Nghiên cứu thu nhận cellulose vi khuẩn làm chất mang trong kỹ thuật cố định tế bào vi sinh vật

Đại Học Quốc Gia Tp. Hồ Chí Minh
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

[\

ĐÀO NGỌC CHÂU

NGHIÊN CỨU THU NHẬN
CELLULOSE VI KHUẨN LÀM CHẤT
MANG TRONG KỸ THUẬT CỐ ĐỊNH TẾ
BÀO
VI SINH VẬT
Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
Mã số ngành: 60 42 80

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Niên khóa 2006-2008
TP. HỒ CHÍ MINH, tháng 07 năm 2008

HVTH: Đào Ngọc Châu


CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HỒ CHÍ MINH.

Cán bộ hướng dẫn khoa học: TS. NGUYỄN THÚY HƯƠNG.
(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị và chữ ký)

Cán bộ chấm nhận xét 1: ..................................................................................

(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị và chữ ký)

Cán bộ chấm nhận xét 2: ..................................................................................
(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị và chữ ký)

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại HỘI ĐỒNG CHẤM BẢO VỆ LUẬN VĂN
THẠC SĨ.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA, ngày 10 tháng 07 năm 2008.

HVTH: Đào Ngọc Châu


ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHIÃ VIỆT NAM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
Độc Lập - Tự Do - Hạnh Phúc
------------------oOo--Tp. HCM, ngày 10 tháng 7 năm 2008.

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ
Họ và tên học viên: ĐÀO NGỌC CHÂU

Giới tính : Nữ.

Ngày, tháng, năm sinh : 15/10/1983

Nơi sinh : Bạc Liêu

Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học.
Khoá (Năm trúng tuyển) : 2006.
1- TÊN ĐỀ TÀI: Nghiên cứu thu nhận cellulose vi khuẩn làm chất mang

trong kỹ thuật cố định tế bào vi sinh vật.
2- NHIỆM VỤ LUẬN VĂN:
-

Tối ưu hóa mơi trường và điều kiện nuôi cấy để thu nhận bacterial
cellulose.

-

Ứng dụng BC làm vật liệu trong kỹ thuật cố định nấm men
Saccharomyces cerevisiae, thực hiện cố định bằng 2 phương pháp:
phương pháp bẫy hấp phụ và phương pháp nhốt.

3- NGÀY GIAO NHIỆM VỤ : tháng 1 năm 2008
4- NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ : tháng 07 năm 2008
5- HỌ VÀ TÊN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN : TS. NGUYỄN THÚY
HƯƠNG.
Nội dung và đề cương Luận văn thạc sĩ đã được Hội Đồng Chuyên Ngành
thông qua.
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

CHỦ NHIỆM BỘ MÔN

(Họ tên và chữ ký)

QUẢN LÝ CHUYÊN NGÀNH
(Họ tên và chữ ký)

HVTH: Đào Ngọc Châu

LỜI CẢM ƠN!
Xin chân thành cảm ơn đến Thầy Cô trong bộ môn Công
nghệ Sinh học đã tạo điều kiện cho tơi và các bạn của tơi hồn
thành luận văn tốt nghiệp.
Châu xin cảm ơn Cô: TS. Nguyễn Thúy Hương – Một người
Thầy rất gần gũi, tận tình chỉ bảo và thương yêu học trò. Châu
học hỏi được nhiều điều hay ở Cô về nhiệt huyết, tinh thần trách
nhiệm trong cơng việc, về sự bao dung và tình u thương đối với
mọi người. Cô à! Châu sẽ nhớ Cô nhiều lắm đó!
Xin cảm ơn các bạn CH2006 đã ln giúp đỡ, quan tâm
trong suốt thời gian tôi học tập tại lớp.
Con (em) xin cảm ơn gia đình và gia đình chồng đã luôn
quan tâm, ủng hộ con (em) trong quá trình con đi học. Cảm ơn
em gái – Út Châu ln ủng hộ và thương u, quan tâm và chăm
sóc tôi trong suốt thời gian tôi thực hiện luận văn.
Cảm ơn anh, Ơng Xã của bé! Anh chính là nguồn động viên
to lớn, là động lực để bé phấn đấu, là chỗ dựa tinh thần vững
chắc... Mình sắp được gặp nhau rồi Xã à! Anh hãy ráng đợi bé
nha!

HVTH: Đào Ngọc Châu


TÓM TẮT
Cellulose vi khuẩn – BC được biết đến với nhiều khả năng ứng dụng trong các
lĩnh vực kỹ thuật, công nghệ vật liệu, y khoa… Bên cạnh những ứng dụng đó, trong
đề tài nghiên cứu này BC sẽ được biết đến với vai trò làm chất mang trong kỹ thuật
cố định vi sinh vật. Đối tượng được chúng tôi lựa chọn cố định trên chất mang BC

