Phân lập và nhận diện vi khuẩn phân giải lipid từ dầu ăn thực vật

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGHÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

PHÂN LẬP VÀ NHẬN DIỆN VI KHUẨN
PHÂN GIẢI LIPID TỪ DẦU ĂN THỰC VẬT

Cần Thơ, năm 2013


TÓM LƢỢC
Tên đề tài: “Phân lập và nhận diện vi khuẩn phân giải lipid từ dầu ăn thực vật”.
Sự hiện diện của lipid trong nước thải rất khó bị loại bỏ và phân giải do chúng
khơng tan trong nước, vì vậy chúng gây nhiều tác động xấu đến môi trường. Việc xử lý
lipid trong nước thải bằng phương pháp phân giải vi sinh đang được nghiên cứu và
phát triển cũng như trở nên phổ biến trên thế giới. Trong bài nghiên cứu này, một số
vi khuẩn phân giải lipid được phân lập từ nước thải của các nhà hàng và quán ăn.
Việc khảo sát sơ bộ khả năng phân giải lipid của vi khuẩn được thực hiện bằng
phương pháp kiểm tra hoạt tính lipase trên mơi trường thạch Tween 20 và khả năng
tăng sinh của vi khuẩn trong môi trường phân lập. Nhận diện các dòng vi khuẩn phân
lập được dựa trên cơ sở đặc diểm hình thái khuẩn lạc, tế bào vi khuẩn và trình tự 16S
rDNA. Cây phả hệ được dựng bằng phương pháp neighbour-joining. Kết quả đạt được
là có ba trong tổng số năm dịng vi khuẩn phân lập được tìm thấy có khả năng phân
giải lipid nhờ vào hoạt tính lipase của chúng. Các dịng có khả năng sản xuất lipase
hình thành các vịng halo trên môi trường thạch Tween 20. Đường thằng tương quan
được dựng thể hiện mối quan hệ giữa thời gian và đường kính của các vịng halo kết
tủa. Kết quả đo OD của các mơi trường phân lập được chủng 3 dịng vi khuẩn phân
lập đều tăng trong 96 giờ. AL1 và MT8 đều có sự tương đồng cao (ở mức 99%) với lần

lượt hai loài Acinetobacter baumanii và Bacillus cereus, qua phân tích bằng BLAST
N. Cây phả hệ cũng mơ tả chúng có quan hệ gần gũi với nhau.
Từ khóa: nước thải, phân giải lipid, Tween 20, vòng halo.

i


MỤC LỤC

Trang
TÓM LƢỢC ....................................................................................................................i
MỤC LỤC ..................................................................................................................... ii
DANH SÁCH BẢNG .....................................................................................................v
DANH SÁCH HÌNH .....................................................................................................vi
CHƢƠNG 1. GIỚI THIỆU...........................................................................................1
1.1. Đặt vấn đề ..............................................................................................................1
1.2. Mục tiêu đề tài .......................................................................................................2
CHƢƠNG 2. LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU ......................................................................3
2.1. Chất béo ...................................................................................................................3
2.1.1. Khái niệm ......................................................................................................3
2.1.2. Tính chất của chất béo ...................................................................................3
2.1.3. Sự biến đổi dầu mỡ trong quá trình chiên rán ...............................................5
2.2. Vi sinh vật phân giải lipid: .....................................................................................6
2.3. Xác định sự sinh trƣởng của vi sinh vật ...............................................................7
2.3.1. Xác định khối lượng tế bào ...........................................................................7
2.4. Nhận diện vi khuẩn bằng kỹ thuật sinh học phân tử ..........................................9
2.4.1. Trình tự 16S rRNA ........................................................................................9
2.4.2. Mồi và cặp mồi tổng ......................................................................................9
2.4.3. Kỹ thuật PCR ...............................................................................................10
2.4.4. Kỹ thuật giải trình tự DNA ..........................................................................10

ii


2.4.5. Cơng cụ BLAST ..........................................................................................11
2.4.6. Phân tích phát sinh lồi................................................................................12
CHƢƠNG 3. PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................14
3.1. Phƣơng tiện nghiên cứu .......................................................................................14
3.1.1. Dụng cụ, thiết bị ..........................................................................................14
3.1.2. Nguyên vật liệu............................................................................................15
3.1.3. Hóa chất .......................................................................................................15
3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu .....................................................................................16
3.2.1. Thu mẫu .......................................................................................................17
3.2.2. Phân lập vi khuẩn phân giải lipid ................................................................17
3.2.3. Khảo sát sơ bộ khả năng phân giải lipid: ................................................19
3.2.4.Nhận diện (indentification) vi khuẩn............................................................20
3.2.5. Phân tích quan hệ di truyền .....................................................................24
CHƢƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN..............................................................25
4.1. Kết quả thu mẫu chất thải ...................................................................................25
4.2. Kết quả phân lập vi khuẩn phân giải lipid.........................................................25
4.3. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc các dòng vi khuẩn phân lập..............................26
4.4. Đặc điểm tế bào của các dòng vi khuẩn phân lập .............................................27
4.5. Khảo sát sơ bộ khả năng phân giải lipid của các dòng vi khuẩn phân lập .....27
4.5.1. Kiểm tra hoạt tính lipase của các dòng vi khuẩn phân lập ..........................27
4.5.2. Khảo sát khả năng phân giải lipid của các chủng vi khuẩn phân lập ..........28
4.5.3. Khảo sát mức độ sinh trưởng của các tế bào vi khuẩn phân lập .................30
4.6. Nhận diện dịng vi khuẩn có khả năng phân giải lipid .....................................31
iii


