KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC: SẮP XẾP THEO HỆ THỐNG VÀ BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT MỘT SỐ CHẤT ỨC CHẾ PROTEASE

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY BẮC




NGUYỄN THỊ THẮM



SẮP XẾP THEO HỆ THỐNG VÀ BƯỚC ĐẦU
NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT MỘT SỐ CHẤT
ỨC CHẾ PROTEASE



KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC








SƠN LA, NĂM 2013

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY BẮC

NGUYỄN THỊ THẮM



SẮP XẾP THEO HỆ THỐNG VÀ BƯỚC ĐẦU
NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT MỘT SỐ CHẤT
ỨC CHẾ PROTEASE



CHUYÊN NGÀNH: HÓA SINH HỌC


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC


Người hướng dẫn: ThS. Nguyễn Văn Dũng



SƠN LA, NĂM 2013
Lời cảm ơn!
Em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới thầy giáo - Ths. Nguyễn Văn
Dũng người đã hướng dẫn tận tình em trong thời gian thực hiện đề tài.
Em xin cảm ơn thầy giáo - Ths. Nguyễn Đình Thoại phụ trách phòng
thực hành Hóa phân tích, cô Trần Hồng Xuân, cô Trần Thị Mừng phụ trách
phòng thực hành Di truyền - Thực vật, Ban chủ nhiệm Khoa Sinh - Hóa và

các cán bộ tại Trung tâm Thông tin Thư viện đã tạo điều kiện tốt nhất cho em
thực hiện đề tài.
Em xin cảm ơn anh Nguyễn Huy Hùng, các bạn: Hà Trà My, Trương
Thị Thương, Cầm Thị Nho, Lường Minh Toàn, Phạm Thị Nương, Đinh
Văn Lâm lớp K50 ĐHSP Sinh, Trường Đại học Tây Bắc đã giúp đỡ, ủng
hộ nhiệt tình cho em trong suốt thời gian qua.
Đề tài của đã hoàn thành nhưng không thể tránh khỏi những thiếu sót.
Em rất mong nhận được ý kiến đóng góp của các thầy, cô giáo và các bạn
sinh viên để đề tài của em được hoàn thiện hơn.

Sơn La , tháng 05 năm 2013
Người thực hiện


Nguyễn Thị Thắm










MỤC LỤC

PHẦN MỘT. MỞ ĐẦU 1
1. Đặt vấn đề 1
2. Mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu 2

2.1. Mục tiêu của đề tài 2
2.2. Nhiệm vụ của đề tài 2
3. Đối tượng nghiên cứu 2
4. Tổng quan nghiên cứu vấn đề 2
4.1. Lịch sử nghiên cứu về protease 2
4.2. Lịch sử nghiên cứu về chất ức chế protease 4
5. Thời gian, nội dung và địa điểm nghiên cứu 6
5.1. Thời gian và nội dung nghiên cứu 6
5.2. Địa điểm nghiên cứu 7
6. Phương pháp nghiên cứu. 7
6.1. Phương pháp nghiên cứu lí thuyết 7
6.2. Phương pháp nghiên cứu trong phòng thí nghiệm 7
6.2.1. Phương pháp quang phổ UV – VIS 7
6.2.2. Phương pháp chiết dịch thô bằng dung môi hữu cơ 8
6.2.3. Phương pháp chuẩn độ foocmol để đánh giá mức độ thủy phân protein
9
6.2.4. Xác định hoạt độ protase bằng phương pháp Anson 10
PHẦN HAI. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 13
Chương 1. Chất ức chế protease và hệ thống phân loại 13
1.1 Một số chất ức chế protease đã được nghiên cứu 13
1.2. Hệ thống chất ức chế protease đã được nghiên cứu 18
Chương 2. Kết quả xác định chất ức chế protease 22
2.1. Dùng phương pháp chuẩn độ foocmol để đánh giá mức độ thủy phân
protein nhằm mục đích phát hiện sự có mặt chất ức chế protease. 22
2.2. Sử dụng phương pháp Anson để xác định sự có mặt của chất ức chế
protease. 25
PHẦN BA. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 27
3.1. Kết luận 27
3.2. Kiến nghị 27
TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC


1
PHẦN MỘT. MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Enzyme là những chất xúc tác sinh học do cơ thể sống tổng hợp nên.
Chúng xúc tác cho các phản ứng hóa sinh. Nhờ có enzyme mà các quá trình
hóa sinh xảy ra nhạy và với tốc độ rất nhanh trong những điều kiện sinh l í
bình thường (nhiệt độ cơ thể và pH môi trường tế bào).
Enzyme có ở trong mọi sinh vật và là động lực của mọi quá trình sống.
Hay có thể nói enzyme là những chất mà dưới tác dụng của chúng các phản
ứng hóa sinh được thực hiện nhanh chóng với nhịp điệu, trình tự rõ ràng và
chính xác trong quá trình trao đổi vật chất của cơ thể sống.
Lịch sử enzyme đã có từ rất lâu, ngay từ thế kỷ XIX đã có những nghiên
cứu ghi nhận sự hiện diện của chất xúc tác sinh học này trong quá trình tiêu
hóa ở nước bọt, dạ dày và ruột. Năm 1850, Pasteur đã nhận định quá trình lên
men được một yếu tố xúc tác là ferment. Sau này yếu tố trên được thống nhất
gọi là enzyme. Năm 1897, người ta đã chứng minh chính dịch chiết của
enzyme chứ không phải toàn bộ tế bào nấm men có khả năng lên men đường
thành rượu. Đó là bằng chứng về sự tham gia của bản thân enzyme trong quá
trình lên men. Năm 1926, lần đầu tiên Sammer đã thu được tinh thể enzyme
Urease. Năm 1930, Northrop thu được tinh thể Pepsin và Trypsin [26].
Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của Công nghệ sinh học, các
chế phẩm enzyme được sản xuất ngày càng nhiều và được sử dụng hầu hết
trong các lĩnh vực như: chế biến thực phẩm, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế…
Hàng năm, lượng enzyme được sản xuất trên thế giới đạt khoảng trên 300.000
tấn với giá trị trên 500 triệu USD, được phân phối trong các lĩnh vực khác
nhau. Khoảng 75% chế phẩm là enzyme thủy phân được sử dụng cho việc
thủy phân cơ chất tự nhiên. Protease là enzyme được sử dụng nhiều nhất hiện

nay trong một số ngành sản xuất như: chế biến thực phẩm (đông tụ sữa làm
fomat, làm mềm thịt, bổ sung để làm tăng chất lượng sản phẩm trong sản xuất
bia, xử lý phế phụ phẩm trong chế biến thực phẩm…), sản xuất chất tẩy rửa,
thuộc da, y tế, nông nghiệp…[29]. Ở Việt Nam cũng có nhiều công trình công
bố về nghiên cứu và sử dụng protease, chủ yếu tập trung vào các protease
thực vật và động vật. Hiện nay, công nghệ enzyme ở nước ta còn khá mới mẻ,
các đề tài nghiên cứu chủ yếu tập trung vào nghiên cứu việc thu nhận enzyme,
sử dụng enzyme vào các công nghệ sản xuất và chế biến thực phẩm.