là Saccharomyces cerevisiae 28. Trước khi lên men thu nhận và tiến hành xử lý BC,
chúng tơi thực hiện tối ưu hóa pH và môi trường lên men nhằm thu nhận được
lượng BC tối ưu. pHopt của chủng Acetobacter xylinum BC16 được chúng tôi ghi
nhận tại pH = 4.4 và môi trường lên men BC tối ưu với nồng độ glucose, (NH4)2SO4
và (NH4)2HPO4 lần lượt là 20g/l, 8g/l và 2g/l môi trường nước dừa già. BC trở
thành chất mang cố định tế bào nấm men bằng 2 phương pháp: bẫy – hấp phụ và
nhốt chủ động. Chế phẩm BC với kích thước 2cmx2cm, chế độ lắc 200 vòng/phút
và thời gian ủ 2 ngày của phương pháp bẫy – hấp phụ đã cố định lượng lớn tế bào
nấm men với mật độ 9,251x106 tế bào/cm3; đồng thời chế phẩm này được sử dụng
khảo sát biến động của quá trình lên men rượu. Với phương pháp nhốt chủ động,
BC sau xử lý có dạng hình tròn với Ø = 11cm, bề dày là 2mm đã cố định được
1,102x107 tế bào/cm3. Hiệu quả sử dụng chế phẩm Saccharomyces cerevisiae 28 cố
định trên chất mang BC trong giai đoạn lên men (số lần tái sử dụng) là 8 lần mà vẫn
đảm bảo hoạt tính sinh học của nấm men.

HVTH: Đào Ngọc Châu


Abstract
Bacterial Cellulose (BC) is known with many applications in material
technology, and medical field… Beside those applications, BC in this project will
be known as a carrier in the immobilizing bacterial cell technology. Saccharomyces
cerevisiae 28 is the object that we chose for immobilization using the BC carrier.
Before fermenting, gathering and treating BC, we brought the pH concentration and
fermentative environment into the optimized level where we could collect the most
BC. pHopt concentration of Acetobacter xylinum BC16 strain was collected at pH =
4.4, and the optimized level of fermentative environment was found in juice of old
coconut with glucose concentration, (NH4)2SO4 and (NH4)2HPO4 respectively was
20g/l, 8g/l, and 2g/l. BC became the carrier immobilizing yeasts by 2 methods: trap
– absorb and active confinement. In trap – absorb method, BC preparation with size

2cm x 2cm, agitator at 200 cycle/min, and incubation time in 2 days had
immobilized a huge amount of yeasts with density 9,251x106 cells/cm3; also, this
preparation was used for testing the fluctuation of the alcoholic fermentation. In
active confinement method, BC after treatment had circle shape with diameter was
11 cm, and the thickness was 2mm. This BC had immobilized 1,102x107 cells/cm3.
The effect of using Saccharomuces cerevisiae 28 preparation for immobilizing the
BC carrier in the fermentative process could be up to 8 times, and still keep the
biology properties of the yeast.

HVTH: Đào Ngọc Châu


MỤC LỤC
Mục lục

Trang

Chương 1 – MỞ ĐẦU
Mở đầu ....................................................................................................................1
Chương 2 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Giới thiệu về cellulose vi khuẩn (BC) và Acetobacter xylinum .........................2
2.1.1 Các vi sinh vật sản sinh BC ............................................................................2
2.1.2 Sơ lược về vi khuẩn Acetobacter xylinum ......................................................3
2.1.3 Các đặc điểm của cellulose vi khuẩn (bacterial cellulose – BC) ....................4
2.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tạo BC ...................................................13
2.1.5 Nước dừa già -Nguyên liệu dùng để nuôi A. xylinum nhằm thu nhận BC ......16
2.1.6 Các nghiên cứu về A.xylinum ..........................................................................17
2.2 Kỹ thuật cố định tế bào vi sinh vật .....................................................................19
2.2.1 Sơ lược về kỹ thuật cố định tế bào vi sinh vật ................................................19
2.2.2 Các phương pháp cố định ................................................................................20

2.2.3 Ưu điểm của vi sinh vật cố định với vi sinh vật tự do ....................................23
2.2.4 Chất mang trong kỹ thuật cố định tế bào vi sinh vật ......................................23
2.3 Tính chất của chất mang BC ..............................................................................25
Chương 3 – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
3.1 Địa điểm và thời gian thực hiện .........................................................................27
3.2 Vật liệu ...............................................................................................................27
3.3 Phương pháp nghiên cứu ....................................................................................30
3.3.1 Sơ đồ nghiên cứu .........................................................................................30
3.3.2 Khảo sát giống A. xylinum ...........................................................................31
3.3.3 Phương pháp giữ giống và nhân giống ........................................................31
3.3.4 Phương pháp thu nhận BC ...........................................................................32

HVTH: Đào Ngọc Châu


3.3.5 Phương pháp quy hoạch thực nghiệm .........................................................33
3.3.6 Xác định trọng lượng BC khô .....................................................................35
3.3.7 Phương pháp xử lý cellulose vi khuẩn tươi khi thu hoạch ..........................36
3.3.8 Phương pháp xác định mật độ tế bào được cố định trên chất mang BC .....37
3.3.9 Phương pháp hóa lý .....................................................................................37
3.3.10 Nghiên cứu các phương pháp và điều kiện cố định S. cerevisiae
trên chất mang BC .....................................................................................37
3.3.11 Nghiên cứu các biến động trong quá trình lên men rượu ..........................40
Chương 4 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Một số đặc điểm sinh học của chủng Acetobacter xylinum BC16
khảo sát trong đề tài............................................................................................42
4.2 Tối ưu hóa mơi trường và điều kiện ni cấy để thu nhận BC...........................44
4.2.1 Tối ưu hóa pH mơi trường lên men.............................................................45
4.2.2 Tối ưu hóa mơi trường.................................................................................46
4.3 Ứng dụng BC làm vật liệu trong kỹ thuật cố định nấm men

