào thụ thể, màng tế bào bị tác động và tạo khe hở cho virut thâm nhập vào bên
trong tế bào gây cảm ứng tổng hợp ARN [35, 115, 148]. Sau đó sợi ARN được bộc lộ là
ARN đơn-polymeraza để tạo thành ARN phân cực (-) bổ sung thành chuỗi ARN kép nhờ
phiên mã sớm và thông tin trung gian sao chép sợi ARN kép được làm khuôn để tổng

8
hợp các sợi ARN mới theo cách bán bảo tồn và không đối xứng. Khung đọc mở được
đồng dịch mã bằng cách cắt đoạn protein liên tiếp thành các đoạn protein cấu trúc và
không cấu trúc [172]. ARN và protein của virut được tổng hợp trên lưới nội chất có hạt,
vùng quanh nhân trong nguyên sinh chất của tế bào chủ. Sự nhân lên của virut liên quan
đến phát triển của lưới nội chất tạo thành các nội bào đặc trưng. Các sản phẩm tổ
ng hợp
được lắp ráp ở màng tế bào chất. Sau đó các hạt virion được giải phóng qua bộ máy
Golgi bằng ngoại bào xuất tiết và các virut mới tiếp tục xâm nhập vào tế bào khác và bắt
đầu một chu kỳ mới [52, 53, 54].
4.2 Sự nhân lên của virut trong tế bào

Hình 3 : Sơ đồ nhân lên của flaviviruses [148]
Virut VNNB nhân lên trên nhiều loại tế bào cả ở trên tế bào tiên phát và tế bào
thường trực, chúng có nguồn gốc từ
người, khỉ, gặm nhấm, lợn, chim, gia cầm và muỗi
[23, 24, 45]. Tế bào thận bào thai người, thận khỉ, thận lợn, tế bào phôi gà các dòng tế
bào thường trực như GMK2, Vero (thận khỉ), BHK21 (thận chuột đất vàng), C6/36 (tế
bào muỗi Albobitus). Virut nhân lên gây hủy hoại tế bào (CPE) nhưng cũng có một số

7. Sự hình thành
virion trong NSC
1. Gắn kế
t

th
ụ thể
2
.
Th
ụ

t
h

ể

của

tế

b
ào
3. Dung hợp màng
tế bào ở pH thấp
4. Cởi áo (bộc
lộ sợi ARN)
5. Dịch mã thành chuỗi
polyprotein
6. Sao chép ARN
8. Lắp ráp v
à
hoàn thiện
9. Phóng thích
các hạt viru
t

9
loại tế bào quan sát dưới kính hiển vi quang học, không thấy hiện tượng CPE [119]. Hiệu
giá virut đạt được tùy thuộc vào tế bào chủ, loại cảm ứng và thích hợp virut nhân lên tốc
độ nhanh, thời gian tạo CPE nhanh sau 1-2 ngày gây nhiễm (Tế bào C6/36, Vero và
BHK21) [117].
Hình ảnh tế bào tổn thương quan sát trên kính hiển vi quang học cho thấy: tế bào
phình to, các tiểu thể hạt xuất hiện ở lưới nội chất làm rối loạn chức năng phân chia tế
bào, vỏ màng nội bào tạo thành các không bào căng phồng và các tiểu thể trong nhân bị

méo mó. Tăng sinh tiểu thể Lysosom và làm loãng nguyên sinh chất của tế bào. Hoạt tính
enzym lysosom tăng lên trong tổ chức tế bào nhiễm [132].
5. Sinh bệnh học
Virut VNNB có cấu trúc kháng nguyên giống như các flavivirus khác, bao gồm
virut viêm não St. Louis, virut West Nile vì vậy, chúng có phản ứng chéo với các epitop
trung hòa với virut VNNB trên kháng nguyên bề mặt E. Một số phân typ của kháng
nguyên đã được nghiên cứu, mặc dù vậy cho đến nay nghiên cứu sự khác nhau giữ
a các
phân typ về độc tính thần kinh, vật chủ vẫn còn nghèo nàn. Vẫn các giả thiết, muỗi đốt
qua da rồi virut nhân lên tại chỗ sau đó tiến đến các hạch lympho vùng. Virut tấn công
đến hệ thần kinh trung ương và chắc chắn sẽ đến hệ tuần hoàn tổn thương tế bào thần
kinh trung ương rồi hủy hoại hệ thần kinh trung ương [92]. Virut nhân lên và khu trú ở
não, vùng chất xám, vùng đồi thị, tiểu não và có mặt trong nước não t
ủy [40, 74, 75, 76].
Chẩn đoán căn nguyên VNNB chủ yếu dựa vào huyết thanh học [61, 80]. Sử dụng
bộ sinh phẩm MAC-ELISA để phát hiện sớm IgM đặc hiệu kháng virut VNNB trong
nước não tủy hoặc trong máu bệnh nhân trong vòng 4-7 ngày sau khởi bệnh [8, 22, 25,
26, 48, 71, 194]. Những phương pháp chẩn đoán khác như dot-blot hoặc kỹ thuật tủa
miễn dịch (immuniprecipitation IgM assay) phát hiện IgM [167]. Có thể phân lập virut từ
máu bệnh nhân trong giai đoạ
n sớm, từ dịch não tủy hoặc từ não tử thi. Kỹ thuật PCR để
phát hiện hệ gen đặc hiệu của virut, đặc biệt trong dịch não tủy cũng dễ dàng phát hiện
được sự có mặt của hệ gen virut VNNB [68, 93, 107, 133].
Mô hình nghiên cứu thí nghiệm trên chuột nhắt trắng là rõ ràng nhất [40]. Những
nghiên cứu sâu về các thể lâm sàng và nhiễm virut thể ẩn cho thấy mức độ thể hiện lâm
sàng: từ t
ừ, đột ngột, thể nhẹ, thể nặng, thể ẩn phụ thuộc vào các yếu tố: đường gây
nhiễm (dưới da, phúc mạc, não); số lượng virut xâm nhập vào cơ thể; tính độc lực của
chủng virut; tuổi cảm nhiễm của vật chủ Vật chủ là yếu tố rất quan trọng về tạo miễn
dịch, sinh interferon. Sức khỏe của vật chủ ảnh hưởng

