Nghiên cứu tách chiết các hoạt chất có hoạt tính chống oxy hóa sản xuất bột vẹm xanh Perna viridis đông khô 2

CHƢƠNG 2

VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu
Mẫu vẹm xanh (Perna viridis) đƣợc thu mua từ trại nuôi trồng tại xã Xuân Phƣơng,
thị xã Sông Cầu, Phú Yên (Việt Nam). Vẹm xanh đƣợc thu hoạch vào quý III (từ
đầu tháng 7 đến cuối tháng 9) của năm, cấp đông ảo quản theo các điều kiện tiêu
chuẩn để thực hiện nghiên cứu.
2.2 Hóa chất
Nƣớc cất 2 lần; hexan, K3[Fe(CN)6] 1%; FeCl3 0,1%; dung dịch đệm phosphat
0,2M (pH=6,6) (Na2HPO4.7H2O, NaH2PO4 0,2M, Na2HPO4.12H2O); TCA10%
(Tricloacetic acid 10% ); Vitamin C (100µg/ml); Tris-HCl 0,05M (pH=7,0).
Dung dịch chuẩn DPPH (100µM); etanol; enzym protease (2mg/ml), dung dịch
chuẩn ABTS; K2S2O8; Maltosedextrin.
Enzyme protease SEB-Neural PL thƣơng mại đƣợc mua từ Công ty Hƣng Thịnh đạt
tiêu chuẩn ISO 9002. Các đặc điểm kỹ thuật tuân theo các kỹ thuật tiêu chuẩn dành
cho enzyme thực phẩm của FAO/WHO JECFA, FCC và IFOAM.
2.3 Thiết bị và dụng cụ
2.3.1 Thiết bị
-

Cân kĩ thuật

-

Máy sắc kí khí GC/MS

-

Cân phân tích

-

Tủ lắc

-

Tủ sấy

-

Tủ hút

-

Tủ lạnh

-

Máy đông khô

-

Máy đo độ ẩm

-

Máy sấy phun

-

Máy li tâm

-

Thiết bị chiết soxhle

2.3.2 Dụng cụ

20


-

Đũa thủy tinh

-

Erlen

-

Bóp cao su

-

Đũa thủy tinh

-

Ống nhỏ giọt

-

Giá đỡ ống nghiệm

-

Giấy lọc

-

Ống ly tâm

-

Nhiệt kế

-

Bình cầu 500ml

-

Ống đong

-

Becher

-

Ống nghiệm

-

Bình định mức

-

Micro pipet

-

Bình tia

-

Pipet thẳng

-

Cuvet

2.4 Phƣơng pháp phân tích
2.4.1 Phương pháp xác định hàm ẩm [49]
 Cách tiến hành: Cân 10g mẫu vẹm xanh đã đƣợc xay nhỏ đồng nhất đƣợc cho
vào cốc nung đã iết trƣớc khối lƣợng, sấy mẫu ở 100-105oC đến khối lƣợng
khơng đổi, khi đó lƣợng nƣớc tự do có trong mẫu sẽ bốc hơi hết.
 Cơng thức tính độ ẩm của (W):

(2-1)
Trong đó:

M1 là khối lƣợng cốc nung và mẫu trƣớc khi sấy (g)
M2 là khối lƣợng cốc nung và mẫu sau khi sấy (g)
M là khối lƣợng mẫu đem sấy (g)

2.4.2 Xác định hàm lượng kim loại, khoáng bằng phương pháp đo phổ hấp thụ
nguyên tử (AAS)
 Cách tiến hành:
o

Cân từ 10g đến 20g mẫu thử, chính xác đến 0,1mg cho vào chén nung.

Trong khi tro hóa, nếu khả năng sơi mạnh thì cần sấy trong tủ, trên nồi cách thủy
hoặc bếp điện ở 100°C. Tro hóa trong lị nung cài đặt chƣơng trình. Đặt chén vào

20


lị nung ở nhiệt độ an đầu khơng cao hơn 100°C. Tăng nhiệt độ với tốc độ tối đa
50°C/ giờ đến 450°C (kim loại) và 525°C (khoáng). Để yên chén ít nhất 8 giờ hoặc
qua đêm [25], [26].
o

Lấy chén nung ra khỏi lò và để nguội. àm ƣớt tro bằng 1ml đến 3ml nƣớc
và cho ay hơi trên nồi cách thủy hoặc bếp điện. Đặt chén nung trở lại lò ở
nhiệt độ không quá 200°C và tăng đến 450°C (kim loại) và 525°C
(khoáng) với tốc độ tăng nhiệt 50°C/ giờ đến 100°C/ giờ. Tiếp tục tro hóa
trong 1 giờ đến 2 giờ hoặc lâu hơn. ặp lại quy trình cho đến khi sản phẩm

đƣợc tro hóa hồn tồn, tức là tro có màu trắng/xám hoặc sáng màu. Số lần
cần thiết lặp lại tùy thuộc vào từng loại sản phẩm.

o

Với mẫu đo kim loại. Thêm 5ml dung dịch acid clohydric 6M vào chén
nung đảm bảo rằng tất cả tro đều tiếp xúc với acid. àm ay hơi acid trên
nồi cách thủy hoặc bếp điện. Hòa tan tro trong 10ml đến 30ml dung dịch
acid nitric 0,1M, chính xác đến 0,1ml.

o

Với mẫu đo khống, hịa tan tro trong 5ml HNO3 1M, làm ấm trên nồi hơi
hoặc bếp từ 2 phút - 3 phút để hỗ trợ dung dịch. Thêm dung dịch vào bình
định mức 50ml và định mức bằng HNO31M. Thêm dung dịch LaCl3 vào độ
pha loãng cuối cùng của từng dung dịch chuẩn và mẫu thử để tạo ra 0,1%
(w/v) a để xác định Mg.

o

Xoay chén nung để cho tất cả tro đều tiếp xúc với acid. Đậy mặt kính đồng
hồ và để yên khoảng 1 giờ đến 2 giờ. Sau đó, khuấy kỹ dung dịch trong
chén nung bằng que khuấy và chuyển tất cả vào chai nhựa. Xử lý mẫu trắng
giống nhƣ đối với mẫu thử. Thực hiện hai phép thử mẫu trắng cho mỗi mẻ
phân tích.

o

Đo phổ hấp thu nguyên tử: Chiều dài ƣớc sóng, hỗn hợp khí và các thơng
số kỹ thuật khác thích hợp nhất với từng kim loại đƣợc nêu trong sách

hƣớng dẫn do các nhà sản xuất thiết bị cung cấp. Các thông số khuyến cáo
đƣợc nêu trong bảng 2.1.