4.6.1. Kết quả điện di sản phẩm PCR ....................................................................31

4.6.2 Kết quả giải trình tự và nhận diện vi khuẩn .................................................31
4.7. Phân tích quan hệ di truyền các dịng vi khuẩn phân lập đƣợc với các dòng vi
khuẩn tƣơng đồng về trình tự 16S rDNA trên NCBI ......................................33
CHƢƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..................................................................35
5.1. Kết luận .................................................................................................................35
5.2. Đề nghị ...................................................................................................................35
TÀI LIỆU THAM KHẢO...........................................................................................36
PHỤ LỤC .......................................................................................................................1
Phụ lục 1. Kết quả .........................................................................................................1
Bảng 9. Kết quả đo bán kính vịng halo (cm) ..........................................................1
Bảng 10: Kết quả đo OD các dịng vi khuẩn ni trong môi trường quan sát ở
bước sống 660nm ....................................................................................................1
Phụ lục 2. Kết quả thống kê ..........................................................................................2
Bảng kết quả phân tính phương sai hai nhân tố 3 lần lặp lại thí nghiệm đo OD ....2
Phụ lục 3: Kết quả giải trình tự ..................................................................................3
Kết quả giải trình tự 16S rDNA của 3 dòng vi khuẩn nhận diện ............................3

iv


DANH SÁCH BẢNG
Trang
Bảng 1: So sánh khả năng phân giải lipid của các dịng vi khuẩn ..................................7
Bảng 2: Trình tự primer dùng nhận diện vi khuẩn phân giải lipid (dựa trên vùng
16S rDNA) ...................................................................................................... 21
Bảng 3: Thành phần hóa chất cho một phản ứng PCR với thể tích 25 µl .................... 21
Bảng 4: Chu kỳ phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen 16S rDNA của vi khuẩn .......... 23
Bảng 5: Danh sách mẫu chất thải được thu ở các nhà hàng, quán ăn trên địa bàn
quận Ninh Kiều, thành phố Cần Thơ .............................................................. 26
Bảng 6: Đặc điểm khuẩn lạc của vi khuẩn phân lập .................................................... 27

Bảng 7: Đặc điểm tế bào của vi khuẩn phân lập được quan sát dưới kính hiển vi
độ phóng đại 400 lần ....................................................................................... 28
Bảng 8: Kích thước đoạn gen 16S rDNA được giải trình tự của 3 dịng vi khuẩn
có khả năng phân giải lipid.............................................................................. 32

v


DANH SÁCH HÌNH
Trang
Hình 1. Số lượng nhà hàng khách sạn qua các năm 2008 – 2011 trên địa bàn
quận Ninh Kiều, Tp.Cần Thơ .............................................................................1
Hình 2. Đo số lượng vi sinh vật bằng phương pháp đo độ đục .......................................8
Hình 3. Kỹ thuật cấy ria tách rịng ............................................................................... 18
Hình 4. Tạo giếng trên đĩa mơi trường Tween20 ......................................................... 20
Hình 5. Cài đặt chu kỳ gia nhiệt của phản ứng PCR với cặp mồi tổng ........................ 23
Hình 6: Quan sát khuẩn lạc sau khi cấy trãi ................................................................. 27
Hình 7: Khuẩn lạc 5 dịng vi khuẩn phân lập ............................................................... 28
Hình 8: Kiểm tra hoạt tính lipase các dịng vi khuẩn trên mơi trường Tween20 ......... 29
Hình 9: Sự tương quan giữa đường kính halo và thời gian ủ của 3 dòng vi
khuẩn phân lập................................................................................................. 30
Hình 10: Khảo sát halo xung quanh giếng thạch Tw20 của dịng vi khuẩn MT8 ........ 30
Hình 11: Phổ điện di sản phẩm PCR được nhân lên từ đoạn gen 16S rDNA của 3
dòng vi khuẩn cần nhận diện ......................................................................... 32
Hình 12: Cây phả hệ trình bày mối quan hệ di truyền của ba dịng vi khuẩn có
khả năng phân giải lipid trong dầu ăn thực vật ............................................. 35

vi

TỪ VIẾT TẮT

BLAST

Basic Local Alignment Search Tool

BLAST N

Nucleotide BLAST

BSA

Bovine Serum Albumin Acetyllated

CTAB

Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide

ddNTP

Dideyribonucleoside Triphosphate

DNA

Deoxyribose Nucleic Acid

EDTA

Ethylene Diamin Tetra Acetic Acid

EtBr

Ethidium Bromide

LB

Lauria Bertani

NCBI

The National Center for Biotechnology Information

PCR

Polymerase Chain Reaction

PHYLIP

Phylogeny Inference Package

SDS

Sodium Dodecyl Sulfate

Taq

Thermus aquaticus

TBE

Tris Boric EDTA

TE

Tris EDTA

Tm

Melting temperature

Tween 20

Polysorbate 20

vii


CHƢƠNG 1. GIỚI THIỆU
1.1. Đặt vấn đề
Mỡ, dầu thực vật và dầu nhờn (Fats, oils and greases – FOGs) được thải ra ngồi
mơi trường cùng với nước thải xuất phát từ khu công nghiệp chế biến thực phẩm, các
nhà hàng, bếp hay là các tai nạn tràn dầu. Lượng nước thải giàu lipid ngày một tăng
mỗi năm do sự phát triển đơ thị hóa. Đặc biệt, trên địa bàn quận Ninh Kiều, thành phố
Cần Thơ, càng ngày càng xuất hiện nhiều thêm các quán ăn, nhà hàng và khu chung cư
vì vậy lượng dầu mỡ được thải ra ngồi ngày càng tăng. Nếu không được xử lý, chúng
sẽ ảnh hưởng rất lớn đến mơi trường bởi vì lipid khơng khơng tan trong nước nên rất
khó loại bỏ hay phân giải chúng.

Hình 1: Số lƣợng nhà hàng khách sạn qua các năm 2008 – 2011 trên địa bàn quận
Ninh Kiều, Tp.Cần Thơ.