đến tính sinh bệnh [73]. Thử
nghiệm tiêm vào não chuột liều cao thì bệnh thể hiện dồn dập, đột ngột. Nếu liều gây
nhiễm qua da, lượng virut thấp nên diễn biến trước tiên virut nhân lên ở máu ngoại vi rồi

10
hướng thần kinh trung ương và sau đó gây ra Hội chứng não cấp. Tính từ khi virut nhân
lên đến thời điểm sốt, đó là giai đoạn ủ bệnh. Thời gian này có thể 6-16 ngày, tùy thuộc
vào các yếu tố trên. Hệ miễn dịch hoạt động trước khi xuất hiện các triệu chứng lâm
sàng. Do đó, khởi bệnh sau 3-4 ngày đã có thể phát hiện kháng thể IgM và chính giai
đoạn sớm này có thể phân lập được virut một cách dễ dàng từ
dịch não tủy [25] .

Hình 4: Quá trình xâm nhập và phát triển trong cơ thể sau nhiễm virut VNNB [121]
Theo sơ đồ trên cho thấy: muỗi đốt, virut truyền qua da, nhân lên tại chỗ và tiến
tới hạch lympho vùng, tuyến ức (hệ miễn dịch) rồi vào máu. Trước tiên, gây nhiễm virut
huyết và các tổ chức ngoài thần kinh như cơ vân, cơ trơn, cơ tim, nội mao mạch, các tổ
chức lympho, tuyến nội tiết, ngoại tiết và vào hệ tuần hoàn. Nhiễm virut huyết dao độ
ng
bởi tỷ lệ di chuyển của macrophage và cuối cùng kích thích sinh kháng thể dịch thể, qúa
trình này diễn biến khoảng một tuần sau khi nhiễm virut. Khi virut tiến tới hệ thần kinh
trung ương, ngay lập tức gây cảm ứng thần kinh: thử nghiệm rất rõ ở chuột nhắt và khỉ,
biểu hiện thương tổn chủ yếu ở vùng chất xám, đồi thị và tiểu não. Huang và Wong đã
Tổ chức ngoài thần kinh

- Cơ vân, cơ trơn
- Tuyến tụy, thượng thận
- Các tổ chức liên quan
Virut truyền qua da
Hạch Lympho vùng
Tuyến ức

Máu
Huyết tương
Tổ chức biểu mô
Kháng thể thể dịch
Nội mô mao mạch
Tế bào nội mạc võng mô
- Rối loạn chức năng tế bào
- Ly giải tế bào
- Viêm tế bào
Thần kinh đệm
Lymphocyt
Macrophage
KT của hệ thần kinh
trung ương
Mô thần kinh

11
nghiên cứu theo dõi và miêu tả các tổn thương thần kinh trung ương cho thấy, liệt ngoại
biên, liệt 4 chi và liệt toàn thân [66]. Miyake mô tả lại bệnh lý thể hiện ở người trong giai
đoạn cấp: xung huyết, phù nề, xuất huyết vi thể ở não, gây hủy hoại và thái hóa tế bào
thần kinh, viêm tắc mạch vi thể chủ yếu xảy ra ở chất xám, não giữa và thân não [111].
Ngoài ra các thương tổn ngoài tổ chức thần kinh như tă
ng sinh các trung tâm bạch huyết,
viêm cơ tim, xuất hiện các tế bào kuffler ở gan, viêm phổi, xuất huyết thận [160].
Lợn nhiễm virut viêm não dẫn đến sẩy thai và tìm thấy các thương tổn ở bào thai
lợn bị sẩy. Virut viêm não còn gây vô tinh, viêm mào tinh hoàn, viêm bao tinh hoàn và
dừng sinh tinh dịch. Sau khi tiêm virut viêm não vào chuột cái chửa cũng gây sẩy thai. Ở
người cũng đã chứng minh nhiễm virut truyền qua nhau thai, gây sẩy thai và đã phân lập
được virut ở bào thai [111].
Đáp ứng miễn dị

ch bảo vệ: miễn dịch bảo vệ được kết hợp với sự phát triển của
kháng thể trung hòa [193]. Mặc dù chưa có tiêu chuẩn quốc tế quy định, hiệu giá kháng
thể trung hòa 1:10 hoặc lớn hơn 1:10 là đủ bảo vệ. Vai trò của miễn dịch trung gian tế
bào cũng được chứng minh trong nghiên cứu trên mô hình chuột.
Đáp ứng miễn dịch thụ động: Globulin miễn dịch để đ
iều trị viêm não điều chế
từ huyết tương người chưa có. Theo kinh nghiệm của một số tác giả, bệnh viêm não do
ve truyền thì phải được sử dụng ngay trước khi khởi bệnh mới có hiệu quả, nếu chỉ muộn
4 ngày sau khởi bệnh cũng không có hiệu quả. Một số nghiên cứu để điều trị sớm bằng
α-interferon, có thể kết hợp vớ
i plasma miễn dịch điều trị dự phòng tốt hơn [50, 51, 64
165].
Đáp ứng miễn dịch chủ động: Văcxin phòng bệnh VNNB được sử dụng rộng rãi
trên thế giới. Tuy nhiên, hiện tại chỉ có văcxin bất hoạt, tinh khiết từ não chuột là được sử
dụng rộng rãi [1, 4, 5, 6, 63, 70, 72, 168, 171, 182].
Văcxin bất hoạt và văcxin sống giảm độc lực trên tế bào thận chuộ
t đất vàng tiên
phát (PHK) được sản xuất và phân phối tại Trung Quốc với hơn 75 triệu liều văcxin bất
hoạt và 25 triệu liều văcxin sống giảm động lực được sử dụng hàng năm tại Trung Quốc
để dự phòng cho trẻ em [60, 116].
Tại Nhật Bản, các nhà sản xuất hàng năm chỉ đạt 11 triệu liều, đủ cung cấp trong
nước và xuất khẩu 2 triệu liều. V
ăcxin bất hoạt từ não chuột do BIKEN (Nhật Bản) và
Green Cross (Hàn Quốc) sản xuất đều được sử dụng ở các nước châu Âu, bắc Mỹ và Úc.
Sau khi một sinh viên Mỹ ở Bắc Kinh chết do VNNB. Trung tâm kiểm soát bệnh tật
(CDC, Hoa Kỳ) chỉ sử dụng văcxin của BIKEN để tiêm cho lính Mỹ và du khách Mỹ đến
các vùng có dịch.