21


Bảng 2.1 Các thông số thiết bị đối với kỹ thuật đo AAS
Ngun tố

Ngọn lửa

Bƣớc sóng (nm)

Fe

Dinitơ monoxit-axetylen, oxy hóa

248,30

Cu

Khơng khí-axetylen, oxy hóa

324,70

Zn

Khơng khí-axetylen, oxy hóa

213,90

Mg

Khơng khí-axetylen, oxy hóa

285,20

K

Khơng khí-axetylen, oxy hóa

227,00

Cơng thức tính: Tính hàm lƣợng kim loại trong mẫu thử, X, biểu thị bằng miligam
trên kilogam (mg/kg), theo cơng thức:
(2-2)
Trong đó:
C là nồng độ kim loại trong dung dịch thử, tính bằng miligam trên lít
(mg/l);
C0 là nồng độ trung bình của kim loại trong dung dịch thử trắng, tính bằng
miligam trên lít (mg/l);
V là thể tích của dung dịch thử, tính bằng mililit (ml);
m là khối lƣợng của phần mẫu thử, tính bằng gam (g).
2.4.3 Xác định hàm lượng iod bằng phương pháp quang phổ nguồn plasma
cảm ứng cao tần kết nối khối phổ (ICP-MS)[27]


Cách tiến hành: Cân khoảng 100mg đến 500mg mẫu (tính theo chất khơ),

chính xác đến 1mg, thêm 5ml nƣớc và trộn kỹ. Thêm 1ml dung dịch TMAH trộn

kỹ, làm kín ình và đặt trong tủ sấy đã làm nóng trƣớc đến 90oC trong 3 giờ. Sau

22


khi nguội, chuyển định lƣợng chứa sang ình định mức 25ml và pha loãng bằng
nƣớc đến vạch. Lọc qua bộ lọc màng lỗ 0,45µm.


Sau khi thiết bị đã đƣợc hiệu chuẩn, tiến hành phân tích mẫu thử. Mỗi mẫu

pha lỗng đƣợc lọc từ 5-10ml và phân tích bằng ICP-MS. Tốc độ đếm của các tín
hiệu thử nghiệm giảm dần theo sự tăng tổng hàm lƣợng muối của dung dịch mẫu
thử. Việc hiệu chỉnh hiệu ứng nền này bằng chất chuẩn nội sẽ hợp lý trong các
trƣờng hợp nếu cƣờng độ của nó trong dung dịch mẫu khác với cƣờng độ trong
các dung dịch hiệu chuẩn q 30%.


Cơng thức tính:
(2-3)

Trong đó:
C: nồng độ mẫu (mg/ml, trong đó dung dịch mẫu đọc trên đƣờng cong);
V: thể tích dịch chiết (ml);
d: hệ số pha loãng;
W: khối lƣợng mẫu (g);
S: nồng độ mẫu của iod (µg/100g)
2.4.4 Xác định hàm lượng canxi, photpho bằng phương pháp quang phổ
nguồn plasma cảm ứng cao tần kết nối khối phổ (ICP-MS)


Cách tiến hành: Cân chính xác 1g mẫu thử, sấy khô và nghiền cho vào chén

sứ tráng men, dạng cao. Tro hóa 2 giờ ở 500°C và để nguội. Tro ƣớt với 10 giọt
H2O và cẩn thận thêm 3-4 ml HNO3 (1:1). àm ay hơi HNO3 dƣ trên tấm nóng
100-120°C. Quay trở lại lị và tro hóa thêm 1 giờ ở 500°C. Làm nguội chén, hòa
tan tro trong 10ml HCl (1:1) và chuyển định lƣợng sang ình định mức 50 ml. Pha
lỗng đến thể tích bằng H2O. [26].


23


Xác định nguyên tố đƣợc thực hiện bằng phƣơng pháp quang phổ phát xạ plasma
kết hợp tự cảm. Hiệu chuẩn của thiết bị đƣợc thực hiện thông qua việc sử dụng các
tiêu chuẩn hiệu chuẩn đã iết. Sau khi hiệu chuẩn xong, các giải pháp kiểm tra có
thể đƣợc phân tích.


Cơng thức tính: Tính nồng độ cho từng phần tử của từng dung dịch thử đã
pha lỗng theo µg/ml.
(2-4)

Trong đó:
a: là hàm lƣợng nguyên tố Ca hoặc P trong mẫu, tƣơng ứng với cƣờng độ
phát xạ đƣợc đo trên đồ thị chuẩn (ppm);
Vđm: là thể tích định mức của dung dịch đo phổ (ml);
m: là khối lƣợng mẫu lấy để phân tích (g);
Fd: hệ số pha lỗng.
2.4.5 Xác định hàm lượng vitamin B1 bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu

năng cao (HPLC)


Cách tiến hành: Mẫu đƣợc đồng hóa và xử lý bằng enzyme. Mẫu thử đã xử

lý bằng enzyme đƣợc ly tâm và lọc qua giấy lọc hoặc đầu lọc cỡ 0,45µm (nhằm
loại bỏ các hợp chất gây nhiễu và bảo vệ cột HPLC). Tiến hành oxy hóa thiamin
thành thiocrom. Dung dịch mẫu đƣợc ơm vào hệ thống HP C pha đảo. Bơm các
thể tích giống nhau gồm dung dịch chuẩn, mẫu và mẫu trắng vào hệ thống HPLC.
Nhận dạng thiocrom bằng so sánh thời gian lƣu của các pick riêng lẻ trong sắc ký
đồ thu đƣợc từ dung dịch mẫu và dung dịch chuẩn [28].