(Nguồn: chi cục thống kê quận Ninh Kiều, thành phố Cần Thơ)
Hiện tượng tắt nghẽn ống cống hay ống nước thải thường xuyên xảy ra do sự hiện
diện của lipid. Hiện nay có nhiều phương pháp được áp dụng để loại váng dầu mỡ này
như phương pháp vật lý, vớt bỏ lớp váng này ra khỏi nước thải rồi đem chơn dưới lịng
đất hoặc đem đốt, khá hiệu quả. Tuy nhiên, việc đốt hay chôn lipid lại gây ra các vấn
đề ảnh hưởng môi trường khác (Sugimori et al., 2002). Hơn nữa, các lớp váng dầu mỡ
tồn tại bên ngoài môi trường trong thời gian dài thường gây ra mùi rất khó chịu.
Phương pháp hóa học cũng được áp dụng vào việc xử lý vấn đề này. Mặc dù hai
1


phương pháp này đạt hiệu quả cao nhưng thường tốn rất nhiều tiền khi áp dụng trên
qui mô lớn.
Trong thời gian gần đây, kỹ thuật xử lý chất thải bằng vi sinh thu hút được rất
nhiều sự quan tâm của các nhà khoa học cũng như xã hội. Để việc xử lý này được
thành công, điều cần thiết là phải chọn lọc được các vi sinh vật có khả năng phân giải
các chất thải gây ô nhiễm dưới các điều kiện nhiệt độ, nồng độ pH và dinh dưỡng khác
nhau. Hiện nay, có rất nhiều vi sinh vật được phát hiện có khả năng phân giải lipid như
Pseudomonas aeruginosa, Bacillus sp. và các loại nấm men trên qui mơ phịng thí
nghiệm. Ngồi ra, Bacillus subbtilis BN 1001 đang được sử dụng trong hệ thống xử lý
nước thải cơng nghiệp có chứa lipid (Akiyama, 1991). Các đề tài nghiên cứu phân lập,
tối ưu hóa và áp dụng các chủng vi khuẩn có khả năng phân giải lipid được thực hiện
khá nhiều trên thế giới, đặc biệt ở các nước Nhật Bản, Anh, Ấn Độ và Iran. Ở Việt
Nam, các bài nghiên cứu về vấn đề này cón khá ít.
Với các lý do trên, đề tài “Phân lập và nhận diện vi khuẩn phân giải lipid từ
dầu ăn thực vật” được thực hiện.
1.2. Mục tiêu đề tài
Phân lập được một số dòng vi khuẩn có khả năng phân giải lipid từ dầu ăn thực
vật.

2


CHƢƠNG 2. LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1. Chất béo
2.1.1. Khái niệm
Chất béo là trieste của glixerin với các acid monocacboxylic có số chẵn nguyên
tử C (thường từ 12C đến 24C) không phân nhánh, gọi chung là trigliceride.
Khi thủy phân chất béo thì thu được glixerin và acid béo (hoặc muối).
Chất béo có cơng thức chung là:

(R1, R2, R3 là các gốc hidrocarbon no hoặc khơng no, khơng phân nhánh, có thể
giống nhau hoặc khác nhau).
-

Acid béo no thường gặp là:

C15H31COOH (acid panmitic)
C17H35COOH (acid stearic)
-

Acid béo không no thường gặp là:

C17H33COOH (acid oleic)
C17H31COOH (acid linoleic)
2.1.2. Tính chất của chất béo
a. Tính chất vật lí
- Các chất béo khơng tan trong nước do gốc hidrocarbon lớn của các acid béo
làm tăng tính kị nước của các phân tử chất béo, nhưng tan trong các dung môi hữu cơ
như benzene, chloroform, ether dầu hỏa, ít tan trong cồn.

- Độ sôi của dầu mở cao, thường trên 300oC.
- Tỷ trọng nhỏ hơn 1.
- Chỉ số khúc xạ vào khoảng 1.4690 đến 1.4771.
- Độ nhớt của dầu mỡ cao, từ 0.40 đến 0.92 Poado.
3


- Nhiệt độ nóng chảy phụ thuộc vào cấu tạo của dầu mỡ. Các acid béo no có
nhiệt độ nóng chảy cao hơn các acid béo chưa no. Trong các acid béo chưa no, nhiệt
độ nóng chảy cịn phụ thuộc vào số lượng dây nối đôi và cấu tạo không gian (đồng
phân cis hay trans) của acid béo. Acid béo khơng no càng có nhiều dây nối đơi trong
phân tử, thì nhiệt độ nóng chảy càng thấp. Đồng phân cis có nhiệt độ nóng chảy thấp
hơn acid béo có đồng phân trans. Ví dụ acid oleic có nhiệt độ nóng chảy là 13oC và
đồng phân trans của nó là acid elaidic có nhiệt độ nóng chảy là 51.5oC.
b. Tính chất hóa học
Phản ứng thủy phân trong mơi trường acid:

Trigliceride

glixerin

Acid béo

Phản ứng xà phịng hóa:

glixerin

Trigliceride
-

Xà phịng

Phản ứng xà phịng hóa xảy ra nhanh hơn phản ứng thủy phân trong môi trường
acid và không thuận nghịch.

-

Để xác định chất lượng của chất béo người ta thường dựa vào một số chỉ số sau:
o Chỉ số acid: là số miligram KOH để trung hịa hồn tồn các acid tự do
có trong 1 gram chất béo.
o Chỉ số xà phịng hóa: là tổng số miligram KOH để xà phịng hóa chất
béo và acid tự do trong 1 gram chất béo.
4


o Chỉ số ester: là hiệu của chỉ số xà phịng hóa và chỉ số acid.
o Chỉ số iod: là số gram iod có thể cộng vào liên kết bội trong mạch
carbon của 100 gram chất béo.