2
Nhằm phục vụ cho các công tác nghiên cứu chuyên sâu về protease,
chúng tôi thực hiện đề tài: “Sắp xếp theo hệ thống và bước đầu nghiên cứu
tách chiết một số chất ức chế protease”.
2. Mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu
2.1. Mục tiêu của đề tài
- Sắp hệ thống các chất ức chế protease
- Tách chiết và bước đầu nghiên cứu một số chất ức chế protease
2.2. Nhiệm vụ của đề tài
- Sưu tập các bài báo trong nước và ngoài nước, các tạp chí, các báo báo
có liên quan đến protease và các chất ức chế protease.
- Sắp xếp các chất đã công bố theo một quy tắc nhất định.
- Thực hiện tách chiết một số chất ức chế protease.
- Thử khả năng ức chế enzyme của dịch chiết thu được.
3. Đối tượng nghiên cứu
Chất ức chế protease trong dịch chiết protein từ thân cây Tô mộc, quả
Mướp đắng và hạt Gấc.
4. Tổng quan nghiên cứu vấn đề
4.1. Lịch sử nghiên cứu về protease
Protease là các enzyme xúc tác cho sự thủy phân liên kết peptit (CO-NH)

trong phân tử protein, chuỗi polypeptit đến sản phẩm cuối cùng là các acid
amin. Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng thuỷ phân liên kết este và
vận chuyển acid amin.
Các protease từ động vật
Trong các protease, các enzyme của hệ tiêu hóa được nghiên cứu sớm
hơn cả. Từ thế kỷ XVIII, nhà tự nhiên học người Pháp là Reaunur đã làm thí
nghiệm rất đơn giản và đã phát hiện được rằng dịch dạ dày của chim ăn thịt
có khả năng tiêu hóa thịt [11].
Năm 1836, Schwam đã quan sát được hoạt động phân giải protein của
dịch vị. Tuy nhiên, mãi đến hơn 30 năm sau người ta mới tách được enzyme
này [11].


3
Năm 1857, Corvisart tách được trypsine từ dịch tụy. Đây là protease đầu
tiên thu nhận được ở dạng chế phẩm, trong chế phẩm vẫn còn lẫn nhiều
protein khác [11].
Năm 1862, Danilevxki dùng phương pháp hấp phụ trên colondion đã
tách được trypsine với amylase tụy tạng. Phương pháp này có ý nghĩa rất lớn
trong nghiên cứu tinh chế enzyme và protein.
Năm 1872, Hommarsten đã tách được chế phẩm chymotrypsine (renin).
Ngoài những enzyme của hệ tiêu hóa, các nhà khoa học cũng có những
nghiên cứu đầu tiên về protease trong máu. Schidt đã nêu giả thiết rằng
trong máu có enzyme fibrin (ngày nay gọi là trombin) tham gia trong quá
trình đông máu. Ông đã tiến hành việc tách chiết enzyme này và kết tủa
bằng cồn, chế phẩm nhận được có tác dụng làm cho dung dịch fibrinogen
đông lại nhanh chóng.
Các protease từ thực vật
So với các protease từ động vật, các protease từ thực vật được phát hiện
muộn hơn.

Năm 1874, Group – Besanez công bố đã nhận được protease từ hạt của
một loại đậu. Họ cũng nhận thấy dịch chiết từ hạt đại mạch, bông, lanh đều có
hoạt động phân giải protein. Ý kiến này dựa trên cơ sở thực nghiệm là sau khi
cho dịch chiết từ các nguyên liệu trên tác dụng với fibrin, nuớc lọc của hỗn
hợp cho phản ứng màu Biure. Bằng chứng này không thật sự vững chắc nên
Group – Besanez không tiếp tục nghiên cứu. Vì vậy Wurtz được xem như là
người đầu tiên tách chiết thành công protease từ thực vật (1879). Ông nêu lên
rằng các phần khác nhau của cây đu đủ có chứa protease, khi dùng cồn để kết
tủa sẽ thu nhận được một chế phẩm enzyme không tinh khiết (100g/1 cây) gọi
là papain.
Các protease từ vi sinh vật
Các protease của vi sinh vật mới được chú ý nghiên cứu nhiều từ năm
1950, mặc dầu từ năm 1918 – 1919 Waksman đã phát hiện được khả năng
phân giải protein của xạ khuẩn. Trong hơn 10 năm nay, số công trình nghiên
cứu protease vi vinh vật tăng lên đáng kể, nhiều hơn các công trình nghiên
cứu protease của động vật và thực vật. Những kết quả đạt được trong lĩnh vực
nghiên cứu protease vi sinh vật đã góp phần mở rộng quy mô sản xuất chế
phẩm enzyme và ứng dụng enzyme trong thực tế.


4
Trong thời gian gần đây người ta cũng đã có những phương pháp thích
hợp để thu nhận chế phẩm không tan của protesae. Kết quả này mở ra triển
vọng to lớn trong nghiên cứu và các ứng dụng của các protease.
4.2. Lịch sử nghiên cứu về chất ức chế protease
Trên thế giới
Các chất ức chế protease trong tự nhiên được báo cáo lần đầu tiên năm
1894 bởi Fermi và Pernossi khi hai nhà khoa học này phát hiện hoạt tính
chống trypsine trong huyết thanh người.
Tuy nhiên, những thành tựu trong nghiên cứu các chất ức chế chỉ thực sự