Saccharomyces cerevisiae 28 ...............................................................................50
4.3.1 Xử lý BC trước khi cố định vi sinh vật lên chất mang.................................50
4.3.2 Khảo sát quá trình cố định trên chất mang BC bằng phương pháp
bẫy - hấp phụ................................................................................................51
4.3.3 Cố định tế bào nấm men S. cerevisiae 28 lên chất mang BC bằng
phương pháp nhốt chủ động...........................................................................55
4.4 Khả năng ứng dụng của nấm men cố định bằng chất mang BC trong
lên men rượu.......................................................................................................58
Chương 4 – KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
5.1 Kết luận ...............................................................................................................64
5.2 Kiến nghị .............................................................................................................65
Tài liệu tham khảo ..................................................................................................66

HVTH: Đào Ngọc Châu


DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình

Trang

1. Hình 2.1. Acetobacter xylinum ...........................................................................3
2. Hình 2.2. A-BC được tạo ra từ môi trường lắc (a) và S-BC được tạo ra
từ môi trường tĩnh (b) .........................................................................................6
3. Hình 2.3. Cấu trúc của cellulose (a) Cellulose vi khuẩn (x 20000) và (b)
cellulose của thực vật (x200) ..............................................................................7
4. Hình 2.4. Vị trí – q trình biến dưỡng carbon và tổng hợp cellulose ở
A. xylinum .............................................................................................................9
5. Hình 2.5. Con đường dự đốn của q trình sinh tổng hợp và tiết ra cellulose

khi glucose được tế bào A. xylinum hấp thụ từ bên ngồi .................................9
6. Hình 2.6. Sự tổng hợp vi sợi bởi Acetobacter xylinum ......................................10
7. Hình 2.7. Con đường chuyển hóa carbon của Acetobacter xylinum ..................12
8. Hình 2.8. Bacterial cellulose ở điều kiện ni cấy tĩnh .....................................14
9. Hình 2.9. Bacterial cellulose ở điều kiện ni cấy lắc .......................................14
10. Hình 2.10. Sơ đồ các chất mang trong việc cố định tế bào...............................24
11. Hình 3.1. Sơ đồ tiến trình nghiên cứu .............................................................30
12. Hình 3.2. Sơ đồ thu nhận BC ...........................................................................32
13. Hình 3.3. Sơ đồ xử lý BC .................................................................................36
14. Hình 4.1. Hình ảnh vi thể của A. xylinum BC16 .............................................42
15. Hình 4.2. Hình ảnh đại thể A. xylinum BC16 trên môi trường đặc ..................43
16.Hình 4.3. Màng BC trên mơi trường lỏng .........................................................43
17. Hình 4.4. Màng BC trước khi xử lý .................................................................50
18. Hình 4.5. Màng BC sau khi xử lý ..........................................................................50
19. Hình 4.6. Nấm men cố định trên chất mang BC ..............................................55
20. Hình 4.7. Nấm men cố định trong chất mang BC ............................................55

HVTH: Đào Ngọc Châu


21. Hình 4.8. BC trước khi cố định bằng phương pháp nhốt..................................56
22. Hình 4.9. BC sau khi cố định bằng phương pháp nhốt .....................................56

HVTH: Đào Ngọc Châu


DANH MỤC BẢNG VÀ ĐỒ THỊ

I. DANH MỤC BẢNG

Trang

1. Bảng 2.1. Cấu trúc BC ở một số loài vi khuẩn ...............................................2
2. Bảng 2.2. Thành phần của nước dừa ..............................................................16
3. Bảng 2.3. Ưu, nhược điểm các phương pháp thông dụng để cố định tế bào .22
4. Bảng 4.1. Kết quả kiểm tra các đặc điểm sinh hóa ........................................44
5. Bảng 4.2. Trọng lượng BC thu được tại các pH .............................................45
6. Bảng 4.3. Các nhân tố quy họach thực nghiệm ..............................................47
7. Bảng 4.4. Mơ hình quy hoạch thực nghiệm trong điều kiện lên men tĩnh
(YT) và lên men lắc (YL) ....................................................................................48
8. Bảng 4.5. Kết quả thí nghiệm tại tâm .............................................................48
9. Bảng 4.6. Hệ số bj của phương trình hồi quy .................................................49
10. Bảng 4.7. Mật độ tế bào nấm men cố định trên chất mang qua các phương
pháp trong 30 phút đầu hấp phụ ...................................................................51
11. Bảng 4.8. Ảnh hưởng của thời gian ủ lên mật độ tế bào nấm men được cố
định trên chất mang BC .....................................................................................53
12. Bảng 4.9. So sánh phương pháp bẫy – hấp phụ và phương pháp nhốt
chủ động.............................................................................................................57
13. Bảng 4.10. Một số chỉ tiêu hóa lý trong lên men rượu..................................59
14. Bảng 4.11. So sánh các chất mang trong kỹ thuật cố định tế bào nấm men .62
II. DANH MỤC ĐỒ THỊ