Tính kết quả: Sử dụng đƣờng chuẩn, tính khối lƣợng vitamin B1, biểu thị

theo thiamin clorua hydroclorua, bằng mg/100g mẫu.

24


(2-5)
Trong đó:
Ats: là diện tích pick hoặc chiều cao pick của thiocrom thu đƣợc với dung
dịch mẫu thử, tính bằng đơn vị chiều cao hoặc diện tích;
Ast: là diện tích pick hoặc chiều cao pick của thiocrom thu đƣợc với dung
dịch thử chuẩn, tính bằng đơn vị chiều cao hoặc diện tích;
Vts: là thể tích dung dịch mẫu thử, tính bằng mililit (ml);
ρ: là nồng độ khối lƣợng của thiamin clorua hydroclorua trong dung dịch
chuẩn (µg/ml);
ms: là khối lƣợng mẫu, tính bằng gam (g);

100: là hộ số để tính hàm lƣợng trên 100g;
1000: là hệ số chuyển đổi µg/100g thành mg/100g;
Báo cáo kết quả vitamin B1 bằng mg/100g đƣợc biểu thị theo thiamin
clorua hydroclorua (M=337,28).
2.4.6 Xác định hàm lượng vitamin B12 bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu
năng cao (HPLC)


Cách tiến hành: Chuẩn bị mẫu thử trong điều kiện tránh ánh sáng UV. Bảo

quản mẫu thử đã chuẩn bị ở nhiệt độ từ 2oC đến 8oC và sử dụng trong vịng 14
ngày. Đồng hóa mẫu thử. Thêm 30ml dung dịch đệm natri acetat 0,1M và 1ml
dung dịch kali xyanua 1%. Đun nóng mẫu ở nhiệt độ 105oC, 60 phút. Sau đó, lấy
mẫu ra và làm nguội trong bể nƣớc đá. Cô đặc và làm sạch mẫu bằng cột SPE C18
loại 600mg. Sử dụng 44 ml axetonitril 25% vào các cột SPE 600mg để rửa giải
vitamin B12. Sau đó dịch cơ đƣợc hòa tan trong nƣớc và đƣợc ơm vào máy
HPLC. Với pha động D: Dung dịch axetonitril 2,5%, tốc độ dòng: 1,2 ml/phút;

25


điều chỉnh sao cho dịch rửa giải vitamin B12 chảy từ cột rây phân tử trong thời
gian từ 10,5 phút đến 14,5 phút [29].


Tính kết quả: Tính phần khối lƣợng của vitamin B12 trong mẫu thử, X

(µg/kg), theo cơng thức sau:
(2-6)
Trong đó:

Ci: là nồng độ vitamin B12 trong dung dịch mẫu thử đƣợc ơm vào thiết bị
HP C, đƣợc xác định từ đƣờng chuẩn, tính bằng microgram trên lít (µg/l);
D1: là thể tích dung dịch pha lỗng thứ nhất, tính bằng mililit (D1=100ml);
D2: là thể tích dung dịch pha lỗng cuối cùng, tính bằng mililit (ml);
V: là thể tích dịch lọc đƣợc đƣa lên cột SPE, tính bằng mililit (ml);
w: là khối lƣợng mẫu, tính bằng gam (g).
2.4.7 Xác định hàm lượng vitamin A bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng
cao (HPLC)


Cách tiến hành: Khởi động hệ thống HPLC và cho phép làm nóng và cân

bằng trong tối thiểu 30 phút với pha động di chuyển với tốc độ dòng chảy là 1
ml/phút.Tiêm các vitamin chuẩn đã đƣợc thực hiện thơng qua xà phịng hóa vào hệ
thống HPLC. Điều chỉnh pha động để đạt đƣợc độ phân giải 1,5 hoặc tốt hơn. Các
pha A và B di động lần lƣợt là nƣớc/metanol (20:80) và metanol (100%), với cả
hai pha di động bao gồm cả acid formic 0,1%. Các thông số khác bao gồm tốc độ
dòng pha di động 0,25 đến 0,50 ml/phút, nhiệt độ cột 29°C, thể tích tiêm mẫu 5μl,
năng lƣợng va chạm 21V, áp suất khí ion 50 psi, nhiệt độ ion hóa 320°C [30].


Cơng thức tính: Sử dụng tiêu chuẩn USP. Xác định yếu tố đáp ứng cho

vitamin A (RFA):

26


(2-7)
Trong đó:

PkHTstd là chiều cao cực đại hoặc diện tích tiêu chuẩn từ sắc ký đồ;
mlstd là ml của tiêu chuẩn làm việc đƣợc sử dụng trong thủ tục;
concstd sự cô đặc của USP vitamin A (dƣới dạng retinol) trên mỗi chứng
nhận USP (mg/g);
mgstd là mg tiêu chuẩn USP đƣợc cân trong phần thuốc thử.
10000 các yếu tố pha loãng kết hợp cho tiêu chuẩn vitamin A.
Thêm chiều cao hoặc diện tích pick đã hiệu chỉnh cho đồng phân 13-cis với đồng
phân all-trans để có tổng chiều cao hoặc diện tích của mẫu thử. Tính nồng độ
vitamin A (tính bằng µg/g dƣới dạng retinol) theo phƣơng trình sau:
(2-8)
Trong đó:
RFA: yếu tố ảnh hƣởng vitamin A;
PkHTSPLE: tổng chiều cao mẫu thử của diện tích hoặc diện tích của tất cả
trans và 13-cis retinol;
100: khối lƣợng pha loãng của phần thử nghiệm, ml;
W: trọng lƣợng của phần kiểm tra.
2.4.8 Xác định hàm lượng acid béo bằng phương pháp sắc ký khí (GC-MS)


Cách tiến hành:

27


Cân chính xác 100mg mẫu thử đã đồng nhất vào bình mojonnier có nhãn. Thêm
100mg acid pyrogallic và 2ml dung dịch chuẩn nội triglyceride, 2,0ml ethanol và
trộn đều cho đến khi toàn bộ phần mẫu thử đồng nhất trong dung dịch. Thêm 10ml
HCl 8,3M và trộn đều. Đặt bình vào rổ trong bể siêu âm ở 70-80oC đƣợc đặt ở tốc
độ khuấy trộn vừa phải trong 40 phút. Thêm 25ml dietyl ete vào bình mojonnier.
Đậy nắp ình và đặt trong máy ly tâm. y tâm 5 phút. Đổ lớp ether (trên cùng) dƣ

lƣợng còn lại trong cốc chứa chất béo chiết xuất. Tiến hành methyl hóa.
Hịa tan dƣ lƣợng chất béo chiết xuất trong 2-3ml chloroform và 2-3ml dietyl ete.
Cho ay hơi đến khô trong bể nƣớc 40oC. Thêm 2ml thuốc thử BF3 7% và 1ml
toluene. Bịt kín lọ bằng nắp vặn có chứa vách ngăn ằng chất liệu teflon/silicone.
Đặt lọ trong lò 45 phút ở 100oC. Lắc nhẹ lọ cứ sau 10 phút. Làm nguội sau đó
thêm 5ml H2O, 1ml hexane và khoảng 1g Na2SO4. Đậy nắp lọ và lắc 1 phút đến
khi có hiện tƣợng tách lớp, sau đó chuyển lớp trên cùng sang một lọ khác chứa 1g
Na2SO4 ( ƣu ý: ớp trên cùng chứa FAME bao gồm FAME của dung dịch chuẩn
triglyceride). Tiêm FAME vào lọ lấy mẫu tự động để phân tích GC.
Sử dụng dung dịch chuẩn FAME để tối ƣu hóa phản ứng sắc ký trƣớc khi tiêm
mẫu. Sau khi tất cả các điều kiện sắc ký đã đƣợc tối ƣu hóa, tiêm dung dịch thử
nghiệm [31].


Cơng thức tính:
Tính hệ số đáp ứng (Ri) cho mỗi acid béo i như sau:
(2-9)

Trong đó:
Psi: diện tích pick của acid béo riêng trong dung dịch chuẩn FAME hỗn
hợp;
PsC11:0: diện tích pick của acid béo C11:0 trong dung dịch chuẩn FAME hỗn
hợp;

28


WC11:0: trọng lƣợng của chuẩn nội trong dung dịch chuẩn FAME hỗn hợp;
Wi: trọng lƣợng của FAME cá nhân trong giải pháp tiêu chuẩn FAME hỗn
hợp.

Tính lượng cá thể (triglyceride) (WTG) trong mẫu thử như sau:
(2-10)
Trong đó:
Pti: diện tích cực đại của acid béo i trong phần thử nghiệm;
WtC11:0: trọng lƣợng của C11:0 tiêu chuẩn nội bộ đƣợc thêm vào phần thử
nghiệm (g);
1,0067: chuyển đổi tiêu chuẩn nội bộ từ triglyceride sang FAME;
PtC11:0: diện tích cực đại của C11:0 trong phần thử nghiệm;
ƒTGi: hệ số chuyển đổi cho FAME thành triglyceride cho từng acid béo
riêng lẻ.
Tính tổng lượng chất béo trong mẫu thử (tổng của tất cả các acid béo; được
biểu thị dưới dạng triglyceride (bao gồm cả dạng cis và trans của acid khơng
bão hịa đơn) như sau:
(2-11)
Trong đó: Wmẫu thử = khối lƣợng mẫu (g)
Tính trọng lượng của từng acid béo (Wi) như sau:
(2-12)
ƒFai: các yếu tố chuyển đổi để chuyển đổi FAME thành các acid éo tƣơng ứng của
chúng.

29


2.4.9 Xác định hàm lượng acid amin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng
cao (HPLC)
Phƣơng pháp này đƣợc tiến hành trên máy Agilent 1200 HPLC với ơm kép
G1311A và detector G1315B Diode Array Detector (DAD), buồng chạy 10mm.
Cài đặt DAD: UV: 338nm, 10nm bandwidth (bw), reference: 390nm, 20nm bw
(cho các acid amin OPA) 262nm, 16nm bw, reference: 324nm, 8nm bw (cho các
acid amin FMOC). Độ rộng peak: > 0,03 phút (0,5 giây). Slit: 4nm. Cột ZORBAX

Eclipse-AAA 4,6 x 150mm (5µm) để đo với độ nhạy vừa phải, độ phân giải cao tại
áp suất thấp.
Hỗn hợp để phân tích sắc ký bao gồm 17 acid amin từ hỗn hợp acid amin chuẩn
250 pmol/µl standard mix (PN: 5061-3331) và citrulline và 6 acid amin bổ sung,
đƣợc hòa trộn tại nồng độ khoảng 250 pmol/µl. Hỗn hợp acid amin để dựng đƣờng
chuẩn bao gồm 17 acid amin từ hỗn hợp chuẩn và 4 acid bổ sung, cùng với thành
phần chuẩn norvaline và sarcosine (PN: 5062-2478) đƣợc pha ở các nồng độ xác
định.


