NHÂN DÕNG GEN PRION (PrP) TỪ GIỐNG BÕ HANWOO (Bos Taurus Coreanae) CỦA HÀN QUỐC doc

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC
****0O0****

ĐẶNG QUỐC BẢO

NHÂN DÕNG GEN PRION (PrP) TỪ GIỐNG BÕ
HANWOO (Bos Taurus Coreanae)
CỦA HÀN QUỐC

LUẬN VĂN KỸ SƢ
CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh
-Tháng 9/2006-


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC
****0O0****

NHÂN DÕNG GEN PRION (PrP) TỪ GIỐNG BÕ
HANWOO (Bos Taurus Coreanae)
CỦA HÀN QUỐC

LUẬN VĂN KỸ SƢ
CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giáo viên hƣớng dẫn

Sinh viên thực hiện
GS.TS. Kwon Moosik
ĐẶNG QUỐC BẢO
(Pr PGS.TS Nguyễn Ngọc Tn
KHĨA: 2002 – 2006

Thành phố Hồ Chí Minh
-Tháng 9/2006-


MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING
NONG LAM UNIVERSITY, HCMC
FACULTY OF BIOTECHNOLOGY


GENE CLONING PRION (PrP) FROM KOREAN
BOVINE:
HANWOO (Bos taurus Coreanae)

GRADUATION THESIS
MAJOR: BIOTECHNOLOGY

Professor
Ph.D Kwon Moosik
Dr. Nguyen Ngoc Tuan

Student
DANG QUOC BAO
TERM: 2002 - 2006

HCMC, 09/2006


LỜI CẢM TẠ
Chân thành cảm ơn
Ban giám hiệu Trƣờng Đại Học Nơng Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh.
Ban chủ nhiệm Bộ Mơn Cơng Nghệ Sinh Học.
Các Thầy Cơ Phịng Quan Hệ Quốc Tế
Các Thầy Khoa Công Nghệ Di Truyền, Đại Học Sungkyunkwan, Hàn Quốc
Đã truyền đạt cho em những kiến thức quý báu và giúp đỡ em trong thời gian
em học tập tại trƣờng.
Đặc biệt xin chân thành cảm ơn sâu sắc đến:
TS. Kwon Moosik- Trƣởng bộ môn Công Nghệ Di Truyền, Đại Học
Sungkyunkwan đã tận tình dạy bảo, hƣớng dẫn, giúp đỡ em trong nghiên
cứu và thực hiện đề tài.
TS. Nguyễn Ngọc Tuân- Trƣởng phòng Sau Đại Học, Đại Học Nông Lâm
đã giúp đỡ rất nhiều và hƣớng dẫn tận tình trong q trình viết khố luận.
TS. Trần Thị Dung- Trƣởng bộ môn Công Nghệ Sinh Học trƣờng Đại Học
Nông Lâm đã tạo điều kiện cho em thực hiện đề tài này.
Ths. Kim Yong Hwan và các anh chị trong phịng thí nghiệm Cơng Nghệ Di
Truyền, Đại Học Sungkyunkwan đã tận tình hƣớng dẫn, chỉ bảo em trong
suốt thời gian em thực hiện khóa luận.
Xin cảm ơn các bạn trong và ngồi lớp đã động viên giúp đỡ tơi trong suốt q
trình học tập và làm khóa luận tốt nghiệp.
Con xin gửi lòng biết ơn sâu sắc đến bố mẹ, những ngƣời đã sinh thành, nuôi
dƣỡng, dạy dỗ con và luôn bên con trong mọi thời điểm.
Thủ Đức, ngày 10 tháng 08 năm 2006

iii

TĨM TẮT
ĐẶNG QUỐC BẢO, Đại Học Nơng Lâm TP. Hồ Chí Minh. Tháng 8/2006. ―NHÂN
DỊNG GEN PRION (PrP) TỪ BỊ HANWOO (BOS TAURUS COREANAE) CỦA
HÀN QUỐC‖
Giáo viên hƣớng dẫn
GS. TS. KWON MOOSIK
PGS. TS. NGUYỄN NGỌC TUÂN
BSE là một bệnh truyễn nhiễm do prion, là một trong những bệnh đƣợc quan
tâm trong giới nghiên cứu. Hiện nay các nhà khoa học đang tiến hành nghiên cứu để
có thể tạo ra một bộ kit chẩn đoán sớm bệnh BSE, các nghiên cứu này đều tập trung
nghiên cứu cấu trúc protein PrPsc, dạng protein gây bệnh của prion. Bƣớc đầu trong
nghiên cứu của chúng tơi về protein PrPsc, đã tiến hành nhân dịng và giải trình tự gen
prion.
Tách chiết DNA từ máu của bò Hanwoo và PCR để khuếch đại gen prion. Gen
prion đƣợc khuếch đại có kích thƣớc 651 bp, sau đó đƣợc kết buộc vào véc tơ pGEMT easy và chuyển vào vi khuẩn E. coli DH5α. Khuẩn lạc chứa véc tơ tái tổ hợp có màu
trắng trên mơi trƣờng LB chuyên biệt (Amp+, Xgal, IPTG). Plasmid thu đƣợc sau quá
trình tinh sạch đƣợc giải mã trình tự. Kết quả giải trình tự thành cơng đã cho thấy sự
giống nhau gần nhƣ hồn tồn trong trình tự gen prion của bị Hanwoo và bị châu Âu.
Việc thành cơng trong q trình nhân dòng sẽ là bƣớc đầu quan trọng cho mục
tiêu cuối cùng trong nghiên cứu của chúng tôi là tạo kit chẩn đoán bệnh BSE.

