ỨNG DỤNG của RETROVIRUS TRONG BIẾN ĐỔI GEN Ở ĐỘNG VẬT

CÔNG NGHỆ SINH HỌC
ĐỘNG VẬT

Chuyên đề:

ỨNG DỤNG CỦA RETROVIRUS
TRONG BIẾN ĐỔI GEN Ở ĐỘNG VẬT

TP. HỒ CHÍ MINH
03.202
1


1. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA RETROVIRUS:
Retrovirus là loại virus RNA, có vỏ bọc bên ngồi. Sau khi xâm
nhiễm, genome virus được sao chép ngược thành DNA sợi kép, hợp nhất
vào genome tế bào chủ và biểu hiện thành protein.
Hạt retrovirus có kích thước, hình dạng có thể thay đổi đơi chút
nhưng đường kính khoảng 100nm.
Vỏ của virus là glycoprotein, tạo thành các gai ở màng (Hình A).
Protein trưởng thành này được chia làm hai loại polypeptid (Hình B):
- Glycoprotein vỏ bên ngoài (SU), kháng nguyên chủ yếu của virus, có
chức năng bám vào thụ quan.
- Glycoprotein màng (TM), bám vào protein SU ở vỏ, chịu trách nhiệm
đối với sự dung hợp màng.

2


Bên trong màng là protein cơ bản (MA), không định hình. Protein
này bao lấy capsid (CA). CA là protein phong phú nhất trong hạt virus

(chiếm khoảng 33 % trọng lượng tổng số), có hình khối 20 mặt. Bên
trong capsid là lõi, thường có hình nón.
 Sơ đồ cấu trúc genome của Retrovirus

Genome retrovirus bao gồm hai bản sao của phân tử RNA sợi đơn,
mạch thẳng, có cap ở đầu 5’ và đuôi poly A ở đầu 3’ (tương đương với
mRNA). Genome retrovirus có kích thước khoảng 8-11kb.
RNA của retrovirus đơn giản chứa 3 nhóm gen chủ yếu:
+Gen gag mã hóa protein lõi, capsid và nucleoprotein
+Gen pol mã hóa enzyme phiên mã ngược và enzyme hợp nhất
+Gen env mã hóa protein trong cấu trúc vỏ của virus
Trật tự của các nhóm gen này ở tất cả các retrovirus là không thay đổi
5’ – gag – pol – env – 3’

2. Hoạt động của Retrovirus:
Màng của retrovirus có glycoprotein, protein dùng để liên kết với
thụ quan protein trên tế bào vật chủ. Có hai sợi của RNA bên trong tế
bào, chứa 3 enzyme: protease, reverse transcriptase và integrase.
Bước đầu của quá trình sao chép là sự liên kết của glycoprotein với
thụ quan protein. Khi đã có liên kết với nhau, màng của retrovirus sẽ
3


phân giải thành một bộ phận của tế bào chủ để sợi RNA và enzyme có
thể xâm nhập tế bào.
Trong tế bào, enzyme reverse transcriptase tạo một dây DNA phụ
từ sợi RNA đã bị phân giải của retrovirus. Sợi DNA này được gọi là
cDNA. Sau đó, cADN làm khn để tổng hợp ra sợi ADN thứ hai bổ
sung với nó (cADN→ADN) để xâm nhập vào nhân tế bào chủ bằng
enzyme integrase. Sợi cADN này cũng có thể làm khn để tổng hợp trở

lại bộ gene của virus (cADN→ARN).
Ribosome được dùng để sao chép mRNA của virus thành chuỗi
axit amin để tạo protein trong màng lưới nội bào. Bước này cũng sẽ tạo
enzyme và vỏ protein của virus. RNA của virus sẽ được hình thành trong
nhân. Những mảnh này sau đó sẽ tập hợp lại và ra khỏi màng tế bào, trở
thành một retrovirus mới. Cứ thế, retrovirus này lại tấn công vào các tế
bào chủ khác.