Cách tiến hành: Cân 1g mẫu cho vào bình tam giác cổ nhám, bổ sung 75ml

HCl 6M chứa 0,1% phenol. Sau đó, đƣợc đƣa vào hệ thống khí agon để đuổi hết
khí O2 trong vịng 10 phút. Tiếp theo, vặn chặt nắp, ủ ở 110oC trong 24 giờ. Dung
dịch thủy phân đƣợc lọc và làm khô bằng máy cô quay. Sau đó cao chiết đƣợc hịa
tan trong acid HCl lỗng 0,01M đến 50ml. Dịch acid amin đƣợc ơm vào máy
HP C theo chƣơng trình đã chọn trên.
2.4.10 Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Kjeldahl


Nguyên tắc: Mẫu đƣợc phân hủy trong acid sulfuric với sự có mặt của chất

xúc tác. Nitơ từ protein và một số thành phần khác đƣợc chuyển đổi thành amoni
sunfate. Sản phẩm phân hủy đƣợc kiềm hóa bằng dung dịch natri hydroxyde và
giải phóng amoniac bằng cách chƣng cất vào lƣợng dƣ dung dịch acid boric.
Chuẩn độ amoniac bằng dung dịch chuẩn acid. Hàm lƣợng nitơ đƣợc tính từ lƣợng
amoniac tạo thành. Kết quả đƣợc chuyển đổi thành "protein thô" bằng cách nhân
với một yếu tố (thƣờng là 6,25) [32].
30



Cách tiến hành:

Cân 1g mẫu, chính xác đến 1mg, chuyển định lƣợng vào bình Kjeldahl khơ. Thêm
25ml acid sulfuric và 10g chất xúc tác, phân hủy trong tủ hút, cho vào chậm và
xoay nhẹ ình để tránh tạo bọt quá mức. Đun sơi hỗn hợp trong ít nhất 45 phút sau
khi dịch phân hủy thành màu xanh nhạt rõ ràng. Để nguội dịch hoàn toàn và thêm
100-200ml nƣớc. Trộn và chuyển vào ình chƣng cất. Thêm 80-85ml dung dịch
natri hydroxyde bão hịa.
Chƣng cất amoniac vào 25ml acid clohydric 0,1N có chứa vài giọt chỉ thị methyl
red. Hoặc chƣng cất vào 50ml acid boric 2% có chứa chất chỉ thị bromocresol
xanh. Acid boric là trung tính với chỉ thị này và amoni borat kiềm đƣợc tạo thành
đƣợc chuẩn độ trực tiếp với HCl 0,1N. Chuẩn độ acid dƣ ằng NaOH 0,1N.


Công thức tính:
(2-13)

Trong đó:
V: là ml acid 0,1N đƣợc thêm vào - ml dung dịch NaOH 0,1N đƣợc sử
dụng để trung hòa nitơ amoniac.
W: là khối lƣợng của mẫu.

31


2.4.11 Bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ enzyme thích hợp so với nguyên liệu[8]
2.4.11.1

Khảo sát nồng độ enzyme và thời gian phản ứng.

Hỗn hợp phản ứng đƣợc chuẩn bị với 4,5 g vẹm xanh trong 100 ml Tris - hydrochloride
0,05 M (Tris-HCl, pH 7,0), tiến hành thủy phân với dãy nồng độ enzyme protease (0,5,
1,0, 1,5 và 2,0 mg / ml) ở nhiệt độ phòng (250C) trong ba khoảng thời gian (360, 488 và
600 phút). Dừng phản ứng thủy phân bằng cách bổ sung dung dịch TCA 10% theo tỉ lệ
1:1 trong 30 phút. Lớp dịch nổi phía trên có chứa dịch thủy phân đƣợc thu bằng cách ly
tâm ở tốc độ 13.000 vòng/phút trong 15 phút. Để xác định lƣợng sản phẩm tạo thành, 2ml
dịch thủy phân và 1ml dung dịch thuốc thử Folin & Ciocalteu 0,5M đƣợc trộn trong dung
dịch natri cacbonat 0,5M rồi ủ ở 500C trong 30 phút. Sản phẩm thủy phân đƣợc đo ằng
máy quang phổ ở ƣớc sóng 660 nm.

2.4.11.2

Khảo sát nồng độ cơ chất bột vẹm xanh.

Sau khi xác định đƣợc nồng độ enzyme và thời gian phản ứng tối ƣu, tiến hành khảo sát
nồng độ cơ chất bột vẹm xanh bằng cách sử dụng dãy nồng độ cơ chất gồm 0.5, 1.5, 2.5,
3.5 và 4.5 g vẹm xanh trong Tris-HCl 0,05 M (pH 7,0). Phản ứng thủy phân đƣợc thực
hiện với việc bổ sung 2 mg/ml protease cho mỗi ống phản ứng và đƣợc ủ ở 250C trong
600 phút. Sau khi ủ 600 phút, ngừng phản ứng thủy phân bằng cách bổ sung dung dịch
TCA 10% theo tỉ lệ 1:1 trong 30 phút. Lớp dịch nổi phía trên có chứa dịch thủy phân
đƣợc thu bằng cách ly tâm ở tốc độ 13.000 vòng/phút trong 15 phút. Để xác định lƣợng
sản phẩm tạo thành, 2ml dịch thủy phân và 1ml dung dịch thuốc thử Folin & Ciocalteu
0,5M đƣợc trộn trong dung dịch natri cacbonat 0,5M rồi ủ ở 500C trong 30 phút. Sản
phẩm thủy phân đƣợc đo ằng máy quang phổ ở ƣớc sóng 660 nm.

2.4.12

Phương pháp thủy phân protein bằng enzyme

Bột vẹm xanh đƣợc trộn vào trong dung dịch Tris-HCl (pH=7,0) để dịch vẹm xanh
đạt nồng độ 45mg/ml. Enzym protease (60mg/ml) pha loãng đạt nồng độ 2mg/ml
trong dung dịch Tris-HCl (pH=7,0). Bổ sung dung dịch enzyme pha loãng trên vào
dịch vẹm xanh theo tỉ lệ 1:1. Thủy phân trong 10 giờ ở điều kiện 25oC đƣợc tính
tại thời điểm bổ sung enzyme. Ngừng phản ứng thủy phân bằng TCA 10% theo tỉ
lệ 1:1 (enzyme + dịch vẹm xanh: TCA) trong 30 phút. Tiến hành ly tâm

32


13000rpm/phút trong 15 phút để loại bỏ tủa protein và enzyme cịn sót lại. Thu hồi
dịch thủy phân, kết thúc quá trình thủy phân.
2.4.13 Phương pháp xử lý số liệu
Các số liệu đƣợc xử lí trên Excel, đƣợc trình bày dạng Mean ± SE. Các thuật toán
thống kê Student's t-test đƣợc sử dụng để kiểm tra sự sai khác có ý nghĩa so với
đối chứng, với P < 0,05 đƣợc coi là sai khác có ý nghĩa thống kê.
Số liệu đƣợc phân tích bằng chƣơng trình Graph pad prism v8.0.2. Từ kết quả
phân tích, xác định mức tối ƣu của các yếu tố cho sản lƣợng protein đạt cực đại.
2.4.14 Phương pháp bắt gốc tự do DPPH [50]
Phƣơng pháp ắt gốc tự do DPPH là phƣơng pháp đơn giản, dễ thực hiện, cho kết
quả ổn định. Phƣơng pháp này dùng để thực hiện phản ứng mang tính chất sàng
lọc tác dụng chống oxy hóa của mẫu nghiên cứu trong thử nghiệm an đầu.