iv


ABSTRACT
Prion — short for proteinaceous infectious particle — is a unique type of
infectious agent, as it is made only of protein. Prion was termed in 1982 by Prusiner,
who was prized Nobel for his research on prion. Bovine spongiform encephalopathy
(BSE) is one of the most notable prion diseases. BSE is not only potential risk on

bovine but also on human. Until now Korea is free from BSE (Tae-Yung Kim et.
al,2005), but the BSE is high risk damage society. The study on BSE is absolutelly
remarkable. As the first step of our prion study, we were attempted cloning full gene
of prion encoding bovine prion protein from Korean bovine. PrP gene was amplified
from genome DNA (gDNA) of Korean bovine by PCR following 2 primers forward
and reverses primer. The recombinant PrP of full sequence cDNA is 651bp long
encoding 217 amino acids. Amplified gene was then transmitted in to pGEM-T easy
vector. Subsequently, recombination vector was transformed into compentent cell E.
coli DH5α. Recombinant plasmid of PrP was then further analyzed through
sequencing.

v


MỤC LỤC
Lời cảm tạ ................................................................................................................... iii
Tóm tắt ........................................................................................................................ iv
Mục lục ....................................................................................................................... vi
Danh sách các chữ viết tắt .......................................................................................... viii
Danh sách các bảng .................................................................................................... xi
Danh sách các bảng hình ảnh ..................................................................................... x
CHƢƠNG 1: MỞ ĐẦU.............................................................................................. 1
1.1. Đặt vấn đề ............................................................................................................ 1
1.2. Mục tiêu ............................................................................................................... 1
1.3. Yêu cầu ................................................................................................................ 1
CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................... 2
2.1. Prion..................................................................................................................... 2
2.2. Bệnh não dạng xốp ở bị và các bệnh khác có ngun nhân do pion .................. 3
2.2.1. Bệnh não dạng xốp ở bò ................................................................................... 3
2.2.2 Các bệnh khác có nguyên nhân do prion ........................................................... 4

2.3. Sự nhân dòng ....................................................................................................... 5
2.3.1. Kỹ thuật PCR .................................................................................................... 5
2.3.2. Kỹ thuật điện di ................................................................................................ 6
2.3.3. Véc tơ plasmid .................................................................................................. 6
2.3.4. Sự kết buộc ....................................................................................................... 7
2.3.5. Biến nạp ở vi khuẩn E. coli .............................................................................. 7
2.3.6. Chọn lọc vi khuẩn đã đƣợc biến nạp ................................................................ 8
2.3.7. Giải trình tự ...................................................................................................... 9
2.3.7.1. Phƣơng pháp Sanger và Coulson................................................................... 9
2.3.7.2. Phƣơng pháp Maxam – Gilbert ..................................................................... 9
2.3.7.3. Giải trình tự bằng hệ thống tự động .............................................................. 9
CHƢƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................. 10
3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài ................................................................ 10
3.2. Vật liệu ................................................................................................................ 10
vi


3.3. Dụng cụ và hoá chất ............................................................................................ 10
3.3.1. Dụng cụ............................................................................................................. 10
3.3.2. Hóa chất ............................................................................................................ 10
3.3.3. Các dung dịch ................................................................................................... 11
3.4. Mồi PCR ............................................................................................................. 11
3.5. Khuếch đại gen prion từ bộ gen của bò Hàn Quốc bằng kỹ thuật PCR .............. 11
3.6. Kỹ thuật điện di trên thạch agarose phân tách gen prion ................................... 12
3.6.1. Kiểm tra sản phẩm PCR ................................................................................... 12
3.6.2. Thạch tinh sạch DNA ....................................................................................... 12
3.7. Tách chiết và tinh sạch DNA............................................................................... 12
3.8. Sự kết buộc .......................................................................................................... 13
3.9. Biến nạp plasmid vào vi khuẩn E. coli ................................................................ 13
3.10. Chuẩn bị plasmid .............................................................................................. 14

3.11. Giải trình tự ....................................................................................................... 14
CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................. 15
4.1. Kết quả ................................................................................................................. 15
4.1.1. Khuếch đại gen prion bằng kỹ thuật PCR ........................................................ 15
4.1.2. Tinh sạch đoạn PCR từ sản phẩm PCR ............................................................ 16
4.1.3. Gắn đoạn DNA vào véc tơ pGEM-T easy........................................................ 17
4.1.4. Biến nạp vào vi khuẩn E. coli ........................................................................... 17
4.1.5. Giải trình tự sản phẩm ...................................................................................... 18
4.2. Thảo luận ............................................................................................................. 18
CHƢƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .................................................................. 20
5.1. Kết luận................................................................................................................ 20
5.2. Đề nghị ................................................................................................................ 20
TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................................... 21
PHỤ LỤC ................................................................................................................... 23

vii


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Amp

ampicillin

BSE

Bovine spongiform encephalopathy
(Bệnh viêm não dạng xốp ở bò)

bp

base pair (cặp base)

cDNA

complementary deoxyribonucleic acid

CJD

Creutzfeldt-Jakob disease

dNTP

deoxynucleoside triphosphate

DNA

deoxyribonucleic acid

E. coli

Escherichia coli

EDTA

ethylen diamine tetraacetic acid

EtBr

ethidium bromide

g

gram

gDNA

genome DNA (bộ gen)