Trang

1. Đồ thị 4.1. Ảnh hưởng của pH đến trọng lượng BC khô trên môi trường lên
men. ................................................................................................................46
2. Đồ thị 4.2. Mật độ vi khuẩn cố định trên BC với các kích thước khác nhau
và qua chế độ khuấy đảo khác nhau ...............................................................52

HVTH: Đào Ngọc Châu

3. Đồ thị 4.3. Ảnh hưởng của thời gian ủ lên mật độ tế bào nấm men ...............54
4. Đồ thị 4.4. So sánh độ rượu của dịch lên men giữa mẫu đối chứng và qua
các lần tái sử dụng chế phẩm ..........................................................................60
5. Đồ thị 4.5. So sánh chỉ số mật độ quang giữa mẫu đối chứng với các
lần tái sử dụng chế phẩm nấm men cố định....................................................60

HVTH: Đào Ngọc Châu


HVTH: Đào Ngọc Châu


CHƯƠNG 1 – MỞ

ĐẦU

Trong quá trình cố định vi sinh vật, vật liệu và phương pháp cố định là hai yếu
tố mang tính chất quyết định đến hiệu quả của việc cố định vi sinh vật. Trong đó,
đặc biệt tính chất của vật liệu cố định (hay còn gọi là chất mang) là cơ sở cho sự lựa
chọn phương pháp cố định. Trên thế giới, chất mang có tính chất là polymer tổng
hợp đã được nghiên cứu và sử dụng trong những thập niên 70 – 80 đa dạng với các
vật liệu như: Sephadex, polyacrylamid, polyvinylacetat, polystyren, polyetylen,
polyhydroxyetyl metacrylat… Tuy nhiên, ngoài những ưu điểm là bền, độ trương và
khả năng cố định tốt thì nhược điểm của những chất mang này là giá thành cao,
không tương hợp sinh học và khơng phân hủy sinh học được cho nên ít được sử
dụng [3]. Từ những nhược điểm polymer tổng hợp mang lại, polymer sinh học đã
được chú ý nghiên cứu và sử dụng với các sản phẩm như: chitin, chitosan,
alginate… Đây là những sản phẩm tự nhiên, phong phú, rẻ tiền và có khả năng phân

hủy sinh học nên thân thiện với mơi trường. Bên cạnh đó, nhược điểm mắc phải của
loại chất mang này là độ trương thấp, tính chất cơ lý kém bền và khơng đồng nhất.
Chính vì những lý do trên, việc nghiên cứu và tìm kiếm chất mang thay thế có
những ưu điểm ưu việt, đồng thời khắc phục những nhược điểm của những chất
mang trên là cần thiết. Cellulose vi sinh vật (hay còn gọi là microbial cellulose MC) hay cụ thể hơn cellulose vi khuẩn (bacterial cellulose - BC) là một loại
polymer sinh học được xem là nguồn nguyên liệu tiềm năng và đã được ứng dụng
rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như y học, thực phẩm [4],[25], công nghiệp
dệt [26], mỹ phẩm…[27]. Các nghiên cứu về tính chất hóa lý, cơ lý của BC cho
thấy BC đáp ứng được các yêu cầu lý tưởng của vật liệu cố định [17],[18],[50]. Đề
tài này nhằm tìm hiểu và mở ra một hướng ứng dụng mới của BC: “Nghiên cứu
thu nhận cellulose vi khuẩn làm chất mang trong kỹ thuật cố định tế bào vi sinh
vật”.

HVTH: Đào Ngọc Châu


HVTH: Đào Ngọc Châu


CHƯƠNG 2 – TỔNG

QUAN

2.1 Giới thiệu về cellulose vi khuẩn (BC) và Acetobacter xylinum.
2.1.1 Các vi sinh vật sản sinh BC
Ngồi thực vật, nấm và tảo có cellulose là thành phần cấu trúc cơ bản hình
thành nên vách tế bào, cellulose cịn được tổng hợp bởi một số lồi vi khuẩn, được
gọi là cellulose vi khuẩn (bacterial cellulose – BC) (bảng 2.1). Con đường tổng hợp
và cơ chế điều hòa tổng hợp BC ở các loài giống nhau, nhưng cấu trúc BC ở mỗi
lồi thì khác nhau [18]. Có các điểm khác biệt đáng kể về thuộc tính vật lý của các

sản phẩm cellulose, chủ yếu là chiều dài của chuỗi glucan (được đặc trưng bởi mức
độ polymer hóa), tính kết tinh và trạng thái kết tinh của nó. Tùy thuộc vào mỗi loại
mà trạng thái kết tinh của cellulose khác nhau. Từ đó tính chất vật lý của sản phẩm
như độ bền, độ hịa tan trong các dung mơi, tính chịu ảnh hưởng của các tác nhân
biến tính cũng khác nhau [43].
Bảng 2.1. Cấu trúc BC ở một số loài vi khuẩn.
Giống

Cấu trúc cellulose

Acetobacter

Lớp sợi ngoại bào tạo thành các dãy.

