Nghiên cứu thu nhận CELLULOSE vi khuẩn làm chất mang trong kỹ thuật cố định tế bào vi sinh vật

Đại Học Quốc Gia Tp. Hồ Chí Minh
TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA



NGHIÊN CỨU THU NHẬN
CELLULOSE VI KHUẨN LÀM CHẤT
MANG TRONG KỸ THUẬT CỐ ĐỊNH
TẾ BÀO VI SINH VẬT
Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
Mã số ngành: 60 42 80

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP. HỒ CHÍ MINH, tháng 07 năm 2008


CƠNG TRÌNH ĐƢỢC HỒN THÀNH TẠI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HỒ CHÍ MINH.

Cán bộ hƣớng dẫn khoa học: TS. NGUYỄN THÚY HƢƠNG.
(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị và chữ ký)

Cán bộ chấm nhận xét 1: ..................................................................................
(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị và chữ ký)

Cán bộ chấm nhận xét 2: ..................................................................................
(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị và chữ ký)

Luận văn thạc sĩ đƣợc bảo vệ tại HỘI ĐỒNG CHẤM BẢO VỆ LUẬN VĂN

THẠC SĨ.

TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA, ngày 10 tháng 07 năm 2008.


TÓM TẮT
Cellulose vi khuẩn – BC đƣợc biết đến với nhiều khả năng ứng dụng trong các
lĩnh vực kỹ thuật, công nghệ vật liệu, y khoa… Bên cạnh những ứng dụng đó, trong
đề tài nghiên cứu này BC sẽ đƣợc biết đến với vai trò làm chất mang trong kỹ thuật
cố định vi sinh vật. Đối tƣợng đƣợc chúng tôi lựa chọn cố định trên chất mang BC
là Saccharomyces cerevisiae 28. Trƣớc khi lên men thu nhận và tiến hành xử lý BC,
chúng tơi thực hiện tối ƣu hóa pH và môi trƣờng lên men nhằm thu nhận đƣợc
lƣợng BC tối ƣu. pHopt của chủng Acetobacter xylinum BC16 đƣợc chúng tôi ghi
nhận tại pH = 4.4 và môi trƣờng lên men BC tối ƣu với nồng độ glucose, (NH4)2SO4
và (NH4)2HPO4 lần lƣợt là 20g/l, 8g/l và 2g/l môi trƣờng nƣớc dừa già. BC trở
thành chất mang cố định tế bào nấm men bằng 2 phƣơng pháp: bẫy – hấp phụ và
nhốt chủ động. Chế phẩm BC với kích thƣớc 2cmx2cm, chế độ lắc 200 vòng/phút
và thời gian ủ 2 ngày của phƣơng pháp bẫy – hấp phụ đã cố định lƣợng lớn tế bào
nấm men với mật độ 9,251x106 tế bào/cm3; đồng thời chế phẩm này đƣợc sử dụng
khảo sát biến động của quá trình lên men rƣợu. Với phƣơng pháp nhốt chủ động,
BC sau xử lý có dạng hình tròn với Ø = 11cm, bề dày là 2mm đã cố định đƣợc
1,102x107 tế bào/cm3. Hiệu quả sử dụng chế phẩm Saccharomyces cerevisiae 28 cố
định trên chất mang BC trong giai đoạn lên men (số lần tái sử dụng) là 8 lần mà vẫn
đảm bảo hoạt tính sinh học của nấm men.


Abstract
Bacterial Cellulose (BC) is known with many applications in material
technology, and medical field… Beside those applications, BC in this project will
be known as a carrier in the immobilizing bacterial cell technology. Saccharomyces

cerevisiae 28 is the object that we chose for immobilization using the BC carrier.
Before fermenting, gathering and treating BC, we brought the pH concentration and
fermentative environment into the optimized level where we could collect the most
BC. pHopt concentration of Acetobacter xylinum BC16 strain was collected at pH =
4.4, and the optimized level of fermentative environment was found in juice of old
coconut with glucose concentration, (NH4)2SO4 and (NH4)2HPO4 respectively was
20g/l, 8g/l, and 2g/l. BC became the carrier immobilizing yeasts by 2 methods: trap
– absorb and active confinement. In trap – absorb method, BC preparation with size
2cm x 2cm, agitator at 200 cycle/min, and incubation time in 2 days had
immobilized a huge amount of yeasts with density 9,251x106 cells/cm3; also, this
preparation was used for testing the fluctuation of the alcoholic fermentation. In
active confinement method, BC after treatment had circle shape with diameter was
11 cm, and the thickness was 2mm. This BC had immobilized 1,102x107 cells/cm3.
The effect of using Saccharomuces cerevisiae 28 preparation for immobilizing the
BC carrier in the fermentative process could be up to 8 times, and still keep the
biology properties of the yeast.