Kb

kilobase

LB

Luria-Bertani-medium (môi trƣờng Luria-Bertani)

M

molar

MBM

meat and bone meal (bột xƣơng thịt)

ml

millilitre

μl

microlitre

mM

millimolar

mRNA

messenger ribonucleic acid

NCBI

National Center for Biotechnology Information
Trung tâm thông tin công nghệ sinh học quốc gia

OIE

The International Office for Epizootic Diseases
Văn phòng quốc tế về bệnh dịch

PrP

prion protein

PrPc

cellular prion protein

PrPSc

scrapie-associated prion protein

Rpm

round per minute (vòng/phút)
viii


TE

Tris-HCl EDTA

Tris

Tris hydroxymethyl aminomethane

TSE

Transmissible Spongiform Encephalopathies

UV

ultraviolet

V

Volt

vCJD

variant Creutzfeldt-Jakob disease

ix


DANH SÁCH CÁC BẢNG
BẢNG

TRANG

Bảng A.1: Các bệnh do prion ............................................................................... 23

DANH SÁCH CÁC HÌNH ẢNH
HÌNH

TRANG

Hình 4.1: Gradient PCR ........................................................................................ 15
Hình 4.2: PCR gen prion ....................................................................................... 16
Hình 4.3: Thạch elution (tinh sạch) ...................................................................... 16
Hình 4.4: Sản phẩm sau qúa trình tinh sạch ......................................................... 17
Hình 4.5: Véc tơ pGEMT easy và gen PrP đƣợc cắt bởi EcoR I .......................... 18
Hình B.1: Cấu trúc protein PrP và vị trí đoạn mồi trên gen prion ........................ 24
Hình B.2: Mồi thiết kế cho dịng hố .................................................................... 24
Hình B.3: Bản đồ của véc tơ pGEMT easy ......................................................... 25
Hình B.4: So sánh trình tự gen prion của bò Hanwoo và dòng bò khác............... 26

x

1

CHƢƠNG 1: MỞ ĐẦU
1.1.

Đặt vấn đề
Trong thời gian gần đây prion trở thành một thuật ngữ rất đƣợc lƣu ý trong giới

khoa học. Prion là một tác nhân gây bệnh mới đƣợc chú ý từ khi gây nên bệnh bò
điên vào thập niên 1980 tại Anh Quốc. Sau khi trở thành đại dịch trên bị, ngƣời ta
cịn tìm thấy đƣợc mối liên hệ giữa các tác nhân gây nên bệnh bò điên và bệnh vCDJ
ở ngƣời. Trong suốt vài thập kỷ qua, bệnh bò điên đã gây thiệt hại đáng kể cho nền
chăn nuôi các nƣớc kể cả các nƣớc có phát hiện đại dịch và các nƣớc nhập khẩu thịt.
Các nghiên cứu về prion trong thời gian gần đây rất đƣợc chú ý, trong đó các
nhà nghiên cứu chú trọng hơn vào việc tìm hiểu cơ chế gây bệnh của prion. Ngồi ra
ngƣời ta cịn tìm cách nghiên cứu trên protein của chúng để có thể tìm ra phƣơng thức
nhằm xác định bệnh sớm nhất để tránh sự lây lan trên diện rộng có thể xảy ra.
Cùng với các nghiên cứu về prion đã và đang đƣợc triển khai trên thế giới, tại
phịng thí nghiệm cơng nghệ di truyền thuộc khoa công nghệ di truyền đại học
Sungkyunkwan, Hàn Quốc, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu gen prion của bò
Hanwoo (Hàn Quốc). Trong phạm vi đề tài này, nhƣ là bƣớc đầu trong nghiên cứu của
chúng tôi về prion, đề tài tiến hành nhân dịng và giải mã trình tự của đoạn gen prion
(mã hoá protein prion) nhằm chuẩn bị nguyên liệu cho các nghiên cứu sâu hơn về sau.

1.2.

Mục tiêu
Tiến hành nhân dịng và giải trình tự gen prion giải mã protein prion ở giống bò

Hanwoo (Hàn Quốc).

1.3.

