KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT TRÂM HƯƠNG THEO HƯỚNG BỀN VỮNG Ở VIỆT NAM

LỜI CẢM ƠN
Để hồn thành bài khóa luận tốt nghiệp này, em xin tỏ lòng biết ơn sâu
sắc tới tập thể thầy cô hƣớng dẫn PGS. TS. Hà Văn Huân và ThS.Nguyễn Thị
Thơ, đã tận tình hƣớng dẫn, chỉ bảo trong suốt q trình thực hiện khóa luận.
Khóa luận tốt nghiệp này đƣợc sự hỗ trợ kinh phí từ đề tài Nghị Định
thƣ với Đức “Nghiên cứu ứng dụng công nghệ sản xuất trầm hương theo
hướng bền vững ở Việt Nam”. Em xin chân thành cảm ơn.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến quý thầy cô Viện Công nghệ
sinh học Lâm nghiệp - Trƣờng Đại học Lâm Nghiệp Việt Nam đã giúp đỡ, chỉ
bảo hết sức tận tình, khơng chỉ q trình làm khóa luận mà cả q trình học
tập, bồi dƣỡng tại trƣờng. Đặc biệt là sự giúp đỡ của tồn thể thầy cơ bộ mơn
Tài ngun thực vật rừng của Viện Công nghệ sinh học Lâm Nghiệp.
Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè và ngƣời thân đã
động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện thuân lợi trong quá trình học tập, sinh
hoạt, làm nghiên cứu khoa học và hoàn thành bài khóa luận tốt nghiệp này.
Vì điều kiện thời gian, khả năng của bản thân cịn có những hạn chế
nên bài khóa luận tốt nghiệp này cịn có những thiếu sót, em rất mong nhận
đƣợc ý kiến đóng góp quý báu của thầy cô giáo, các nhà khoa học cũng nhƣ
các bạn sinh viên để bài khóa luận của em đƣợc hoàn thiện hơn.
Em xin trân trọng cảm ơn!
Hà Nội, ngày 11 tháng 5 năm 2018
Sinh viên
Phạm Minh Thùy

i


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN .................................................................................................... i
MỤC LỤC ......................................................................................................... ii
DANH MỤC CÁC BẢNG............................................................................... iv

DANH MỤC HÌNH ẢNH ................................................................................ v
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ........................................................................... vi
ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................... 1
PHẦN 1 . TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU ........................................ 2
1.1 Khái quát về đối tƣợng nghiên cứu ............................................................. 2
1.1.1 Chi Trầm hƣơng ....................................................................................... 2
1.1.2 Giới thiệu tổng quan Aquilaria sinensis ................................................... 3
1.1.3 Sơ lƣợc hình thái: ..................................................................................... 3
1.1.4 Phân bố và giá trị kinh tế.......................................................................... 4
1.2 Tổng quan về mã vạch ADN (ADN mã vạch) ............................................ 6
1.2.1 Các đặc điểm cơ bản của trình tự mã vạch .............................................. 8
1.2.2 Một số locus đƣợc sử dụng trong phƣơng pháp ADN mã vạch ở thực vật ... 9
1.3 Tình hình nghiên cứu ADN mã vạch ở thực vật ....................................... 15
1.3.1 Những thành tựu trên thế giới ................................................................ 15
1.3.2 Những thành tựu nghiên cứu tại Việt Nam ............................................ 16
1.3.3 Nghiên cứu Mã vạch ADN của cây Trầm hƣơng Aquilaria .................. 19
PHẦN 2 MỤC TIÊU, NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU................................................................................................................. 21
2.1 Mục tiêu nghiên cứu.................................................................................. 21
2.2 Nội dung nghiên cứu ................................................................................. 21
2.3. Địa điểm thực hiện ................................................................................... 21
2.4 Vật liệu, hóa chất và các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu: .................... 21
2.4.1 Vật liệu nghiên cứu: ............................................................................... 21
2.4.2 Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu bao gồm: ................................. 22
ii


2.4.3 Thiết bị sử dụng trong nghiên cứu ......................................................... 22
2.5 Phƣơng pháp nghiên cứu........................................................................... 22
2.5.1 Phƣơng pháp tách chiết ADN tổng số.................................................... 22

2.5.2 Phƣơng pháp điện di kiểm tra sản phẩm ADN sau tách chiết ............... 23
2.5.3 Phƣơng pháp nhân gen đích bằng kĩ thuật PCR .................................... 24
2.5.4 Phƣơng pháp tinh sạch sản phẩm PCR và giải trình tự ......................... 26
2.5.5 Điện di kết quả tinh sạch ........................................................................ 27
2.5.6 Giải trình tự gen ..................................................................................... 27
2.5.7 Phƣơng pháp phân tích số liệu ............................................................... 27
PHẦN 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................... 28
3.1 Kết quả tách chiết ADN tổng số ............................................................... 28
3.2 Kết quả nhân bản gen với các cặp mồi nghiên cứu .................................. 28
3.2.1 Kết quả nhân bản gen matK ................................................................... 28
3.2.2 Kết quả nhân bản gen trnH- psbA.......................................................... 30
3.2.3 Kết quả nhân bản gen rbcL .................................................................... 30
3.3 Phân tích kết quả ....................................................................................... 31
3.3.1 Kết quả so sánh đoạn gen matK ............................................................. 31
3.3.2 Kết quả so sánh đoạn gen trnH-psbA .................................................... 33
3.3.3 Kết quả so sánh với đoạn gen rbcL ........................................................ 34
3.4 Xây dựng cây pháp sinh chủng loại .......................................................... 37
PHẦN 4 KẾT LUẬN, TỒN TẠI VÀ KIẾN NGHỊ........................................ 38
1. Kết luận ..................................................................................................... 38
2. Tồn tại ....................................................................................................... 38
3. Kiến nghị ................................................................................................... 38
TÀI LIỆU THAM KHẢO

iii


DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1: Thông tin của một số mồi ADN Mã vạch thiết kế cho hệ gen .......... 11
lục lạp .............................................................................................................. 11

ảng 2.1: Trình tự và th ng tin về cặp mồi ................................................... 24
ảng 2.2: Thành phần và nồng độ các chất sử dụng trong một phản ứng PCR
......................................................................................................................... 25
ảng 2.3: Chu kì nhiệt cho phản ứng PCR mồi matK .................................... 25
ảng 2.4: Chu kì nhiệt cho phản ứng PCR mồi psbA .................................... 25
ảng 2.5: Chu kì nhiệt cho phản ứng PCR mồi rbcL ..................................... 26

iv


DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Hình thái lá và hoa của lồi Trầm huơng ........................................... 2
Hình 1.a Hình thái lá và cành Aquilaria sinensis .............................................. 3
Hình 1.b Hình thái quả Aquilaria sinensis ........................................................ 3
Hình 3.1: Kết quả điện di ADN tổng số của hai mẫu Dó bầu trung quốc; giếng
1: HBQN01; giếng 2: TDC01 ......................................................................... 28
Hình 3.2 Ảnh diện di sản phẩm PCR nhân đoạn gen matK từ mẫu ADN Dó
bầu trung quốc. M-thang ADN chuẩn 100bp, Giếng 1: HBQN01; Giếng 2:
TDC01. ............................................................................................................ 29
Hình 3.3. Ảnh điện di sản phẩm PCR nhân đoạn gen trnH-psbA từ các mẫu
ADN Dó bầu trung quốc. M-thang ADN chuẩn 100bp, Giếng 1: HBQN01;
Giếng 2: TDC01. ............................................................................................. 30
Hình 3.4 Ảnh diện di sản phẩm PCR nhân đoạn gen rbcL từ các mẫu ADN
Dó bầu trung quốc. M- thang ADN chuẩn 100bp; Giếng 1: mẫu HBQN01;
Giếng 2 mẫu TDC01.