Phản ứng hidro hóa:

Tristearin (rắn)

Triolein (lỏng)

Phản ứng hidro hóa chất béo làm tang nhiệt độ nóng chảy của chất béo.
Phản ứng oxi hóa:
Nối đơi C=C ở gốc acid không no của chất béo bị oxi hóa chậm bởi oxi khơng
khí tạo thành peoxit, chất này bị phân hủy thành andehide có mùi khó chịu. Đó là
ngun nhân của hiện tượng dầu mỡ bị ơi thiu.

2.1.3. Sự biến đổi dầu mỡ trong quá trình chiên rán
Rán là cho nguyên liệu vào trong dầu ở nhiệt độ cao. Dầu dung để rán nguyên
liệu có thể là dầu lạc, dầu bông, dầu hướng dương, dầu đậu nành, dầu cọ. Đối với thịt,
có thể dung mỡ động vật để rán.
Mục đích khi rán là:
-

Tăng giá trị cảm quan của sản phẩm.

-

Tăng giá trị dinh dưỡng của sản phẩm.

-

Tiêu diệt hệ thống men và vi sinh vật.

Những biến đổi trong quá trình rán:
-

Trong quá trình rán, do tác dụng của nhiệt độ cao và thời gian dài, do tác dụng
của nước thoát ra từ nguyên liệu và do sự hòa lẫn các gluxit, protein, lipid, tạo
thành nhũ tương, do tiếp xúc với khơng khí trên mặt thống và với mặt truyền
nhiệt, nên dầu bị biến tính.

5


-

Khi rán độ nhớt của dầu tang do các chất dinh dưỡng trong nguyên liệu dịch
chuyển vào dầu, dầu bị xẫm màu.

-

Ở nhiệt độ cao, dầu tiếp xúc với hơi nước và oxi nên bị thủy phân và oxi hóa
thành acid béo, glixerin, rồi thành các chất peoxit, andehide, xeton (có mùi ơi
khét) và acrolein (là chất lỏng độc, khi rán bốc thành khói xanh thốt ra trên
mặt thống của dầu làm cay mắt).
Hiện nay, biện pháp chủ yếu để chống hiện tượng hư hỏng dầu trong khi rán là

duy trì dầu rán trong lị rán với thời gian ngắn nhất. Người ta cịn chống oxi hóa dầu
bằng cách cho chất chống oxi hóa vào dầu rán.
2.2. Vi sinh vật phân giải lipid:
Các vi sinh vật có khả năng dị hóa và loại bỏ các lipid trong nước thải có thể là
nguồn giá trị trong việc xử lý các vấn đề gây ô nhiễm.
Việc nghiên cứu sự phân giải các loại dầu mỡ ăn được từ vi sinh vật đã và đang
được quan tâm từ rất nhiều nhà khoa học như: Okuda và các đồng sự vào năm 1991,
Bednarski 1994, Wakelin và Forster 1997, Matsumiya 2007, Sugimori và Utsue vào
các năm 2011 và 2012.
Hiện nay, chúng ta đã tìm ra được các dòng vi khuẩn như Acinetobacter
sp.SOD-1 từ nghiên cứu của Sugimori và các đồng sự vào năm 2002, Rhodotorula
pacifica ST3411, Cryptococcus laurentii ST3412 của Sugimori vào năm 2009 hay
Acinetobacter sp. SS-192 và Pseudomonas aeruginosa SS-219 của Sugimori và Utsue
vào năm 2012 có khả năng phân giải lipid.
Các loại vi sinh vật khác nhau có khả năng sản sinh các enzyme lipase ngoại
bào, chuyển triglyceride (thành phần chính của dầu thực vật và mỡ động vật) thành các
acid béo và glycerol. Ví dụ như vi khuẩn Pseudomonas fluorescens, Chromobacterium
vinosum và nấm Aspergillus niger, Humicola lanuginose, Rhizopus delemar và
Candida rugosa. Chúng đều tiết ra 1,3-regiospecific lipase enzyme vào môi trường

nuôi dưỡng để di hóa cho việc phân giải lipid.
Khả năng phân giải lipid từ dầu ăn của một số chủng vi khuẩn được thể hiện
qua bảng sau:

6


Bảng 1: So sánh khả năng phân giải lipid của các dòng vi khuẩn
Chủng

Nhiệt độ ủ và Hiệu quả phân

Lipid

thời gian
Acinetobacter sp. UD-4

10,000 ppm dầu 25oC, 7 ngày

giải (%)
60 – 96

ăn
P. aeruginosa T1

Acinetobacter sp.

10,000 ppm dầu 30oC, 5 ngày
ăn

Xấp xỉ 100

8,000 ppm dầu

28oC, 3 ngày

60 – 65

50oC, 2 ngày

54

30oC, 2 ngày

77 – 97

30oC, 24 tiếng

80 – 95

28oC, 24 tiếng

Xấp xỉ 100

37oC, 24 tiếng

89.5 ± 1.5

ăn
R. sphaeroides NAT

3,000 ppm dầu
salad
10,000 ppm dầu

Burkholderia sp. DW2-1

ăn
5,000 ppm dầu

Bacillus sp. strain 351

ăn
4,000 ppm dầu

Hỗn hợp môi trường của C. ăn
cylindracea SL1B1 và B.
arboris SL1B1
P. aeruginosa SS-219