12
Gây bệnh thực nghiệm: Mô hình thực nghiệm có hiệu quả nhất là chuột nhắt,

chuột hamster. Đó là động vật dễ cảm nhiễm với virut VNNB nhưng các yết tố có quyết
định đến tính sinh bệnh là :
+ Đường gây nhiễm.
+ Lượng virut thâm nhập vào cơ thể.
+ Tuổi cảm nhiễm.
+ Độc lực thần kinh của chủng gây nhiễm.
Nhiều tác giả đã nghiên cứu, đều có chung một nhậ
n xét là chuột non có tính cảm
nhiễm mạnh hơn chuột già [54]. Họ còn chứng minh đường gây nhiễm trực tiếp vào não,
thời gian ủ bệnh và phát bệnh nhanh hơn đường ngoại biên [52]. Năm 1991, Ogata đã
chứng minh virut viêm não có ái tính với tế bào thần kinh [125]. Dù đường vào cơ thể
bằng trực tiếp với tổ chức não hay bằng đường ngoại biên thì virut cũng theo các hạch
bạch huyết, hướng tới các nơron thầ
n kinh và nhân lên mạnh mẽ, nhanh chóng ở tổ chức
tế bào thần kinh. Miura đã nghiên cứu, phân tích về tính độc lực thần kinh ở chủng độc
lực có một gen trội, chính gen này quyết định tính độc lực của chủng virut VNNB. Huang
và Wong đã nghiên cứu và công bố kết quả trùng lặp với một số tác giả trước đó là:
Trong giai đoạn cấp tính virut VNNB nhân lên và gây tổn thương tổ chức não như hiện
tượng xung huyế
t, phù nề và xuất huyết ở não chuột [66, 122]. Các tiêu bản cắt cực mỏng
soi trên kính hiển vi cho thấy sự thoái hóa, hoại tử tế bào thần kinh, hạch thần kinh đệm,
nơron thần kinh, hiện tượng viêm quanh mao mạch [54, 132]. Các hiện tượng này xảy ra
ở não trung gian, não giữa và thân não chủ yếu ở vùng chất xám. Ngoài ra người ta cũng
ghi nhận được sự tăng sinh của các trung tâm bạch huyết, tăng các tiểu thể Malpighi ở
lách, viêm c
ơ tim, viêm tế bào Kuffler ở tổ chức gan, viêm giãn phế nan ở phổi và các nốt
xuất huyết cục bộ ở thận. Johnson đã phát hiện thấy các kháng nguyên virut VNNB tập
trung ở nơron thần kinh vùng đồi thị và thân não của bệnh nhân tử vong do VNNB [75].
Nghiên cứu virut VNNB ở lợn cho thấy lợn không có triệu chứng viêm não mà
thường virut viêm não gây thai chết lưu hoặc sẩy thai và đã chứng minh virut viêm não ở

não của lợn con bị sẩy. Ở l
ợn đực thì virut gây thiểu năng tinh dịch hoặc không có tinh
dịch, viêm mào tinh hoàn và vỏ tinh hoàn.
Ở phụ nữ mang thai bị viêm não sẽ gây sẩy thai và phân lập được virut từ bào thai.
Tiêm virut viêm não qua đường phúc mạc cho chuột chửa cũng gây sẩy thai.
Chuột nhiễm virut thể ẩn trong thời kỳ mang thai có thể nhiễm virut thể ẩn ở lần mang
thai sau.
6. Xét nghiệm cận lâm sàng và chẩn đoán nghiên cứu phòng thí nghiệm

13
6.1 Xét nghiệm lâm sàng [77, 109, 110]
- Bạch cầu tăng: 10-34x10
9
/l; số lượng trung tính giao động 51-90%
- Áp lực nước não tủy tăng (NNT)
- Tế bào trong NNT tăng 10-980 x 10
6
/l; protein < 900mg/l; nồng độ glucose bình
thường.
- Điện não đồ không có gì đặc biệt, bao gồm cả sóng theta và delta.
Điện não đồ thay đổi có thể giúp phân biệt với viêm não do Herpes. Phân tích hình
ảnh qua computer có thấy một chút thay đổi ở vùng chất xám, nhưng phải là chuyên gia
có nhiều kinh nghiệm mới phát hiện được.
6.2 Chẩn đoán phòng thí nghiệm
Các phương pháp chẩn đoán phòng thí nghiệm vẫn thường theo một quy trình nhất
định. Chẩn đoán sớm, nhanh và các phương pháp dịch t
ễ học. Phát hiện kháng thể IgM
đặc hiệu kháng virut VNNB còn phục vụ nghiên cứu, xác định căn nguyên là phân lập
virut. Chúng tôi trình bày tuần tự các phương pháp chẩn đoán phòng thí nghiệm theo qui
trình của TCYTTG.