Ngun tắc: Hoạt tính chống oxy hóa thể hiện qua việc đánh ắt gốc tự do,

làm giảm màu của DPPH, sự giảm màu đó sẽ đƣợc xác định bằng cách đo quang ở
ƣớc sóng 517 nm (Viện dƣợc liệu, 2006; Wojdylo A. et al, 2007).



Chuẩn bị thuốc thử và mẫu thử: Cân 2,7mg DPPH cho vào ình định mức
25ml. Thêm 25ml MeOH, lắc mạnh cho tan hết, sau đó thêm MeOH vào
cho đủ 25ml. Để ổn định trong tối 30 phút, 4oC.

2.4.15 Phương pháp bắt gốc tự do ABTS [50]
Khả năng ắt gốc tự do ABTS đƣợc xác định theo phƣơng pháp của Re và cộng sự
(1999).


Nguyên tắc: Cation ABTS++ [2,2’-azinobis(3- ethylbenzothiazoline-6-

sulfonate] là một chất phát quang màu xanh, đƣợc đặc trƣng ở độ hấp thu λ=734
nm. Khi cho chất chống oxy hóa vào dung dịch chứa ABTS++, các chất chống
oxy-hóa sẽ khử ion này thành ABTS. Đo độ giảm độ hấp thu của dung dịch ở ƣớc
sóng 734nm so với mẫu đối chứng để xác định hoạt tính của chất chống oxy hóa.
Khả năng ắt gốc tự do ABTS của một cao chiết (hoặc chất chống oxy hóa) ở
nồng độ xác định đƣợc biểu diễn thơng qua phần trăm ức chế (I%).
33


CHƢƠNG 3

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Xác định thành phần nguyên liệu
Tiến hành xác định kích thƣớc vẹm xanh sử dụng trong thí nghiệm bằng cách đo
các thơng số chiều dài, chiều rộng và khối lƣợng. Nguyên liệu vẹm xanh sử dụng
đƣợc xác định qua các thông số trong bảng 3.1.

Bảng 3.1 Kích thƣớc của vẹm xanh

3.1.1

Kích thƣớc

Vẹm xanh

Chiều dài (cm ± SD)

13,60 ± 0,23

Chiều rộng (cm± SD)

5,34 ± 0,41

Khối lƣợng (g ± SD)

31,25 ± 4,47

Hàm lượng protein vẹm xanh

Nguyên liệu vẹm xanh có hàm lƣợng các acid amin cao, đáng chú ý là hàm lƣợng
methionine của vẹm xanh (0,22mg/100g) là giữ nhiệm vụ đặc iệt trong đó là khả
năng chuyển thành phân tử chứa lƣu huỳnh đảm nhiệm nhiều vai trị khác nhau,
ao gồm ảo vệ các mơ, chỉnh sửa DNA và duy trì hoạt động của tế ào. Ngồi ra,
methionine cịn giữ một vai trị quan trọng khác trong quá trình tạo ra các protein
mới thay thế các protein cũ đã già hoặc bị hƣ hại. Điều này cho thấy khả năng của
nguyên liệu vẹm xanh hỗ trợ tốt cho cơ thể tái tạo năng lƣợng và chống lại các tác
động gây oxi hóa bên ngồi.

Ngồi ra, tổng acid amin thiết yếu (∑E = 3,92mg/100g), tổng các acid amin không
thiết yếu (∑NE = 5,34mg/100g), và hàm lƣợng của từ loại acid amin trong vẹm
xanh đƣợc xác định cụ thể trong bảng 3.2.

36


Bảng 3.2 Hàm lƣợng protein của vẹm xanh Việt Nam
Hàm lƣợng
Histidine

0,18c

Arganine

0,67c

Threonine

0,40c

Valine

0,39c

Methionine

0,22c

Isoleucine

0,39c

Leucine

0,61c

Phenylalanine

0,36c

Lysine

0,70c

∑E

3,92c

Glutamic acid

1,35c

Hàm lƣợng acid Proline

0,42c

amin

Glycine

1,08c

Alanine

0,52c

Cystine

0,20c

Aspartic acid

0,94c

Tyrosine

0,38c

Serine

0,45c

Taurine

-

Citrulline

-

∑NE

5,34c

Tỉ lệ ∑E/∑NE

0,734
11,40c

Hàm lƣợng Protein

c

: đơn vị tính là g/100g;

∑E: Tổng acid amin thiết yếu
37


∑NE: Tổng acid amin không thiết yếu
Hàm lƣợng acid amin thiết yếu Lysin đạt 0,70g/100g nguyên liệu, acid amin
không thiết yếu nhƣ Glycine chiếm hàm lƣợng 1,08g/100 trên tổng hàm lƣợng
acid amin không thiết yếu là 5,34 g/100 g nguyên liệu an đầu.
3.1.2

Hàm lượng acid béo của vẹm xanh

Xác định hàm lƣợng acid béo của vẹm xanh ở Việt Nam điều đáng chú ý là chỉ
tiêu hàm lƣợng omega 3, 6 và 9. Hàm lƣợng omega 3 có trong vẹm xanh (∑omega