.................................................................................. 31

Hình 3.5 Cây phân loại dựa trên đoạn gen rbcL xây dựng bằng trang web:

https:/www.ebi.ac.uk/Tool/msa/muscle/ ......................................................... 37

v


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
Nghĩa đầy đủ

Chữ viết tắt
ADN

Axit deoxyribonucleic

ARN

Axit ribonucleic

Bp

Base pair

CBOL

Consortium for the Mã vạch of life

CTAB

Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide

Dntp

Deoxyribonucleotide triphosphate

EDTA

Ethylenediaminetetraacetic acid

ITS – rADN

Internal Transcribed Spacer – rADN

IUCN

International Union for Conservation of Nature ADN
Natural Resources
(Liên minh Bảo tồn Thiên nhiên Quốc tế)

Kb

Kilobase

PCR

Polymerase Chain Reaction

rADN

Ribosome axit deoxyribonucleic

Rnase

Ribonuclease

TAE

Tris- Acetic acide - EDTA

vi


ĐẶT VẤN ĐỀ
Trầm hƣơng (Aquilaria sinensis (Lour) Gilg.) thuộc chi Dó trầm
Aquilaria , họ Trầm Thymelaeaceae , cây gỗ. Là loài đặc hữu Trung Quốc,
phân bố cả ở Việt Nam. Có khả năng tạo trầm từ tác động đứt gãy cơ học và
xâm nhiễm của loài nấm Cryptosphaerica mangifera, nấm Melanotus
flavolives. Tinh dầu Trầm hƣơng và dầu Trầm mang giá trị kinh tế cao, đƣợc
sử dụng trong nhiều trong ngành công nghiệp nƣớc hoa, đƣợc liệu, sản xuất
hƣơng, làm chất thơm, giấy, đồ dùng trong nghi lễ, thuộc hàng sản phẩm giá
trị cao….
Do giá trị kinh tế cao cùng việc sử dụng và khai thác bất hợp pháp kiến
cho số lƣợng giảm sút rõ rệt, loài đã bị khai thác quá mức trong tự
nhiên, đƣợc liệt kê là dễ bị tổn thƣơng bởi IUCN (Liên minh Bảo tồn Thiên
nhiên Quốc tế). Cùng với đó việc làm giả phân phối với giá trị cao ngày càng
phổ biến. Vì vậy, địi hỏi cần có cơng cụ xác định nguồn gốc chính xác của
các lồi Trầm nói riêng cũng nhƣ các lồi dƣợc liệu nói chung.
Trong cơng tác kiểm nghiệm dƣợc liệu hiện nay, phƣơng pháp chủ yếu
đƣợc sử dụng dựa trên hình thái học (quan sát bằng mắt hoặc qua tiêu bản
hiển vi). Tuy nhiên, phƣơng pháp này gặp trở ngại sau khi các nguyên liệu
thực vật đã qua xử lý hoặc hình thái gần giống nhau, sự nhầm lẫn giữa các
lồi gần giống hoặc hình thái gần tƣơng đƣơng cũng gây cản trở q trình

phân tích gây khó khăn trong việc phân loại và nghiên cứu nhân giống.
Hiện nay, sử dụng phƣơng pháp mã vạch ADN là một trong những công cụ
hữu hiệu phục vụ định danh lồi chính xác, nhanh chóng, tự động hóa bằng
cách sử dụng một vùng ADN chuẩn hay cịn gọi là chỉ thị ADN (mã vạch
ADN).
Chính vì vậy, tơi thực hiện đề tài nghiên cứu “Xác định mã vạch ADN
cho lồi Dó bầu trung quốc (Aquilaria sinensis (Lour) Gilg.) tại Việt
Nam”.
1


PHẦN 1 . TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
1.1 Khái quát về đối tượng nghiên cứu
1.1.1 Chi Trầm hương
Chi Trần hƣơng gọi chung cho một chi thuộc họ Trầm gồm 15 loài
sống ở Châu Á. Trên thế giới, chi trầm phân bố chủ yếu ở khu vực nhiệt đới
từ Ấn Độ đến Đ ng Nam Á và miền Nam Trung Quốc. Ở nƣớc ta hiện đã
phát hiện ra 6 loài chi trầm phân bố rải rác trong rừng rậm nhiệt đới thƣờng
xanh, ẩm nguyên sinh: A. crassna, A. baillonii, A. rugosa, A. malaccensis, A.
sinensis, A. banaensis. Trong số các loài có khả năng tạo trầm thì Aquilaria
sinensis có khả năng tạo trầm và có giá trị kinh tế cao. Tuy nhiên loài đã bị
khai thác quá mức trong tự nhiên, đƣợc liệt kê là dễ bị tổn thƣơng bởi IUCN.
Phân loại khoa học
Giới (Regnum):

Plantae

Ngành (Division):

Magnoliophyta

Lớp (Classis):

Magnoliopsita

Bộ (Ordo):

Malvales

Họ (Familia):

Thymelaeaceae

Chi (Genus):

Aquilaria

Hình 1.1 Hình thái lá và hoa của lồi Trầm huơng
2


1.1.2 Giới thiệu tổng quan Aquilaria sinensis
Aquilaria sinensis là một loài cây bản địa của họ Thymelaeaceae, cây
thƣờng xanh cao từ 6 đến 20m. Vỏ cây màu xám nhạt hoặc xám đậm, lá sắp
xếp luân phiên, vân bên lá mỏng và dày đặc, gần nhƣ song song với nhau.
Hoa thơm và có màu vàng. Quả viên nang gỗ màu xanh lá cây (hình 1.b)

Hình 1.a Hình thái lá và cành

Hình 1.b Hình thái quả Aquilaria

Aquilaria sinensis

sinensis

Theo tài liệu y học Trung Quốc, nhựa có thể đƣợc chiết xuất lớn số
lƣợng do nhiễm nấm tự nhiên hoặc do tổn thƣơng bên ngoài lên đến 5 cm
vào vỏ cây). Thu hoạch bền vững của nhựa của một cây có thể đƣợc gây ra
bằng cách mở một vết thƣơng 3-4 cm vào vỏ cây, và với nhựa thu thập một
vài năm sau đó sau khi tích lũy. Hoặc một lƣợng nhỏ nhựa có thể đƣợc chiết
xuất từ khối gỗ bởi sƣởi ấm hoặc đốt cháy, để nhựa hóa lỏng và thấm từ các
khối gỗ[28].
1.1.3 Sơ lược hình thái:
Cây gỗ thƣờng xanh, cao 6 – 20 m, đƣờng kính thân đạt 60 – 80 cm,
thân thƣờng thẳng, đ i khi có rãnh dạng lịng máng; bạch gốc cao tới 2 m; vỏ
ngoài nhẵn, màu nâu xám, thịt vỏ màu trắng có nhiều chất xơ celluloz , nứt
dọc lăn tăn, dễ bóc và tƣớc ngƣợc từ gốc lên; cành mảnh, cong queo, màu nâu
nhạt, có lông hoặc nhẵn, tán thƣa. Lá đơn, mọc cách (so le); cuống lá dài 4 – 6
3