6.2.1 Phân lập virut [43, 80, 81, 94, 162, 112, 193]
- Tiêm vào não chuột sơ sinh
- Nuôi cấy trên tế bào phôi gà, phôi vịt tiên phát
- Nuôi cấy trên các dòng tế bào thường trực: Vero, LLCMK
2
, C6/36 và AP/61.
- Kỹ thuật tiêm vào muỗi
6.2.2 Phát hiện kháng nguyên [39, 143, 145, 193]
- Ngưng kết hồng cầu thụ động ngược.
- Miễn dịch huỳnh quang.
- Miễn dịch gắn vàng, bạc (MIGSS).
6.2.3 Phát hiện kháng thể [26, 36, 45, 55, 167]
- ELISA tóm bắt kháng thể IgM
- Avidin biotin system
- Kỹ thuật hấp phụ miễn dịch gắn Biotin
- Thử nghiệm miễn dịch DOT tóm bắt IgM phát hiện màng nitrocellulose
- Kỹ thuật ngưng kết hồng cầu
- Kỹ thuậ
t kết hợp bổ thể
- Kỹ thuật tan huyết phóng xạ đơn
- Kỹ thuật trung hòa

14
Để có thể chẩn đoán phân biệt viêm não do herpes hay VNNB , vùng tổn thương
chủ yếu là diencephalon và basal ganglia, nơi virut herpes gây viêm não thường gây biến
đổi ở vùng sừng trước.
6.2.4 Chẩn đoán căn nguyên [8, 166, 167]
Dựa vào phân lập virut, phát hiện kháng nguyên, kháng thể đặc hiệu trong máu,
trong dịch não tủy. Chẩn đoán phòng thí nghiệm xác định VNNB theo một trong ba yêu
cầu sau:

- Hiệu giá kháng thể lấy máu lần 2 tăng hơn máu lần 1 gấp 4 lần, hoặc cao hơn, nếu là
kỹ
thuật HI hoặc ELISA-IgG (hiệu giá kháng thể HT2 ≥ 4 lần so với HT1).
- Phân lập và định loại virut hoặc xét nghiệm trình tự hệ gen trong dịch nuôi cấy virut,
máu, dịch não tủy hoặc các dịch khác của cơ thể;
- Phát hiện kháng thể IgM trong máu, dịch não tủy bằng thử nghiệm miễn dịch enzym
(ELISA). Đây là phương pháp chẩn đoán nhanh và rất đặc hiệu, với độ pha loãng của
huyết thanh là 1/100 cho kết quả OD mẫu thử/OD HT (-) ≥
2 là dương tính. Thời gian
thực hiện chỉ sau 4 giờ là đã có kết quả.
6.2.4.1 Phân lập virut trên não chuột
Cho đến nay việc phân lập virut VNNB cũng như các virut Arbo hiệu quả nhất là
tiêm vào não chuột nhắt trắng 1-3 ngày tuổi 0,01-0,02ml/con và thường kết hợp với 1 liều
tiêm dưới da hoặc tiêm phúc mạc 0,03-0,05ml/com. Chuột sơ sinh được coi là vật chủ
nhạy cảm nhất. Chuột đất vàng sơ sinh cũng có thể sử dụng nhưng không cho k
ết quả tốt
hơn. Điểm tiêm là vùng đồi thị của não, giữa tai và mắt. Sau khi tiêm chuột vẫn bú mẹ, vì
vậy chú ý mỗi ổ chuột không quá 6-8 con để chuột mẹ chăm sóc tốt hơn. Chuột bị chết
trước 24 giờ đều loại bỏ do đó trong 24 giờ đầu phải thăm chuột 2 lần để loại bỏ chuột
chết do tiêm hoặc do các nguyên nhân khác.
Quan sát các biểu hiện lâm sàng ở chu
ột ốm, bỏ bú, dạ dày không có sữa, chuột
mất màu hồng, tím tái, chậm chạp, nằm liệt nhưng khó quan sát thấy liệt.
Thu thập chuột ốm, xử lý chuột bằng dung dịch khử trùng và mổ lấy não vô trùng. Sau đó
nghiền đồng nhất 10% trong PBS pH8 có chứa BSA (albumin bò). Ly tâm lạnh 2000v/p
trong 20 phút. Lấy nước nổi bảo quản ở -80
o
C hoặc Nitơ lỏng. Một phần thử nghiệm
ngưng kết hồng cầu ngỗng. Cũng có thể phải tiêm truyền 3 lần, chuột không ốm mới loại
bỏ.

6.2.4.2 Phân lập virut trên tế bào [44, 69]

15
Sau khi tiêm não chuột ổ (+). Não chuột nhiễm được nghiền đồng nhất 10-20%
trong PBS pH8. Ly tâm loại tủa, lọc vô trùng (millipore Millex). Huyền dịch virut sau lọc
được cấy vào tế bào C6/36 (nhạy nhất) hoặc Vero Theo dõi sử hủy hoại của tế bào,
trong 14 ngày nếu có CPE sớm hơn thì gặt và cấy truyền tiếp để nâng hiệu giá.

Hình 5: Sơ đồ phân lập virut viêm não Nhật Bản [150]
6.2.5 Định loại virut VNNB [43]
Bệnh nhân Tử thi
Mẫu bệnh phẩm để
tiêm truyền
- Máu, huyết thanh, plasma
(khởi bệnh 1-4 ngày)
- Dịch não tủy
- Não: Sinh thiết vùng chất xám.
- Lách, phổi, gan và các cơ quan
khác

Xử lý
- Tách chắt huyết thanh, bỏ
máu đông.
- Pha loãng 1/10 hoặc không
pha loãng
- Nghiền đồng nhất 10-20%
trong PBS pH8, có chất bền
vững và kháng sinh. Ly tâm
1000v/p, trong 20 phút.
- Lấy nước nổi pha 10

-1
-10
-2


Tiêm truyền
- Chuột nhắt 1-3 ngày tuổi: tiêm não 0,01-0,02ml
- Chuột hamster sơ sinh: tiêm não 0,01-0,02ml
- Nuôi cấy tế bào C6/36, BHK21, Vero CPE hoặc plaques
- Tiêm vào ngực của muỗi Culex

Quan sát
Chuột ốm hoặc
chết
Tế bào: CPE,
PFU
,
FA
Phôi gà
(không đặc hiệu)
Muỗi, FA, CF

Tiêm truyền tiếp
- Huyền dịch não
10% (±)
- Tiêm truyền
não chuột (+)
- Dich nổi tế bào,
tiếp tục cấy
truyền: CPE.