MỤC LỤC
Mục lục

Trang

Chƣơng 1 – MỞ ĐẦU
Mở đầu ....................................................................................................................1
Chƣơng 2 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Giới thiệu về cellulose vi khuẩn (BC) và Acetobacter xylinum .........................2
2.1.1 Các vi sinh vật sản sinh BC ............................................................................2
2.1.2 Sơ lƣợc về vi khuẩn Acetobacter xylinum ......................................................3
2.1.3 Các đặc điểm của cellulose vi khuẩn (bacterial cellulose – BC) ....................4

2.1.4 Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình tạo BC ...................................................13
2.1.5 Nƣớc dừa già -Nguyên liệu dùng để nuôi A. xylinum nhằm thu nhận BC ......16
2.1.6 Các nghiên cứu về A.xylinum ..........................................................................17
2.2 Kỹ thuật cố định tế bào vi sinh vật .....................................................................19
2.2.1 Sơ lƣợc về kỹ thuật cố định tế bào vi sinh vật ................................................19
2.2.2 Các phƣơng pháp cố định ................................................................................20
2.2.3 Ƣu điểm của vi sinh vật cố định với vi sinh vật tự do ....................................23
2.2.4 Chất mang trong kỹ thuật cố định tế bào vi sinh vật .......................................23
2.3 Tính chất của chất mang BC ..............................................................................25
Chƣơng 3 – VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
3.1 Địa điểm và thời gian thực hiện .........................................................................27
3.2 Vật liệu ...............................................................................................................27
3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu ....................................................................................30
3.3.1 Sơ đồ nghiên cứu .........................................................................................30
3.3.2 Khảo sát giống A. xylinum ...........................................................................31
3.3.3 Phƣơng pháp giữ giống và nhân giống ........................................................31


3.3.4 Phƣơng pháp thu nhận BC ...........................................................................32
3.3.5 Phƣơng pháp quy hoạch thực nghiệm .........................................................33
3.3.6 Xác định trọng lƣợng BC khô .....................................................................35
3.3.7 Phƣơng pháp xử lý cellulose vi khuẩn tƣơi khi thu hoạch .......................... 36
3.3.8 Phƣơng pháp xác định mật độ tế bào đƣợc cố định trên chất mang BC .....37
3.3.9 Phƣơng pháp hóa lý .....................................................................................37
3.3.10 Nghiên cứu các phƣơng pháp và điều kiện cố định S. cerevisiae
trên chất mang BC .....................................................................................37
3.3.11 Nghiên cứu các biến động trong quá trình lên men rƣợu .......................... 40
Chƣơng 4 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Một số đặc điểm sinh học của chủng Acetobacter xylinum BC16
khảo sát trong đề tài ............................................................................................ 42

4.2 Tối ƣu hóa mơi trƣờng và điều kiện ni cấy để thu nhận BC ........................... 44
4.2.1 Tối ƣu hóa pH mơi trƣờng lên men ............................................................. 45
4.2.2 Tối ƣu hóa mơi trƣờng.................................................................................46
4.3 Ứng dụng BC làm vật liệu trong kỹ thuật cố định nấm men
Saccharomyces cerevisiae 28 ...............................................................................50
4.3.1 Xử lý BC trƣớc khi cố định vi sinh vật lên chất mang .................................50
4.3.2 Khảo sát quá trình cố định trên chất mang BC bằng phƣơng pháp
bẫy - hấp phụ ................................................................................................ 51
4.3.3 Cố định tế bào nấm men S. cerevisiae 28 lên chất mang BC bằng
phƣơng pháp nhốt chủ động ...........................................................................55
4.4 Khả năng ứng dụng của nấm men cố định bằng chất mang BC trong
lên men rƣợu .......................................................................................................58
Chƣơng 4 – KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
5.1 Kết luận ...............................................................................................................64
5.2 Kiến nghị .............................................................................................................65


Tài liệu tham khảo ..................................................................................................66

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình

Trang

1. Hình 2.1. Acetobacter xylinum ........................................................................... 3
2. Hình 2.2. A-BC đƣợc tạo ra từ môi trƣờng lắc (a) và S-BC đƣợc tạo ra
từ mơi trƣờng tĩnh (b) ......................................................................................... 6
3. Hình 2.3. Cấu trúc của cellulose (a) Cellulose vi khuẩn (x 20000) và (b)
cellulose của thực vật (x200) .............................................................................. 7

4. Hình 2.4. Vị trí – quá trình biến dƣỡng carbon và tổng hợp cellulose ở
A. xylinum ............................................................................................................. 9
5. Hình 2.5. Con đƣờng dự đốn của quá trình sinh tổng hợp và tiết ra cellulose
khi glucose đƣợc tế bào A. xylinum hấp thụ từ bên ngồi ................................. 9
6. Hình 2.6. Sự tổng hợp vi sợi bởi Acetobacter xylinum ...................................... 10
7. Hình 2.7. Con đƣờng chuyển hóa carbon của Acetobacter xylinum .................. 12
8. Hình 2.8. Bacterial cellulose ở điều kiện ni cấy tĩnh ..................................... 14
9. Hình 2.9. Bacterial cellulose ở điều kiện nuôi cấy lắc ....................................... 14
10. Hình 2.10. Sơ đồ các chất mang trong việc cố định tế bào ............................... 24
11. Hình 3.1. Sơ đồ tiến trình nghiên cứu ............................................................. 30
12. Hình 3.2. Sơ đồ thu nhận BC ........................................................................... 32
13. Hình 3.3. Sơ đồ xử lý BC ................................................................................. 36
14. Hình 4.1. Hình ảnh vi thể của A. xylinum BC16 .............................................. 42
15. Hình 4.2. Hình ảnh đại thể A. xylinum BC16 trên môi trƣờng đặc .................. 43
16.Hình 4.3. Màng BC trên mơi trƣờng lỏng ......................................................... 43
17. Hình 4.4. Màng BC trƣớc khi xử lý ................................................................. 50
18. Hình 4.5. Màng BC sau khi xử lý ..........................................................................50
19. Hình 4.6. Nấm men cố định trên chất mang BC .............................................. 55