Achromobacter

Sợi

Aerobacter

Sợi

Agrobacterium

Sợi ngắn.

Alcaligen

Sợi

Pseudomonas

Các sợi khơng tách biệt.

Rhizobium

Sợi ngắn.

Sarcina

Cellulose dị hình.

Zoogloea

Chưa xác định rõ cấu trúc.
[18].

Acetobacter xylinum (A.aceti ssp. xylinum, A. xylinus), là vi sinh vật tạo
cellulose hữu hiệu nhất. Gần đây, nó được xếp vào giống mới Gluconacetobacter,
bao gồm các loài là G. xylinus, G. hansenii, G. europaeus, G. oboediens và G.

HVTH: Đào Ngọc Châu


intermedius)[18]. Những nghiên cứu về cellulose vi khuẩn tập trung vào đối tượng
A. xylinum cả về nghiên cứu cơ bản và các ứng dụng rộng rãi [39].
2.1.2 Sơ lược về vi khuẩn Acetobacter xylinum
2.1.2.1 Phân loại
Theo Bergey, A. xylinum thuộc hệ thống phân loại sau:
Lớp: Schizomycetes

Bộ: Pseudomonadales
Bộ phụ: Pseudomonadieae
Họ: Pseudomonadaceae
Loài: Acetobacter xylinum [14]
2.1.2.2 Đặc điểm về hình thái

Hình 2.1. Acetobacter xylinum [55]

A. xylinum có dạng hình que, thẳng hay hơi cong, có thể di động hoặc khơng
di động và khơng sinh bào tử. Tế bào A. xylinum đứng riêng lẽ hoặc kết thành chuỗi
dài, có khả năng tạo váng dày trên môi trường nuôi cấy [4].
2.1.2.3 Đặc điểm sinh lý và sinh hóa của A. xylinum
A. xylinum là vi khuẩn Gram âm, nhưng đặc điểm Gram của chúng có thể bị
biến đổi do tế bào già đi hay do điều kiện môi trường. A. xylinum thuộc loại vi

HVTH: Đào Ngọc Châu


khuẩn hiếu khí bắt buộc, nên chúng tăng trưởng ở bề mặt tiếp xúc giữa môi trường
lỏng và môi trường khí [3],[30],[34].
Chúng khơng sử dụng muối NH4 làm nguồn N duy nhất, đồng thời trên bề mặt
môi trường dịch thể tạo thành màng dày nhầy, có chứa cellulose [11]. Ngồi ra, A.
xylinum tạo: (1) phản ứng catalase dương tính, (2) oxy hóa ethanol thành CO2 và
H2O, (3) khơng tăng trưởng trên môi trường Hoyer, (4) không tạo sắc tố nâu, (5)
tổng hợp cellulose [3],[30].
A. xylinum có thể sử dụng nhiều nguồn đường khác nhau và tùy thuộc vào chủng
mà nguồn đường nào được sử dụng tốt nhất. Chúng có thể chuyển glucose thành
acid gluconic, điều này làm cho pH môi trường giảm từ 1 đến 2 đơn vị [34].
Nhiệt độ tối ưu để A. xylinum phát triển là từ 25 đến 30oC và pH từ 5,4 đến
6,3 [30]. Theo Hestrin (1947), pH tối ưu của A. xylinum là 5,5 và chúng không phát

triển ở nhiệt độ 37oC ngay cả trong môi trường dinh dưỡng tối ưu [27].
Khi nuôi trên môi trường đặc, lúc tế bào còn non, khuẩn lạc mọc riêng rẽ,
nhầy và trong suốt, xuất hiện sau 3 đến 5 ngày. Khi già, tế bào mọc dính nhau thành
từng cụm và khuẩn lạc mọc theo đường nuôi cấy [7].
2.1.3

Các đặc điểm của cellulose vi khuẩn (bacterial cellulose – BC)

2.1.3.1 Đặc điểm về cấu trúc của BC
Cellulose là một polymer không phân nhánh bao gồm những gốc
glucopyranose nối với nhau bởi nối β-1,4. Các nghiên cứu cơ bản về BC cho thấy,
BC có cấu trúc hóa học giống y hệt PC (plant cellulose – cellulose thực vật). Tuy
nhiên, cấu trúc đa phân và thuộc tính của BC khác với PC. Các sợi mới sinh ra của
BC kết lại với nhau để hình thành nên các sợi sơ cấp (subfibril), có chiều rộng
khoảng 1,5nm, là những sợi mảnh nhất có nguồn gốc tự nhiên. Các sợi cơ bản kết
lại thành các vi sợi (microfibril). Các vi sợi nằm trong các bó (bundle), và cuối cùng
hình thành các dải (ribbon). Trong khi chiều rộng của các sợi cellulose được tạo ra
từ gỗ thông là 30.000 – 75.000 nm hay gỗ bulô (Betula) là 14.000 – 40.000 nm
(hình 2.3). Những dải vi sợi cellulose mịn có chiều dài thay đổi từ 1 – 9 µm làm