- Chuẩn độ PFU
bằng phương
pháp phủ thạch
Tiếp tục tiêm
truyền trên chuột,
trên tế bào hoặc
trên muỗi
Xác định động
vật hoặc tế bào
thích h
ợp


Chuột ổ
Tế bào muỗi
C6/36, BHK21,
Vero
Phương pháp khó
thực hiện (cần
p
hải điêu luyện)
(+) (-)
Hủy
(+) (-)
Hủy

16
Sau khi tiêm truyền nhiều lần (theo sơ đồ phân lập) cho đến khi đạt hiệu giá ≥ 10
-5

(LD
50
) và hình ảnh thương tổn tế bào CPE điển hình. Sau đó kiểm tra vô khuẩn và bảo
quản ở dạng pha loãng 20% có chất bền vững và chất bảo quản virut.


Hình 6: Sơ đồ định loại virut [150]
6.2.5.1 Các phương pháp chẩn đoán huyết thanh học
- Ngăn ngưng kết hồng cầu (HI): Đặc hiệu là ngưng kết hồng cầu Ngỗng, kỹ thuật này
đã ứng dụng cách đ
ây 50 năm và ngày nay vẫn được sử dụng ở nhiều phòng thí
Định loại
Nếu nghi ngờ mẫu phân lập có ít virut,
chuẩn bị kháng huyết thanh hoặc kháng
thể đơn dòng, để thử nghiệm tiếp

Nếu việc định loại không nghi ngờ
Pha dung dịch borate pH9 cho phả
n
ứng CF và HI
- Thử nghiệm HA
- Thử nghiệm CF và HI với kháng
huyết thanh chuẩn

Lọc, tinh khiết, soi HVĐT
Định loại bằng kỹ thuật trung hòa
(NT) hoặc CF, HI, ELISA
Tách chiết thành phần HA bằng
sucrose aceton và siêu âm.
Nếu virut có phản ứng chéo phải

chuẩn bị kháng thể đơn dòng để
loại trừ.
Lấy kháng nguyên HA thử nghiệm
với KHT mẫu chuẩn
Thử nghiệm khuếch đại gen bằng
kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc
hiệu.
Nếu nghi ngờ virut Arbo mới cần
mở rộng định loại, phối hợp với
các phòng Thí nghiệm chuẩn thức
quốc tế để thực hiện định loại
bằng kỹ thuật PCR và phân tích
trình tự gen (sequencing).
Nếu không tìm thấy virut nhưng nghi
ngờ thì phải phân lập lại từ đầu


17
nghiệm vì kỹ thuật đơn giản và không cần thiết bị [38]. Do đó, giá thành để xét
nghiệm rẻ hơn so với các kỹ thuật khác.
- Kết hợp bổ thể (CF): Hầu như ít phòng thí nghiệm còn sử dụng vì phức tạp và độ tin
cậy thấp.
- Hấp phụ liên kết enzym (ELISA): gồm có GAC-ELISA để phát hiện kháng thể IgG
và MAC-ELISA để phát hiện IgM. Là các kỹ thuật đang sử dụng rộng rãi ở các phòng
thí nghiệm trên th
ế giới [22, 43].
- Miễn dịch huỳnh quang (IF)[143]: với kháng nguyên chuẩn: Yêu cầu trước tiên kính
hiển vi huỳnh quang, đây là một loại thiết bị đắt tiền và các sinh phẩm chuẩn thức
quốc tế, do đó các tuyến dưới khó có thể áp dụng nếu không có kinh phí và không
được đào tạo.

- Miễn dịch phóng xạ (RIA): để phục vụ nghiên cứu ở các Viện. Ở Bệnh viện lớn kỹ
thu
ật này ít có giá trị trong chẩn đoán nên áp dụng hạn chế
6.2.5.2 Các phương pháp phát hiện virut: Để phục vụ nghiên cứu là chủ yếu
- Nhuộm âm bản soi hiển vi điện tử (cần phải có mẫu virut tinh khiết).
- Miễn dịch HVĐT (miễn dịch gắn vàng): là kỹ thuật rất đặc hiệu và chỉ những nước
phát triển và các phòng thí nghiệm chuẩn thức mới thực hiện vì rất tốn kém. Phòng thí
nghi
ệm Hiển vi Điện tử, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương đã ứng dụng kỹ thuật này
nhưng để nghiên cứu về virut VNNB thì các phương pháp trên đã đủ để xác định,
chưa phải dùng kỹ thuật này trừ khi là một virut mới gây viêm não.
- Miễn dịch điện di đối lưu, khuếch tán.
- Miễn dịch huỳnh quang: dễ dàng phát hiện virut khi có kháng thể đơn dòng.
- Sinh học phân tử: Bằng k
ỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu cho kết quả chính xác, có
thể phát hiện một lượng virut rất nhỏ (100 hạt virut/ml bệnh phẩm). Ngày nay nhiều
phòng thí nghiệm trên thế giới sử dụng kỹ thuật này để phát hiện nhanh virut, chỉ cần
mồi đặc hiệu [37, 93, 107]. Tuy nhiên, các thiết bị cho kỹ thuật này thường tốn kém,
sinh phẩm đắt tiền cho nên không thể phổ biến cho tuyến cơ sở
.
7. Đặc điểm lâm sàng
Các triệu chứng của hội chứng não cấp do virut về lâm sàng không thể nào nhận
biết được.
Thời gian ủ bệnh VNNB từ 4-14 ngày, khởi bệnh thường đột ngột sốt, đau người,
mệt mỏi, đau đầu, đặc biệt viêm não ở người lớn. Ở trẻ em đau dạ dày, ruột và có thể rối