20. Hình 4.7. Nấm men cố định trong chất mang BC ............................................ 55
21. Hình 4.8. BC trƣớc khi cố định bằng phƣơng pháp nhốt .................................. 56
22. Hình 4.9. BC sau khi cố định bằng phƣơng pháp nhốt ..................................... 56


DANH MỤC BẢNG VÀ ĐỒ THỊ

I. DANH MỤC BẢNG

Trang

1. Bảng 2.1. Cấu trúc BC ở một số loài vi khuẩn ............................................... 2
2. Bảng 2.2. Thành phần của nƣớc dừa .............................................................. 16
3. Bảng 2.3. Ƣu, nhƣợc điểm các phƣơng pháp thông dụng để cố định tế bào . 22
4. Bảng 4.1. Kết quả kiểm tra các đặc điểm sinh hóa ........................................ 44
5. Bảng 4.2. Trọng lƣợng BC thu đƣợc tại các pH ............................................. 45
6. Bảng 4.3. Các nhân tố quy họach thực nghiệm .............................................. 47
7. Bảng 4.4. Mơ hình quy hoạch thực nghiệm trong điều kiện lên men tĩnh
(YT) và lên men lắc (YL) .................................................................................... 48
8. Bảng 4.5. Kết quả thí nghiệm tại tâm ............................................................. 48
9. Bảng 4.6. Hệ số bj của phƣơng trình hồi quy ................................................. 49
10. Bảng 4.7. Mật độ tế bào nấm men cố định trên chất mang qua các phƣơng
pháp trong 30 phút đầu hấp phụ ................................................................... 51
11. Bảng 4.8. Ảnh hƣởng của thời gian ủ lên mật độ tế bào nấm men đƣợc cố
định trên chất mang BC ..................................................................................... 53
12. Bảng 4.9. So sánh phƣơng pháp bẫy – hấp phụ và phƣơng pháp nhốt
chủ động............................................................................................................. 57
13. Bảng 4.10. Một số chỉ tiêu hóa lý trong lên men rƣợu .................................. 59
14. Bảng 4.11. So sánh các chất mang trong kỹ thuật cố định tế bào nấm men . 62
II. DANH MỤC ĐỒ THỊ

Trang

1. Đồ thị 4.1. Ảnh hƣởng của pH đến trọng lƣợng BC khô trên môi trƣờng lên
men. ................................................................................................................ 46
2. Đồ thị 4.2. Mật độ vi khuẩn cố định trên BC với các kích thƣớc khác nhau


và qua chế độ khuấy đảo khác nhau ............................................................... 52
3. Đồ thị 4.3. Ảnh hƣởng của thời gian ủ lên mật độ tế bào nấm men ............... 54

4. Đồ thị 4.4. So sánh độ rƣợu của dịch lên men giữa mẫu đối chứng và qua
các lần tái sử dụng chế phẩm .......................................................................... 60
5. Đồ thị 4.5. So sánh chỉ số mật độ quang giữa mẫu đối chứng với các
lần tái sử dụng chế phẩm nấm men cố định.................................................... 60



CHƢƠNG 1 – MỞ

ĐẦU

Trong quá trình cố định vi sinh vật, vật liệu và phƣơng pháp cố định là hai yếu
tố mang tính chất quyết định đến hiệu quả của việc cố định vi sinh vật. Trong đó,
đặc biệt tính chất của vật liệu cố định (hay còn gọi là chất mang) là cơ sở cho sự lựa
chọn phƣơng pháp cố định. Trên thế giới, chất mang có tính chất là polymer tổng
hợp đã đƣợc nghiên cứu và sử dụng trong những thập niên 70 – 80 đa dạng với các
vật liệu nhƣ: Sephadex, polyacrylamid, polyvinylacetat, polystyren, polyetylen,
polyhydroxyetyl metacrylat… Tuy nhiên, ngoài những ƣu điểm là bền, độ trƣơng và
khả năng cố định tốt thì nhƣợc điểm của những chất mang này là giá thành cao,
không tƣơng hợp sinh học và khơng phân hủy sinh học đƣợc cho nên ít đƣợc sử
dụng [3]. Từ những nhƣợc điểm polymer tổng hợp mang lại, polymer sinh học đã
đƣợc chú ý nghiên cứu và sử dụng với các sản phẩm nhƣ: chitin, chitosan,
alginate… Đây là những sản phẩm tự nhiên, phong phú, rẻ tiền và có khả năng phân
hủy sinh học nên thân thiện với mơi trƣờng. Bên cạnh đó, nhƣợc điểm mắc phải của
loại chất mang này là độ trƣơng thấp, tính chất cơ lý kém bền và khơng đồng nhất.
Chính vì những lý do trên, việc nghiên cứu và tìm kiếm chất mang thay thế có
những ƣu điểm ƣu việt, đồng thời khắc phục những nhƣợc điểm của những chất
mang trên là cần thiết. Cellulose vi sinh vật (hay còn gọi là microbial cellulose MC) hay cụ thể hơn cellulose vi khuẩn (bacterial cellulose - BC) là một loại
polymer sinh học đƣợc xem là nguồn nguyên liệu tiềm năng và đã đƣợc ứng dụng
rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau nhƣ y học, thực phẩm [4],[25], công nghiệp