Yêu cầu
Thiết kế mồi phát hiện gen prion và thực hiện phản ứng PCR
Chuyển gen prion vào véc tơ pGEM-T easy, biến nạp véc tơ tái tổ hợp vào vi

khuẩn E. coli.
Nhân dòng vi khuẩn, thu nhận vector tái tổ hợp và giải trình tự gen


2

CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Prion
Prion - đƣợc viết tắt từ thuật ngữ proteinaceous infectious particle (hạt lây
nhiễm có bản chất protein) là một tác nhân gây bệnh truyền nhiễm đặc biệt, đƣợc cấu
thành từ protein. Bệnh do prion còn đƣợc gọi là các bệnh não dạng xốp truyền nhiễm
(Transmissible Spongiform Encephalopathies: TSE) là các bệnh gây thái hóa thần kinh
ảnh hƣởng trên cả ngƣời và động vật. Một số bệnh đƣợc liệt kê ở Bảng A.1(Prusiner,
1998).
Prion đã đƣợc nghiên cứu cách đây gần một thế kỷ. Vào năm 1930, các nhà
khoa học đã nhận thấy tỷ lệ mắc bệnh CJD (Creutzfeldt- Jakob) rất cao ở một số gia
đình. Năm 1954 trong khi nghiên cứu bệnh run ngứa trên cừu ở Ireland, Bjorn
Sigurdsson đã đƣa ra khái niệm nhiễm vi rút chậm. Sở dĩ nó đƣợc gọi là vi rút chậm vì
sau khi lây nhiễm cho vật chủ, các triệu chứng bệnh khơng biểu hiện nhƣ: khơng sốt,
khơng có dấu hiệu ung thƣ bạch cầu, khơng có đáp ứng miễn dịch dịch thể. Ngoài ra
khả năng chịu nhiệt và các tác nhân hoá học khác cho thấy rằng prion có bản chất khác
bản chất của vi rút. Vào năm 1982, căn cứ vào các nghiên cứu trƣớc đó, Prusiner đã
cho rằng có sự tham gia của một loại đại phân tử trong q trình lây nhiễm và nó có

bản chất protein. Trong cùng nghiên cứu đƣợc đăng trên tạp chí Science vào năm
1982, Prusiner đã đặt tên tác nhân này là prion để phân biệt với các tác nhân lây nhiễm
từ vi rút và thể vi rút (Prusiner, 1982).
Khảo sát trên mRNA của gen prion cho thấy khơng có sự khác biệt trong trình
tự base của dạng bình thƣờng và các mô bị bệnh run ngứa. Điều này cho thấy cấu trúc
gen không phải là yếu tố quyết định tính lây nhiễm của prion (Chesebro và ctv, 1985).
Gen prion mã hố protein prion (PrP). Ở động vật có vú, protein prion bình
thƣờng (PrPc) là một loại protein màng của tế bào thần kinh và tế bào đệm của não bộ
và tuỷ sống, ngồi ra chúng cịn xuất hiện trên một vài loại mô ngoại vi và bạch cầu.
PrPc vẫn cịn một số đặc tính cần đƣợc nghiên cứu thêm (Kang và ctv, 2004). PrPc có
thể chuyển sang dạng PrPsc gây bệnh. PrPc đóng vai trị chính trong cách sinh bệnh và
truyền lây bệnh, nhƣng dạng đột biến PrPsc lại là thành phần chính của các hạt prion
bất thƣờng (Prusiner, 1991). Mặc dù PrPc và PrPsc có cùng trình tự acid amin, chúng


3

có cấu trúc bậc hai khác nhau. Chìa khố chính để hiểu rõ cơ chế sinh bệnh của prion
là ta phải hiểu rõ sự thay đổi cấu trúc bậc hai từ dạng bình thƣờng PrPc (glycoprotein
bề mặt tế bào) sang dạng đồng phân gây bệnh PrPsc (Hình B.1.A). Khi khảo sát
protein trên các đối tƣợng bị bệnh, ngoại trừ PrPsc đến thời điểm hiện tại, khơng có
một tác nhân đặc hiệu nào khác đƣợc cho là nguyên nhân gây nên các bệnh viêm não
dạng xốp. Nên các nhà khoa học khẳng định PrPc là nguyên nhân gây nên bệnh viêm
não dạng xốp (Diedrich và ctv, 1993).
PrPc có cấu trúc xoắn anpha (khoảng 40%) và một phần nhỏ dạng bê ta, trong
khi đó PrPsc gây bệnh lại có ít cấu trúc xoắn alpha (30%) nhiều cấu trúc dạng phiến
(khoảng 45%)(Pan và ctv, 1993; Pergami và ctv 1996). Sự khác biệt trong cấu trúc bậc
hai làm tăng tính mẫn cảm với proteinase K (PK), và sự khác biệt trong tính hồ tan
(Corsaro và ctv, 2002).
2.2. Bệnh não dạng xốp ở bò (BSE) và các bệnh khác có nguyên nhân do prion