18
loạn tinh thần, ngủ gà ngay ở giai đoạn đầu, lên cơn co giật. Thể nặng dẫn đến hôn mê
nhanh chóng và có thể không hồi phục. Một số trường hợp tiến triển viêm não, màng não
rất nhanh chỉ trong phút chốc. Trong 50.000 ca được báo cáo mỗi năm thì 10.000 ca tử

vong. Số còn sống sót đều để lại di chứng thần kinh và tinh thần cần tiếp tục điều trị và
chăm sóc. Hầu hết di chứng để l
ại ở trẻ <10 tuổi [112, 159].
Kinh nghiệm cho thấy phụ nữ mang thai mắc viêm não rất hạn chế. Tuy nhiên một
nghiên cứu của Uttar Pradesh (Ấn Độ) đã xác định rằng nguy cơ sẩy thai ở 1-6 tháng
mang thai nếu nhiễm virut viêm não thể nặng [46, 91]. Vấn đề này còn được tiếp tục
nghiên cứu mới có kết luận đầy đủ. Một vài thể VNNB ở góc độ dịch tễ học cần phả
i tiếp
tục nghiên cứu. Ví dụ phân vùng địa lý, lưu hành virut giữa các vụ dịch, chu kỳ dịch
bùng phát
Tính nghiêm trọng của bệnh thể hiện ở bệnh cảnh lâm sàng. Thời kỳ ủ bệnh 5-16
ngày. Sau đó, khởi bệnh ồ ạt bằng các triệu chứng sốt cao đột ngột, đau đầu, đau cơ, buồn
nôn, nôn. Tiếp đến là rối loạn ý thức xuất hiện các dấu hiệ
u như lú lẫn, mê sảng, hôn mê.
Rối loạn vận động như trương lực cơ tăng, chân tay co cứng, cứng gáy, cử động bất
thường, có các cơn co giật. Nặng hơn là liệt nửa người hoặc liệt toàn thân. Bệnh để lại di
chứng liệt vận động hoặc rối loạn tinh thần. Bệnh VNNB thể hiện rất đa dạng: từ thể
VNNB điển hình, viêm màng não n
ước trong đến những trường hợp nhẹ chỉ sốt, đau đầu
và phần nhiều là nhiễm virut nhưng không biểu hiện triệu chứng gọi là nhiễm thể ẩn với
tỷ lệ 200/1-300/1, có nghĩa là cứ 200-300 trường hợp nhiễm mới có mội trường hợp điển
hình. Hoặc theo TCYTTG tỷ lệ này giao động 200/1- 1000/1.
Tiêu chuẩn để chẩn đoán bệnh VNNB
Cần phối hợp d
ịch tễ học, lâm sàng và xét nghiệm. Dựa vào các tiêu chuẩn dưới
đây để chẩn đoán bệnh VNNB:
- Dịch tễ học
Vùng có lưu hành các yếu tố dịch tễ học và gây bệnh VNNB như nuôi lợn gần
nhà, muỗi Culex phát triển, mùa bệnh tháng 4-tháng 7 hàng năm. Tuổi cảm nhiễm 1-15
tuổi, đặc biệt ở nhóm 1-4 tuổi.

- Lâm sàng
+ Hội chứng màng não (cơ năng và thực thể) ;
+ Hội chứng viêm não cấp tính: số
t > 38
o
C, co giật liên tiếp hoặc liệt vận động,
ngủ gà hoặc hôn mê.
- Xét nghiệm lâm sàng

19
+ Dịch não tủy: Tế bào 10-100 bạch cầu/ml, chủ yếu là lympho bào; protein 0,5-
1g/l ; glucoza và clo bình thương
+ Công thức máu: bạch cầu tăng cao, chủ yếu là bạch cầu trung tính.

- Xét nghiệm huyết thanh
+ ELISA phát hiện kháng thể IgM (+), kháng nguyên đặc hiệu là Nakayama hoặc
Beijing-1
+ HI và ELISA phát hiện kháng thể IgG. Nếu lấy máu 2 lần cách nhau 1-2 tuần thì
hiệu giá kháng thể máu 2 tăng gấp 4 lần so với máu 1. Nếu lấy máu đơn với HI phải đạt ≥
1/640 và ELISA là ≥ 1/1600.
- Xét nghiệm bệnh nhân
đã tử vong
+ Phân lập và định loại virut VNNB: sinh thiết não vùng đồi thị và chất xám
(phương pháp phân lập chuột ổ, trên tế bào C6/36).
+ Giải phẫu bệnh vi thể: hình ảnh tổn thương thường gặp nhất là viêm quanh
mạch, các đám tế bào hoại tử rải rác chiếm ưu thế trong chất xám.
8. Dịch tễ học bệnh VNNB


20

Hình 7: Sự lan truyền của virut VNNB kể từ lần đầu tiên được ghi nhận 1871 cho đến
năm 1998 đã đến Australia [163]
Virut VNNB lưu hành rộng rãi ở hầu hết các nước trong khu vực châu Á (hình 7),
bao gồm: Nhật Bản, Trung Quốc, Đài Loan, Triều Tiên, Philippine, vùng viễn đông Nga,
tất cả các nước Đông Nam Á và Ấn Độ. Dần dần nó đã lan tràn đến các vùng khác không
thuộc châu Á như vùng Torres của Australia [49, 141]. Hàng năm, trong khu vực này có
khoảng 50.000 trường h
ợp mắc và trong đó có khoảng 10.000 tử vong, số sống sót mang
nhiều di chứng thần kinh nặng nề [164].
Bảng 1 : Phân bố bệnh VNNB ở một số nước theo vùng và mùa [171]
Nước Vùng lưu hành Mùa truyền bệnh Ghi chú

Bangladest
Ít số liệu, dự đoán lưu
hành rộng
Tháng 7- tháng 12
(giống miền Bắc Ấn
Độ)
Dịch rải rác một số huyện,
không thông báo đầy đủ
Bhutan Không có số liệu Không có số liệu Không có số liệu
Brunei Dịch rải rác giống
Malaysia
Lưu hành quanh năm

Cambodia
Lưu hành dịch cao và
rộng khắp trong cả nước
Tháng 5 - tháng 10 Dự phòng cao ở những
vùng nông thôn gần Phnom