dệt [26], mỹ phẩm…[27]. Các nghiên cứu về tính chất hóa lý, cơ lý của BC cho
thấy BC đáp ứng đƣợc các yêu cầu lý tƣởng của vật liệu cố định [17],[18],[50]. Đề
tài này nhằm tìm hiểu và mở ra một hƣớng ứng dụng mới của BC: ―Nghiên cứu
thu nhận cellulose vi khuẩn làm chất mang trong kỹ thuật cố định tế bào vi sinh
vật‖.



CHƢƠNG 2 – TỔNG

QUAN

2.1 Giới thiệu về cellulose vi khuẩn (BC) và Acetobacter xylinum.
2.1.1 Các vi sinh vật sản sinh BC
Ngồi thực vật, nấm và tảo có cellulose là thành phần cấu trúc cơ bản hình
thành nên vách tế bào, cellulose cịn đƣợc tổng hợp bởi một số lồi vi khuẩn, đƣợc
gọi là cellulose vi khuẩn (bacterial cellulose – BC) (bảng 2.1). Con đƣờng tổng hợp
và cơ chế điều hòa tổng hợp BC ở các loài giống nhau, nhƣng cấu trúc BC ở mỗi
lồi thì khác nhau [18]. Có các điểm khác biệt đáng kể về thuộc tính vật lý của các
sản phẩm cellulose, chủ yếu là chiều dài của chuỗi glucan (đƣợc đặc trƣng bởi mức
độ polymer hóa), tính kết tinh và trạng thái kết tinh của nó. Tùy thuộc vào mỗi loại
mà trạng thái kết tinh của cellulose khác nhau. Từ đó tính chất vật lý của sản phẩm
nhƣ độ bền, độ hịa tan trong các dung mơi, tính chịu ảnh hƣởng của các tác nhân
biến tính cũng khác nhau [43].
Bảng 2.1. Cấu trúc BC ở một số loài vi khuẩn.
Giống

Cấu trúc cellulose

Acetobacter

Lớp sợi ngoại bào tạo thành các dãy.

Achromobacter

Sợi

Aerobacter

Sợi

Agrobacterium

Sợi ngắn.

Alcaligen

Sợi

Pseudomonas

Các sợi khơng tách biệt.

Rhizobium

Sợi ngắn.

Sarcina

Cellulose dị hình.

Zoogloea

Chƣa xác định rõ cấu trúc.
[18].

Acetobacter xylinum (A.aceti ssp. xylinum, A. xylinus), là vi sinh vật tạo
cellulose hữu hiệu nhất. Gần đây, nó đƣợc xếp vào giống mới Gluconacetobacter,
bao gồm các loài là G. xylinus, G. hansenii, G. europaeus, G. oboediens và G.


intermedius)[18]. Những nghiên cứu về cellulose vi khuẩn tập trung vào đối tƣợng
A. xylinum cả về nghiên cứu cơ bản và các ứng dụng rộng rãi [39].
2.1.2 Sơ lƣợc về vi khuẩn Acetobacter xylinum
2.1.2.1 Phân loại
Theo Bergey, A. xylinum thuộc hệ thống phân loại sau:
Lớp: Schizomycetes
Bộ: Pseudomonadales
Bộ phụ: Pseudomonadieae
Họ: Pseudomonadaceae
Loài: Acetobacter xylinum [14]
2.1.2.2 Đặc điểm về hình thái

Hình 2.1. Acetobacter xylinum [55]

A. xylinum có dạng hình que, thẳng hay hơi cong, có thể di động hoặc khơng
di động và khơng sinh bào tử. Tế bào A. xylinum đứng riêng lẽ hoặc kết thành chuỗi
dài, có khả năng tạo váng dày trên môi trƣờng nuôi cấy [4].
2.1.2.3

Đặc điểm sinh lý và sinh hóa của A. xylinum

A. xylinum là vi khuẩn Gram âm, nhƣng đặc điểm Gram của chúng có thể bị
biến đổi do tế bào già đi hay do điều kiện môi trƣờng. A. xylinum thuộc loại vi


khuẩn hiếu khí bắt buộc, nên chúng tăng trƣởng ở bề mặt tiếp xúc giữa môi trƣờng
lỏng và môi trƣờng khí [3],[30],[34].
Chúng khơng sử dụng muối NH4 làm nguồn N duy nhất, đồng thời trên bề mặt
môi trƣờng dịch thể tạo thành màng dày nhầy, có chứa cellulose [11]. Ngồi ra, A.
xylinum tạo: (1) phản ứng catalase dƣơng tính, (2) oxy hóa ethanol thành CO2 và
H2O, (3) khơng tăng trƣởng trên môi trƣờng Hoyer, (4) không tạo sắc tố nâu, (5)
tổng hợp cellulose [3],[30].
A. xylinum có thể sử dụng nhiều nguồn đƣờng khác nhau và tùy thuộc vào chủng
mà nguồn đƣờng nào đƣợc sử dụng tốt nhất. Chúng có thể chuyển glucose thành
acid gluconic, điều này làm cho pH môi trƣờng giảm từ 1 đến 2 đơn vị [34].
Nhiệt độ tối ƣu để A. xylinum phát triển là từ 25 đến 30oC và pH từ 5,4 đến
6,3 [30]. Theo Hestrin (1947), pH tối ƣu của A. xylinum là 5,5 và chúng không phát
triển ở nhiệt độ 37oC ngay cả trong môi trƣờng dinh dƣỡng tối ƣu [27].
Khi nuôi trên môi trƣờng đặc, lúc tế bào còn non, khuẩn lạc mọc riêng rẽ,
nhầy và trong suốt, xuất hiện sau 3 đến 5 ngày. Khi già, tế bào mọc dính nhau thành
từng cụm và khuẩn lạc mọc theo đƣờng nuôi cấy [7].
2.1.3