3. KHÁI NIỆM VECTOR
- Vector là một phương tiện có khả năng mang một đoạn DNA
ngoại lai và xâm nhập vào loại tế bào chủ thịch hợp thì có khả
năng tự tái bản khơng phụ thuộc vào sự sao chép của hệ gen tế
báo chủ.
- Nói cách khác, vector là một phương tiện truyền thơng tin di
truyền trong cơ thể hoặc giữa các cơ thể khác nhau.

4




Các đặc tính của vector virus:

- Vector virus là các loại virus được cắt bỏ gen độc lực và gắn
thêm các gen chỉ thị đặc hiệu.
- Dễ dàng xâm nhiễm vào tế bào chủ, có thể nhiễm vào nhiều
loại vật chủ.
- Có khả năng nhân nhanh trong tế vào vật chủ
- Khả năng mạng đoạn DNA có kích thước lớn.
5.Cơ chế tạo vector Retrovirus:

Vector retrovirus là cấu trúc DNA nhân tạo có nguồn gốc từ
retrovirus, được sử dụng để xen DNA ngoại lai vào nhiễm sắc thể của
vật chủ.
5


Yếu tố chìa khóa trong việc sử dụng retrovirus làm thể truyền phân phối
gen là sự an toàn sinh học (biosafety). Mục đích chính của thiết kế
vector là bảo đảm tạo ra một virus không khả năng tái bản (replication
incompetent virus) trong tế bào chủ.
Về nguyên tắc, có thể tạo ra vector retrovirus có khả năng tái bản
(replication competent retroviral vector) bằng cách thêm các trình tự cần
thiết vào virus. Nhưng một thiết kế phổ biến hơn là thay thế các gen của
virus bằng các gen chuyển mong muốn để tạo ra vector tái bản khơng
hồn tồn (replication defective vector).
Mặt khác, kích thước của đoạn DNA ngoại lai mà vector tái bản
khơng hồn tồn có thể tiếp nhận lớn hơn nhiều so với vector có khả
năng tái bản. Sự biểu hiện của các protein retrovirus ở hầu hết các
retrovirus gây ung thư xảy ra tự nhiên do một promoter đơn (single
promoter) nằm trong đoạn lặp dài tận cùng (LTR) ở đầu 5’và sự biểu
hiện của các vùng mã hóa virus phức tạp xảy ra nhờ sự cắt ghép xen kẻ
(alternative splicing).
Tuy nhiên, việc thiết kế vector làkhông bị giới hạn do sử dụng
promoter retrovirus đơn. Một hướng thiết kế khác là sử dụng promoter
phức (multiple promoter) và các trình tự tiếp nhận ribosome ở bên trong
(internal ribosome entry site = IRES).
Một điểm lưu ý quan trọng khi thiết kế vector retrovirus là hiệu quả tái
bản của virus trong cấu trúc vector.
Phần lớn các vector retrovirus thường được thiết kế dựa trên virus
Mo-MLV. Ðây là loại virus có khả năng xâm nhiễm vào cả các tế bào

chuột (có thể phát triển vector ở mơ hình chuột) và tế bào người (có thể
điều trị bệnh cho người). Các gen của virus (gag, pol và env) được thay
thế bằng các gen chuyển mong muốn và được biểu hiện ở các plasmid
trong dòng tế bào đóng gói. Các vùng cần thiết bao gồm các đoạn lặp dài
tận cùng ở đầu 3’ và 5’ (3’LTR và 5’LTR) và trình tự đóng gói.
6


7


-Vector retrovirus là cần thiết cho liệu pháp gen, đã được sử dụng
có hiệu quả trong nhiều liệu pháp gen chữa bệnh cho người như suy
giảm miễn dịch do thiếu hụt enzyme ADA, ung thư, tiểu đường, thiếu
máu
- Các vector retrovirus khác nhau đã được thiết kế để tạo động vật
chuyển gen và gà chuyển gen đặc biệt (Ronfort, Legras và Verdier,
1997). Các vector này mang các trình tự env có khả năng nhận biết các
tế bào phơi gà.
PP1: Các vector mang các trình tự env có khả năng nhận biết các tế
bào phôi gà. Chúng được tiêm vào trứng gà mới đẻ. Ở giai đoạn này
chứakhoảng 60 000 tế bào. Chỉ một tỉ lệ nhỏ các tế bào này có cơ hội
mang gen chuyển nhờ vector retrovirus. Gà chuyển gen tạo ở dạng thể
khảm và có rất ít cơ hội truyền gen chuyển của chúng cho thế hệ sau
 Hiệu quả không cao
PP2: Tiêm gen vào các tế bào được thực hiện ở giai đoạn phôi 16 tế
bào tại vùng lân cận của tế bào mầm nguyên thủy => động vật chuyển
gen => truyền gen cho thế hệ sau
 Hiệu quả cao