3,000 ppm dầu
ăn

(Theo Sugimori và Utsue, 2012)
2.3. Xác định sự sinh trƣởng của vi sinh vật
2.3.1. Xác định khối lượng tế bào
Sự sinh trưởng của vi sinh vật không chỉ biểu hiện ở số lượng tế bào mà còn ở
cả sự tăng trưởng của tổng khối lượng tế bào. Phương pháp trực tiếp nhất là xác định
trọng lượng khô của tế bào. Trước hết cần ly tâm để thu nhận sinh khối tế bào. Sau đó
rửa tế bào rồi làm khơ trong lị sấy rồi cân trọng lượng khơ. Phương pháp này thích

hợp để xác định sự sinh trưởng của nấm. Phương pháp này tốn thời gian và không thật
mẫn cảm. Đối với vi khuẩn vì trọng lượng từng cá thể là rất nhỏ, thậm chí phải ly tâm
tới vài trăm ml mới đủ số lượng để xác định trọng lượng sinh khối khô.
Phương pháp nhanh hơn, mẫn cảm hơn là dùng phương pháp đo độ đục nhờ tán
xạ ánh sáng. Mức độ tán xạ ánh sáng tỷ lệ thuận với nồng độ tế bào. Lúc nồng độ vi
khuẩn đạt đến 107 tế bào/ml thì dịch ni cấy sẽ vẩn đục, nồng độ càng tăng thì độ đục
7


cũng tăng theo và làm cản trở ánh sáng đi qua dịch ni. Có thể đo độ tán xạ ánh sáng
bằng quang phổ kế (spectrophotometer). Ở một mức độ hấp thụ ánh sáng thấp, giữa
nồng độ tế bào và giá trị hấp thụ ánh sáng có quan hệ tuyến tính (hình 14.9). Chỉ cần
nồng độ vi sinh vật đạt tới nồng độ có thể đo được là đều có thể dùng phương pháp đo
độ đục trên quang phổ kế để xác định sự sinh trưởng của vi sinh vật. Nếu hàm lượng
một số vật chất trong mỗi tế bào là giống nhau thì tổng lượng chất đó trong tế bào có
tương quan trực tiếp với tổng sinh khối vi sinh vật. Chẳng hạn, thu tế bào trong một
thể tích nhất định của dịch nuôi cấy, rửa sạch đi rồi đo tổng lượng protein hay tổng
lượng nitrogen, có thể thấy sự tăng quần thể vi sinh vật là phù hợp với sự tăng tổng
lượng protein (hay N). Cũng tương tự như vậy, việc xác định tổng lượng chlorophyll
có thể dùng đẻ đo sinh khối tảo; đo hàm lượng ATP có thể biết được sinh khối của các
vi sinh vật sống.

Hình 2: Đo số lƣợng vi sinh vật bằng phƣơng pháp đo độ đục.
Thông qua việc đo độ hấp thụ ánh sáng có thể xác định được sinh khối vi sinh
vật. Khi số lượng tế bào tăng lên sẽ dẫn đến việc tăng độ đục, mức độ tán xạ ánh sáng
nhiều hơn và quang phổ kế sẽ đo được mức độ tăng lên của trị số hấp thụ ánh sáng.
Trên quang phổ kế có hai thang chia độ: phía dưới là trị số hấp thụ ánh sáng, phía trên
là mức độ thấu quang. Khi trị số hấp thụ ánh sáng tăng lên thì mức độ thấu quang hạ
xuống.
(Nguồn: ngày 11/03/2009)

8


2.4. Nhận diện vi khuẩn bằng kỹ thuật sinh học phân tử
2.4.1. Trình tự 16S rRNA
16S rRNA (16S ribosomal RNA) là một hành phần của tiểu đơn vị 30S cấu tạo
nên ribosome ở tế bào sơ hạch. 16S rRNA dài khoảng 1542 nucleotide. Các gen mã
hóa cho chúng được gọi là 16S rDNA (DNA ribosome) và được sử dụng để xây dựng
cây phả hệ. Trong một tế bào vi khuẩn có thể tồn tại nhiều chuỗi 16S rRNA (Case et
al., 2007).
16S rRNA có chức năng: (1) Tương tự như 23S RNA, 16S có vai trị cấu tạo
nên cấu trúc của ribosome và hoạt động như các giàn giáo (scaffold) xác định vị trí của
các phân tử protein ribosome. (2) Đầu 3’ chứa trình tự anti-Shine-Dalgarno giúp liên
kết với bộ ba mã mở đầu (AUG) trên mRNA. (3) Tương tác với 23S, hỗ trợ hình thành
liên kết giữa hai bán đơn vị 30S và 50S. (4) Ổn định liên kết chính xác giữa bộ ba mã
hóa và bộ ba đối mã tại vị trí A bằng việc hình thành liên kết hydro giữa nguyên tử N2
của Adenin tại vị trí 1492 và 1493 với gốc 2’OH của mạch sườn mRNA.
Trình tự gen 16S rRNA có chứa các vùng siêu biến nên có thể cung cấp các
trình tự đặc hiệu để có thể định danh vi khuẩn. Phân tích trình tự gen 16S rRNA trở
thành phương pháp phổ biến để định danh vi khuẩn nhanh và chính xác (Clarridge,
2004). Wose là người tiên phong trong việc sử dụng 16S rRNA. Gen 16S rRNA được
sử dụng trong các nghiên cứu về cây phát sinh lồi (Weisburg et al., 1991) vì có tính
bảo tồn cao giữa các loài vi khuẩn và cả cổ khuẩn (Coenye và Vandamme, 2003).
2.4.2. Mồi và cặp mồi tổng
Mồi (primer) là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một
đầu của mạch khuôn và DNA polymerase sẽ nối dài mồi để hình thành mạch mới; các
mồi này gồm một mồi xuôi (forward primer) và mồi ngược (reverse primer) [Trần
Linh Thước, 2005].
Cặp mồi tổng (Universal primer) là mồi được dùng trong phản ứng PCR để

khuếch đại gen 16S rRNA. Các mồi này nhắm đến các gen có trình tự bảo tồn cao và
khuếch đại các gen mục tiêu với các đoạn ngắn.
Thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi tổng để khuếch đại gen 16S rRNA nhằm
định danh và nghiên cứu thông tin về di truyền phả hệ. Phổ biến nhất là cặp mồi được
thiết kế bởi Weisburg et al. (1991) và hiện đang được gọi là 27F và 1492R.
9