HVTH: Đào Ngọc Châu


hình thành nên cấu trúc lưới dày đặc, được ổn định bởi các nối hydrogen
[5],[18],[29].
BC khác PC về chỉ số kết chặt, về mức độ polymer hóa. BC có mức độ
polymer hóa từ 2.000 – 6.000; một vài trường hợp đạt tới 16.000 – 20.000, trong
khi mức polymer hóa ở thực vật là 13.000 – 14.000. So với PC, BC có độ kết tinh
cao hơn, thấm nước tốt hơn, sức bền cơ học ở trạng thái ẩm cao hơn và dễ uốn nắn
hơn [5],[18],[29]. BC được hình thành qua một quá trình phức tạp gồm nhiều giai

đoạn, cho sản phẩm có kích thước khác nhau theo sơ đồ sau:
Sợi sơ cấp-subfibril

vi sợi-microfibril

(rộng 1,5 nm)

(rộng 3,0-3,5nm)

bó-bundle

dải-ribbon [37]
(rộng 40-60nm)

Cấu trúc của BC phụ thuộc chặt chẽ vào điều kiện nuôi cấy. Ở điều kiện nuôi
cấy tĩnh. Vi khuẩn tổng hợp những miếng cellulose trên bề mặt của dịch nuôi cấy,
tại ranh giới giữa bề mặt dịch lỏng và khơng khí giàu oxy. Các miếng BC này được
gọi là BC trên môi trường tĩnh (S-BC: Static BC). Các sợi cellulose sơ cấp liên tục
được đẩy ra từ những lỗ được xếp dọc trên bề mặt của tế bào vi khuẩn, kết tinh lại
thành các vi sợi, và đẩy xuống sâu hơn trong môi trường dinh dưỡng. Các dải
cellulose từ môi trường tĩnh tạo nên các mặt phẳng song song nhưng khơng tổ chức,
có vai trò chống đỡ cho quần thể tế bào A. xylinum. Các sợi BC kế nhau được tạo ra
từ môi trường tĩnh nối với nhau và bẻ nhánh ít hơn các sợi BC được tạo từ môi
trường lắc (A-BC: Agitated-BC). A-BC được tạo ra dưới dạng các hạt nhỏ, các hạt
hình sao và các sợi dài, chúng phân tán rất tốt trong môi trường. Các sợi đan lưới
với nhau trong mơi trường lắc giống như mơ hình kẻ ơ, có cả hai hướng song song
và vuông gốc [5],[18].
Sự khác nhau về cấu trúc không gian ba chiều của hai dạng S-BC và A-BC
được quan sát rõ ràng hơn bằng kính hiển vi điện tử quét (scanning electron
microscope). Những sợi S-BC kéo dài và chồng trên các sợi khác theo chiều đan

chéo nhau. Những sợi A-BC thì rối rắm và cong (hình 2.2) [36]. Ngồi ra, bề mặt
cắt ngang của sợi A-BC (0,1-0,2µm) lớn hơn sợi S-BC (0.05 – 0.10µm). Sự khác

HVTH: Đào Ngọc Châu


nhau về hình thái giữa hai loại BC này làm mức độ kết tinh, kích cỡ kết tinh của
chúng khác nhau [5],[17].

Hình 2.2. A-BC được tạo ra từ mơi trường lắc (a) và S-BC được tạo ra từ môi
trường tĩnh (b) [36].
Hai dạng kết tinh phổ biến của cellulose trong tự nhiên là I và II, được phân
biệt bởi các kỹ thuật phân tích bằng tia X, quang phổ, và tia hồng ngoại. Cellulose I
có thể được chuyển thành cellulose II, nhưng cellulose II thì khơng thể chuyển
thành cellulose I.
Cellulose I được tổng hợp bởi đa số thực vật và A. xylinum ở môi trường tĩnh.
Các chuỗi β-1,4-glucan ở cellulose I được sắp xếp song song với nhau theo một
trục. Trong khi đó, các chuỗi β-1,4-glucan ở cellulose II thì xếp một cách ngẫu
nhiên, hầu như không song song và nối với nhau bởi một số lượng lớn nối
hydrogen, làm cho cellulose II có độ bền về nhiệt. Rất ít tế bào Eukaryota tổng hợp
cellulose II. A. xylinum thì tổng hợp được cả 2 loại cellulose I và II [18],[19]. Trong
phân tử cellulose I có sự hiện diện của Iα và Iβ, do được cấu tạo bởi glucose dạng α
hay dạng β. Dạng Iβ bền về nhiệt động học hơn [19]. Glucose dạng α và glucose
dạng β là hai dạng đồng phân không gian của nhau. Hai dạng đồng phân này chỉ

HVTH: Đào Ngọc Châu


khác nhau ở sự định hướng của nhóm hydroxyl [6]. Hai dạng này có ở các cellulose
có nguồn gốc từ tảo, vi khuẩn , thực vật. BC có dạng Iα nhiều hơn PC.

