XÁC ĐỊNH GIỚI TÍNH TINH TRÙNG và PHÔI

XÁC ĐỊNH GIỚI TÍNH TINH TRÙNG VÀ PHƠI
ĐẶT VẤN ĐỀ
Cơng nghệ sinh sản trên gia súc đã và đang được áp dụng ngày càng phổ biến trên thế giới, đặc
biệt là trên bị sữa, vì khả năng sinh sản ít với khoảng 3-4 bê trong cả cuộc đời, và thường sinh
sản kém hơn khi năng suất sữa tăng cao. Chăn ni bị sữa ở VN đang được khuyến khích phát
triển mạnh, hiện có khoảng 227 ngàn con với 125 ngàn bò vắt sữa (10/2014) và được quy hoạch
phát triển lên 300 ngàn con vào năm 2020. Sinh sản của bò sữa hiện đang gặp nhiều vấn đề khó
khăn với tuổi phối giống lần đầu cao, biến động lớn (16-36 tháng), khoảng cách giữa 2 lứa đẻ
kéo dài (14-18 tháng), hệ số phối đậu cao và nhiều bệnh sinh sản. Vì vậy, để góp phần giải quyết
tình trạng sinh sản kém của đàn bò sữa, việc áp dụng những kỹ thuật sinh sản mới như công nghệ
cấy truyền phôi, tinh phân tách… là cần thiết, nhằm giúp tăng nhanh đàn bò cái, đảm bảo đạt số
lượng 300 ngàn con vào năm 2020

I. Giới thiệu sơ lược NST giới tính.
Nhiễm sắc thể giới tính là gì?

Khác nhau của tinh trùng X và Y
Các nhóm trước đã nói rõ về sự khác nhau giữa tinh trùng X và Y
Ở bài này cần nắm rõ 2 phần là tinh trùng X to và nặng hơn tinh trùng Y, tinh trùng Y bơi
nhanh hơn X và tinh trùng X tích điện (-) cịn Y là (+)

Khác nhau về phôi
-Ở động vật lưỡng bội và trong tế bào soma của người, đều có một cặp nhiễm sắc thể có mối
quan hệ trực tiếp với việc quyết định giới tính, gọi là nhiễm sắc thể giới tính, nhiễm sắc thể
khác thường gọi là nhiễm sắc thể thường.
-Có rất nhiều lồi ở giống đực và giống cái có số lượng nhiễm sắc thể giới tính khác nhau, gọi tắt
là dị số nhiễm sắc thể giới tính. Nhiễm sắc thể giới tính có hình dạng khác nhau, khác nhau về
hình thái và chất lượng.
-Ở người và các lồi động vật có vú khác, cơ chế xác định giới tính được xác định bằng các
nhiễm sắc thể X và Y. Giới cái có kiểu nhiễm sắc thể XX và giới đực có kiểu nhiễm sắc thể XY.
Nhiễm sắc thể XY ở người có phần tương đồng rất rõ nằm ở hai đầu mút nhiễm sắc thể giúp

chúng tiếp hợp với nhau trong q trình giảm phân, cịn phần cịn lại (rất lớn) là khơng tương
đồng (trên X có gen nhưng trên Y khơng có gen tương ứng).