mm; phiến lá hình trứng, bầu dục thu n đến mác thu n, kích thƣớc 8 – 15 x
2,5 – 9 cm, mỏng nhƣ giấy hoặc dai gần nhƣ da, mặt trên màu lục bóng, mặt
dƣới nhạt hơn và có lơng mịn; gốc lá thon nhọn dần hay tù; chóp lá nhọn,
thn nhọn, tận cùng có mũi; gân bên 15 – 18 đ i, thay đổi thất thƣờng, khá
rõ ở mặt dƣới. Cụm hoa hình tán hoặc chùm tán, mọc ở nách lá hoặc ở đầu
cành, cuống cụm hoa mảnh, dài 2 – 3 cm. Hoa nhỏ, mẫu 5; đài hợp ở phần
dƣới, hình chng, màu vàng lục, trắng nhạt hoặc vàng xám, phía ngồi có
l ng thƣa; mặt trong gần nhƣ nhẵn, có 10 đƣờng gân rõ; tồn tại ở quả; 5 thùy
dài hình trứng thn, dài 12 – 15 mm. Phần phụ dạng cánh hoa, đính gần

họng đài; nhị 10; bầu hình trứng, 2 ơ, có lơng rậm, gốc bầu có tuyến mật. Quả
nang gần hình trứng ngƣợc, hình quả lê, dài 4 cm, đƣờng kính 2,5 – 3 cm, có
lơng mềm, ngắn, có mang dài tồn tại, khi khơ nứt làm 2 mảnh, thƣờng mỗi
quả chỉ có một hạt[3].
1.1.4 Phân bố và giá trị kinh tế
Aquilaria sinensis (Lour.) Gilg, 1894 (ISC, 2: 948; CCI: 233)_
Ophispermun sinense Lour. 1790.- Bạch mộc hƣơng, Thổ trầm hƣơng, Nữ nhi
hƣơng, Trầm giả
Phân bố: Việt Nam, gặp ở Trung Quốc (Quảng Tây, Quảng Đ ng, Phúc
Kiến , Đài Loan[3].
Aquilaria sinensis là nguồn cung cấp trầm hƣơng trầm, rất thơm và có
giá trị cao nhƣ một loại hƣơng, nƣớc hoa và dƣợc liệu. Ngƣời ta sử dụng phần
gỗ đã hoá trầm ở những cây có lồi nấm Cryptosphaerica mangifera gây
nhiễm, ngồi ra cịn phát hiện nấm Melanotus flavolives chứa trong khối trầm
từ loài A. sinensis. Trầm hƣơng có hình dáng kích thƣớc khơng nhất định

nhƣng đều có mùi thơm, nhất là khi đốt. Khi dùng làm thuốc ngƣời ta chẻ
thành mảnh nhỏ, phơi trong râm mát cho kh , rồi tán bột mịn.
Bộ phận dùng: Gỗ thân

4


Giá trị dƣợc liệu: chất làm se, chất kích thích, thuốc bổ bổ giúp giảm co
thắt, đặc biệt là các hệ thống tiêu hóa và hơ hấp, và làm hạ sốt. Ở phƣơng
Tây, Trung Quốc và Ấn Độ thuốc hƣơng đƣợc sử dụng chống lại bệnh ung
thƣ, đặc biệt là của tuyến giáp. Ở Trung Quốc nó đƣợc áp dụng nhƣ một thuốc
an thần, Decoctions của gỗ đƣợc cho là có đặc tính chống vi khuẩn, ví dụ nhƣ
chống lại Mycobacterium tuberculosis và Shigella flexneri
Thành phần hố học: Có tinh dầu mà thành phần chủ yếu là

benzylaceton 26% metoxybenzalaceton 53% và terpen alcol 11%, cịn có acid
cinamic và các dẫn xuất agarospirol, baimuxianic acid, baimuxianal.
Tính vị, tác dụng: Gỗ Trầm có vị cay, hơi ngọt, tính ấm, có tác dụng giáng
khí, bổ nguyên dƣơng, hạ đờm. Ở Thái Lan, gỗ Trầm đƣợc xem nhƣ có tác
dụng trợ tim, bổ huyết, lợi tiêu hố, trừ ỉa chảy, chống nơn và hạ sốt.
Sử dụng với mục đích khác:
Hƣơng thơm đƣợc tạo ra từ gỗ hóa trầm đã đƣợc đánh giá cao trong
hàng ngàn năm, và dƣợc sử dụng nhƣ hƣơng cho các mục đích nghi lễ trong
Phật giáo, Nho giáo và Ấn Độ giáo đang lan rộng khắp miền Đ ng và Nam Á.
Ở Thái Lan, nó đƣợc đƣa vào các lị thiêu, trong khi ở Nhật Bản, hƣơng đƣợc
sử dụng trong các nghi lễ trà.
Gỗ chỉ có một phần bão hịa với nhựa nhƣng vẫn thơm, và đ i khi cũng
là gỗ còn lại sau khi chƣng cất, đƣợc làm thành các que gọi là 'joss-sticks'
hoặc 'agarbattis' đƣợc đốt nhƣ hƣơng.
Hƣơng cũng đƣợc sử dụng nhƣ thuốc chống côn trùng.
Tinh dầu Trầm là một loại dầu thiết yếu thu đƣợc bằng cách chƣng cất gỗ
trầm. Đƣợc sử dụng trong nƣớc hoa sang trọng.
Dầu trầm hƣơng có màu hổ phách từ vàng đến tối màu, chất lỏng nhớt
với mùi balsamic và gỗ đặc trƣng. Hƣơng thơm của nó có một số điểm tƣơng
đồng với vetiverol hoặc styrax và có vị ngọt tƣơng tự nhƣ dầu gỗ đàn hƣơng.
Mùi đậm vƣơng lâu.
5


Vỏ bên trong bạc có thể đƣợc lấy ra khỏi thân cây trong một tờ giấy
lớn. Đƣợc đánh giá cao về sức mạnh và độ bền, sử dụng làm thành vải và dây
thừng. Vỏ cũng đƣợc viết thành tài liệu viết trƣớc đây, chỉ đƣợc sử dụng cho
các biên niên của các sự kiện quan trọng và sách tôn giáo.
Gỗ của cây kh ng đƣợc khai thác, đƣợc gọi là 'karas', mềm và rất nhẹ
với mật độ khoảng 400 kg / m3 khơng khí khơ.Màu trắng kem đến màu nâu