Các đặc điểm của cellulose vi khuẩn (bacterial cellulose – BC)

2.1.3.1

Đặc điểm về cấu trúc của BC

Cellulose là một polymer không phân nhánh bao gồm những gốc
glucopyranose nối với nhau bởi nối β-1,4. Các nghiên cứu cơ bản về BC cho thấy,
BC có cấu trúc hóa học giống y hệt PC (plant cellulose – cellulose thực vật). Tuy
nhiên, cấu trúc đa phân và thuộc tính của BC khác với PC. Các sợi mới sinh ra của
BC kết lại với nhau để hình thành nên các sợi sơ cấp (subfibril), có chiều rộng
khoảng 1,5nm, là những sợi mảnh nhất có nguồn gốc tự nhiên. Các sợi cơ bản kết
lại thành các vi sợi (microfibril). Các vi sợi nằm trong các bó (bundle), và cuối cùng
hình thành các dải (ribbon). Trong khi chiều rộng của các sợi cellulose đƣợc tạo ra
từ gỗ thông là 30.000 – 75.000 nm hay gỗ bulô (Betula) là 14.000 – 40.000 nm
(hình 2.3). Những dải vi sợi cellulose mịn có chiều dài thay đổi từ 1 – 9 µm làm


hình thành nên cấu trúc lƣới dày đặc, đƣợc ổn định bởi các nối hydrogen
[5],[18],[29].
BC khác PC về chỉ số kết chặt, về mức độ polymer hóa. BC có mức độ
polymer hóa từ 2.000 – 6.000; một vài trƣờng hợp đạt tới 16.000 – 20.000, trong
khi mức polymer hóa ở thực vật là 13.000 – 14.000. So với PC, BC có độ kết tinh
cao hơn, thấm nƣớc tốt hơn, sức bền cơ học ở trạng thái ẩm cao hơn và dễ uốn nắn
hơn [5],[18],[29]. BC đƣợc hình thành qua một quá trình phức tạp gồm nhiều giai
đoạn, cho sản phẩm có kích thƣớc khác nhau theo sơ đồ sau:
Sợi sơ cấp-subfibril

vi sợi-microfibril

(rộng 1,5 nm)

(rộng 3,0-3,5nm)

bó-bundle

dải-ribbon [37]
(rộng 40-60nm)

Cấu trúc của BC phụ thuộc chặt chẽ vào điều kiện nuôi cấy. Ở điều kiện nuôi
cấy tĩnh. Vi khuẩn tổng hợp những miếng cellulose trên bề mặt của dịch nuôi cấy,
tại ranh giới giữa bề mặt dịch lỏng và khơng khí giàu oxy. Các miếng BC này đƣợc
gọi là BC trên môi trƣờng tĩnh (S-BC: Static BC). Các sợi cellulose sơ cấp liên tục
đƣợc đẩy ra từ những lỗ đƣợc xếp dọc trên bề mặt của tế bào vi khuẩn, kết tinh lại
thành các vi sợi, và đẩy xuống sâu hơn trong môi trƣờng dinh dƣỡng. Các dải
cellulose từ môi trƣờng tĩnh tạo nên các mặt phẳng song song nhƣng khơng tổ chức,
có vai trò chống đỡ cho quần thể tế bào A. xylinum. Các sợi BC kế nhau đƣợc tạo ra
từ môi trƣờng tĩnh nối với nhau và bẻ nhánh ít hơn các sợi BC đƣợc tạo từ môi
trƣờng lắc (A-BC: Agitated-BC). A-BC đƣợc tạo ra dƣới dạng các hạt nhỏ, các hạt
hình sao và các sợi dài, chúng phân tán rất tốt trong môi trƣờng. Các sợi đan lƣới
với nhau trong mơi trƣờng lắc giống nhƣ mơ hình kẻ ơ, có cả hai hƣớng song song
và vuông gốc [5],[18].
Sự khác nhau về cấu trúc không gian ba chiều của hai dạng S-BC và A-BC
đƣợc quan sát rõ ràng hơn bằng kính hiển vi điện tử quét (scanning electron
microscope). Những sợi S-BC kéo dài và chồng trên các sợi khác theo chiều đan
chéo nhau. Những sợi A-BC thì rối rắm và cong (hình 2.2) [36]. Ngồi ra, bề mặt
cắt ngang của sợi A-BC (0,1-0,2µm) lớn hơn sợi S-BC (0.05 – 0.10µm). Sự khác


nhau về hình thái giữa hai loại BC này làm mức độ kết tinh, kích cỡ kết tinh của
chúng khác nhau [5],[17].