-Năm 1990, các nhà khoa học Anh đã phát hiện ra một gen được gọi là SRY (sex determining of
Y) nằm ở đầu của nhiễm sắc thể Y quy định sự phát triển của tinh hồn. Gen này quy định
prơtêin có chức năng điều hịa hoạt động của các gen khác tham gia vào quá trình hình thành các
đặc điểm giới tính nam. Nếu khơng có gen này thì phơi sẽ phát triển buồng trứng và hình thành
cơ thể nữ.
-Mặc dù giới tính ở người và động vật có vú khác đều được xác định theo kiểu XX - giới cái và XY - giới
đực nhưng cơ chế này có một số điểm khác biệt sau:
- Nhiễm sắc thể Y lại giữ vai trò quan trọng trong việc quy định nam tính ở người. Khi có nhiễm sắc thể Y
sẽ cho ra nam giới, cịn nếu khơng có Y sẽ là nữ giới.
- Trong hai nhiễm sắc thể X ở nữ giới chỉ có một nhiễm sắc thể X hoạt động còn nhiễm sắc thể kia bị bất
hoạt về mặt di truyền (hầu hết các gen đều không hoạt động).
Ở ruồi giấm, cơ chế xác định giới tính cũng theo kiểu XX - giới cái và XY - giới đực như ở động vật có
vú. Tuy nhiên, nhiễm sắc thể Y ở ruồi giấm lại khơng có chức năng trong việc xác định giới tính như ở
động vật có vú (có nhiêm sắc thể Y thì sẽ phát triển thành con đực, khơng có Y thì phát triển thành con
cái). Nếu phơi của ruồi giấm có 2X thì sẽ phát triển thành con cái, cịn phơi chỉ có 1 nhiễm sắc thể X sẽ
phát triển thành con đực.

Cơ chế xác định giới tính kiểu X - O
Ở một số lồi châu chấu, dế và một số lồi cơn trùng khác, con cái có hai nhiễm sắc thể X cịn con đực
chỉ có một nhiễm sắc thể X. Giới tính của cá thể phụ thuộc vào việc trứng được thụ tinh bởi tinh trùng có
mang nhiễm sắc thể X hay khơng.

Cơ chế xác định giới tính kiểu XX - giới đực và XY - giới cái
Ở chim và một số loài cá cũng như một số lồi cơn trùng, con cái có nhiễm sắc thể X và Y cịn con đực có
2 nhiễm sắc thể XX. Như vậy, giới tính của cá thể phụ thuộc vào nhiễm sắc thể giới tính của trứng. Nếu
trứng có nhiễm sắc thể Y kết hợp với tinh trùng mang X sẽ con cái, còn trứng mang nhiễm sắc thể X kết

hợp với tinh trùng mang X sẽ cho ra con đực.

Cơ chế xác định giới tính kiểu đơn bội - lưỡng bội
Ở hầu hết các lồi ong và kiến, tế bào khơng có nhiễm sắc thể giới tính riêng và giới tính được xác định
bằng mức bội thể. Nếu trứng được thụ tinh thì hợp tử (2n) sẽ cho ra con cái (ong chúa hoặc ong thợ) cịn
nếu trứng khơng được thụ tinh (n) sẽ cho ra ong đực.

II. Mục đích việc xác định giới tính tinh trùng và phơi.
Trong sản xuất nhằm tạo ra đời con có giới tính mong muốn phục vụ sản xuất


Trong y học giúp các gia đình sinh con có giới tính mong muốn (một số nước khơng cho
phép việc này vì ảnh hưởng đến cân bằng giới tính)
Trong nghiên cứu nhằm phục hồi các động vật có nguy cơ tuyệ chủng, tạo ra các nguồn
gen mang giới tính xác định phục vụ cho nghiên cứu

III. Bằng cách nào thay đổi giới tính theo ý muốn.
Kiểm sốt giới tính đối với động vật có vú đã được nghiên cứu nhiều trong mấy chục năm
nay, ví dụ kích thích tố mang tính ứng dụng, thay đổi độ PH của dịch thể, dinh dưỡng,
nguyên tố kim loại khác nhau, thay đổi môi trường đường sinh dục, giết chết hoặc làm mất
tác dụng tinh trùng mang nhiễm sắc thể nào đó… nhưng những cách này chỉ có thể thay
đổi tỷ lệ giới tính nhất định, khơng đạt được mục đích kiểm sốt giới tính hồn tồn. Hơn
nữa các kết quả này thường khơng ổn định và thiếu tính sao chép. Hiện nay phương pháp
kiểm sốt giới tính chủ yếu là giám định giới tính phơi thai và tinh trùng X, Y.
Các phương pháp xác định giới tính phơi:
- Kiểm tra hoạt động enzyme liên kết NST
- Phản ứng miễn dịch đối với kháng nguyên chuyên biệt giới tính.
-Phân tích duy truyền TB để xác định giới tính

1.Giám định giới tính phơi thai.