2.2.1. Bệnh não dạng xốp ở bò
Bệnh não dạng xốp ở bò là một trong những bệnh đáng chú ý nhất trong các
loại bệnh do prion gây ra. Sở dĩ bệnh đƣợc gọi là bệnh não dạng xốp vì khi xét nghiệm
mơ học ngƣời ta thấy có các khơng bào trong chất xám của não trông giống nhƣ san
hô. Bệnh đƣợc gọi là bệnh truyền nhiễm vì chúng có khả năng lây lan trong lồi và
giữa các lồi với nhau (trích Nguyễn Ngọc Tuân, 2002).
Sau khi lây nhiễm cho bò, thời gian ủ bệnh trung bình khoảng 5 năm. Đó cũng
là lý do bệnh chỉ đƣợc phát hiện sau khi đã trở thành một đại dịch. Ví dụ nhƣ trong
trƣờng hợp của Anh, BSE đã lây nhiễm 160.000 đại gia súc và bò sữa trong suốt thập
niên 1980 cho đến khi chúng đƣợc quan tâm (Anderson và ctv, 1996). Một vài nghiên
cứu đã cho thấy rằng BSE trở thành một đại dịch lớn và lây lan mạnh, nguyên nhân là
do các nhà chăn nuôi sử dụng trực tiếp bột thịt xƣơng (MBM) vào khẩu phần ăn của
bò sữa (Nathanson và ctv, 1997; Wilesmith và ctv, 1991). Bột thịt xƣơng đƣợc chế
biến từ phủ tạng của cừu, bị, heo và gà, phó sản của lò mổ gia súc đƣợc xem nhƣ thức
ăn bổ sung giàu đạm. Trong quá trình chế biến MBM đƣợc xử lý ở nhiệt độ thấp, kết
quả là các tác nhân gây bệnh khơng đƣợc phá huỷ hồn tồn. Thật ra prion có bản chất
là protein nên rất khó tiêu diệt bằng các tác nhân vật lý và hoá học. Prion kháng rất


4

mạnh với nhiệt độ, formol, tia cực tím, phần lớn các dung môi nhƣ các chất kiềm, chất
tẩy, muối đậm đặc. Prion có khả năng kháng bức xạ gấp 10 lần vi rút, bị biến tính ở
121oC trong một giờ hoặc 240oC trong 1 phút (trích Nguyễn Ngọc Tuân, 2002). Vì
ngun nhân đó, để phịng tránh nguy cơ của prion, MBM đã bị cấm sử dụng làm thức
ăn bổ sung trong chăn ni và các nƣớc có gia súc bị lây nhiễm prion đều chọn giải
pháp thiêu hủy thú nghi bệnh. Đối với các nƣớc khác, việc cấm nhập khẩu thịt từ các
nƣớc có dịch là giải pháp tối ƣu.
Sau đợt đại dịch đầu tiên ở Anh Quốc vào năm 1986, BSE đã lan rộng khắp
Châu Âu vào năm 2000. Sau đó, đại dịch lan rộng ra các quốc gia khác nhƣ Nhật Bản

(2001), Israel (2002), Canada (2003), và tại Hoa Kỳ (2003, chỉ tìm thấy ở bị nhập từ
Canada, nên OIE xếp hạng Hoa Kỳ là quốc gia chƣa bị BSE). Ghi nhận đến tháng 2
năm 2005 đã có 189.000 trƣờng hợp lây nhiễm tại 23 quốc gia (không bao gồm Hoa
Kỳ). Đến thời điểm cuối năm 2005 vẫn chƣa có trƣờng hợp BSE nào đƣợc ghi nhận ở
Hàn Quốc (Tae-Yung Kim và ctv, 2005), tuy nhiên vì khả năng lây nhiễm và nguy hại
cho cộng đồng nên BSE vẫn là một nguy cơ đáng đƣợc quan tâm.
2.2.2 Các bệnh khác có ngun nhân do prion
BSE khơng chỉ là mối nguy cho bị mà cịn có tiềm năng gây nguy hiểm cho
ngƣời. Ngƣời ta tin rằng có mối liên quan đến BSE, bệnh vCJD (Creutzfeldt-Jakob
biến thể) đƣợc phát hiện đầu tiên vào tháng 3 năm 1996 tại Anh Quốc. Khác với CJD
thể bình thƣờng, vCJD biến thể lây nhiễm trên các bệnh nhân trẻ (trung bình 29 so với
65 tuổi), thời gian ủ bệnh cũng lâu hơn (14 tháng so với 4 tháng rƣỡi trong trƣờng hợp
CJD). Khi quan sát những điểm tƣơng đồng trong các tác nhân gây bệnh vCJD và BSE
và sự tƣơng đồng trong cách lây truyền của các tác nhân gây bệnh có thể giúp ta đƣa ra
kết luận rằng vCJD và BSE có cùng tác nhân gây bệnh (WHO, 2002).
Trong thực tế và thực nghiệm, ngƣời ta quan sát đƣợc prion cịn có khả năng
gây bệnh trên chuột nhắt, chuột cống, chồn, mèo, cừu, nai, dê và một vài loài linh
trƣởng khác (Bảng A.1).


5

2.3. Sự nhân dịng
Khố luận này là bƣớc đầu trong q trình nghiên cứu của nhóm nghiên cứu tại
Hàn Quốc với mục tiêu thực hiện nhân dòng và giải mã đoạn gen của prion trên giống
bò Hanwoo (Bos taurus coreanae) của Hàn Quốc.
Gen prion đƣợc khuếch đại từ bộ gen (gDNA) của bò Hàn Quốc bởi kỹ thuật
PCR nhờ vào 2 đoạn mồi: mồi xi và mồi ngƣợc (Hình B.2). Sản phẩm khuếch đại có
651 cặp base (bp) mã hố 217 acid amin. Sau đó, đoạn gen đƣợc khuếch đại này đƣợc
chuyển vào véc tơ pGEM-T easy. Véc tơ chứa đoạn gen mong muốn đƣợc chuyển vào

vi khuẩn E. coli. Sản phẩm PrP tái tổ hợp này đƣợc dùng để giải trình tự và là vật liệu
cho các nghiên cứu sau này.