8


- Vector retrovirus cũng được sử dụng để chuyển gen vào nỗn bào
của bị và khỉ (Chen, 1998, 2001).
+ Ðể tiến hành cơng việc này địi hỏi hai điều kiện đặc biệt. Vỏ
của vector là protein G của VSV (vesicular somatitis virus) có
chức năng nhận biết màng phospholipid và vì vậy cho phép tiêm
vào nhiều loại tế bào khác nhau.
+ Các hạt virus được tiêm vào giữa màng trong (zona pellucida)
và màng noãn bào vào lúc màng nhân đã biến mất, tạo cho genome
virus cơ hội tốt nhất để có thể đến được genome tế bào chủ (Hình
9).
- Lentivirus là một phân lớp của retrovirus. Chúng có khả năng hợp
nhất vào genome của các tế bào ở pha nghỉ, cả các tế bào tăng
sinh và tế bào không tăng sinh. Khả năng này có được là do sự có
mặt của một tín hiệu ở một trong số các protein virus. Protein virus
này nhắm tới genome của virus ở vùng nhân. Lentivirus phức tạp
hơn các retrovirus đơn giản, chứa thêm 6 gen tat, rev, vpr, vpu, nef
9


và vif. HIV là một loại lentivirus. Vector lentivirus được nghiên
cứu nhiều do tiềm năng sử dụng của chúng trong liệu pháp gen.
 Ưu điểm và nhược điểm chính của vector Retrovirus:
*Ưu điểm:
+ Hiệu quả biến nạp cao
+ Thao tác đơn giản, sự xâm nhiễm có thể được thực hiện bằng
cách ủ phôi đã loại bỏ màng trong với thể virus.
+ Phương pháp này được mở rộng đối với các động vật có vú khác

mà khơng có vấn đề đặc biệt.
+ Phương pháp này thuận lợi một cách đặc biệt cho việc chuyển
gen vào chuột trong khi phương pháp vi tiêm là rất khó sử dụng ở
đây.
*Nhược điểm:
+ Các hạt virus phải được kiểm sốt an tồn sinh học bằng biện
pháp thích hợp. Bước này ngày càng được tiêu chuẩn hóa nhằm
tăng cường sử dụng các loại vector này cho liệu pháp gen.
+ Các đoạn DNA có kích thước khơng vượt quá 7-9kb có thể được
đưa vào vector này. Sự biểu hiện của gen reporter là tương đối thấp
trong trường hợp này. Mặt khác, sự hợp nhất độc lập của vector
xảy ra trong cùng một phôi dẫn đến động vật chuyển gen thể khảm.
Rõ ràng, phương pháp này chỉ có thể thay thế vi tiêm trong một số
trường hợp.

6. ƯU ĐIỂM VÀ NHƯỢC ĐIỂM CỦA VIỆC CHUYỂN GEN SỬ
DỤNG RETROVIRUS:
10


* Ưu điểm:
- Gắng chèn gen mục tiêu vào NST của tế bào quan tâm-->biểu hiện
gen mục tiêu ổn định
- Ít nhạy cảm với hệ miễn dịch
- Sử dụng đối với các dòng tế bào phân chia mạnh
* Khuyết điểm:
- Gắng chèn gen mục tiêu một cách ngẫu nhiên
- Không có khả năng chuyển nhiễm lên các dịng tế bào không phân
chia
- Sự biểu hiện bắt đầu giảm đi sau một thời gian biểu hiện ổn định

11