Hình 2.2. A-BC đƣợc tạo ra từ mơi trƣờng lắc (a) và S-BC đƣợc tạo ra từ môi
trƣờng tĩnh (b) [36].
Hai dạng kết tinh phổ biến của cellulose trong tự nhiên là I và II, đƣợc phân
biệt bởi các kỹ thuật phân tích bằng tia X, quang phổ, và tia hồng ngoại. Cellulose I

có thể đƣợc chuyển thành cellulose II, nhƣng cellulose II thì khơng thể chuyển
thành cellulose I.
Cellulose I đƣợc tổng hợp bởi đa số thực vật và A. xylinum ở môi trƣờng tĩnh.
Các chuỗi β-1,4-glucan ở cellulose I đƣợc sắp xếp song song với nhau theo một
trục. Trong khi đó, các chuỗi β-1,4-glucan ở cellulose II thì xếp một cách ngẫu
nhiên, hầu nhƣ không song song và nối với nhau bởi một số lƣợng lớn nối
hydrogen, làm cho cellulose II có độ bền về nhiệt. Rất ít tế bào Eukaryota tổng hợp
cellulose II. A. xylinum thì tổng hợp đƣợc cả 2 loại cellulose I và II [18],[19]. Trong
phân tử cellulose I có sự hiện diện của Iα và Iβ, do đƣợc cấu tạo bởi glucose dạng α
hay dạng β. Dạng Iβ bền về nhiệt động học hơn [19]. Glucose dạng α và glucose
dạng β là hai dạng đồng phân không gian của nhau. Hai dạng đồng phân này chỉ


khác nhau ở sự định hƣớng của nhóm hydroxyl [6]. Hai dạng này có ở các cellulose
có nguồn gốc từ tảo, vi khuẩn , thực vật. BC có dạng Iα nhiều hơn PC.
S-BC có nhiều dạng Iα hơn A-BC. Sự khác nhau về tỉ lệ Iα giữa hai loại S-BC và
A-BC làm phóng đại các chỉ số kết tinh, chỉ số Iα tỉ lệ thuận với kích cỡ kết tinh. ABC có chỉ số kết tinh thấp hơn và kích cỡ kết tinh nhỏ hơn S-BC [5],[18].
Một phần đáng kể cellulose II có ở A-BC. Trong tự nhiên, cellulose II chỉ đƣợc
tổng hợp ở một vài vi sinh vật (một số tảo, mốc, và vi khuẩn nhƣ Sarcina ventriculi,
A. xylinum). Hiện nay, sản phẩm công nghiệp của cellulose II chủ yếu có đƣợc là
dựa trên sự biến đổi hóa học cellulose thực vật [18].

(a)
Tế bào vi khuẩn

(b)
Cellulose của thực vật

Hình 2.3. Cấu trúc của cellulose (a) Cellulose vi khuẩn (x 20000) và (b) cellulose
của thực vật (x200) [53].

2.1.3.2 Chức năng sinh lý của cellulose đối với A. xylinum
A. xylinum là vi khuẩn khơng có khả năng quang hợp. Trong mơi trƣờng tự
nhiên, đa số vi khuẩn tổng hợp các polysaccharide ngoại bào để hình thành nên lớp
vỏ bao quanh tế bào, màng BC là một ví dụ. Những tế bào vi khuẩn sản xuất
cellulose đƣợc bẫy bên trong mạng lƣới polymer. Mạng lƣới này là vật chống đỡ
cho quần thể vi sinh vật luôn ở bề mặt tiếp giáp giữa mơi trƣờng lỏng và khơng khí


(hình 2.3a). Vì vậy, các chủng vi khuẩn sản xuất BC có thể sống ở những nơi cống
rãnh. Hệ thống lƣới polymer làm cho các tế bào có thể bám chặt trên bề mặt môi
trƣờng và làm tế bào thâu nhận chất dinh dƣỡng một cách dễ dàng hơn so với khi tế
bào ở trong mơi trƣờng lỏng khơng có mạng lƣới cellulose.
Một vài tác giả cho rằng, cellulose đƣợc tổng hợp bởi A. xylinum cịn đóng vai
trị tích trữ và có thể đƣợc sử dụng khi vi sinh vật này bị thiếu nguồn dinh dƣỡng.
Sự phân hủy cellulose đƣợc xúc tác bởi enzyme exo-glucanase hay endo-glucanase,
sự hiện diện cả hai loại enzyme này đƣợc phát hiện trong dịch nuôi cấy một vài
chủng A. xylinum sản xuất cellulose [18].
Nhờ vào tính dẻo và tính thấm nƣớc của các lớp cellulose mà các tế bào vi
khuẩn kháng lại đƣợc những thay đổi bất lợi trong môi trƣờng sống nhƣ giảm lƣợng
nƣớc, thay đổi pH, xuất hiện các chất độc, và các vi sinh vật gây bệnh. Các vi khuẩn
A. xylinum có thể tăng trƣởng và phát triển bên trong lớp vỏ bao. Cellulose bao
quanh tế bào vi khuẩn bảo vệ chúng khỏi tia cực tím. Khoảng 23% tế bào A.
xylinum đƣợc bao BC sống sót sau 1 giờ xử lý tia cực tím. Tách BC khỏi tế bào, khả
năng sống của tế bào giảm đáng kể, chỉ còn 3% [5],[18].
2.1.3.3 Sinh tổng hợp BC
A. xylinum là vi khuẩn khơng có khả năng quang hợp. Chúng có thể sử dụng
nguồn carbon là các monosaccharide, cụ thể là D-glucose để tạo ra cellulose ngoại
bào chỉ trong vài ngày. Trong môi trƣờng nuôi cấy tĩnh, A. xylinum tạo ra màng
cellulose ngay trên bề mặt tiếp xúc giữa mơi trƣờng và khơng khí. Q trình tổng
hợp BC đã đƣợc chứng minh gồm 5 giai đoạn cơ bản do 5 enzyme khác nhau xúc