2.3.1. Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reacton)
Kỹ thuật PCR đƣợc sử dụng để khuếch đại một đoạn DNA đã đƣợc biết trƣớc
trình tự.
Phản ứng PCR phụ thuộc vào khả năng tách đôi của mạch đơn DNA và bắt cặp
bổ sung trong điều kiện thí nghiệm đƣợc kiểm sốt (in vitro). Nhân tố thứ hai ảnh
hƣởng đến phản ứng PCR là đoạn mồi (primer), đoạn oligonucleotide có độ dài
khoảng 18 - 20 base. Hai đoạn mồi này bắt cặp bổ sung với đoạn DNA cần khuếch đại
đã đƣợc biến tính. Nhiệt độ ủ bắt cặp từ 50 – 60oC. Đoạn mồi sau khi bắt cặp với DNA
mẫu đƣợc tiếp tục kéo dài nhờ vào các deoxynucleotide (dNTPs) và DNA polymerase
chịu nhiệt có trong hỗn hợp phản ứng. Enzyme này đƣợc gọi là Taq polymerase,
enzyme này vẫn có khả năng giữ hoạt tính ở 95oC trong q trình duỗi DNA và 72oC
trong quá trình kéo dài chuỗi. Khi phản ứng kết thúc, hỗn hợp đƣợc nâng lên 95oC để
tách đoạn DNA mạch đơi mới. Sau đó nhiệt độ lại đƣợc hạ thấp xuống và bắt đầu một
chu kỳ mới vì các đoạn mồi vẫn còn trong hỗn hợp. Các chu kỳ đƣợc lặp lại sẽ nhanh
chóng khuếch đại đoạn gen mong muốn. Ở mỗi chu kỳ, số lƣợng DNA đƣợc tăng gấp
đơi. Vì thế trong một thời gian ngắn chỉ khoảng hơn 20 chu kỳ, đoạn DNA mong
muốn đƣợc tăng lên hàng triệu lần trong khi đoạn DNA gốc vẫn không đƣợc nhân lên.
(Sandy Primrose và ctv, 2004)


6

2.3.2. Kỹ thuật điện di
Kỹ thuật điện di không chỉ đƣợc sử dụng trong q trình phân tích mà cịn đƣợc
sử dụng cho quá trình tinh sạch DNA. Kỹ thuật điện di thƣờng đƣợc tiến hành trên 2
loại thạch là agarose và polyacrylamide. Agarose thích hợp phân tách DNA có độ dài
từ vài trăm base đến 20.000 base. Polyacrylamide thƣờng sử dụng cho các đoạn có

kích thƣớc nhỏ hơn. Cơ chế của quá trình dựa trên sự khác biệt về trọng khối phân tử
của DNA. Dƣới tác dụng của điện trƣờng, DNA tích điện âm sẽ di chuyển từ cực âm
sang cực dƣơng và xuyên qua các lỗ nhỏ trong thạch. Các phân tử có khối lƣợng nhỏ
sẽ di chuyển nhanh hơn và ngƣợc lại. Thạch agarose có cấu trúc mạng phức tạp bao
gồm các đại phân tử có kích thƣớc lỗ phụ thuộc vào nồng độ agarose đƣợc sử dụng.
Kỹ thuật điện di là kỹ thuật cho phép xác định kích thƣớc đoạn DNA. DNA sẽ
đƣợc xuyên qua chất nền đƣợc gọi là gel trong một điện trƣờng. DNA tích điện âm cho
nên khi điện di mẫu đƣợc cho vào những giếng gần cực điện âm và DNA sẽ di chuyển
về phía cực dƣơng. Sau q trình điện di trên thạch, các đoạn DNA đƣợc phân tách
theo khối lƣợng của chúng. Sự di chuyển tỷ lệ nghịch với kích thƣớc phân tử, DNA có
khối lƣợng nhỏ di chuyển nhanh và ngƣợc lại. Các DNA này có thể đƣợc quan sát
bằng tia UV sau khi nhuộm bằng các tác nhân nhuộm màu nhƣ EtBr.