3 = 491,5mg/100g), hàm lƣợng omega 6 của vẹm xanh (∑ omega 6 =
98,4mg/100g). Đối với hàm lƣợng omega 9 của vẹm xanh (∑ omega 9 = 45,3
mg/100g. Với hàm lƣợng omega 3,6,9 cao của vẹm xanh thì đây sẽ là một nguồn
cung cấp các acid béo tốt cho cơ thể con ngƣời. Hàm lƣợng của các acid béo còn
lại đƣợc xác định trong bảng 3.3.
Bảng 3.3 Hàm lƣợng acid béo vẹm xanh
Acid béo

Hàm lƣợng (mg/100g)

C14:0

154,00a

C16:0

422,00a

C16:1

170,00a

C18:0

145,00a

C18:1

18,70a

C18:2

22,00a

C18:3

61,50a

C20:1

26,60a

C20:4

76,40a

C20:5

247,00a

C22:1

156,00a

C22:6

183,00a
38

a: đơn vị tính là mg/100g;
3.1.3

Thành phần khống chất, vitamin và kim loại của vẹm xanh Phú Yên

3.1.3.1 Thành phần khống chất
Tiến hành phân tích thành phần khống trên vẹm xanh ở Việt Nam tập trung vào
các chỉ tiêu: hàm lƣợng kali, canxi, sắt, magie, kẽm, photpho, iod, đồng.
Vẹm xanh có tổng khống chất 496,847mg/100g thịt. Cụ thể, về hàm lƣợng kali,
vẹm xanh (162mg/100g); hàm lƣợng sắt trong vẹm xanh (1,82mg/100g); magie có
trong vẹm xanh (46,30mg/100g); hàm lƣợng đồng của vẹm (0.23mg/100g), hàm
lƣợng kẽm có trong vẹm xanh (1,38mg/100g). Vẹm xanh có hàm lƣợng các chỉ
tiêu về hàm lƣợng canxi, phốt-pho và iod cao. Cụ thể, kết quả đƣợc trình bày trong
bảng 3.4 cho ta thấy rằng, hàm lƣợng canxi ở vẹm xanh (117mg/100g).
Bảng 3.4 Thành phần khoáng chất vẹm xanh
Kim loại

Hàm lƣợng

Kali

162,00a

Canxi

117,00a

Sắt

1,82a

Magie

46,30a

Kẽm

1,38a

Photpho

168,00a

Iod

117,00b
0,23 a

Đồng
a: đơn vị tính là mg/100g;
b: đơn vị tính là µg/100g;

39


3.1.3.2 Thành phần vitamin
Tiến hành phân tích thành phần vitamin trong vẹm xanh ở Việt Nam, so sánh giữa
bốn chỉ tiêu đƣợc phát hiện gồm hàm lƣợng vitamin A, B1, B12 và D. Hàm lƣợng
vitamin B1 không phát hiện trong vẹm xanh và hàm lƣợng vitamin D trong mẫu
vẹm xanh (<48IU/100g). Đối với hàm lƣợng vitamin A vẹm xanh chứa

0,21mg/100g. Vẹm xanh chứa hàm lƣợng vitamin B12 (0,018mg/100g) cao.
Bảng 3.5 Thành phần vitamin vẹm xanh
Hàm lƣợng

Vitamin
Vitamin A

0,21e

Vitamin B1

-

Vitamin B12

0,018b
<48e

Vitamin D
b: đơn vị tính là µg/100g;
d: đơn vị tính là mg/kg;
e: đơn vị tính là IU/100g;
3.1.3.3 Kim loại nặng

Phân tích mức độ an toàn về kim loại nặng của vẹm xanh ở Việt Nam cho thấy
hàm lƣợng chì ảnh hƣởng khơng đáng kể đến sức khỏe ngƣời trƣởng thành nhƣng
có ảnh hƣởng đến sự phát triển thần kinh của bào thai, trẻ sơ sinh và trẻ em.
Ngƣỡng kim loại chì cho phép tồn tại trong loài nhuyễn thể hai mảnh vỏ tối đa ở
1,50 mg/kg[33]. Hàm lƣợng chì trong trong vẹm xanh 0,1mg/kg, đạt ngƣỡng an
toàn theo yêu cầu của Bộ Y tế.

40


3.2 Kết quả xác định các thông số kỹ thuật
Bảng 3.6 Nồng độ enzyme và thời gian phản ứng
[E]
mg/ml

360 phút

480 phút

600 phút

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0.5

0.482

0.531

0.402

0.544

0.6

0.567

0.568

0.574

0.538

1

0.61

0.523

0.429

0.588

0.62

0.537

0.707

0.644

0.598

1.5

0.514

0.573

0.506

0.621

0.718

0.65

0.738

0.637

0.623

2

0.523

0.537

0.569

0.691

0.64

0.567

0.661

0.613

0.651

Hình 3.1 Đồ thị sự tƣơng quan giữa nồng độ enzyme với thời gian phản ứng
Nồng đồ bột vẹm
Bảng 3.7 Nồng độ cơ chất bột vẹm
[S] mg/ml

OD 660nm

0

0

0

0

5

0.476

0.512

0.37

15

0.777

0.69

0.719

25

0.883

0.853

0.813

35

0.998

1.018

0.99

45

0.978

1.118

0.808

41


Ảnh hƣởng của nồng độ enzyme đến quá trình thủy phân đƣợc xác định thông qua
phản ứng thủy phân 4,5 g bột vẹm xanh với dãy nồng độ enzyme protease (0,5,
1,0, 1,5, 2,0 mg/ml) ở 250C trong ba khoảng thời gian khác nhau (360, 480 và 600
phút). Kết quả cho thấy nồng độ enzyme càng cao và thời gian phản ứng càng kéo
dài tạo ra số lƣợng sản phẩm nhiều hơn, trong đó nồng độ enzyme 2 mg/ml cho số
lƣợng sản phẩm đạt mức tối đa (Bảng 3.6). Trong thời gian phản ứng 480 và 600
phút, tốc độ sản phẩm tạo ra tăng dần và khơng có nhiều sự khác biệt, ngƣợc lại