tác tạo thành để chuyển hóa dần cơ chất ban đầu là D-glucose thành UDP-glucose
qua các sản phẩm trung gian là glucose-6-phosphat và glucose-1-phasphat. Sau đó,
sản phẩm cuối UDP-glucose sẽ đƣợc liên kết tạo chuỗi polymer bởi enzyme
cellulose synthase (hình 2.4, 2.5).


5-ketogluconate
D-Glucose Gluconate 2-ketogluconate

GDH

1

GADH

2,5-ketogluconate

2-KGDH

1- glucose permease
2- glucokinase

Glucose

2

Glucose-6-P

6-PG

3
Glucose-1-P
UDP-glucose

Entner-Doudoroff

route
Glycolysis

4

5

3- phosphoglucomutase

Gluconate

Chu trình pentose
phosphate

4- UDP- glucose
pyrophosphorylase
5- cellulose synthase

Chu trình
Krebs

Cellulose
Hình 2.4. Vị trí – q trình biến dƣỡng carbon và tổng hợp cellulose ở A.
Xylinum [20].

Hình 2.5. Con đƣờng dự đốn của q trình sinh tổng hợp và tiết ra
cellulose khi glucose đƣợc tế bào A. xylinum hấp thụ từ bên ngoài [53].


Vị trí hình thành cellulose ở chu chất (giữa màng ngoài và màng tế bào chất).
Sợi cellulose đƣợc tiết ra ngoại bào nhờ các cấu trúc lỗ trên màng tế bào vi khuẩn.
Các phức hợp tổng hợp cellulose gọi là TC-terminal complex phân bố thành hàng
ngang ở chu chất có vai trị chuyển hóa tiếp UDP-glucose thành cellulose. Đầu tiên,
từ phức hợp chỉ tạo ra đƣợc chuỗi gồm 6-8 glucan đƣợc gọi là sợi sơ cấp (subfibril),
sau đó các sợi sơ cấp kết lại thành vi sợi có kích thƣớc lớn hơn (microfibril), kế tiếp
các vi sợi này sẽ gắn kết với nhau thành các dải ribbon. Cuối cùng, các dải ribbon
này tụ họp hình thành nên màng cellulose [21]. Q trình đó đƣợc mơ tả qua hình
2.6
Cellulose I

Cellulose II

Màng sinh chất
Lớp vỏ lipopolisaccarit

Cellulose Synthase

Vi sợi Cellulose

Cấu tử tạo
Cellulose

Tiền sợi

Hình 2.6. Sự tổng hợp vi sợi bởi Acetobacter xylinum (Iguchi et al, 2000) [31].
Sinh tổng hợp BC là một tiến trình bao gồm nhiều bƣớc đƣợc điều hịa một
cách chun biệt và chính xác, liên quan đến một số lớn enzyme, các phức hợp xúc
tác và các protein điều hòa. Tiến trình này bao gồm sự tổng hợp uridine
diphosphoglucose (UDPGlc), tiền chất của cellulose, tiếp đến là sự polymer hóa
glucose vào chuỗi β-1,4-glucan, và sự kết hợp các sợi mới vào dải (ribbon), đƣợc


hình thành từ hàng trăm, thậm chí hàng ngàn sợi cellulose riêng lẽ. Con đƣờng và
cơ chế của sự tổng hợp UDPGlc tƣơng đối đƣợc biết nhiều, trong khi đó cơ chế
phân tử của sự polymer hóa glucose vào mạch dài và các mạch nhánh, sự đẩy ra bên
ngoài tế bào của chúng và sự kết hợp thành sợi cần đƣợc làm sáng tỏ hơn [18].
Cellulose đƣợc tổng hợp từ A. xylinum là sản phẩm cuối cùng của sự biến dƣỡng
carbon, phụ thuộc vào trạng thái sinh lý tế bào liên quan đến hoặc là chu trình
pentose phosphate hoặc là chu trình Krebs, đi kèm với quá trình sinh tạo glucose
(hình 2.7). Q trình glycose giải khơng hoạt động ở vi khuẩn acid acetic bởi vì nó
khơng tổng hợp đƣợc enzyme quan trọng của con đƣờng này đó là phosphofructose
kinase. Ở A. xylinum, sự tổng hợp cellulose liên hệ chặt chẽ với tiến trình dị hóa
oxid hóa và tiêu thụ khoảng 10% năng lƣợng có nguồn gốc từ những phản ứng dị
dƣỡng. Sự tổng hợp BC không gây trở ngại cho các q trình đồng hóa khác, bao
gồm sự tổng hợp protein [18].
A. xylinum chuyển nhiều phức hợp carbon nhƣ: hexose, glycerol, pyruvate,
dihydroxyacetone, và các dicarboxylic acid thành cellulose, thƣờng có hiệu suất
50%. Dicarboxylic acid đi vào chu trình Krebs nhờ q trình decarboxyl hóa để
thành pyruvate, chuyển thành hexose thông qua con đƣờng sinh tạo glucose, tƣơng
tự đối với glycerol, dihydroxyacetone và các hợp chất trung gian của chu trình
pentone phosphate [18]. Con đƣờng chuyển hóa carbon của A. xylinum đƣợc mơ tả
chi tiết qua hình 2.7.
Tiền chất trực tiếp của cellulose là UDPGlc (uridine diphosphoglucose), là sản
phẩm của con đƣờng phổ biến ở các sinh vật, bao gồm cả thực vật, liên quan tới sự