2.3.3. Véc tơ plasmid
Plasmid là phân tử DNA nằm ngồi nhiễm sắc thể có kích thƣớc biến thiên từ 1
Kb đến hơn 200 Kb. Các plasmid hầu hết là mạch đơi, dạng vịng và có thể tách ra từ
vi khuẩn ở dạng siêu xoắn.
Vì khả năng có thể nhân đôi với số lƣợng lớn và độc lập với tế bào chủ nên
plasmid là vật liệu quan trọng trong công nghệ di truyền. Plasmid đƣợc phát triển từ
thập kỷ 1970, đầu thập kỷ các tác nhân chọn lọc nhƣ kanr, ampr, hay terr đƣợc chuyển
vào plasmid. Năm 1973, Cohen và cộng sự lần đầu tiên sử dụng plasmid nhƣ là một
véc tơ cho q trình nhân dịng - pSC101. Plasmid đầu tiên mang đầy đủ đặc tính cần
thiết cho một véc tơ nhân dòng là plasmid pBR313. Từ năm 1983 đến nay, plasmid đã
đƣợc phát triển rất nhiều đặc tính mới: mang các origin và các promoter có nguồn gốc
từ thể thực khuẩn, các tác nhân chọn lọc mới, véc tơ plasmid biểu hiện (Brown, 2005).


7

Plasmid có các đặc điểm nhƣ sau :

Plasmid có thể tìm thấy ở nhiều lồi vi khuẩn, hầu hết các plasmid chỉ có
khả năng lây nhiễm trong một số ít vật chủ.
Là một DNA nằm ngoài nhiễm sắc thể (NST), có vật chất di truyền ổn định
và nhân đơi độc lập với NST tế bào vật chủ.
Có rất nhiều cơ chế để ổn định số lƣợng trong tế bào vật chủ.
Phụ thuộc vào enzyme và protein tổng hợp từ tế bào chủ trong quá trình sao
mã và dịch mã.
Thƣờng chứa các enzyme cần thiết cho tế bào chủ. Đặc tính này rất cần thiết
cho quá trình chọn lọc plasmid trong công nghệ di truyền nhƣ kháng sinh,
phân hủy các hợp chất hữu cơ phức tạp, các enzyme cắt hạn chế và biến đổi.

2.3.4. Sự kết buộc (ligation)
Tất cả các tế bào sống đều có khả năng sản sinh DNA ligase, nhƣng enzyme sử
dụng trong công nghệ di truyền thƣờng đƣợc tinh sạch từ vi khuẩn E. coli đã bị nhiễm
bởi thể thực khuẩn T4. Trong tế bào, enzyme này đó một vai trị rất quan trọng trong
q trình sửa chữa các lỗi trên mạch đôi DNA. Trong thực nghiệm, DNA ligase khơng
chỉ có khả năng sửa chữa các lỗi trên mạch đơi mà cịn có khả năng nối các phân tử
DNA lại với nhau hoặc hai đầu của cùng một phân tử.
T4 DNA ligase là một ligase phổ biến có nguồn gốc từ thể thực khuẩn T4. Nó
có khả năng kết buộc mạch đôi của DNA hoặc RNA. Enzyme này có hoạt tính trên cả
đầu dính và đầu bằng. Ngồi ra T4 DNA ligase cịn có thể sửa chữa, thêm vào những
base cịn trống trên mạch đơi của DNA, RNA. Q trình này địi hỏi phải có ATP.
2.3.5. Biến nạp ở vi khuẩn E. coli
Biến nạp vào vi khuẩn E. coli là một bƣớc cần thiết trong bất kỳ thí nghiệm
nhân dịng nào, ngƣời ta ln tìm cách nâng cao khả năng biến nạp của chúng. Mục
tiêu là đƣa plasmid vào tế bào chủ nhằm nhân nhanh số lƣợng phục vụ cho nghiên cứu.
Nguyên nhân của việc sử dụng E. coli là do chúng có cấu trúc di truyền đơn giản, hơn
nữa chúng là đối tƣợng nghiên cứu đƣợc hiểu rõ nhất về sinh hóa cũng nhƣ các thơng
tin di truyền. Các nghiên cứu đã cho thấy rằng tế bào E. coli và plasmid DNA có khả

8

năng biến nạp cao nhất ở mơi trƣờng có ion calci và nhiệt độ thấp (0 – 5oC), và bƣớc
sốc nhiệt (37 – 45oC) cũng đóng một vai trị quan trọng. Một vài yếu tố khác nhƣng
các ion kim loại ngồi canci cũng có vai trị trong q trình biến nạp.
Trạng thái khả nạp tự nhiên xuất hiện ở một vài loài vi khuẩn khi mà nồng độ
chất dinh dƣỡng và hàm lƣợng oxy trong môi trƣờng giảm xuống thấp. Thực tế khi
nghiên cứu biến nạp phải tiến hành xử lý tế bào để chúng ở trạng thái khả nạp, có khả
năng hấp thu DNA. Để có đƣợc tế bào khả nạp ngƣời ta thƣờng xử lý tế bào bằng các
phƣơng pháp vật lý và hóa học. Trong phƣơng pháp hóa học, các tế bào vi khuẩn bình
thƣờng sẽ đƣợc xử lý bằng các hóa chất và DNA có thể xâm nhập vào các lỗ trên
màng tế bào. Hoá chất quan trọng nhất trong phƣơng pháp hoá học là CaCl2.
Quá trình biến nạp sử dụng tế bào khả nạp đƣợc chia thành hai bƣớc chính :
Xử lý với CaCl2: biến tế bào E. coli bình thƣờng thành tế bào khả nạp.
Sốc nhiệt: tạo sự mất cân bằng nhiệt bên trong và bên ngồi màng tế bào
khiến DNA có thể dễ dàng xâm nhập vào tế bào.
2.3.6. Chọn lọc vi khuẩn đã đƣợc biến nạp
Vì mơi trƣờng ni cấy có chứa các tác nhân kháng sinh nên chỉ có những
khuẩn lạc có sự hiện diện của vec tơ mới có gen tổng hợp kháng sinh và tồn tại trên
môi trƣờng kháng sinh. Tuy nhiên, các véc tơ này có thể mang gen mong muốn hoặc
tự đóng vịng. Để nhận biết đƣợc, chúng ta cần sử dụng thêm một phƣơng pháp nhận
biết khác nhƣ :
- PCR: sau khi tách plasmid của những khuẩn lạc tồn tại đƣợc trên mơi
trƣờng có chứa kháng sinh, thực hiện phản ứng PCR với các primer của gen chèn. Sau
đó điện di để kiểm tra kết quả.
- Xác định thể biến nạp có mang plasmid tái tổ hợp bằng phƣơng pháp lai
khuẩn lạc.
- Sử dụng enzyme cắt plasmid để xác định sự hiện diện của gen chèn.
- Sử dụng phƣơng pháp α-complementation. Sự hoạt động của enzyme