được bắt đầu với những công trình nghiên cứu của Kunitz và Nothrop về chất
ức chế trypsin tụy bò. Cùng với trypsin, sau này nhiều protease khác đã được
sử dụng để phát hiện các chất ức chế protease như: chymotrypsin, elastase,
subtilisin và các protease tinh chế từ nấm [25].
Gần 40 năm, chất ức chế protease được xem như chất không tốt về dinh
dưỡng. Mãi đến năm 1980, Dr Walter Troll thuộc trường đại học y khoa (New
York University Medical Center) đã khám phá rằng đậu nành nguyên sơ có
khả năng ngăn cản không cho bệnh ung thư phát triển ở các loài động vật do
tác dụng của chất ức chế protease. Tiếp sau đó nhiều nhà khoa học đã khảo
sát và thử nghiệm chất ức chế protease từ đậu nành trong phòng thí nghiệm và
thấy rằng nó có tác dụng chống lại sự phát triển mầm ung thư kết tràng
(colon), ung thư phổi, ung thư tuyến tụy và ung thư miệng [25].
Năm 1987, Viện Ung Thư Quốc Gia Hoa Kỳ (National Cancer Institute)
đã nhận thấy vai trò quan trọng của chất ức chế protease như một loại thuốc
chữa bệnh ung thư. Chúng ngăn cản sự tác động của một số genes di truyền
gây nên chứng ung thư. Ngoài ra chúng còn có tác dụng bảo vệ các tế bào cơ
thể không cho hư hại, gây nên bởi môi trường xung quanh như tia nắng phóng
xạ, các gốc tự do, chất có thể tấn công ADN [11].
7/11/2002, tại New York, Theo một nghiên cứu gần đây thì chất ức chế
protease do bạch cầu chế tiết (Secretory leukocyte protease inhibitor, SLPI)
một protein được tìm thấy trong nước bọt và nơi khác có thể đóng một vai trò
quan trọng trong việc phòng ngừa sự lây truyền HIV/AIDS qua sữa mẹ [11].
Các báo cáo trước đây cho thấy SLPI có khả năng bảo vệ tế bào không bị
nhiễm HIV trong phòng thí nghiệm. Tuy nhiên, nồng độ SLPI trong nước bọt
ở trẻ nhũ nhi có ảnh hưởng đến nguy cơ lây truyền HIV-1 từ mẹ sang con hay
không thì chưa được rõ.


5
Tiến sĩ Carey Farquhar, thuộc Trường Đại học Washington ở Seattle và

cộng sự đang tiến hành nghiên cứu đo lường nồng độ của SLPI trong các mẫu
nước bọt từ 188 trẻ nhũ nhi của các bà mẹ bị nhiễm HIV. Các mẫu nước bọt
này được lấy lúc sinh và lúc 1, 3, 6 tháng tuổi.
Ngày 20 tháng 1 năm 2006, các nhà khoa học Coralie E. Halls, Sally W.
Rogers, Mohammed Oufattole, Ole Ostergard, Birte Svenssonb, John C.
Rogersa làm việc tại Viện Hóa học Sinh học, Đại học bang Washington, Mỹ
đã công bố đề tài nghiên cứu về Kunitz – một chất ức chế cysteine protease
tinh chế từ Cauli ower và Arabidopsis. Đề tài này đã nghiên cứu về trình tự
gen tổng hợp chất ức chế Kunitz và kiểm tra hoạt động của chúng trong một
số môi trường khác nhau [11].
Đến nay, các chất ức chế protease đã được tìm thấy rộng rãi trong tự
nhiên từ nguồn thực vật, động vật, vi khuẩn. Có thể nói không ở tổ chức sống
nào là không tồn tại các chất ức chế protease và nhiều chất ức chế protease đã
được tổng hợp nhân tạo.
Một số công trình nghiên cứu ứng dụng của chất ức chế protease vào các
lĩnh vực nghiên cứu khác nhau như:
“Sử dụng các chất ức chế protease trong xét nghiệm hiện kháng nguyên”
của Thurgau, Viện Công nghệ sinh học tại Đại học Constance, Kreuzlingen,
Thụy Sĩ [29]
“Kháng virus hoạt động của các chất ức chế protease chống lại Toxoplasma
gondii”. Bộ môn Ký sinh trùng, Viện Y học Nhiệt đới, Pedro Kouri, Havana,
Cuba.
“Phân lập chất ức chế Pepsin từ rễ của cây Anchusa strigosa” của Sở
Khoa học sinh học, Khoa Khoa học, Đại học Jordan, Amman, Jordan [14].
“Nghiên cứu về một số chất ức chế protease aspartic: quy định tổng hợp
protease nội sinh trong giai đoạn vận động nảy mầm trong hạt giống Vigna
radiate” của Phòng khoa học Sinh hóa, phòng thí nghiệm và hóa chất quốc
gia, Ấn Độ do Aarohi Kulkarni, Mala Rao thực hiện [18].
Ở Việt Nam
Một số luận văn, đề tài, báo cáo khoa học cũng nghiên cứu về chất ức

chế protease trên khía cạnh điều trị căn bệnh ung thư hoặc phương pháp
tách chiết và sử dụng các thực phẩm chứa các chất ức chế protease vào đời
sống như:


6
Báo cáo “Chiết xuất và phân lập các isoflavonoid từ đậu nành Glycine
max” [28].
Luận văn “Polyphenol và hoạt độ ức chế của một số serine proteinase từ
thân, hạt gỗ Vang (Caesalpinia sappan L.) và một số cây thuốc khác”. Tác
giả Nguyễn Minh Thắng - Trường Đại học Quốc gia Hà Nội. Theo tác giả, ở
Việt Nam nghiên cứu cũng cho thấy trong dịch nuôi cấy Pseudomonas có ít
nhất 5 protein (polypeptide) có hoạt tính phân giải protein ở pH kiềm [11].
“Nghiên cứu điều tra các chất ức chế proteinase ở các phần khác nhau
của thân và hạt cây Tô mộc (Caesalpinia sappan L)”. Do Hoàng Thu Hà và
Phạm Thị Trân Châu thực hiện. Công trình này nghiên cứu tác dụng của dịch
chiết từ các phần khác nhau của thân và hạt cây Tô mộc (C.sappan) đến hoạt
độ của một số loại proteinase [27].
Luận văn: “Tìm hiểu về Bromelain enzyme, chiết suất và ứng dụng” [27].
Luận văn: “Sản xuất sữa chua đậu nành bổ sung tảo SPIRULINA” [27]
Tại Sơn La
Hiện nay chưa có công trình khoa học nào nghiên cứu về chất ức chế
protease. Bên cạnh đó đã có ứng dụng thuốc ức chế trong điều trị bệnh HIV
và một số bệnh khác tại các bệnh viện [25].
5. Thời gian, nội dung và địa điểm nghiên cứu
5.1. Thời gian và nội dung nghiên cứu
Thời gian
Nội dung nghiên cứu
Kết quả dự kiến
Tháng 9 – tháng