phosphoryl hóa glucose thành glucose-6-phosphate, đƣợc xúc tác bởi glucokinase,
tiếp đến là quá trình đồng phân hóa hợp chất này thành glucose-α-1-phosphate,
đƣợc xúc tác bởi photphoglucomutase và cuối cùng chuyển thành UDPGlc bởi
enzyme UDPGlc pyrophosphorylase. Enzyme cuối cùng này dƣờng nhƣ quan trọng
liên quan đến quá trình tổng hợp BC. Một vài đột biến không tổng hợp cellulose
(Cel-) thiếu enzyme này (Valla và cộng sự, 1989). Hơn nữa, hoạt động của
pyrophosphorylase thay đổi ở những chủng A. xylinum khác nhau và hoạt động cao


nhất đƣợc phát hiện ở các sinh vật tổng hợp cellulose hữu hiệu nhất, nhƣ là A.
xylinum ssp. sucrofermentans BPR2001. Chủng này thích sử dụng fructose hơn,
biểu lộ sự hoạt động cao của phosphoglucoisomerase, và có một hệ thống
phosphotransferase. Hệ thống này chuyển fructose thành fructose-1-phosphate và
tiếp đến là fructose-1,6-biphosphate [5], [18].

Chu
trình
Krebs

Hình 2.7. Con đƣờng chuyển hóa carbon của Acetobacter xylinum [5],[39].


PTS: hệ thống chuyển đổi phospho

GK: glucokinase

IPFK: frurose-1-phosphate kinase

PGM: phosphoglucomutase

Glc-6-P: glucose-6-phosphate

UGP: pyrophosphorylase UDPGlc

Glc-1-P: glucose-1-phosphate

CS: cellulose synthase

Fru-6-P: frutose-6-phosphate

PGI: phosphoglucomutase

Fru-bi-P: frutose-1,6-bi-phosphate

FK: frutokinase

UDPGlc: uridine diphosphoglucose

FBP: frutose-1,6-biphosphate phosphatase

PGA: phosphogluconic acid

G6PDH: glucose-6-phosphate dehydrogenase

2.1.4 Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình tạo BC
Chất lƣợng và năng suất của BC đƣợc tạo ra phụ thuộc rất nhiều yếu tố nhƣ sau:
2.1.4.1 Ảnh hƣởng bởi phƣơng pháp lên men
Ngày nay, sản xuất BC đƣợc thực hiện bằng nhiều phƣơng pháp lên men khác
nhau nhƣ nuôi cấy lắc, nuôi cấy tĩnh trên khay… Việc lựa chọn phƣơng pháp nào để
thực hiện là tùy thuộc vào định hƣớng ứng dụng vì sản phẩm BC sẽ có đặc tính hóa

lý và cấu trúc khác nhau ứng với từng phƣơng pháp khác nhau [17].
Khi nuôi cấy tĩnh hay bề mặt, màng BC (S-BC) đƣợc tích lũy trên bề mặt mơi
trƣờng ni. S-BC thƣơng mại thông dụng nhƣ Nata-de Coco, màng rung truyền âm
thanh, làm màng trị bỏng… Cịn khi ni cấy lắc thì BC (A-BC) sẽ có dạng sợi
huyền phù, hay dạng khối khơng đồng nhất (dạng hột nhỏ, hoặc hình cầu, hình elip).
Kiểu ni này thích hợp hơn cho sản xuất BC công nghiệp và cho các ứng dụng
khác của A-BC nhƣ: mỹ phẩm, vật liệu, chất nhũ hóa… Kiểu lên men BC này chƣa
đƣợc nghiên cứu và tiến hành ở Việt Nam [5].
Theo các nhà nghiên cứu thì phƣơng pháp ni cấy chìm cho hiệu suất sinh tổng
hợp BC cao hơn vì các thiết bị lên men chìm có thể cung cấp tốt lƣợng oxy cho tế
bào hoạt động. Đồng thời BC này cịn có khả năng giữ nƣớc cao hơn từ phƣơng
pháp tĩnh. Tuy nhiên, trở ngại ở đây là thƣờng phát sinh các chủng đột biến Celmột cách ngẫu nhiên sau thời gian lên men. Các chủng Cel- này sẽ khơng cịn khả
năng sản sinh BC nữa, vì thế làm hiệu suất BC giảm đáng kể sau đó