vàng nhạt hoặc xám nâu, gỗ và gỗ chƣa phân biệt rõ ràng. Các kết cấu khá thô
và gỗ khuếch tán xốp. Phù hợp cho làm hộp, ánh sáng trong nhà xây dựng và
veneer.
Gỗ thơm khác với gỗ th ng thƣờng chủ yếu do lắng đọng nhựa thơm.
Nhựa đƣợc c đặc trong các sợi phloem đƣợc bao. Hàm lƣợng nhựa trong gỗ
thơm là tƣơng đối cứng, giòn và nặng.
1.2 Tổng quan về mã vạch ADN (ADN mã vạch)
Phƣơng pháp phân loại hình thái đã có lịch sử phát triển từ lâu đời và
đã xây dựng đƣợc một hệ thống phân loại sinh vật nói chung và thực vật nói
riêng tƣơng đối toàn diện. Phƣơng pháp phân loại này chủ yếu dựa vào sự
khác biệt về hình thái giữa các cơ quan trên cơ thể thực vật, đặc biệt là cơ
quan sinh sản hoa . Tuy nhiên phƣơng pháp này cũng gặp khơng ít những
khó khăn khi cần xác định những mẫu vật đang trong giai đoạn phát triển
chƣa ra hoa , những mẫu vật có đặc điểm hình thái giống nhau, hoặc khó
nhận biết do có nhiều điểm tƣơng đồng ở bậc phân loại thấp nhƣ loài và dƣới
loài. Ngoài ra, để giám định một lồi thơng qua sản phẩm đã qua sơ chế hay
một hoặc một vài bộ phận rời rạc là rất khó khăn. ên cạnh đó, phƣơng pháp
phân loại hình thái chỉ thực hiện đƣợc bởi các chuyên gia hình thái học, việc
phân loại đ i khi tốn nhiều thời gian và công sức.
Thuật ngữ “ADN mã vạch” lần đầu tiên đƣợc sử dụng vào năm 1993
(Arnon, 1993) là một khái niệm sử dụng trình tự ADN nhƣ một ký tự nhận
dạng để xác định nhanh chóng và chính xác lồi. Về cơ bản, kỹ thuật này dựa
6


vào việc sử dụng một khu vực ADN (400-800 bp nhƣ là một tiêu chuẩn để
nhận dạng các loài một cách nhanh chóng và chính xác. Kỹ thuật ADN mã
vạch giúp các nhà phân loại học trong công tác phân loại và xác định lồi,
Nâng cao năng lực kiểm sốt, hiểu biết và tận dụng sự đa dạng sinh học.
Ngoài ra, kỹ thuật này có triển vọng nghiên cứu và ứng dụng trong khoa học

cuộc sống, trong khoa học pháp y, y tế, nghiên cứu y dƣợc, sản xuất và kiểm
soát chất lƣợng thực phẩm. Phƣơng pháp này v cùng có ý nghĩa trong các
trƣờng hợp các mẫu vật sinh học cần giám định loài đã đƣợc qua xử lý, chế
biến nhƣ các dạng chế phẩm thuốc hay thực phẩm đã qua chế biến v.v.
Nghiên cứu của Hebert và cộng sự (2002) chỉ ra rằng các cá thể từ bộ
sƣu tập của 200 lồi có quan hệ gần gũi với nhau thuộc bộ cánh vảy có thể
xác định với độ chính xác 100% bằng cách sử dụng gen ty thể cytochrome c
oxidase tiểu đơn vị I COI

đây là enzyme cuối cùng trong đƣờng hô hấp

chuỗi vận chuyển điện tử của ty thể, màng) [6]. Sau đó nhiều nghiên cứu về
định danh loài bằng chỉ thị ADN đã thành c ng trên động vật nhƣ chim, cá,
ốc tiền, nhện và một số lồi cơn trùng thuộc bộ Cánh cứng. Năm 2003, Hebert đã
đề xuất “mã vạch ADN” ADN mã vạch nhƣ là một cách để xác định loài [6].
Tuy nhiên cần lƣu ý rằng ADN mã vạch không thể thay thế phân loại
nhƣng nó là c ng cụ hữu ích để tạo ra thông tin về đơn vị phân loại chƣa biết.
Để thúc đẩy việc sử dụng ADN mã vạch cho tất cả sinh vật nhân chuẩn sống
trên hành tinh này, CBOL (Consortium for the Mã vạch of Life

đã đƣợc

thành lập vào tháng 5 năm 2004, gồm hơn 120 tổ chức từ 45 quốc gia. Với
mục tiêu ban đầu là xây dựng một thƣ viện trực tuyến trình tự mã vạch cho tất
cả các lồi chƣa đƣợc biết đến, có thể làm tiêu chuẩn phân loại cho bất kỳ
mẫu ADN nào. Theo The Mã vạch of Life Data Systems năm 2011 đã lƣu trữ
đƣợc hơn 1.100.000 ADN mã vạch từ hơn 95.000 đối tƣợng sinh vật khác
nhau. Trong hơn 10 năm , đã có trên 180.000 trình tự ADN mã vạch của thực
vật đƣợc lƣu trữ trong ngân hàng gene quốc tế và liên kết với hơn 2000 bài
7

báo khác nhau. Với sự hỗ trợ của CBOL, ADN mã vạch ngày càng phát triển
và trở thành một phƣơng pháp phân loại và định danh loài mới.
1.2.1 Các đặc điểm cơ bản của trình tự mã vạch
Đặc điểm quan trọng nhất của ADN mã vạch là phải phổ biến và đặc
hiệu trong các biến dị và dễ dàng sử dụng. Điều này có nghĩa là các đoạn gen
đƣợc sử dụng nhƣ một mã vạch nên thích hợp cho nhiều đơn vị phân loại, có
sự biến đổi giữa các lồi nhƣng ổn định và bảo thủ cao bên trong loài hoặc
biến đổi kh ng đáng kể. Do đó, ADN mã vạch lý tƣởng là một đoạn ADN có
trình tự nucleotide ngắn, bắt cặp đƣợc với cặp mồi đƣợc thiết kế đặc hiệu để
dễ dàng khuếch đại bằng PCR.
Với động vật, hệ gen ty thể với các đặc tính di truyền theo dòng mẹ, tốc
độ đột biến cao chủ yếu là các đột biến thay thế trong vùng mã hoá, vùng điều
khiển và không tái tổ hợp đƣợc coi là một cơng cụ hữu hiệu trong nghiên cứu
tìm ra nguồn gốc các lồi. Thêm vào đó, ADN ty thể có số lƣợng bản sao lớn
trong tế bào và bền vững trong thời gian rất dài, hàng nghìn năm trong khi đó
ADN nhân chỉ có một bản sao và nhanh chóng bị phân huỷ ra ngồi mơi
trƣờng. Do vậy phần lớn các nghiên cứu sử dụng một vùng ADN ngắn của
gen ty thể mã hóa cytochrome c oxidase subunit I (COI) làm chỉ thị ADN.
Mặc dù có vài trƣờng hợp ngoại lệ, COI đƣợc coi là một chỉ thị ADN điển
hình và chung cho các lồi động vật.
Q trình tìm kiếm một chỉ thị ADN chung cho các loài thực vật gặp
nhiều khó khăn. Ở thực vật hệ gen lục lạp mang nhiều đặc điểm thích hợp đối
với chỉ thị ADN và hệ gen nhân, vùng ADN nằm giữa các gen hay còn gọi ITS
Internal Transcribed Spacer thƣờng đƣợc sử dụng làm ADN chỉ thị trong một số
nghiên cứu [6; 15; 19]. Nhiều vùng gen đã đƣợc nghiên cứu và đề xuất là chỉ thị
ADN cho thực vật. Tuy nhiên chƣa có chỉ thị ADN nào đƣợc đa phần các nhà
phân loại học thực vật hoàn toàn chấp nhận [7; 13; 14]. Mặc dù vậy, các nhà