10 /2012
Chọn đối tượng nghiên cứu

Sưu tầm tài liệu
Viết đề cương
Chọn được đối tượng thích
hợp
Tìm được tài liệu
Hoàn thành đề cương đề tài
Tháng 11 /2012 –
tháng 2 /2013
Nghiên cứu tài liệu và sắp xếp
các chất ức chế protease
Đưa ra được hệ thống các
chất ức chế protease
Tháng 3 – tháng 4
/2013
Thực hiện tách chiết một số
chất ức chế protease
Tách chiết thành công một
số chất ức chế protease
Tháng 5/2013
Viết báo cáo đề tài
Đề tài hoàn chỉnh


7
5.2. Địa điểm nghiên cứu
Phòng thực hành Bộ môn Thực vật – Di truyền – Hóa sinh – Phương
pháp

6. Phương pháp nghiên cứu.
6.1. Phương pháp nghiên cứu lí thuyết:
+) Thu thập tài liệu:
Thu thập tất cả các tài liệu có liên quan tới đề tài như:
- Tài liệu nghiên cứu về protease
- Tài liệu nghiên cứu về chất ức chế protease
+) Phân tích và tổng hợp lí thuyết
- Tổng hợp các chất thu được sau khi nghiên cứu lí thuyết
- Phân tích: trên cơ sở những tài liệu thu thập được, phân tích và lựa
chọn thông tin cần thiết cho đề tài.
6.2. Phương pháp nghiên cứu trong phòng thí nghiệm
6.2.1. Phương pháp quang phổ UV – VIS [4].
Phương pháp này dùng để định lượng các hợp chất chính xác và thuận
tiện nhất.
Phương pháp này dựa trên sự hấp hấp thụ ánh sáng của một số hợp chất
tại vùng bước sóng nhất định và hàm lượng của chất đó được tính ra theo
nguyên tắc của định luật Lambert – Beer.
Phổ hấp thụ UV – VIS là phổ hấp thụ các chất tan ở trạng thái dung dịch
đồng thể của một dung môi nhất định như: nước, metanol, benzen, toluen,
cloroform, Vì thế muốn thực hiện phép phổ này cần phải:
- Hòa tan chất phân tích trong một dung môi phù hợp
- Chiếu vào dung dịch mẫu chứa hợp chất cần phân tích một chùm bức
xạ đơn sắc có mức năng lượng phù hợp để cho chất phân tích hay sản phẩm
của nó hấp thụ bức xạ để tạo ra phổ UV – VIS của nó.
- Đo cường độ của chùm sáng sau khi đã qua dung dịch mẫu nghiên cứu.
Phương trình cơ bản của của phép đo định lượng theo phổ UV – VIS là:
A = ε.l.C (ε.l = const vậy A = f(C) hàm bậc nhất)


8

Bằng cách chuẩn bị một dãy màu có nồng độ tăng dần và biết chính xác
trước C
1
, C
2
, C
3
, (thường là 5 – 7 nồng độ nằm trong vùng tuyến tính của
mối quan hệ A – C) và dung dịch màu của chất cần xác định nồng độ trong
điều kiện phân tích như dãy dung dịch chuẩn. Nghiên cứu chọn điều kiện phù
hợp nhất đo độ phổ của các mẫu chuẩn và mẫu phân tích như các thông số về
thời gian, môi trường, loại cuvet, Đo độ hấp thụ quang của các dung dịch
chuẩn, dựng đường chuẩn độ theo hệ tọa độ A – C sau đó đo độ hấp thụ
quang của dung dịch chất màu cần xác định nồng độ (giả sử là A
x
) rồi áp vào
đường chuẩn ta được giá trị C
x
tương ứng với nồng độ chất cần xác định.
Nguyên tắc:
Lấy một lượng dung dịch (C
x
) vào hai bình định mức 1 và 2. Thêm vào
bình 2 một lượng dung dịch chuẩn của chất phân tích (C
a
). Thực hiện phản
ứng hiện màu ở cả hai bình trong điều kiện thí nghiệm thích hợp hoàn toàn
như nhau. Đem đo D của hai dung dịch ở λ
max
. Theo định luật Lambert – Beer

với D
a
và D
x
ta có:
C
x
=
.
ax
ax
CD
DD

Trong đó:
D
x
là mật độ quang của dung dịch không thêm
D
a
là mật độ quang của dung dịch sau khi thêm
6.2.2. Phương pháp chiết dịch thô bằng dung môi hữu cơ [5]
Nguyên tắc:
Độ hòa tan của protein trong dung dịch phụ thuộc vào nhiều yếu tố, một
trong số đó là hằng số điện môi của dung dịch. Nhìn chung, những phân tử
dung môi có hằng số điện môi lớn (như nước, dimethylsulphoxid) có thể ổn
định tương tác giữa chúng với các phân tử protein và tạo điều kiện thuận lợi
cho sự hòa tan của protein trong dung dịch. Ngược lại, các dung môi với hằng
số điện môi nhỏ (aceton, ethanol…) ngăn cản sự phân tán của các phân tử
protein trong môi trường. Do đó, độ hòa tan của những phân tử protein giảm

và xảy ra kết tủa do sự làm giảm hằng số điện môi hiện hữu của môi trường.
Điều này có được bằng cách thêm một dung môi hòa tan trong nước như
aceton, ancol vào dung dịch chứa protein. Sự tủa bằng aceton hoặc ethanol
80% có nhiều thuận lợi hơn vì nó tương đối rẻ, có sẵn ở dạng tinh khiết với ít
chất tạp nhiễm gây độc hay ức chế đối với enzym, do nhiệt độ bay hơi của


9
dung môi thấp nên dễ tách bỏ dung môi khỏi chế phẩm enzyme bằng phương
pháp sấy nhẹ bằng quạt gió.
Nguyên liệu và hóa chất:
Mẫu đã được cắt nhỏ
Etanol 96%
Máy li tâm
Cách làm:
Lấy một lượng mẫu, thái nhỏ, cho vào bình có lắp ống làm lạnh, cho cồn
96
o
đã đun sôi vào làm ngập toàn bộ mẫu, phải tính toán trước để nồng độ cồn
còn từ 72 – 82
o
, tiếp tục đun sôi 30 phút trên nồi cách thủy. Sau đó để nguội
(vẫn giữ nguyên ống làm lạnh), thay ống làm lạnh bằng nút đậy kín.
6.2.3. Phương pháp chuẩn độ foocmol để đánh giá mức độ thủy phân
protein [5]
Nguyên tắc:
Dựa vào phản ứng Xiorenxen để bao vây nhóm amin tự do; chuẩn độ
nhóm cacboxil tự dobằng kiềm có nồng độ xác định. Từ lượng kiềm chuẩn
độ, tính lượng Nitơ amin tương ứng
Nguyên liệu, hóa chất:

Cơ tươi là nguồn cung cấp enzyme; protein 5%, KH
2
PO
4
0,1N, dung
chất ức chế, timolphtalein 1% dung dịch foocmol gồm 1ml timolphtalein 1%
với 50ml foocmol 40% và vài giọt NaOH 0,1N, dung dịch màu xanh nhạt.
Cách làm:
Lấy hai bình nón (V=100ml), cho vào mỗi bình 2g cơ tươi đã nghiền nát
và 10ml KH
2
PO
4
0,1N, lắc nhẹ để tạo môi trường pH thích hợp với hoạt động
của proteinase có trong cơ. Thêm vào bình 1 (đối chứng) 10ml dung dịch axit
tricloaxetic 10% để kìm hãm hoạt động của enzyme. Cho vào mỗi bình 2ml
dung dịch protein 5%. Đặt hai bình trong tủ ấm 37
o
C, thời gian 1 giờ. Sau đó
thêm vào bình 2: 10ml dung dịch chất ức chế để kìm hãm hoạt động của
enzyme. Dùng ống đong đo dung tích mẫu (V). Lọc dung dịch trong từng
bình, đo lại dung tích dịch lọc, chuyển sang các bình tương ứng với bình thí
nghiệm (2) và bình kiểm tra (1). Thêm vào mỗi bình chứa dịch lọc 10ml
foocmaldehit và 5 giọt tomolphtalein để làm chất chỉ thị màu. Chuẩn độ bằng
NaOH 0,2N đến khi xuất hiện màu xanh mực cửu long thì dừng lại.


10
Tính kết quả:
X = (V

2
– V
1
).2,82.V.f/V
3
.g
X: Hàm lượng nitơ amin trong mẫu nghiên cứu (mg %)
V
2
: Thể tích NaOH 0,2N dùng để chuẩn độ mẫu thí nghiệm (ml)
V
1
: Thể tích NaOH 0,2N dùng để chuẩn độ mẫu kiểm tra (ml)
V
3
: Thể tích dịch lọc đem chuẩn độ (ml)
V: Thể tích dung dịch mẫu (ml)
g: Lượng mẫu đem phân tích (gam)
f: Hệ số điều chỉnh nồng độ NaOH 0,2N
6.2.4. Xác định hoạt độ protase bằng phương pháp Anson [8]
Nguyên tắc:
Protease tác dụng với cơ chất là casein, sản phẩm tạo thành là các
peptide ngắn hay axit amin thì tyrosine chiếm đa số. Xác định Tyrosine bằng
phản ứng màu với thuốc thử Folin. Từ đó xác định hoạt độ enzyme protease
theo định nghĩa: Hoạt độ của protease được biểu thị là số µmol Tyrosine sinh
ra do thủy phân casein bởi 1ml dung dịch hay 1mg hỗn hợp chứa protease
trong 1 phút ở điều kiện chuẩn.
Nguyên liệu và hóa chất:
- Đệm Sorensen pH=7,6
- Dung dich casein 1%

- Dung dịch axit tricloaxetic 10%
- Dung dịch NaOH 0,5N
- Dung dịch HCl 0,2N
- Dung dịch Tyrosine 20mM/l: Khuấy và nghiền 0,118g tyrosine trong
dung dịch HCl 0,2N vừa đủ 50ml.
- Dung dịch tyrosine chuẩn 1 mM/l: pha loãng 5ml dung dịch Tyrosine
20mM/l trong HCl 0,2N thành 100ml.
Tiến hành:
Dựng đường chuẩn:


11
Ống nghiệm
0
1
2
3
4
5
Dung dịch tyrosine chuẩn 1 mM/l
(ml)
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
Dung dịch HCl 0,2N (ml)
1.0
0.8

0.6
0.4
0.2
0
Dung dịch NaOH 0,5N (ml)
2
2
2
2
2
2
Thuốc thử Folin (ml)
0.6
0.6
0.6
0.6
0.6
0.6
Lượng tyrosine
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
Lắc và để yên 10 phút, đem đo mật độ quang học ở 720nm
Vẽ đồ thị sự biến thiên mật độ quang học theo lượng tyrosine ở các ống
Dung dịch hóa chất
Ống nghiệm
Thử không

Thử thật
1
2
3
1
2
3
Casein 1% (ml)
5
5
5
5
5
5
TAC 10% (ml)
5
5
5
0
0
0
Dịch enzyme mẫu (ml)
0
0
0
1
1
1
Lắc đều, giữ ở 35,5
o

C trong vòng 30 phút
TAC 10% (ml)
0
0
0
5
5
5
Dịch enzyme mẫu (ml)
1
1
1
0
0
0
Lọc lấy 1ml dịch lọc thực hiện phản ứng màu
Dịch lọc (ml)
1
1
1
1
1
1
Dung dịch NaOH 0,2N
(ml)
2
2
2
2
2

2
Dung dich folin (ml)
0.6
0.6
0.6
0.6
0.6
0.6


12
Lắc và để yên 10 phút, đem đo mật độ quang học ở 720nm
Tính kết quả:
ĐVHĐ = x.V/t.v
x: số ml suy ra từ đường chuẩn tyrosine
v: thể tích lọc đem phân tích
V: tổng thể tích hỗn hợp phản ứng
t: thời gian phản ứng (10 phút)
ĐVHĐ: đơn vị hoạt độ (UI/ml)