Giám định giới tính phơi thai thường sử dụng phương pháp PCR (polymerase chain reaction).
Đây là phương pháp xác định giới tính bằng cách khuếch đại đoạn DNA đặc trưng cho giới tính
đực hiện diện trên NST Y. Phương pháp này có độ tin cậy cao và khá nhạy vì có thể tiến hành với
lượng mẫu DNA ban đầu tương đối nhỏ.
Thực chất của phương pháp này là kỹ thuật kiểm tra gen quyết định giới tính là nằm trên nhiễm
sắc thể X hay nhiễm sắc thể Y. tức là sử dụng bộ phận cấu thành gen SRY hoặc các đoạn đặc biệt
trên nhiễm sắc thể Y làm vật dẫn, trong điều kiện nhất định tiến hành phản ứng gia tăng PCR, cá
thể có khả năng tăng đoạn mục tiêu là đực, ngược lại là cái.
-PCR( phản ứng tổng hợp dây chuyền nhờ polymerase) thực chất là 1 phương pháp tạo dòng
trong ống nghiệm.Nghĩa là thu một lượng lớn bản sao của 1 trình tự xác định. Cơ sở của PCR
chính là đặc tính hoạt động của các DNA polymerase. Các polymerase này chỉ có khả năng tổng
hợp một mạch mới từ khn kể tự một đoạn mồi đã bắt cặp sẵn với khuôn.
-PCR gồm 3 bước:


+Biến tính phân tử DNA
+Bắt cặp đoạn mồi với mạch khuôn
+Tổng hợp mạch mới
3 bước này lập thành 1 chu kì và được lặp lại nhiều lần( mục đích để làm tăng tối đa nguyên liệu
dùng cho phản ứng nhân bản)
=>Hiện nay, kỹ thuật ứng dụng PCR giám định giới tính phơi thai được sử dụng rộng rãi, phương
pháp này đơn giản dễ làm. Ngồi phương pháp PCR, cịn có phương pháp huỳnh quan miễn dịch
gián tiếp, tìm DNA đặc biệt trên nhiễm sắc thể Y, phân tích hình thái nhân…, so với phương
pháp PCR, các phương pháp này phát triển chậm và tính chuẩn xác khơng cao.

(1)Nhiệt độ tăng lên 94-96 °C để tách hai sợi DNA ra. Bước này gọi là biến tính, nó phá vỡ cầu nối
hydrogen nối 2 sợi DNA. Trước chu kỳ 1, DNA thường được biến tính đến thời gian mở chuỗi để
đảm bảo mẫu DNA và mồi được phân tách hoàn toàn và chỉ còn dạng sợi đơn. Thời gian: 1-2 phút
(2)Sau khi 2 sợi DNA tách ra, nhiệt độ được hạ thấp xuống để mồi có thể gắn vào sợi DNA đơn.
Bước này gọi là gắn mồi. Nhiệt độ giai đoạn này phụ thuộc vào đoạn mồi và thường thấp hơn nhiệt

độ biến tính 50 °C (45-60 °C). Sử dụng sai nhiệt độ trong giai đoạn này dẫn đến việc đoạn mồi
không gắn hoàn toàn vào DNA mẫu, hay gắn một cách tùy tiện. Thời gian: 1-2 phút.
(3) Cuối cùng, DNA polymerase gắn tiếp vào sợi trống. Nó bắt đầu bám vào và hoạt động dọc theo
sợi DNA. Bước này gọi là kéo dài. Nhiệt độ kéo dài phụ thuộc DNA-polymerase. Thời gian của bước
này phụ thuộc vào cả DNA-polymerase và chiều dài mảnh DNA cần khuếch đại. Như một quy tắc
…, 1000bp/ 1 phút.


*PCR còn để xác định vân tay, kiểm tra huyết thống, chẩn đốn bệnh di truyền, tách dịng gen...