S-BC có nhiều dạng Iα hơn A-BC. Sự khác nhau về tỉ lệ Iα giữa hai loại S-BC và
A-BC làm phóng đại các chỉ số kết tinh, chỉ số Iα tỉ lệ thuận với kích cỡ kết tinh. ABC có chỉ số kết tinh thấp hơn và kích cỡ kết tinh nhỏ hơn S-BC [5],[18].
Một phần đáng kể cellulose II có ở A-BC. Trong tự nhiên, cellulose II chỉ được
tổng hợp ở một vài vi sinh vật (một số tảo, mốc, và vi khuẩn như Sarcina ventriculi,
A. xylinum). Hiện nay, sản phẩm công nghiệp của cellulose II chủ yếu có được là
dựa trên sự biến đổi hóa học cellulose thực vật [18].

(a)
Tế bào vi khuẩn

(b)
Cellulose của thực vật

Hình 2.3. Cấu trúc của cellulose (a) Cellulose vi khuẩn (x 20000) và (b) cellulose
của thực vật (x200) [53].
2.1.3.2 Chức năng sinh lý của cellulose đối với A. xylinum
A. xylinum là vi khuẩn khơng có khả năng quang hợp. Trong mơi trường tự
nhiên, đa số vi khuẩn tổng hợp các polysaccharide ngoại bào để hình thành nên lớp
vỏ bao quanh tế bào, màng BC là một ví dụ. Những tế bào vi khuẩn sản xuất
cellulose được bẫy bên trong mạng lưới polymer. Mạng lưới này là vật chống đỡ
cho quần thể vi sinh vật luôn ở bề mặt tiếp giáp giữa mơi trường lỏng và khơng khí

HVTH: Đào Ngọc Châu


(hình 2.3a). Vì vậy, các chủng vi khuẩn sản xuất BC có thể sống ở những nơi cống
rãnh. Hệ thống lưới polymer làm cho các tế bào có thể bám chặt trên bề mặt môi
trường và làm tế bào thâu nhận chất dinh dưỡng một cách dễ dàng hơn so với khi tế
bào ở trong mơi trường lỏng khơng có mạng lưới cellulose.
Một vài tác giả cho rằng, cellulose được tổng hợp bởi A. xylinum cịn đóng vai

trị tích trữ và có thể được sử dụng khi vi sinh vật này bị thiếu nguồn dinh dưỡng.
Sự phân hủy cellulose được xúc tác bởi enzyme exo-glucanase hay endo-glucanase,
sự hiện diện cả hai loại enzyme này được phát hiện trong dịch nuôi cấy một vài
chủng A. xylinum sản xuất cellulose [18].
Nhờ vào tính dẻo và tính thấm nước của các lớp cellulose mà các tế bào vi
khuẩn kháng lại được những thay đổi bất lợi trong môi trường sống như giảm lượng
nước, thay đổi pH, xuất hiện các chất độc, và các vi sinh vật gây bệnh. Các vi khuẩn
A. xylinum có thể tăng trưởng và phát triển bên trong lớp vỏ bao. Cellulose bao
quanh tế bào vi khuẩn bảo vệ chúng khỏi tia cực tím. Khoảng 23% tế bào A.
xylinum được bao BC sống sót sau 1 giờ xử lý tia cực tím. Tách BC khỏi tế bào, khả
năng sống của tế bào giảm đáng kể, chỉ còn 3% [5],[18].
2.1.3.3 Sinh tổng hợp BC
A. xylinum là vi khuẩn khơng có khả năng quang hợp. Chúng có thể sử dụng
nguồn carbon là các monosaccharide, cụ thể là D-glucose để tạo ra cellulose ngoại
bào chỉ trong vài ngày. Trong môi trường nuôi cấy tĩnh, A. xylinum tạo ra màng
cellulose ngay trên bề mặt tiếp xúc giữa mơi trường và khơng khí. Q trình tổng
hợp BC đã được chứng minh gồm 5 giai đoạn cơ bản do 5 enzyme khác nhau xúc
tác tạo thành để chuyển hóa dần cơ chất ban đầu là D-glucose thành UDP-glucose
qua các sản phẩm trung gian là glucose-6-phosphat và glucose-1-phasphat. Sau đó,
sản phẩm cuối UDP-glucose sẽ được liên kết tạo chuỗi polymer bởi enzyme
cellulose synthase (hình 2.4, 2.5).

HVTH: Đào Ngọc Châu


5-ketogluconate
D-Glucose Gluconate 2-ketogluconate

GDH

1

Glucose

2

GADH

2-KGDH

6-PG

Glucose-1-P

Glycolysis

UDP-glucose

Chu trình
Krebs

3

4

1- glucose permease
2- glucokinase
3- phosphoglucomutase

Gluconate

Glucose-6-P

5

2,5-ketogluconate

Entner-Doudoroff

route
Chu trình pentose
phosphate

4- UDP- glucose
pyrophosphorylase
5- cellulose synthase

Cellulose
Hình 2.4. Vị trí – q trình biến dưỡng carbon và tổng hợp cellulose ở A.
Xylinum [20].