13
PHẦN HAI. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
Chương 1. Chất ức chế protease và hệ thống phân loại
1.1 Một số chất ức chế protease đã được nghiên cứu
1.1.1. Trong đề tài: "Kiểm tra tính nhạy cảm khi tác động đồng thời của
pepsin và pepsinogen trong niêm mạc dạ dày".
Chất ức chế protease được sử dụng: pepstatin A ức chế hoạt động của
pepsin trong điều kiện pH = 5,3.
Phương pháp: Sử dụng pepstatin A trong thí nghiệm:
Cho 40 – 46 ng pepstatin A vào sunphoxide dimethyl 1g/l, trộn với 1 g
của pepsin trong 0,05ml dung dịch đệm natri acetate 50mmol/l, pH = 5,3 và 3
ml dung dịch đệm có chứa 2,4 hoặc 8g/l casein. Ủ ở 37
o
C trong 10 phút. Theo
cách này có nồng độ pepstatin A được ước tính là khoảng 1,95 – 7,8.10
-8

mol/l. Quá trình thủy phân được ngừng lại sau 1 phút bằng cách cho thêm 0,5
ml dung dịch axit tricloaxetic 25% (w/v). Sau đó các mẫu ngay lập tức được
đặt trên băng làm lạnh ít nhất 4 giờ số lượng casein thủy phân được tính bằng
phân tích huỳnh quang. Các dữ liệu được phân tích bằng phân tích hồi quy
tuyến tính và kết quả được biểu diễn trên đồ thị I/V (trong đó V đại diện cho

vận tốc ban đầu và I đại diện cho chất ức chế).
Kết quả: Pepstain A là một chất ức chế mạnh của pepsin và proteinase
khác như renin và cathepsin D. Các phản ứng của pepsin với pepstatin có thể
giảm khi độ pH được nâng lên, có thể là do sự ion hóa của nhóm cacboxyl
trong các trung tâm hoạt động. Trong nghiên cứu này pepstatin A đã được sử
dụng để ức chế hoạt động proteinase trong niêm mạc sử dụng như là mẫu đối
chứng và điều quan trọng là thiết lập giá trị K
i
cho chất ức chế này ở pH =
5,3.
1.1.2. Trong đề tài: "Ức chế pepsin của nhiều loại ion và nghiên cứu phổ
Circular dichroism (c.d)"
Chất ức chế được nghiên cứu: polyvinyl sulphate (PVS), pyrrolidone
(PVP) và protamine sulphate, PLL
Phương pháp:
Hoạt động của các enzyme pepsin được sử dụng trong các nghiên cứu đã
được báo cáo trước đây sử dụng hemoglobin như một chất nền tại 25
o
C, pH =
2,1 và azocasein ở pH = 5,0. Sử dụng thuốc thử Folin – xiocanto để làm tăng
độ chính xác của việc xác định. Trong mỗi trường hợp một thí nghiệm đã


14
được thực hiện không có mặt của pepsin chính xác cho số lượng nhỏ thủy
phân của hemoglobin ở pH = 2,1 và của azocasein tại pH = 5,0. Giá trị hấp
thụ được dao động trong khoảng ±0.002 đơn vị hấp thụ.
Hiệu quả của poly(vinyl pyrrolidone) và protamine trong phản ứng của
pepsin với hemoglobin đã được kiểm tra ở pH = 2,1 và 25
o

C. Trong các
trường hợp, poly (vinylsulphate) ảnh hưởng rõ rệt hơn ở pH = 7.65 và 37
o
C.
Tất cả những dung dịch phải để cân bằng nhiệt độ 30 phút trước khi trộn.
Thấy rằng Folin - xiocanto của phản ứng ở một mức độ nhỏ với các ion và đã
được thực hiện một thí nghiệm trống trong mỗi trường hợp để cho phép các
kết quả xác định giá trị sai số. Cho PVS (10
-3
mol/lit) với enzyme pepsin (10
-
7
mol/l trong đệm natri acetate 0,01M, pH = 7,65 ở 37
o
C) và lắc đều. Ủ hỗn
hợp trong 5 phút ở 37
o
C. Sau đó cho một lượng thích hợp dung dịch
hemoglobin (1,5%) đã được thêm vào để làm cho một thể tích cuối cùng của
5 ml. Hỗn hợp phản ứng đã kéo dài trong 20 phút ở 37
o
C và kết thúc bằng
việc bổ sung nhanh chóng 5ml axit tricloaxetic 10%. Hỗn hợp này được làm
lạnh trong nước đá trước khi ly tâm ở 4
o
C. Mức độ thủy phân của hemoglobin
biến tính được xác định bằng phương pháp Ason sử dụng thuốc thử Folin
(pha loãng 1: 2 bằng nước cất) và NaOH 0.5M. Độ hấp thụ của dung dịch
được đo ở bước sóng 420 nm sử dụng một Pye - Uincam SP1800 quang phổ
cực tím.

Hiệu quả của PVP và protamine ở pH = 2,1 và 25
o
C giống như NaCl
và KCl đã được nghiên cứu và sử dụng với trình tự tương tự. Kết quả thu
được ba lần giống hệt nhau. Nói cách khác, hoạt động của pepsin được xác
định sử dụng azocasein như một chất nền trong đệm natri acetat (0.001M,
pH=5.0) ở 25
o
C.
Kết quả:
Có thể thấy rằng nồng độ của PVS (4 - 40.10
-5
mol/l) làm giảm hoạt
động của pepsin. Không quan sát thấy bất kỳ đảo ngược của sự ức chế ở nồng
độ cao hơn của PVS trong điều kiện thí nghiệm được sử dụng.
Ảnh hưởng của PVP trong hoạt động của pepsin nó thể hiện rõ ràng ở
nồng độ thấp PVP ức chế hoạt động của pepsin, nhưng ở nồng độ cao hơn sự
ức chế là không đổi. Là một chất ức chế hiệu quả của pepsin ở pH = 7,65 ở tất
cả các nồng độ trong khi PVP, PNP và protamine là chất ức chế ở pH = 2,1 ở
nồng độ thấp và hoạt hóa yếu ở nồng độ cao của các ion.


15
Tại pH = 5,0 theo thứ tự hiệu quả xúc tác của các ion là
polybrene>polyL-lysine>spermine>spermidine>protamine>PVP.
Kết quả phổ c.d cho thấy mỗi chuỗi ion gây ra những thay đổi nhất định
trong quang phổ c.d của pepsin. Thứ tự làm thay đổi phổ Circular dichroism
(c.d) là: polybrene> PLL> PVP> spermidine> spermine.
1.1.3. Trong đề tài: "Nghiên cứu về một số chất ức chế protease
aspartic: quy định tổng hợp protease nội sinh trong giai đoạn vận động nảy