Penh
Hong Kong Hiếm xảy ra ở lãnh thổ
mới
Tháng 4 - tháng 10 Tiêm văcxin không thường
xuyên
Ấn Độ Tất cả các bang trong cả
nước trừ 16 bang không
có dịch
Nam Ấn Độ: Tháng
5-10 ; ở Goa: tháng
10- 1; ở Tamil Nadu:
tháng 8-12 ; ở
Kanataka (đỉnh dịch
tháng 2 tháng 4-6 ở
Mandya) ; Andrha
Pradesh : tháng 9-12 ;
Bắc Ấn Độ : tháng 7-
12
Dịch bùng phát ở Bắc
Bengal, Bihar Goa, Urbun
(theo Lucknow)
Indonesia Kalimantan, Bali, Nusa,
Tenggara, Sulawesi,
Mollucas, Tây Irian
Jaya và Lombok
Nguy cơ quanh năm,
tùy thuộc từng đảo.
Đỉnh dịch kết hợp với
mùa lúa canh tác,
chăn nuôi lợn. Dịch

tháng 11-tháng 3 ;
Bệnh dịch ở người xảy ra ở
Bali và Java ; chỉ 4 ca
khách du lịch đến Bali

21
tháng 6- tháng 7 ở
một số nơi
Nhật Bản Hiếm, một vài ca rải rác
ở tất cả các đảo trừ
Hokkaido
Tháng 6 - tháng 9,
Đảo Okinawa tháng 4
– tháng 10
Tiêm văcxin không thường
xuyên, khuyến cáo du
khách đến Tokyo và các
thành phố có dịch phải tiêm
văcxin
Hàn Quốc Bắc Triều Tiên không
có số liệu; Nam Triều
Tiên dịch xảy ra rải rác
Tháng 7 - tháng 10 ;
hầu hết ca dịch vào
tháng 8 và tháng 9
Vụ dịch lớn xảy ra vào năm
1982-1983
Lào Lưu hành trong cả nước Có thể tháng 5 -
tháng 10
Không thống kê, rất ít tiêm

văcxin
Malaysia Dịch rải rác ở tất cả các
bang của Peminsula,
Sarawak và Subah
Phân bố quanh năm,
không có mùa rõ rệt
Dịch ở Penang, Perak,
Salagor, Johore và Sarawak
Myanma Lưu hành dịch cao
trong cả nước
tháng 5 - tháng 10 Dịch xảy ra ở Shan và
thung lũng ChangMai
Nepal Dịch ở phía Nam
(Terai), thung lũng
Kathmandu dịch vào
những năm gần đây
tháng 7 - tháng 12 ;
hầu hết các ca bệnh
bùng phát ở tháng 8
và tháng 11
Không tiêm phòng thường
xuyên, khuyến cáo khách
du lịch nên tiêm phòng
trước khi đến vùng lưu
hành dịch
Trung Quốc Tất cả các tỉnh ngoại trừ
Xizang, Xinziang,
Quinghai. Dịch thường
xuyên ở phía Nam
Trung Quốc

Bắc Trung Quốc:
tháng 5 – tháng 9;
Nam Trung Quốc:
tháng 4 – tháng 10

Đang tiêm phòng tích cực,
khuyến cáo du khách tiêm
phòng trước khi vào Trung
Quốc
Pakistan Châu thổ miền trung Tháng 6 - tháng 1 Thông báo ca bệnh ở
Karachi, vùng lưu hành
VNNB và West Nile virus
Philippine Hầu như xảy ra ở tất cả
các đảo
Tháng 4 – tháng 11 ;
đỉnh vào tháng 9 và
tháng 1
Dịch được thông báo ở
Nueva Ecija, Luzon và
Manila
LB Nga Vùng Trung cận đông
maritime, Phía Nam của
Khabarousk
Tháng 7 – tháng 9 Ca bệnh ghi nhận đầu tiên
cách đây 30 năm
Singapore Hiếm gặp Quanh năm, đỉnh
bệnh vào tháng 4
Không tiêm phòng thường
xuyên

22
Srilanka Dịch xảy ra ở tất cả các
vùng núi ở các tỉnh
miền Bắc và miền
Trung
Tháng 10 – tháng 1,
đỉnh tháng 5 – tháng
6 (mùa truyền bệnh
trong động vật chứa
virut)
Những năm gần đây dịch
xảy ra ở miền Trung và các
tỉnh Tây Bắc
Đài Loan Có dịch rải rác Tháng 4 – tháng 10,
đỉnh tháng 6
Ca bệnh thông báo ở vùng
Đài Bắc
Thái Lan Dịch thường xuyên ở
phí Bắc, phí Nam rải
rác
Tháng 5 – tháng 10 Dịch hàng năm ở
ChangMai, ca bệnh rải rác
ở Bang Kok, Saburbs
Việt Nam Lưu hành dịch ở tất cả
các tỉnh thành
Tháng 5 – tháng 10 Tỷ lệ cao ở các vùng gần
Hà Nội
Tây Thái
Bình
Dương,

Australia và
Papua New
Guinea
Dịch ở miền Bắc đảo
Mariana và Torres
Strait, Australia và một
số ca rải rác ở bờ biển
phía Tây, của Cap York
Penninsula, Australia và
phía Tây của Papua
New Guinea
Tháng 9 – tháng 1
(Thái Bình Dương)
và tháng 3 – tháng 4
(Torres Strait)
Chu kỳ truyền bệnh trong
động vật không thể duy trì
ở các đảo, dịch có thể theo
mùa và phụ thuộc vào virut
phát triển

Bệnh VNNB thường do muỗi Culex đốt truyền vào ban đêm. Tỷ lệ nhiễm ở muỗi
vào khoảng 1-3% [70]. Loài muỗi này sống chủ yếu ở đồng ruộng lúa nước nhưng có thể
di chuyển vào vùng dân cư sinh sống gần đó. Các ca bệnh thường là ở vùng ngoại ô thành
phố [70, 175, 186]. Các động vật hoang dã và động vật nuôi như Lợn, Chim là vật chủ
chính cho virut VNNB phát triển, người là vật chủ cuố
i cùng và tồn tại trong thời gian
ngắn với hiệu giá virut ở máu ngoại vi rất thấp [186]. Hầu hết số nhiễm không có biểu
hiện lâm sàng, tỷ lệ nhiễm trên thể ẩn vào khoảng 1/30-1/50 [186]. Theo Bernard Field là
1/200-1/300 (tùy thuộc từng vùng lưu hành). Tuổi mắc tập trung ở trẻ <15 tuổi, ở người

lớn tại các vùng lưu hành dịch đều có huyết thanh dương tính [70, 175]. Tỷ lệ tử vong
10-25% tùy thuộc vào sự
điều trị và chăm sóc. Khoảng 30-55% số sống sót để lại di
chứng thần kinh. Virut có thể gây nhiễm bào thai gây ra sẩy thai trong thời kỳ mang thai
3 tháng đầu [175, 186].
Bệnh VNNB thường xảy ra quanh năm, nhưng dịch thường bắt đầu trong mùa
mưa khi quần thể muỗi phát triển tối đa và nhiệt độ ở các khu vực này thích nghi cho
nguồn bệnh [186]. Thường là vào khoảng tháng 5 đến tháng 9 ở các nước bán nhiệt đớ
i
và nhiệt đới phụ thuộc vào mật độ muỗi và động vật khuếch đại, lượng mưa, chim di cư