tốc độ tạo sản phẩm ở 360 phút thì thấp hơn. Hơn nữa, cả ba thử nghiệm về thời
gian phản ứng thủy phân đều đạt đến trạng thái cân bằng ở nồng độ enzyme 2
mg/ml, do đó thời gian thủy phân tối ƣu xác định của bột vẹm xanh là 600 phút và
nồng độ enzyme tối ƣu là 2 mg/ml.
Ảnh hƣởng của năm nồng độ bột vẹm xanh từ 5 đến 45 mg đã đƣợc tiến hành khảo
sát trong cùng điều kiện enzyme protease 2 mg/ml với thời gian phản ứng 600
phút, cho thấy ở nồng độ 45 mg/ml là tối ƣu do sản phẩm thủy phân tạo ra với hàm
lƣợng cao nhất so với các nồng độ cơ chất khác (Bảng 3.7). Từ những kết quả
khảo sát trên, điều kiện thủy phân bột vẹm xanh tối ƣu đƣợc xác định nồng độ cơ
chất vẹm xanh là 45 mg/ml, nồng độ enzyme protease sử dụng là 2 mg/ml, phản
ứng thủy phân đƣợc thực hiện trong 600 phút, pH 7.0 và ở 250C.
3.3 Quy trình cơng nghệ thủy phân vẹm xanh bằng enzym protease

42


3.3.1

Sơ đồ quy trình cơng nghệ

Bột vẹm xanh

Enzym protease

45mg/ml

2mg/ml

10ml
Đệm Tris-HCl (pH =7.0)

10ml
Thủy phân (10 giờ, 25oC)

Ngừng phản ứng bằng TCA
10% (20ml)

30 phút

Ly tâm 13000 rpm/phút
15 phút
Thu hồi dịch thủy phân

Đánh giá khả năng

Sấy phun

kháng oxy hóa

Đơng khơ

(DPPH và ABTS).

Đánh giá khả năng

Đánh giá khả năng

kháng oxy hóa (DPPH

kháng oxy hóa (DPPH

và ABTS).

và ABTS).

Hình 3.2 Sơ đồ quy trình thủy phân bột vẹm xúc tác enzyme protease

43


3.2.2 Thuyết minh quy trình
Trƣớc khi tiến hành thủy phân, các thiết bị và dụng cụ dùng trong thủy phân cần
phải đƣợc rửa sạch bằng xà phòng, tráng bằng cồn và đƣợc khử trùng ở 121oC
trong 30 phút.


Bƣớc 1: Tiến hành thủy phân

Bột vẹm xanh đƣợc trộn với dung dịch Tris-HCl 0.05M để đạt nồng độ 45mg/ml.
Enzym protease (60mg/ml) pha loãng xuống nồng độ 2mg/ml (pha loãng bằng
Tris-HCl pH =7,0). Bổ sung enzym protease (2mg/ml) vào hỗn hợp vẹm xanh
(45mg/ml) theo tỉ lệ 1:1.
Tiến hành thủy phân trong 10 giờ ở nhiệt độ 25oC.


Bƣớc 2: Ngừng phản ứng thủy phân

Sau khi thủy phân 10 giờ, TCA 10% đƣợc bổ sung vào dịch để ngừng phản ứng
thủy phân trong 30 phút theo tỷ lệ 1:1 ( dịch vẹm xanh + enzym protease : TCA
10%).



Bƣớc 3: Ly tâm

Sau khi ngừng phản ứng thủy phân bằng TCA 10%, tiến hành ly tâm 13000
rpm/phút trong 15 phút.
 Bƣớc 4: Thu hồi dịch thủy phân và tiến hành đánh giá khả năng chống oxy
hóa ở các điều kiện khác nhau.
Sau khi thu hồi dịch thủy phân, chia dịch thủy phân thành 3 phần:
+ Đánh giá khả năng chống oxy hóa của dịch thủy phân.
+ Tiến hành đơng khơ sau đó test khả năng chống oxy hóa của dịch thủy phân.
+ Tiến hành sấy phun sau đó test khả năng chống oxy hóa của dịch thủy phân.

44


3.3.2

Đánh giá hiệu suất thu hồi sản phẩm

Để tính hiệu suất, mẫu vẹm xanh đƣợc thủy phân, sau đó ly tâm lấy dịch, sấy phun
và đông khô nhằm thu lại khối lƣợng chất tan. Kết quả nhƣ sau:
Bảng 3.8 Khối lƣợng trƣớc và sau khi sử dụng phƣơng pháp sấy phun và đông khô
Phƣơng pháp

Khối lƣợng ban
đầu

Khối lƣợng sau
phƣơng pháp

Hiệu suất thu hồi
(%)

Sấy phun

100

9,45

9,45

Đông khô

100

3,89

3,89

Hiệu suất thu hồi sản phẩm đƣợc trình bày ở bảng 3.8. Hiệu suất thu hồi sản phẩm
của phƣơng pháp sấy phun cao hơn khoảng 3 lần so với phƣơng pháp đông khô.
Từ kết quả trên cho thấy, phƣơng pháp sấy phun có khả năng giữ lại đƣợc nhiều
chất tan hơn phƣơng pháp đông khô.

3.3.3 Đánh giá khả năng chống oxy hóa của dịch thủy phân vẹm xanh
3.3.3.1 Đánh giá khả năng chống oxy hóa bằng phương pháp DPPH


Tiến hành:

Nồng độ mẫu(mg/ml)

0

9

18

27

36

45

Dịch thủy phân (ml)

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,5

0,4

0,3

0,2

0,1

0

2

2

2

2

2

2

Tris-HCl (ml)
DPPH (ml)

(Khi cho DPPH 0,1mM vào thì lắc rồi đậy kín bằng giấy bạc).
Để ở nhiệt độ phòng trong 30 phút. Tiến hành đo quang ở ƣớc sóng 517nm.


Tính kết quả

Hoạt tính đánh ắt gốc tự do HTCO (%) đƣợc tính theo công thức:
45