8


nghiên cứu cũng đã đi tới một quan điểm thống nhất là sẽ cần không chỉ một mà
nhiều vùng ADN chỉ thị để định danh loài đối với thực vật [11].
Theo Taberlet P. và cộng sự (2007), hệ thống mã vạch ADN lý tƣởng
phải đáp ứng các yêu cầu sau đây:
- Thứ nhất, đoạn ADN chỉ thị phải đủ độ biến thiên để phân biệt giữa
các loài nhƣng cũng phải không khác nhau quá mức giữa các cá thể trong
cùng loài.
- Thứ hai, hệ thống định danh bằng ADN phải đƣợc chuẩn hóa, với
cùng một vùng ADN có thể đƣợc sử dụng cho các nhóm phân loại khác nhau.
- Thứ ba, đoạn ADN chỉ thị cần chứa đủ thông tin phát sinh lồi để có
thể dễ dàng định danh lồi vào các nhóm phân loại (chi, họ,… .
- Thứ tƣ, có khả năng áp dụng với các mẫu vật thơ, với vị trí cặp mồi
nhân gen có độ bảo thủ cao, dễ dàng thực hiện phản ứng khuếch đại và đọc
trình tự ADN
- Đoạn ADN nghiên cứu nên có kích thƣớc ngắn để q trình nhân bản
ADN khơng bị sai lệch. Th ng thƣờng, đoạn ADN nghiên cứu có kích thƣớc
150 bp trở lại, nếu dài hơn sẽ dễ bị sai lầm trong quá trình nhân bản ADN.
1.2.2 Một số locus được sử dụng trong phương pháp ADN mã vạch ở thực vật
1.2.2.1 Trình tự gen nhân
Các trình tự mã vạch đƣợc nhân bản từ ADN hệ gen của bố mẹ dự kiến
sẽ cung cấp nhiều hơn th ng tin về các lồi cần xác định. Tuy nhiên khó khăn
trong việc khuếch đại PCR từ gen nhân vì gen nhân chủ yếu là đơn gen hoặc
có bản sao gen thấp, đặc biệt từ sự suy thoái và chất lƣợng ADN genome và
khả năng phân biệt dƣới loài do bảo toàn gen chức năng có thể chính là lý do
tại sao hạn chế số lƣợng các gen nhân đƣợc thử nghiệm trong xác định loài
bằng phƣơng pháp ADN mã vạch [23; 26].

9


1.2.2.2 Vùng gen mã hóa ribosome
Gen rADN là hệ thống đa gen mã hóa phần ARN của ribosome. Các
gen ADN ribosome (rADN) mang trình tự vừa có tính bảo thủ vừa có tính đa
dạng thích hợp để phân biệt các loài gần gũi. Trong tế bào, rADN đƣợc sắp
xếp nhƣ các đơn vị đƣợc lặp lại ngẫu nhiên bao gồm ADN mã hóa ribosome
18S, 5,8S, 28S và xen giữa các trình tự khơng mã hóa ITS1, ITS2 (internal
transcribed spacers) nằm ở hai bên sƣờn của vùng 5,8S. Vùng mã hóa của ba
gen rADN đƣợc bảo tồn cao hơn hai vùng ITS. Nhìn chung các đơn vị rADN
đƣợc lặp lại hàng nghìn lần và đƣợc sắp xếp tập trung tại vùng lớn trên nhiễm
sắc thể. Một trong những tính năng đáng chú ý nhất của rADN là từng đơn vị
trong hệ thống đa gen kh ng tiến hoá độc lập, thay vào đó tất cả các đơn vị
tiến hố một cách phối hợp nhờ vậy mà rADN đạt mức ổn định cao hơn trong
loài nhƣng khác biệt giữa các loài khác nhau.
Hiện tại, nrITS vùng ITS của gen nhân đƣợc xem là một trong những
cơng cụ hữu ích nhất để đánh giá phát sinh loài ở cả thực vật và động vật vì
nó phổ biến trong tự nhiên, kế thừa từ bố mẹ và biến đổi cao do ít hạn chế
chức năng. Một số nghiên cứu gần đây ở cây sinh sản hữu tính và cây sinh sản
vơ tính cho thấy một số mức độ biến đổi số các bản sao của trình tự ITS1 và
ITS2 do nhiều nguyên nhân nhƣ lai gần, phân ly, tái tổ hợp, tỷ lệ đột biến cao
và hình thành gen giả của các gen chức năng dẫn đến những thay đổi đó. Trên
cơ sở này nrADN có thể đƣợc sử dụng để phân định chính xác và hiệu quả
thực vật trong cùng loài với đặc điểm lịch sử đời sống khác nhau (một năm,
lâu năm, trên cạn, dƣới nƣớc) và nguồn gốc tiến hóa khác nhau [23; 26; 27].
1.2.2.3 Trình tự gen lục lạp
Hệ gen lục lạp của thực vật gồm phân tử ADN mạch vịng có kích
thƣớc 120 - 160 kb chia làm hai bản sao đơn là bản sao đơn lớn (large singlecopy region) và bản sao đơn nhỏ (small single-copy region). Hai bản sao đƣợc
phân cách bởi hai chuỗi lặp lại đảo nhau IRa và IRb có độ dài trung bình 20

10


- 30 kb. Hệ gen lục lạp chứa tất cả các gen rARN (4 gen ở thực vật bậc cao),
các gen tARN (35 gen) và các gen khác mã hóa cho các protein tổng hợp
trong lục lạp (khoảng 100 gen) cần thiết cho sự tồn tại của chúng.
Bảng 1: Thông tin của một số mồi ADN Mã vạch thiết kế cho hệ gen
lục lạp
Mồi

Trình tự 5‟→3‟

a-f

ATGTCACCACAAACAGAGACTAAAGC

→

a-r

CTTCTGCTACAAATAAGAATCGATCTC

←

matK 1F

GAACTCGTCGGATGGAGTG

→

matK 1R

GAGAAATCTTTTTCATTACTACAGTG ←

matK 2F

CGTACTTTTATGTTTACAGGCTAA

→

matK 2R

TAAACGATCCTCTCATTCACGA

←

rpoB 1

AAGTGCATTGTTGGAACTGG

→

rpoB 2

ATGCAACGTCAAGCAGTTCC

→

rpoB 3

CCGTATGTGAAAAGAAGTATA

←

rpoB 4

GATCCCAGCATCACAATTCC

←

rpoC1 1

GTGGATACACTTCTTGATAATGG

→

rpoC1 2

GGCAAAGAGGGAAGATTTCG

→

rpoC1 3

TGAGAAAACATAAGTAAACGGGC

←

rpoC1 4

CCATAAGCATATCTTGAGTTGG

←

ycf5

ycf5 1

GGATTATTAGTCACTCGTTGG

→

(ccsA)