Hình 2.5. Con đường dự đốn của q trình sinh tổng hợp và tiết ra
cellulose khi glucose được tế bào A. xylinum hấp thụ từ bên ngoài [53].

HVTH: Đào Ngọc Châu


Vị trí hình thành cellulose ở chu chất (giữa màng ngoài và màng tế bào chất).
Sợi cellulose được tiết ra ngoại bào nhờ các cấu trúc lỗ trên màng tế bào vi khuẩn.
Các phức hợp tổng hợp cellulose gọi là TC-terminal complex phân bố thành hàng

ngang ở chu chất có vai trị chuyển hóa tiếp UDP-glucose thành cellulose. Đầu tiên,
từ phức hợp chỉ tạo ra được chuỗi gồm 6-8 glucan được gọi là sợi sơ cấp (subfibril),
sau đó các sợi sơ cấp kết lại thành vi sợi có kích thước lớn hơn (microfibril), kế tiếp
các vi sợi này sẽ gắn kết với nhau thành các dải ribbon. Cuối cùng, các dải ribbon
này tụ họp hình thành nên màng cellulose [21]. Q trình đó được mơ tả qua hình
2.6
Cellulose I

Cellulose II

Màng sinh chất
Lớp vỏ lipopolisaccarit

Cellulose Synthase

Vi sợi Cellulose

Cấu tử tạo
Cellulose

Tiền sợi

Hình 2.6. Sự tổng hợp vi sợi bởi Acetobacter xylinum (Iguchi et al, 2000) [31].
Sinh tổng hợp BC là một tiến trình bao gồm nhiều bước được điều hịa một
cách chun biệt và chính xác, liên quan đến một số lớn enzyme, các phức hợp xúc
tác và các protein điều hòa. Tiến trình này bao gồm sự tổng hợp uridine
diphosphoglucose (UDPGlc), tiền chất của cellulose, tiếp đến là sự polymer hóa
glucose vào chuỗi β-1,4-glucan, và sự kết hợp các sợi mới vào dải (ribbon), được

HVTH: Đào Ngọc Châu

hình thành từ hàng trăm, thậm chí hàng ngàn sợi cellulose riêng lẽ. Con đường và
cơ chế của sự tổng hợp UDPGlc tương đối được biết nhiều, trong khi đó cơ chế
phân tử của sự polymer hóa glucose vào mạch dài và các mạch nhánh, sự đẩy ra bên
ngoài tế bào của chúng và sự kết hợp thành sợi cần được làm sáng tỏ hơn [18].
Cellulose được tổng hợp từ A. xylinum là sản phẩm cuối cùng của sự biến dưỡng
carbon, phụ thuộc vào trạng thái sinh lý tế bào liên quan đến hoặc là chu trình
pentose phosphate hoặc là chu trình Krebs, đi kèm với quá trình sinh tạo glucose
(hình 2.7). Q trình glycose giải khơng hoạt động ở vi khuẩn acid acetic bởi vì nó
khơng tổng hợp được enzyme quan trọng của con đường này đó là phosphofructose
kinase. Ở A. xylinum, sự tổng hợp cellulose liên hệ chặt chẽ với tiến trình dị hóa
oxid hóa và tiêu thụ khoảng 10% năng lượng có nguồn gốc từ những phản ứng dị
dưỡng. Sự tổng hợp BC không gây trở ngại cho các q trình đồng hóa khác, bao
gồm sự tổng hợp protein [18].
A. xylinum chuyển nhiều phức hợp carbon như: hexose, glycerol, pyruvate,
dihydroxyacetone, và các dicarboxylic acid thành cellulose, thường có hiệu suất
50%. Dicarboxylic acid đi vào chu trình Krebs nhờ q trình decarboxyl hóa để
thành pyruvate, chuyển thành hexose thông qua con đường sinh tạo glucose, tương
tự đối với glycerol, dihydroxyacetone và các hợp chất trung gian của chu trình
pentone phosphate [18]. Con đường chuyển hóa carbon của A. xylinum được mơ tả
chi tiết qua hình 2.7.
Tiền chất trực tiếp của cellulose là UDPGlc (uridine diphosphoglucose), là sản
phẩm của con đường phổ biến ở các sinh vật, bao gồm cả thực vật, liên quan tới sự
phosphoryl hóa glucose thành glucose-6-phosphate, được xúc tác bởi glucokinase,
tiếp đến là quá trình đồng phân hóa hợp chất này thành glucose-α-1-phosphate,
được xúc tác bởi photphoglucomutase và cuối cùng chuyển thành UDPGlc bởi
enzyme UDPGlc pyrophosphorylase. Enzyme cuối cùng này dường như quan trọng
liên quan đến quá trình tổng hợp BC. Một vài đột biến không tổng hợp cellulose
(Cel-) thiếu enzyme này (Valla và cộng sự, 1989). Hơn nữa, hoạt động của

pyrophosphorylase thay đổi ở những chủng A. xylinum khác nhau và hoạt động cao

HVTH: Đào Ngọc Châu