23
và canh tác nông nghiệp là các yếu tố quan trọng. Tỷ lệ mắc giảm dần ở Trung Quốc,
Hàn Quốc và Nhật Bản nhưng lại tăng lên ở Bangladest, Myanmar, Ấn Độ, Nepal, Bắc
Thái Lan và Việt Nam [186]. Phòng bệnh bằng giám sát vectơ, động vật chứa virut, nằm
màn chống muỗi đốt và tiêm văcxin cho người và động vật [175].


Hình 8: Số mắc VNNB đã thông báo ở một số nước trong vùng lưu hành dịch
hoặc nghi ngờ 1986-1990 [183]
Nguy cơ cho du khách đến vùng có dịch lưu hành với tỷ lệ 1/106 trong vòng 4
tuần, ngoài ra còn phụ thuộc vào mùa, vùng nguy cơ, thời gian lưu trú. Nếu du khách vào
vùng trong mùa dịch thì tỷ lệ này là 1/5000 [161, 168, 174, 175]. Năm 1969, có ít nhất
10000 lính Mỹ đã bị nhiễm ở Việt Nam và 57 ca VNNB và 24 ca viêm não là các khách
du lịch ở phương Tây đến Việt Nam từ 1978-1992 [70, 175].
Theo Igarashi và cộ
ng sự, chu kỳ truyền bệnh của virut VNNB trong tự nhiên
cũng được biết đến rất nhiều. Vectơ chính là muỗi Culex tritaeniorhynchus hoặc một số
loài muỗi có liên quan. Lợn và chim là động vật khuếch đại chủ yếu [9, 11, 13, 124]. Như
chúng ta biết virut VNNB tồn tại ở nhiều nước Đông Á, Đông Nam Á và Nam Á. Hầu

hết khí hậu những khu vực này là ôn hòa, mưa nhiều, gió mùa phù hợp với các cánh đồng
ruộng lúa nướ
c, đồng thời chăn nuôi lợn cũng phát triển ở các nước này. Trên cơ sở về
môi trường của các nước nông nghiệp này tạo điều kiện cho chu kỳ truyền bệnh trong
thiên nhiên được dễ dàng. Vectơ phát triển tỷ lệ thuận với các động vật khuếch đại và chu

24
kỳ truyền virut sang người cũng dễ dàng nên số mắc bệnh ngày càng tăng nếu không có
văcxin dự phòng [14, 65].
- Miền Bắc Thái Lan có tỷ lệ mắc 25/10
5
dân số.
- Việt Nam: lưu hành rộng rãi từ Bắc đến Nam, nhưng đặc biệt nghiêm trọng là ở vùng
châu thổ Sông Hồng và Trung du, tỷ lệ mắc trung bình 5-6/10
5
dân.
- Nhật Bản và Hàn Quốc đã dự phòng bằng văcxin từ lâu nên số mắc bệnh rất thấp. Ở
Nhật Bản chỉ có 10-20 trường hợp/năm.
Bệnh VNNB trước tiên xuất hiện tại châu Á, chủ yếu là ở trẻ em dưới 15 tuổi.
Trong số nhiễm có 70% phát bệnh thể lâm sàng. Số mắc bệnh hoặc chết hoặc để lại di
chứng thần kinh suốt đời. Từ
ca bệnh được ghi nhận cuối thế kỷ 19, bệnh VNNB lan
truyền do du khách từ vùng viễn nam như châu Úc và viễn Tây như Pakistan. Đến nay
bệnh VNNB chưa lan truyền đến châu Phi, châu Âu và châu Mỹ. Văcxin VNNB được sử
dụng từ năm 1941 nhưng rất hạn chế ở nhiều nước lưu hành bệnh. 60 năm trước có
khoảng 10 triệu trẻ em mắc VNNB, tử vong 3 triệu và di chứng thần kinh lâu dài > 4
triệu. Việc giám sát bệnh VNNB còn nghèo nàn và h
ạn chế. Không được tiêm văcxin đầy
đủ, thiếu sự hướng dẫn và hỗ trợ thường xuyên để tiêm chủng và ý thức về phòng chống
bệnh VNNB còn chưa quán triệt đầy đủ.

Tổ chức PATH đã đưa ra một dự án nhằm mục đích:
- Cải thiện việc giám sát bệnh VNNB
- Phát triển nhanh văcxin VNNB thích hợp
- Đưa văcxin VNNB đến nơi cần nhất
- Đẩy mạnh đầ
u tư tiêm chủng VNNB
Đây cũng là một chủ trương đúng đắn nhằm ngăn chặn sự lan truyền bệnh VNNB.
9. Sinh thái bệnh VNNB
9.1 Diễn biến dịch VNNB trong mối quan hệ ổ chứa, vectơ và người
Virut VNNB được truyền qua người do muỗi đốt, các động vật mang virut và
truyền sang cho người. Như vậy, người được cho là vật chủ cuối cùng của virut VNNB
[18, 188].
Ở người, virut VNNB tồn tại trong mộ
t thời gian rất ngắn ở máu ngoại biên và
hiệu giá rất thấp, do đó virut không thể truyền trực tiếp từ người sang người. Mặt khác,
muỗi thích hút máu động vật hơn máu người [21].