ycf5 2

ACTTTAGAGCATATATTAACTC

→

ycf5 3

ACTTACGTGCATCATTAACCA

←

ycf5 4

CCCAATACCATCATACTTAC

RbcL

MatK

RpoB

rpoC1

trnH – trnH2

CGCGCATGGTGGATTCACAATCC

→

psbA

GTTATGCATGAAAGTAATGCTC

←

psbAF

trnH(GUG) ACTGCCTTGATCCACTTGGC
11

→


trnL-F

psb A

CGAAGCTCCATCTACAAATGG

←

trnL-c

CGAAATCGGTAGACGCTACG

→

trnL-d

GGGGATAGAGGGACTTGAAC

←

trnL-e

GGTTCAAGTCCCTCTTATCCC

→

trnL-f

ATTTGAACTGGTGACACGAG3‟

←

trnL-g

GGGCAATCCTGAGCCAA

→

trnL-h

CCATTGAGTCTCTGCACCTATC

←

→: mồi xu i; ←: mồi ngƣợc
Hệ gen lục lạp có tính bảo thủ cao và mang tính đặc thù của từng loài
do vậy việc sử dụng các kết quả phân tích hệ gen lục lạp vào nghiên cứu phát
sinh loài và phân loại thực vật đƣợc các nhà khoa học rất quan tâm. Dựa trên
những thơng tin có sẵn từ các nghiên cứu về phát sinh loài và các nghiên cứu
gần đây, một số locus là đoạn gen hay các gen đƣợc chọn để nghiên cứu làm
chỉ thị mã vạch tiềm năng cho các loài thực vật trên trái đất. Có khoảng 20
gen lục lạp có độ dài phù hợp (khoảng 1 kb đƣợc sử dụng trong nghiên cứu
phát sinh loài. Các gen này chứa đựng nhiều mức độ tiến hố và vì vậy phù
hợp cho nhiều mức độ phân loại [22; 23; 25].
Các locus khác nhau đã đƣợc đề xuất về điều tra nhóm, mồi thích hợp
cho các gen này đƣợc trình bày trong bảng 1.1.
1.2.2.4 Trình tự gen rbcL
Trong các gen lạp thể, rbcL là trình tự gen đặc trƣng nhất, mã hóa các
tiểu đơn vị lớn của rubilose - 1,5 - bisphosphate cacboxylase/ oxygenase
(RUBISCO). rbcL là gen đầu tiên đƣợc giải trình từ thực vật. Gen rbcL đã
đƣợc sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu phát sinh loài và phân loại thực vật
với hơn 10.000 trình tự rbcL có sẵn trong GenBank. Do sự dễ dàng trong

khuếch đại PCR ở một số nhóm thực vật, CBOL gần đây đã c ng nhận rbcL
là một trong những trình tự gen tiềm năng nhất cho các nghiên cứu ADN mã
vạch ở thực vật. Tuy nhiên, do khả năng phân biệt loài thấp, nên hầu hết các
12


nhóm đều cho rằng nên sử dụng kết hợp rbcL với các với các chỉ thị mã vạch
khác, ví dụ nhƣ matK là hai locus mã vạch chuẩn cho thực vật [23; 24; 25].
1.2.2.5 Trình tự gen matK
Trong số các gen lục lạp, matK là một trong những gen tiến hố nhanh
nhất, có kích thƣớc khoảng 1.550 bp và mã hóa cho enzyme maturase liên
quan đến q trình loại bỏ các intron loại 2 trong quá trình phiên mã ARN.
Do matK tiến hố nhanh và có mặt hầu hết trong thực vật nên đã đƣợc sử
dụng nhƣ một chỉ thị trong nghiên cứu mối quan hệ giữa các loài và phát sinh
loài ở thực vật. C OL đã thử nghiệm matK trên gần 550 loài thực vật và thấy
rằng 90% mẫu thực vật hạt kín dễ dàng khuếch đại trình tự bằng cách sử dụng
một cặp mồi đơn và đề nghị sử dụng matK là một trong những locus mã vạch
chuẩn cho thực vật [23; 27].
1.2.2.6 Trình tự gen rpoB và rpoC1
Gen rpoB, rpoC1, rpoC2 mã hóa ba trong 4 tiểu đơn vị của ARN
polymerase lục lạp. Khi nghiên cứu họ Dipterocarpaceae, Tsumura và đtg
1996 đã nhận thấy gen rpoB là thích hợp để nghiên cứu phát sinh lồi. Hiện
nay rpoB là gen đƣợc sử dụng nhiều trong nghiên cứu phát sinh loài và xác
định các loài vi khuẩn, đặc biệt là khi nghiên cứu các chủng có quan hệ gần
gũi. Cùng với gen 16S rRNA, rpoB đƣợc sử dụng trong nhiều nghiên cứu để
xác định loài vi khuẩn mới, do vậy các gen này đƣợc đề xuất là chỉ thị mã
vạch độc lập hoặc kết hợp với một số gen khác. Trong các nghiên cứu gần
đây, C OL đã thử nghiệm 7 locus và thấy rằng khả năng phân biệt loài cuả
đoạn gen rpoC1 là thấp nhất (43%). Mặc dù vậy, trong nghiên cứu Liu và đtg
2010 đã chỉ ra rpoC1 là một chỉ thị rất hữu ích khi đƣợc sử dụng để phân

biệt các loài bryophytes. Do vậy cần có các nghiên cứu tiếp theo để chứng
minh sự phù hợp khi sử dụng rpoB và rpoC1 làm chỉ thị mã vạch trong các
nghiên cứu giám định loài [23; 25].

13


1.2.2.7 Trình tự gen ycf5
ycf5 mã hóa cho một protein có chứa 330 amino acids. Gen này đƣợc
bảo tồn trên tất cả các vùng thực vật và đã đƣợc kiểm nghiệm cho phù hợp
với ADN mã vạch của một vài nhóm. Tuy nhiên, gen này chƣa đƣợc cơng
nhận và sử dụng nhiều trong vai trò của một ADN mã vạch [22; 23].
1.2.2.8 Trình tự hai gen trnH-psbA
Gen trnH-psbA có kích thƣớc trung bình khoảng 450 bp, nhƣng thay
đổi từ 296 đến 1120 bp, trnH-psbA đƣợc chứng minh là có khả năng xác định
loài cao. Locus trnH-psbA đã đƣợc khuếch đại thành cơng ở nhiều thực vật
hạt kín và hạt trần. Tuy nhiên, trong nhiều thực vật hạt kín trnH-psbA lại có
kích thƣớc rất ngắn ~ 300 bp , kích thƣớc của gen này thay đổi lớn do sự có
mặt của gen rpS19 hoặc các gen giả nằm giữa cùng gen của hai gen trnH và
psbA. Trong nhiều nghiên cứu gần đây đã đề xuất việc sử dụng trnH-psbA
nhƣ chỉ thị mã vạch độc lập cho thực vật hay kết hợp với matK. CBOL thấy
rằng khả năng phân biệt loài của trnH-psbA là cao nhất (69%) trong số 7
locus đƣợc thử nghiệm và do đó đề nghị nó nhƣ là chỉ thị barode bổ sung.
trnH-psbA có thể sử dụng trong hệ thống mã vạch ba locus khi hệ thống mã
vạch hai locus khơng cung cấp đầy đủ khả năng phân tích [20; 23].
1.2.2.9 Trình tự hai gen trnL(UAA)-trnF(GAA)
Locus trnL(UAA) - trnF(FAA) chứa gen trnL(UAA), vùng intron và
vùng nằm giữa hai gen trnL(UAA) và trnF GAA . Taberlet và đtg là nhóm
nghiên cứu đầu tiên sử dụng trnL trong các nghiên cứu hệ thống học thực vật.
Vùng khơng mã hố trnL(UAA)và trnF(GAA) khơng phải là vùng có sự biến