2.4.3. Kỹ thuật PCR
Kỹ thuật PCR (Polymerase chain reaction), phản ứng tổng hợp dây chuyền nhờ
polymerase, do Mullis phát minh năm 1985, là kỹ thuật nhân nhanh một đoạn phân tử
DNA trong phịng thí nghiệm (in vitro). Kỹ thuật này hiện được sử dụng phổ biến
trong nhiều lĩnh vực thuộc về sinh học, đặc biệt trong lĩnh vực sinh học phân tử.
Nguyên tắc:
PCR là phương pháp tạo dòng trong in vitro, không cần hiện diện của tế bào.
Kỹ thuật PCR được hình thành dựa trên đặc tính tổng hợp mạch DNA mới từ mạch
khuôn của DNA polymerase với sự hiện diện của mồi chuyên biệt. PCR giúp khuếch
đại một trình tự DNA ban đầu thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của: enzyme
polymerase, một cặp mồi đặc hiệu cho đoạn DNA này, các loại nucleotide tự do, dung
dịch đệm và theo các chu kỳ nhiệt (Trần Linh Thước, 2005). Phản ứng PCR là một
chuỗi gồm nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, lặp đi lặp lại nhiều lần. Số lượng DNA bản sao
được tạo ra tăng theo cấp số nhân (2n).
Mỗi chu kỳ phản ứng PCR gồm 3 bước: (Trần Linh Thước, 2005):
-

Biến tính (denaturation): phân tử DNA được biến tính (mạch đơi DNA tách ra
thành hai mạch đơn) với nhiệt độ cao hơn nhiệt nóng chảy (Tm) của phân tử,
thường là 950C - 950C trong 30 – 60 giây.

-

Bắt cặp (annealing): Nhiệt độ hạ thấp hơn Tm của mồi, cho phép các mồi
chuyên biệt bắt cặp với trình tự DNA khuôn. Nhiệt độ 400C – 700C trong 30 –
60 giây.

-

Kéo dài (elongation): DNA polymerase tổng hợp mạch mới kể từ mồi đã bắt
cặp. Nhiệt độ được tăng lên đến 720C giúp cho DNA polymerase (loại
polymerase chịu nhiệt) hoạt động tổng hợp tốt nhất. Thời gian tùy thuộc độ dài
trình tự DNA cần khuếch đại mà có thể kéo dài từ 30 giây đến vài phút.

2.4.4. Kỹ thuật giải trình tự DNA
Kỹ thuật giải trình tự DNA (DNA sequencing) là kỹ thuật xác định tất cả những hợp
phần do nucleotide hình thành nên phân tử DNA chun tính nào đó (Nguyễn Thị
Lang và Bùi Chí Bửu, 2005). Hiện nay có 2 phương pháp giải trình tự DNA là phương
pháp hóa học, phương pháp dideoxy.

10


Giải trình tự DNA bằng phương pháp hóa học do Maxam và Gilbert đề xuất
năm 1977 nên còn gọi là phương pháp Maxam và Gilbert. Phương pháp này dựa trên
cơ sở phân cắt hóa học tại vị trí đặc biệt của các base, tạo ra một phân tử DNA có đầu
được đánh dấu, hình thành một phân tử được đánh dấu tận cùng bằng một base (A,
hoặc G, hoặc C, hoặc T). Trình tự DNA có thể được đọc từ kết quả của các” ladder”
hay còn gọi là “sequencing ladder” (Nguyễn Thị Lang và Bùi Chí Bửu, 2005).
Giải trình tự DNA bằng phương pháp dideoxy là kỹ thuật do Sanger et al.
(1977) phát minh. Nguyên tắc cơ bản của phương pháp này dựa vào hoạt động của
enzyme DNA polymerase trong quá trình tổng hợp DNA. Enzyme DNA polymerase

xúc tác gắn các nucleotide vào mạch đơn DNA đang tổng hợp ở vị trí 3’OH, khi gặp
nucleotide khơng có nhóm 3’OH thì phản ứng bị dựng lại một cách ngẫu nhiên. Đặc
trưng của phuowngphasp dideoxy là phản ứng được thực hiện riêng rẽ; thành phần
phản ứng bao gồm DNA khuôn, DNA mồi, đầy đủ các loại dNTP, enzyme Tag DNA
polymerase, dung dịch đệm và các điều kiện thích hợp đồng thời có thêm khoảng 1%
mỗi loại ddNTP (dideoxynucleotide: ddATP, ddGTP, ddCTP và ddTTP – các
dideoxynucleotide mất hai nguyên tử oxy ở vị trí C3 và C2). Kết quả phản ứng tổng
hợp nên các đoạn oligonucleotide dài ngắn khác nhau một nucleotide, có thể nhận biết
nhờ phương pháp điện di (Khuất Hữu Thanh, 2006)
Ngày nay, giải trình tự gen bằng máy giải trình tự tự động đã trở nên phổ biến.
Nguyên tắc chung của máy giải trình tự là dựa trên cơ sở phương pháp dideoxy. Máy
đọc trình tự cả trên hai mạch đơn, do vậy có thể phát hiện và giảm nhầm lẫn do kỹ
thuật. Có hai loại mồi (mồi xi và mồi ngược) được sử dụng cho mỗi mạch đơn
DNA. Tiến hành biến tính DNA trong mơi trường có urea và nhiệt độ cao (khoảng
550C), hai mạch đơn DNA tách rời nhau không bắt cặp lại với nhau. Chùm tia laser
đánh dấu vị trí và thời gian đi qua của các nucleotide, từ đó tổng hợp được trình tự sắp
xếp của gen (Khuất Hữu Thanh, 2006).
2.4.5. Công cụ BLAST
Trong tin sinh học, BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) là một thuật
toán dùng để so sánh thông tin của các chuỗi sinh học, chẳng hạn như các chuỗi amino
acid của các phân tự protein khác nhau hoặc nucleotide của các chuỗi DNA. Có 5
chương trình BLAST, các chương trình BLAST được thiết kế bởi Altschul et al.,