2.Kỹ thuật phân tách tinh trùng X và tinh trùng Y.
Phân tách tinh trùng X, Y dùng trong thụ tinh nhân tạo là một trong những phương pháp
đơn giản nhất và có tính khả thi cao nhất.Tinh trùng X và tinh trùng Y có chút khác nhau
về mật độ, thể tích, đặc tính vận động, xung điện, kháng nguyên bề mặt và hàm lượng
DNA, theo nhiều cách phân tách tinh trùng mà con người tạo ra, có thể chia phương pháp
phân tách tinh trùng thành phân tích vật lý, phương pháp miễn dịch và phương pháp phân
tích tế bào dịng chảy (Flow Cytometry).

A. Phương pháp phân tách tinh trùng Flow Cytometry
(phân tích tế bào dòng chảy)

Phương pháp phân tách tinh trùng Flow Cytometry (phân tích tế bào dịng chảy) là phương pháp
căn cứ sự khác biệt về hàm lượng trên DNA của hai loại tinh trùng X và Y để tiến hành phân
tách. Thông thường, nhiễm sắc thể của tinh trùng X lớn hơn nhiễm sắc thể của tinh trùng Y, và có
hàm lượng DNA cao. ở người, sự khác nhau này là 2.8%, gia súc là 3-4.2%, ví dụ lợn là 3.6%,


bò là 3.8%. Phương pháp thực hiện, nhuộm màu tinh dịch bằng nhiên liệu huỳnh quang hoạt thể
Hoechst33342. Cho dung dịch này vào máy, tạo thành dòng chảy trong hệ thống ống liên hợp
khép kín của máy. Đầu tiên, dung dịch đi qua bộ tạo giọt, nhờ xung điện, dung dịch được tạo

thành rất nhiều giọt nhỏ nối tiếp nhau mà mỗi giọt có chứa 1 tinh trùng, hoặc chứa các vật thể
khác có trong dung dịch (có lẽ do cách hoạt động này mà người ta đặt tên cho máy). Tiếp theo,
dòng giọt này đi qua bộ chiếu tia lazer, tuỳ theo mức độ nhuộm màu mà các giọt hấp phụ sự phát
sáng từ tia lazer khác nhau, giọt chứa tinh trùng X phát sáng nhiều hơn so với giọt chứa tinh
trùng Y. Những giọt khác không hấp phụ màu sẽ không phát sáng. Sau khi được chiếu tia lazer,
dịng giọt này sẽ đi qua bộ tích điện, tuỳ theo mức độ phát sáng của mỗi giọt mà tích điện âm (–)
hoặc điện dương (+); các giọt khác không phát sáng sẽ khơng tích điện. Cuối cùng chúng chảy
qua bộ phân tách, lúc này những giọt mang điện tích – (chứa tinh trùng X) chảy về phía bản cực
+ và đổ vào cốc chứa tinh trùng cái; các giọt mang điện tích + (chứa tinh trùng Y) đi về phía bản
cực – rồi đổ vào cốc chứa tinh trùng đực; các giọt cịn lại, khơng mang điện tích nào (không chứa
tinh trùng) sẽ chảy thẳng, rơi vào cốc chứa chất thải.

3. Phương pháp lọc qua phân lớp Percoll.
Phương pháp lọc qua phân lớp Percoll là dựa theo kích thước khác nhau của nhiễm sắc thể X và
nhiễm sắc thể Y của động vật có vú để tiến hành phân tách (cũng phản ánh sự khác nhau về mật
độ của hai loại tinh trùng). Percoll là chất dẫn gradient mật độ, khơng có trên màng tế bào, cũng
khơng gây hại cho tinh trùng. Phương pháp thực hiện, dùng dung dịch sinh lý phù hợp để tinh
trùng có thể sống sót trộn với Percoll thành dung dịch gradient mật độ không liên tục 7-12 lớp, từ
dưới lên trên, dung dịch ngấm dần vào các lớp trong tâm quản, hình thành ống phân tách, cho
tinh dịch pha loãng vào trong ống phân tách, sau một thời gian và tốc độ nhất định, tinh trùng
dồn vào lớp trên cùng của dung dịch gradient và lớp đáy của ống phân tách, tinh trùng ở tầng
thấp chứa nhiều tinh trùng X, tinh trùng ở tầng cao chứa nhiều tinh trùng Y.