đổi lớn nhất của ADN lục lạp nhƣng có ƣu thế nhƣ cấu trúc bậc 2 với vùng
biến đổi và vùng bảo thủ xen kẽ nhau. Điều này tạo thuận lợi cho các nghiên
cứu tìm kiếm trình tự nucleotide ở các vùng bảo thủ để thiết kế mồi và sử
dụng kỹ thuật PCR để khuếch đại các đoạn gen ở vùng biến đổi. Trong nghiên
cứu để xác định trnL (UAA) intron có nên đƣợc sử dụng làm vùng ADN mã
14


vạch, Taberlet 2007 đã sử dụng 100 loài thực vật và kết luận rằng trnL
intron có thể sử dụng nhƣ là một mã vạch của thực vật, trnL-trnF là một mã
vạch tiềm năng cho phân tích, xác định các lồi thực vật [23;27].
1.3 Tình hình nghiên cứu ADN mã vạch ở thực vật
1.3.1 Những thành tựu trên thế giới
Trọng tâm nghiên cứu mã vạch ở thực vật chủ yếu là về đánh giá hiệu
quả tƣơng đối của của các đoạn gen chỉ thị đã đƣợc sử dụng trong nghiên cứu
phát sinh lồi. Đối với thực vật, q trình tìm kiếm một chỉ thị ADN chung
cho các loài thực vật gặp nhiều khó khăn. Hệ gen ty thể ở thực vật thƣờng quá
bảo thủ nên kh ng đƣợc dùng cho chỉ thị ADN, trong khi đó hệ gen lục lạp lại
mang nhiều đặc điểm mong muốn đối với chỉ thị ADN nhƣ ở hệ gen ty thể ở
động vật. Ở hệ gen nhân, vùng ADN nằm giữa các gen hay còn gọi ITS
(Internal Transcribed Spacer cũng đƣợc sử dụng làm ADN chỉ thị trong một
số nghiên cứu [4;18;22].
Mặc dù một vài locus trong hệ gen lục lạp và gen nhân đã đƣợc nghiên
cứu làm chỉ thị trong nghiên cứu ADN mã vạch song kết quả thu đƣợc vẫn có
những hạn chế. Điều này cho thấy việc cần thiết sử dụng kết hợp các locus để
bổ sung cho nhau đem lại hiệu quả cao hơn trong đánh giá, phân loại các loài
thực vật. Trên thực tế từ lâu rbcL đã đƣợc sử dụng trong nghiên cứu phát sinh
lồi, bên cạnh đó trình tự gen matK có tỷ lệ tiến hóa cao nhất trong các gen
lạp thể cũng có khả năng phân biệt lồi cao. Trên cơ sở đó C OL đã kết hợp
hai locus của rbcL và matK mang lại hiệu quả cao (70% sự phân biệt lồi) và

giảm nhiều chi phí cho các điều tra về xây dựng mối quan hệ cũng nhƣ phân
loại đánh giá các loài thực vật. Hiệu quả kết hợp giữa hai gen này thích hợp
cho các nghiên cứu nhƣ là điều tra tƣơng tác thực vật - động vật, xác định các
loài cây đƣợc bảo vệ, các cuộc khảo sát đa dạng sinh học quy mô lớn và phân
biệt cây giống trong các chƣơng trình tái sinh rừng phân biệt và cho mục đích
xác định lồi và phân loại [23].

15


Spooner sau khi xem xét hiệu quả của psbA - trnH, matK, nrITS trên 63
loài khoai tây dại đã chỉ ra rằng trình tự của psbA - trnH, matK và nrITS
khơng cung cấp đầy đủ các thơng tin về lồi cụ thể. Gen lạp thể không cho
thấy đầy đủ sự khác biệt, trong khi các trình tự nrITS cho thấy sự khác biệt
trong lồi cao. Những khó khăn đó cũng gặp phải trong chi Magnolioideae,
họ Magnoliaceae và trong họ Lauraceae khi giải thích những mối quan hệ
trong lồi. Từ những nghiên cứu cụ thể trên ba nhóm thực vật khác nhau, thực
vật hạt kín, hạt trần và rêu các nhà phân loại kết luận rằng việc kết hợp các
locus hệ gen lạp thể nhƣ rbcL + rpoC1 + matK + trnH-psbA mang lại hiệu
quả cao nhƣ một hệ thống mã vạch duy nhất cho xác định các nhóm lồi rộng.
Vì vậy, trong các dự án nhƣ giám định loài sử dụng các chỉ thị mã vạch, việc
đề xuất mã vạch hai locus tiêu chuẩn là kh ng đủ do sự phân ly trong loài và
quần thể ở nhiều thực vật hạt kín là rất lớn. Đặc biệt trong cùng khu vực phân
bố trải qua giao phối và giao phối cận huyết, sự thay đổi của một hoặc hai
trình tự gen lạp thể kh ng đủ để đánh dấu ranh giới loài. Các vấn đề sinh học
nhƣ đa b i thể, dị bội, sinh sản vơ tính, chuyển gen, chọn dịng, phân ly và
tiến hóa nhanh hình thái học dẫn đến sự khó khăn trong xác định lồi. Do vậy
khơng thể sử dụng cùng một vùng ADN để xác định cho các loài khác nhau
mà cần lựa chọn các vùng ADN khác nhau cho xác định ở các loài khác nhau
[24; 25].

Hiện nay hệ thống ADN mã vạch cho thực vật chƣa hồn chỉnh. Tuy
nhiên với các trình tự ADN mã vạch này, các nhà khoa học đã có những
nghiên cứu, ứng dụng đầy hứa hẹn cho xác định loài ở thực vật, mở ra một
triển vọng mới cho cho c ng tác đánh giá, phân loại và bảo tồn đa dạng sinh
học.
1.3.2 Những thành tựu nghiên cứu tại Việt Nam
Ở Việt Nam, đến nay đã có một số c ng trình nghiên cứu về mã vạch
ADN đƣợc triển khai ở một số cơ sở nghiên cứu. Tuy nhiên, các nghiên cứu
này vẫn còn rất nhỏ lẻ, trên một vài đối tƣợng sinh vật, chƣa có tính hệ thống,
16


đồng bộ nên chƣa thể xây dựng đƣợc cơ sở dữ liệu về mã vạch ADN. Một số
đề tài đã và đang đƣợc triển khai tại các viện nghiên cứu và trƣờng đại học
trong cả nƣớc, nhƣ:
Tại Viện Hàn lâm Khoa học và C ng nghệ Việt Nam, nhiều đề tài liên
quan đã đƣợc thực hiện ở các đơn vị trực thuộc Viện C ng nghệ sinh học,
Viện nghiên cứu hệ gen, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện sinh học
nhiệt đới, ảo tàng thiên nhiên v.v. , nhƣ:
Đề tài "Nghiên cứu mối quan hệ di truyền một số loại cây gỗ quý thuộc
chi trắc Dalbergia bị đe dọa tuyệt chủng bằng chỉ thị phân tử", đề tài "Góp
phần xác định các lồi thuộc chi tre Bambusa Schreb ở Việt Nam bằng
phƣơng pháp ADN hỗ trợ phƣơng pháp phân loại hình thái truyền thống", đặc
biệt là đề tài cấp nhà nƣớc TN3/T15, 2012-2015 "Nghiên cứu tính đa dạng
nguồn gen di truyền và thành phần hóa học một số loài lá kim ở Tây Nguyên,
đề xuất giải pháp bảo tồn, sử dụng và phát triển bền vững" do PGS.TS Đinh
Thị Phòng; Đề tài "Đánh giá đa dạng di truyền hai lồi Dầu nƣớc
(Dipterocarpus alatus và Dầu mít D. costatus họ Dầu Dipterocarpaceae)
đang bị đe doạ trong hệ sinh thái rừng nhiệt đới Nam Việt Nam" do TS.
Nguyễn Minh Tâm ở ảo tàng Thiên nhiên Việt Nam làm chủ nhiệm, có thể