11


1990). Trong đó BLAST N (Nucleotide BLAST) cho phép so sánh cấu trúc chuỗi
nucleotide cần phân tích với cấu trúc chuỗi nucleotide trong ngân hàng dữ liệu.
BLAST cho phép so sánh cấu trúc của chuỗi DNA, chuỗi amino acid cần phân
tích với các chuỗi tương ứng lưu trữ trong ngân hàng dữ liệu, nhằm tìm kiếm chuỗi

(hay một số chuỗi) tương đồng nhất với chuỗi cần kiểm tra. Trọng tâm của kỹ thuật
phân tích là tìm kiếm xác định các vùng tương đồng nhau về cấu trúc trên các chuỗi để
xác định mức độ phân ly tương đối của chuỗi cần phân tích với chuỗi khác trong ngân
hàng dữ liệu.Về phương diện kỹ thuật, BLAST cho phép phát hiện sự tương đồng ở
hai mức độ là mang tính cục bộ ở một vùng hay mang tính tổng thể giữa hai chuỗi với
nhau.
2.4.6. Phân tích phát sinh lồi
Trong sinh học, Phylogenetics là ngành khoa học nghiên cứu mối quan hệ tiến
hóa giữa các nhóm sinh vật (như lồi, quần thể, …) dựa vào dữ liệu các trình tự phân
tử hay ma trận dữ liệu về hình thái. Thuật ngữ “Phylogenetics” xuất phát từ sự kết hợp
hai từ gốc Hy lạp: “phylo” có nghĩa là quần thể “bộ tộc” hay lồi là “genesis” có nghĩa
là nguồn gốc hay khai sinh. Vậy “Phylogenesis” được tạm dịch là sự phát sinh lồi.
Phân tích phát sinh lồi (hay cịn gọi là phân tích phả hệ) là phương tiện suy
luận, ước tính các mối quan hệ. Lịch sử tiến hóa được suy luận từ phân tích phát sinh
lồi, thường được mơ tả bằng biểu đồ hình cây phân nhánh trong đó thể hiện các mối
quan hệ di truyền giữa các phân tử (phân tử di truyền), các sinh vật hay cả hai
(Brinkman và Leipe, 2001).
Theo Brinkman và Leipe (2001) q trình phân tích phát sinh lồi có thể chia
thành 4 bước cơ bản sau:
1. Alignment (sắp xếp theo kiểu so sánh giữa các trình tự) [bao gồm cả việc
xây dựng kiểu cơ sở dữ liệu và xuất thành một dãy dữ liệu chứa các trình
tự cần phân tích].
2. Lựa chọn phương pháp xây dựng, kiểm tra và các phương pháp bổ sung
khác.
3. Xây dựng cây phát sinh loài hay cây phả hệ (phylogenetic tree)
4. Đánh giá cây phát sinh loài.

12

Khi xây dựng cây phát sinh loài từ một ma trận dữ liệu, có thể sử dụng phương
pháp khoảng cách (Distance based method) [có phương pháp UPGMA, phương pháp
neighbor joining] hay phương pháp đặc tính (Character based method) [có phương
pháp Minimum Parsimony và phương pháp Maximum Likelihood]. Hiện nay có rất
nhiều phần mềm có thể thực hiện phân tích phát sinh loài như ClustalW, PAUP,
PUZZLE hay PHYLIP,… (Brinkman và Leipe, 2001).
Khi đánh giá cây phát sinh loài, các nhà nghiên cứu trước đây thường sử dụng
phương pháp kiểm tra sai lệch (Skewness test) hay kiểm tra hoán vị (Permutation test).
Sau này các nhà nghiên cứu thường sử dụng phương pháp kiểm tra tỉ lệ xuất hiện
(Likelihood ratio test) để đánh giá các cây phả hệ. Bootstrapping là phương pháp đánh
giá cây phát sinh lồi có lặp lại, các cây này được xây dựng (vẽ) dựa trên các phương
pháp Distance, Minimum Parsimony, Maximum Likelihood và cả các phương pháp
khác. Bootstrapping được phát minh năm 1979 (Efron, 1979) và được giới thiệu như là
phương pháp đánh giá cây phát sinh loài bởi Felsentein (1985). Kết quả phân tích
bootstrapping là giá trị bootstrap (theo phần trăm) gắn liền với một nhánh đặc biệt thể
hiện mối liên hệ của các thành viên trong nhánh.

13


CHƢƠNG 3. PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Phƣơng tiện nghiên cứu
3.1.1. Dụng cụ, thiết bị
Dụng cụ:
 Dụng cụ thu và trữ mẫu nước thải:
o Muỗng, hủ nhựa có nắp
 Dụng cụ phân lập, nuôi cấy vi khuẩn:
o Đĩa petri, ống nghiệm, que cấy, que gạt thủy tinh, đèn cồnbình
tam giác, lam, lamen, ống tuýp chạy PCR, bọc nylon và chai đựng
mẫu đất và mẫu nước…

 Dụng cụ pha chế mơi trường:
o Bình tam giác, ống đong, cốc đong (10 ml, 100 ml, 500 ml, ...)
 Các dụng cụ khác:
o Micropipette (P20, P50, P200, P1000) [Gibson – Đức]
o Eppendorf
o Lame, lamelle, …
Thiết bị:
 Thiết bị dùng trong phân lập vi khuẩn
o Tủ an toàn sinh học (Esco – Singapore)
o Tủ ủ (Binder – Đức)
o Nồi khử trùng nhiệt ướt (Pbinternational – Đức, Tuttnauer – Đức)
o Cân điện tử cấp chính xác 0,01 g (Shimadzu – Nhật Bản)
o Kính hiển vi (Olympus – Nhật Bản)
o Máy đo pH (Eutech – Malaysia)
o Máy lắc vòng
o Máy khuấy từ
o Máy vortex
 Thiết bị dùng trong trích DNA và PCR
14


o Máy li tâm (Heraus – Đức)
o Bộ điện di (Biorad – Mỹ)
o Máy đọc và chụp ảnh gel (Biorad – Mỹ)
o Máy PCR (Perkin Elmer – Mỹ, Biorad – Mỹ)
o Máy sấy chân không
o Water bath
3.1.2. Nguyên vật liệu
- Mẫu nước thải ở ống thoát nước, nơi ứ đọng hàm lượng dầu loang cao, tại các quán
ăn trên địa bàn quận Ninh Kiều, thành phố Cần Thơ.