mầm trong hạt giống Vigna radiate".
Chất ức chế protease được nghiên cứu: VrAPI trong hạt nảy mầm.
Phương pháp:
- Sàng lọc giống cho chất ức chế protease aspartic
10g hạt giống của từng loại giống được ngâm trong 50ml đệm Gly-HCl
(0,05 M, pH = 3,0). Hỗn hợp được ly tâm ở 10.000 v/p trong 20 phút. Các
mẫu tương ứng được phân tích về hoạt động ức chế protease aspartic. Mỗi thí
nghiệm được lặp đi lặp lại trong ba lần với hạt giống của từng chủng loại.
Trong tất cả các thí nghiệm tiếp theo bao gồm cả thanh lọc chất ức chế.
Thân, lá và rễ của cây ở giai đoạn đang sinh trưởng của giống lúa này đã
được thử nghiệm cho sự tồn tại của chất ức chế. Các mô đã không được thử
nghiệm khi bị thương hoặc các tổn thương khác cho các cơ quan.
- Ức chế protease aspartic
Các hoạt động phân giải protein protease aspartic nội sinh (VrAP) được
đo ban đầu trong thí nghiệm kiểm tra hoạt động của enzyme còn sót lại. Ảnh
hưởng của VrAPI được phân tích bằng cách kiểm tra trong điều kiện không
hoạt động hoặc sự tồn tại của chất ức chế. Trong một thí nghiệm cổ điển là
hòa dung dịch VrAP (25ml; 1mg/ml) trong đệm Gly-HCl (0,05M, pH = 3,0)
với các chất ức chế (25g/ml) trong 5 phút. Thêm 0,5ml dung dịch hemoglobin
(5mg/ml) vào hỗn hợp và ủ trong 30 phút ở 37,8
o
C. Thêm 1ml dung dịch axit
pecloric (PCA) (1,7M) để dừng các hoạt động của enzyme sau đó ủ trong 30
phút ở 37,8
o
C. Kết tủa hình thành đã được gỡ bỏ bằng cách lọc. Đo độ hấp
thụ quang phổ của các sản phẩm ở 280 nm. Một đơn vị hoạt động protease
aspartic được xác định bởi sự tăng 0.001 tại 280nm cho mỗi phút ở pH 3.0 và
37,8
o

C, đo như sản phẩm PCA-tan, với hemoglobin như bề mặt. Một đơn vị
của các chất ức chế được định nghĩa là số lượng chất ức chế cần thiết để ngăn


16
chặn một đơn vị protease aspartic trong điều kiện thử nghiệm tiêu chuẩn. Xét
nghiệm được thực hiện trong ba lần và giá trị trung bình được xem là kết quả.
- Lọc và thu đặc tính cấu trúc của VrAPI
- Kiểm tra tính ức chế protease
- Xác định pH tối ưu, nhiệt độ và sự ổn định của tinh khiết chất ức chế
protease aspartic.
- Đo lường protein
- Động học của sự ức chế của VrAP bởi VrAPI
- Đánh giá các thông số động học.
Kết quả:
Thuốc ức chế protease aspartic đã được tìm thấy trong những hạt giống
của Kopergaon-1. Các chất ức chế là 13%, 38% và hơn 63% trong
Kopergaon-1 so với giống khác chỉ dựa trên sự ức chế hoạt động protease
aspartic của enzyme nội sinh.
Hoạt động chất ức chế giảm trong những giờ đầu tiên sau khi bắt đầu
nảy mầm sau tăng lại từ giờ thứ hai trở đi và được duy trì cho đến 12 giờ
nảy mầm.
VrAPI là Chuỗi axit amin có trình tự AEIYNKDGNK LDLYG (Ala-
Glu-Ile-Tyr-Asn-Lys-ASP-Gly-Asn-Lys-ASP-Lys-Tyr-Gly). Trọng lượng phân tử
của chất ức chế là 1559,7 Da. Các chất ức chế được tìm thấy là ổn định trong
một phạm vi rộng của độ pH từ 2 đến 10 với một tối ưu 3.0. Chu kỳ bán rã
của VrAPI 100,8
o
C là 30 phút trong khi hoạt động mạnh nhất được quan sát
thấy ở 37,8

o
C.
Các VrAPI tinh khiết đã được thử nghiệm để ức chế protease aspartic
(protease từ nấm A. saitoi và protease aspartic ), protease cystein (papain
nội sinh) và protease serine (trypsin nội sinh). Đã quan sát thấy rằng các
chất ức chế đã được cụ thể trong ức chế protease chỉ aspartic trong khi nó
đã không thể hiện bất kỳ hoạt động ức chế với các protease cysteine hoặc
các protease serine.
1.1.4. Trong đề tài: "Kunitz-cycteine, một loại thuốc ức chế protease từ
cauli ower và Arabidopsis"
Chất ức chế protease được nghiên cứu: Kunitz, loại chất ức chế cystein
protease


17
Phương pháp:
- Nhân bản gen mã hóa Kunitz ở cauli ower và Arabidopsis
- Nuôi cấy tế bào và theo dõi biểu hiện protein
- Kiểm tra hoạt động của enzyme
- Gắn Atlg72290 vào gel papain-agarose và pepstatin-agarose
- Quan sát biểu hiện tức thời trong thao tác làm ngừng hoạt động của tế
bào trần cây thuốc lá và immunolocalization
Kết quả:
- Có sự ức chế hoạt động của protease proaleurain bởi Kunitz.
- Tại pH=6,3 chất ức chế hầu như không có sự ảnh hưởng tới hoạt động
của protease proaleurain. Tại pH=4,5 thì sự ảnh hưởng này có thể quan sát
được rõ rệt.
- Kunitz có khả năng ức chế protease cystein và điển hình là papain ở
pH=6,3 và 4,5
- Sự tương tác giữa chất ức chế Kunitz với proaleurain và papain bản

chất là tương tác vật lý.
1.1.5. Trong đề tài: "Nghiên cứu sự tương tác của protein globulin-11S
chiết từ hạt quả Kiwi với pepsin".
Chất ức chế được nghiên cứu: tiểu phần globulin-11S chiết từ hạt quả
Kiwi.
Phương pháp:
- Tách globulin từ hạt Kiwi với bộ đệm muối cao
- Dùng gel lọc 11S-GLP và dự toán kích thước
- Thanh lọc tiểu đơn vị β của 11S-GLP
- Kiểm tra chất ức chế protease aspartic
- Ảnh hưởng của papain, trypsin và chymotrypsin trên 11S-GLP
- Kiểm tra sự ức chế pepsin của 11S-GLP
- Thanh lọc chất ức chế protease aspartic từ hạt giống quả Kiwi
Kết quả:


18
- 11S-GLP là protein lưu giữ trong hạt giống lúa mì , hạt thaliana. quan
sát thấy PIA từ phần globulin của một loạt các nguồn thực vật bao gồm cả
cám lúa mì, tấm kiều mạch, lúa mạch ngọc trai, A. thaliana và hạt táo
- 11S-GLP không ức chế trypsin, chymotrypsin hoặc papain
1.1.6. Trong đề tài: "Bất hoạt penicilium roqueforti do ức chế pepsin
protease cụ thể"
Chất ức chế được nghiên cứu: các chất ức chế sử dụng bao gồm DAN,
EPNP, p-bromophenacyl bromide, S-PI và pepstatin.
Phương pháp:
- Kiểm tra hoạt động đối với hoạt động enzyme
- Phản ứng của enzyme với S-PI và pepstatin
- Bất hoạt enzyme bởi S-PI và pepstatin.
Kết quả:

- Protease từ P. roqueforti có đặc tính chung tương tự như của pepsin
- S-PI và pepstain là chất ức chế pepsin từ Streptomyces với cấu trúc rất
giống nhau. chúng có khả năng gắn kết chặt chẽ và không liên kết hóa trị để
pepsin và tạo thành một phức hệ đẳng phân tử tác dụng ức chế của hai chất ức
chế enzyme trên P.roqueforti dường như là yếu hơn so với trên pepsin.
1.2. Hệ thống chất ức chế protease đã được nghiên cứu
Dựa vào thành phần cấu tạo để chia các chất ức chế protease thành các
nhóm khác nhau
Nhóm 1: Các chất ức chế protease có bổ sung thêm thành phần vô
cơ trong quá trình sản xuất và sử dụng.
Gồm những chất ức chế có bổ sung thêm thành phần vô cơ trong quá
trình sản xuất và sử dụng như: HCl, H
2
SO
4
, Cl, S,
Chứa HCl:
1. AEBSF – HCl : không thể đảo ngược chất ức chế protease serine
Thrombin khác. Ức chế bởi ancyl hóa của các trung tâm hoạt động của enzyme.
2. Amastatin – HCl: Ức chế protease Metallo – đảo ngược. Ức chế
nhiều màng peptidaes điều chỉnh quan trọng của các hormon peptide,
aminopeptidase. Ức chế leucine aminopeptidase.


19
3. Antipain – HCl: ức chế thuận nghịch serine protease cysteine. Ức
chế papain và trypsin đặc hơn leupeptin. Tham gia ức chế tổng hợp ARN.
4. APMSF – HCl (4 – Amidinophenyl metan sulfonyl fluoride): không
thể đảo ngược chất ức chế protease serine như trypsin. Hoạt động mạnh hơn
PMSF, không ức chế chymotrypsin và acetylcholine esterase.

5. Benzamidine HCl: Ức chế mạnh thrombin và trypsin.
6. Bestatin – HCl: Ức chế aminopeptidase bề mặt tế bào và
aminopeptidase leucine.
7. TLCK (1–Chloro–3–tosylamido–7–amino–2–heptanone HCl): Ức
chế không phục hồi trypsin, một số serin protease cystein như bromelain, ficin
và papain. Không phản ứng với zymogen.
Chứa H
2
SO
4
:
1. Leupeptin – hemisulfate: là tripeptide aldehyde. Chất ức chế cạnh
tranh thuận nghịch serine protesae cysteine. Cũng ức chế phospholipase D và
kích hoạt C trong tế bào gan chuột.
Chứa Lưu huỳnh:
1. PMSF (Phenyl methyl sulfonyl fluoride): Ức chế không phục hồi
serin protease sulfonylation của protease serin. Ức chế đảo ngược papain và
acetylcholin esterase. Nguồn gốc từ hạt gấc.
Chứa Clo:
1. TPCK (1–Chloro–3–tosylamido–4–phenyl–2–butanone): Ức chế
không phục hồi chymotrypsin, ức chế các serin protease cystein như
bromelain, ficin và papain.
Nhóm 2: Axit hữu cơ
Bao gồm những chất ức chế trong thành phần cấu tạo có chứa nhóm –
(COOH)
1. CA – 074: Ức chế cathepsin B.
Nhóm 3: Amin
Bao gồm những chất ức chế trong thành phần cấu tạo có chứa nhóm
–(NH)
1. Leuhistin: Ức chế của M – Aminopeptidase.

Nhóm 4: Amino axit


20
Bao gồm những chất ức chế trong thành phần cấu tạo có chứa đồng thời
hai nhóm –(COOH) và –(NH)
1. Aminocaproic acid: ức chế hoạt động cao của fibrinolysin và
chymotrypsin.
2. Arphamenine A: Ức chế

- aminopeptidase metallo protease.
3. Chymostatin: có nguồn gốc từ aldehyde. Chất ức chế thuận nghịch
như chymotrypsin serin và một số protease cysteine.
4. E – 64: Không cạnh tranh, không thể đảo ngược chất ức chế protease
cysteine papain. Hình thành mối liên kết thioether với nhóm sulfhydryl trong
trung tâm hoạt động của enzyme.
5. Elastatinal: Chất ức chế elastase.
6. Pepstatin A: Ức chế protease có thể đảo ngược aspartic (ví dụ:
pepsin, cathepsin D, chymosin, rennin).
7. Phosphoramidon: Ức chế thermolysin, endothelin chuyển đổi,
collagenase và metallo – endoproteinase. Trung lập endopeptidase.
Nhóm 5: Gồm nhiều peptide và các chuỗi polypeptide phức tạp
1. (Anpha)1 – antichymotrypsin (từ huyết tương người): Glycoprotein
ức chế protease như chymotrypsin (trên tất cả các bạch cầu trung tính con
người cathepsin G) bằng cách hình thành phức hợp ổn định.
2. Antithrombin III: đóng vai trò quan trọng trong kiểm soát các
protease serine trong quá trình đông máu. Bất hoạt trên các thrombin bằng
cách hình thành một phức hợp cực kỳ ổn định, hiệu quả được tăng cường bởi
heparin. Ức chế các protease khác tham gia vào quá trình đông máu như:
plasmin, kallikrein, IXa,…

3. Aprotinin (ức chế trypsin từ phổi bò): mỗi chuỗi polypeptide ức chế
protease serine bằng cách liên kết với trung tâm hoạt động của enzyme hình
thành phức hợp bền. Ức chế tất cả các carboxypeptidase, plasmin, kallikrein,
trypsin, chymotrypsin, papain, pepsin.
4. CA – 074 Me: proinhibitor cho nôi bào cathepsin B.
5. Diprotin A: Chất ức chế thuận nghịch Metallo Dipeptidylamino
peptidase IV – protease.
6. Ovomucoid (chất ức chế trypsin từ lòng trắng): là monomeric
glycoprotein. ức chế trypsin bò.