nói đây là những c ng trình nghiên cứu đầu tiên và bài bản về lĩnh vực ứng
dụng c ng nghệ ADN trong nghiên cứu đa dạng di truyền, xác định loài ở
Việt Nam. Kết quả của đề tài đã tạo tiền đề quan trọng cho các nghiên cứu
tiếp theo Đinh Thị Phòng, 2011, 2014; Vũ Thị Thu Hiền, 2009).
Kết hợp phƣơng pháp sinh học phân tử và hình thái trong nghiên cứu
phân loại các họ Thiên lý Asclepiadaceae và Trúc đào Apocynaceae ở Việt
Nam (2009-2010, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật ; Nghiên cứu đánh
giá đa dạng di truyền của cây dó bầu tại Việt Nam bằng kỹ thuật chỉ thị ADN
nhằm bảo tồn, hỗ trợ và nâng cao hiệu quả sản xuất trầm hƣơng 2010-2011,
Viện C ng nghệ sinh học ; Định loại phân tử để giám sát thƣơng mại và
thƣơng mại hóa các lâm sản ngoài gỗ ở Campuchia, Lào và Việt Nam 201017


2012, Viện C ng nghệ sinh học, Viện nghiên cứu hệ gen ; Nghiên cứu xây
dựng mã vạch ADN ADN mã vạch phục vụ cho việc định danh sâm Ngọc
Linh và cây

á bệnh 2012-2013, Viện C ng nghệ sinh học

Thu Hiền, 2012; Đinh Thi Phòng, 2011, 2014 .

Nguyễn Thị

ƣớc đầu, một số kết quả

c ng bố đã chỉ ra có thể sử dụng gen 18S rARN để phân loại các lồi thuộc
chi Bình vơi (Stephania Huỳnh Thị Thu Huệ và cộng sự, 2003 , để xác định
mức độ quan hệ họ hàng giữa Sa mộc Cunninghamia lanceolata Lamb.)
nhập từ Trung Quốc và Sa mộc dầu Cunninghamia konishii Hayata mọc tự
nhiên Nguyễn Thị Phƣơng Trang và cộng sự, 2009 , để phân loại 9 loài

thuộc họ Hoàng đàn Cupressaceae ở Việt Nam Nguyễn Minh Tâm và cộng
sự, 2012 . Nguyễn Đức Thành và nhóm nghiên cứu 2007 đã sử dụng một số
gen ở lục lạp để nghiên cứu đa dạng di truyền và xuất xứ một số loài cây lâm
nghiệp. Kết quả nghiên cứu đã chỉ ra, các chỉ thị gen lục lạp là c ng cụ hữu
hiệu trong nghiên cứu đa dạng di truyền và xuất xứ các loài cây lâm nghiệp.
Đề tài giám định phân tử và di truyền quần thể của các rừng gỗ Pơ Mu
(Fokienia hodginsii tại Việt Nam 2010-2011, Trƣờng Đại học C ng nghệ Đại học Quốc gia Hà Nội ; Đánh giá đa dạng di truyền của chi Lan huệ ở
Việt Nam bằng chỉ thị phân tử 2010-2011, Trƣờng Đại học N ng nghiệp I ;
Nghiên cứu hệ thống phân loại và bảo tồn các loài cây thuộc họ Dầu
(Dipterocarpaceae

tại Việt Nam

2010-2012, Trƣờng Đại học Lâm

nghiệp . Nhóm nghiên cứu của Trần Hồng Dũng và cộng sự đã tiến hành
xác định một số đoạn ADN đặc trƣng để làm mã vạch cho một số nhóm thực
vật quý hiếm, đặc hữu, có giá trị kinh tế và dƣợc tính nhƣ: Lan Hài
(Paphiopedilum , Hồng Thảo

Dendrobium , Sâm Ngọc Linh

Panax

vietnamensis , Củ Hoài Sơn Discorea persimilis , Ngải sậy hoang An Giang
họ Gừng Zingiberaceae, hoặc nấm dƣợc liệu nhƣ Linh Chi Ganoderma , nấm
gây bệnh Phytothphora ; động vật quý hiếm đặc hữu Việt Nam Nguyễn
Hoàng Dũng, 2014 . Nguyễn Thị Thanh Nga và cộng sự 2012 đã tiến hành
nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền một số loài cây dƣợc liệu Việt Nam
18

thuộc chi Đảng Sâm Codonopsis sp bằng kỹ thuật ADN mã vạch, kết quả
nghiên cứu đã khuếch đại thành c ng hai vùng gen ITS và matK và phân tích
đƣợc sự đa hình trên mỗi vùng gen. Nghiên cứu đã ứng dụng mã vạch
ADN trong phân tích đa dạng di truyền các loài Codonopsis ở Việt Nam và
cùng các kết quả nghiên cứu trƣớc đây trên thế giới đã khẳng định vùng gen
ITS và matK có thể giúp nhận diện loài và dƣới loài nhƣ một mã vạch phân
tử, đồng thời có thể đƣợc dùng cho các nghiên cứu tiếp theo về tiến hóa học
phân tử và nghiên cứu bảo tồn nguồn gen của loài dƣợc liệu quý. Hoàng Đăng
Hiếu và cộng sự 2012 , đã sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong phân
tích đa dạng cà định dạng của tập đồn cây Dó

ầu Aquilaria SP. tại Hà

Tĩnh, kết quả nghiên cứu đã tách chiết và tinh sạch đƣợc ADN tổng số của 18
mẫu dó bầu trong đó có 3 lồi của Lào, 4 mẫu thu tại Phú Quốc và 11 mẫu thu
tại Hà Tĩnh; đã nhân

bản

thành

công

các

đoạn

gen trnH-

psbA, rbcL, rpoB, ITS bằng phƣơng pháp PCR từ ADN tổng số của 18
mẫu dó bầu. Hà Văn Huân 2013, 2014 đã triển khai nghiên cứu „„Xây dựng
cơ sở dữ liệu chỉ thị phân tử ADN mã vạch cho loài Sến mật (Madhuca
pasquierii) phục vụ giám định loài„„ và phân lập đoạn ADN barcoding cho
loài Trà hoa vàng Tam đảo Camellia tamdaoensis Hakoda et Ninh phục vụ
bảo tồn và phát triển loài Trà đặc hữu, quý hiếm của Việt Nam [1].
Các nghiên cứu trên đã tạo tiền đề quan trọng cho hƣớng nghiên cứu
ứng dụng chỉ thị phân tử vào việc phân loại, giám định, đánh giá đa dạng di
truyền, bảo tồn và quản lý thƣơng mại nguồn tài nguyên sinh vật ở nƣớc ta.
1.3.3 Nghiên cứu Mã vạch ADN của cây Trầm hương Aquilaria
Hiện nay, trên thế giới cũng nhƣ ở Việt Nam đã có những cơng trình
cơng bố kết quả nghiên cứu chỉ thị phân tử nói chung và mã vạch ADN nói
riêng của các lồi thuộc chi Aquilaria. Việc sử dụng mã vạch ADN có thể giúp
chúng ta tìm ra những lồi, xuất xứ Trầm hƣơng cho chất lƣợng trầm tốt một
cách nhanh nhất. Điều này có ý nghĩa rất lớn trong công tác tuyển chọn, gây

19