- Dầu ăn thực vật Cooking oil của công ty cổ phần dầu thực vật Tân Bình – Nakydaco.
- Primer dùng trong kỹ thuật PCR để nhận diện vi khuẩn phân lập được.
3.1.3. Hóa chất
a. Các hóa chất pha mơi trường phân lập và nuôi cấy vi khuẩn
 Môi trường phân lập: 10 g dầu thực vật; 0,5 g (NH4)2SO4; 5 g MgSO4.7H2O; 1
g KH2PO4
 Môi trường Tween20 (E. El-Bestawy et al., 2005): 10 g peptone, 5 g NaCl, 0.1
g CaCl2.2H2O và 20 g agar trong 1 l nước, sau đó bổ sung vào 1% Tween20 và
điều chỉnh pH = 7.5. Tween 20 được khử trùng nhiệt ướt ở 121oC trong 20 phút
trước khi được bỏ vào môi trường.
 ● Môi trường Luria Bertani (LB) (Bennasar et al., 1998): 10 g peptone, 5 g
yeast extract, 5 g NaCl, 20g agar trong 1L nước.
b. Dùng để trích DNA vi khuẩn phân giải lipid:
- TE pH 8,0 hòa tan DNA
- Sodium dodecyl sulfate (SDS) 10% hòa tan DNA và giúp proteinase K hoạt động
tách protein khỏi DNA hiệu quả hơn.
- Isopropanol nhằm tủa DNA
- Ethanol 70% dùng rửa DNA
- Hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB) 10% NaCl 0,75 M
- Proteinase K (20 mg/ml) để loại bỏ protein hoặc polysaccharide khỏi DNA
15


Chloroform: Isoamyl alcohol (tỉ lệ 24:1) nhằm tủa protein và tạo màng ngăn giữa
DNA và protein.
- Lysozyme
- RNase A
- Nước cất hai lần vơ trùng
● 100 µl TE dùng trích DNA vi khuẩn gồm: 10 mM Tris-HCl [pH 7,6]; 1mM EDTA
(Bennasar et al., 1998)

c. Dùng để chạy PCR nhận diện vi khuẩn phân giải lipid
- PCR buffer
- Taq-polymerase
- DNA vi khuẩn
- deoxyribonucleoside triphosphate (dNTPs) gồm dATP, dTTP, dCTP, dGTP
- nước cất vơ trùng
- primer
3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
Q trình nghiên cứu được thực hiện tuần tự theo các bước sau:
1) Thu mẫu chất thải
2) Phân lập vi khuẩn phân giải lipid
3) Mô tả đặc điểm khuẩn lạc và tế bào các dòng phân lập
4) Khảo sát sơ bộ khả năng phân giải lipid
5) Nhận diện vi khuẩn
o Trích DNA, PCR, giải trình tự và BLAST N
6) Phân tích quan hệ di truyền
Thời gian nghiên cứu:
Thời gian thực hiện đề tài 3 tháng kể từ ngày đề cương được duyệt
Địa điểm
 Thu mẫu từ các cống thoát nước, nơi đổ bỏ trực tiếp dầu mở ở các quán ăn
trên địa bàn quận Ninh Kiều, thành phố Cần Thơ. Địa điểm các quán thu

16


mẫu được dựa trên khảo sát thực tế trên các khu vực tập trung đông các
quán ăn, nhà hàng hay các căn tin trong trường đại học Cần Thơ.
 Tiến hành thí nghiệm tại phịng thí nghiệm vi sinh vật và phòng sinh học
phân tử của Viện Nghiên cứu và phát triển Công nghệ Sinh học – Trường
Đại học Cần Thơ.

3.2.1. Thu mẫu
-

Chọn nơi lấy mẫu là các hố ga tại nơi rửa chén của các quán ăn, nơi đổ bỏ
trực tiếp dầu mỡ hay nơi tù động dầu mỡ của nước thải từ các quán ăn ở ao
hồ.

-

Mẫu bao gồm nước thải, bùn hay các vết cặn bám xung quanh nơi lấy mẫu.

-

Mẫu được thu và trữ trong các hũ nhựa có nắp và được xử lý ngay trong
ngày.

3.2.2. Phân lập vi khuẩn phân giải lipid
a. Phân lập (isolation)
- 0.15 g mẫu đất hay 1ml nước thải cho vào 5 ml nước cất và khuấy đều.
- Rút 1% huyền phù chuyển vào 5 ml môi trường phân lập sau đó đem ủ ở 30oC và
140 rpm trong 72 tiếng.
-

Dùng micropipette P200 hút 100 µl từ các mẫu mơi trường phân lập được chọn nhỏ
lên môi trường thạch LB.

-

Dùng que gạt thủy tinh phân phối dịch mẫu trải đều khắp mặt thạch.

-

Đĩa môi trường đã trãi mẫu được ủ ở 30oC trong tủ ủ vi sinh vật từ 1 – 2 ngày để vi
sinh vật phát triển.

-

Chọn các khuẩn lạc khác nhau phát triển trên môi trường trên cấy chuyển nhiều lần
sang môi trường LB mới đến khi các khuẩn lạc rời ra.

17