-galactosidase dễ dàng nhận biết trong mơi trƣờng dinh dƣỡng có 5-bromo-4-chloro3-indolyl- -D-galactoside (Xgal). Hợp chất này không màu nhƣng khi bị cắt sẽ có màu


9

xanh. Trên mơi trƣờng đặc, những khuẩn lạc có -galactosidase hoạt động sẽ có màu
xanh trong khi những khuẩn lạc khơng có

-galactosidase có màu trắng. Vì Xgal

khơng có khả năng hoạt hố -galactosidase, isopropyl- -D-thiogalactoside (IPTG)
đƣợc cho vào mơi trƣờng. -galactosidase đƣợc tổng hợp bởi gene lacZ. Với các véc
tơ có đoạn chèn, gene lacZ sẽ bị cắt và khơng có khả năng tổng hợp -galactosidase
nên có màu trắng. Các véc tơ tự đóng vịng hoặc nối véc tơ – véc tơ gene lacZ hoạt
động làm khuẩn lạc có màu xanh (Lodisd và ctv, 2000) .

2.3.7. Giải trình tự
Có 2 phƣơng pháp chính đƣợc sử dụng để giải trình tự DNA.
2.3.7.1. Phƣơng pháp Sanger và Coulson
Yêu cầu mạch đơn DNA và phân tử DNA đƣợc giải mã thƣờng đƣợc nhân dòng
từ véc tơ M13. Nguyên tắc của phản ứng là dideoxynucleotide (ddNTP) đƣợc cho vào
để nối dài mạch DNA, ddNTP có thể gắn vào mạch nhƣng khơng có khả năng kéo dài
mạch do khơng có đƣờng ở đầu 3’. Các nhóm ddATP, ddTTP, ddGTP, ddCTP lần lƣợt
đƣợc phản ứng và có thể dễ dàng đọc trình tự bằng máy chụp phóng xạ
2.3.7.2. Phƣơng pháp Maxam – Gilbert (Phân giải DNA)
Để thực hiện phƣơng pháp Maxam – Gilbert đòi hỏi phải có DNA mạch đơi, do
đó véc tơ M13 khơng cần phải sử dụng. Nguyên tắc của phƣơng pháp là cắt đoạn DNA
có sử dụng các hố chất để đánh dấu.
2.3.7.3. Giải trình tự bằng hệ thống tự động
Nguyên tắc chung của máy giải trình tự gene tự động dựa trên cơ sở phƣơng

pháp Sanger và Coulson. Máy đọc trình tự cả trên hai mạch đơn, do vậy có thể phát
hiện và giảm các nhầm lẫn do kỹ thuật. Giải trình tự theo phƣơng pháp tự động sử
dụng các chất huỳnh quang để đánh dấu DNA, và đƣợc đọc bằng các đầu dị của máy
dựa vào độ dài bƣớc sóng khác nhau.


10

CHƢƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài
Đề tài đƣợc thực hiện từ tháng 1 năm 2006 đến tháng 6 năm 2006 tại phịng thí
nghiệm Cơng Nghệ Di Truyền, khoa Cơng Nghệ Di Truyền trƣờng Đại học
Sungkyunkwan, Suwon, Hàn Quốc.

3.2. Vật liệu
Gen prion đƣợc sử dụng có nguồn gốc từ giống bị Hanwoo, đƣợc cung cấp bởi
viện Nơng Nghiệp, thuộc Bộ Nơng Nghiệp và Phát Triển Nơng Thơn Hàn Quốc. Q
trình ly trích và tinh sạch bộ gen của bị đƣợc thực hiện bởi anh Kim Yong Hwan,
phịng thí nghiệm Cơng Nghệ Di Truyền, khoa Công Nghệ Di Truyền trƣờng Đại học
Sungkyunkwan.

3.3. Dụng cụ và hoá chất
3.3.1 Dụng cụ
Micropipette

Nồi hấp

Máy luân nhiệt

Tủ sấy

Máy điện di ngang

Lị vi sóng

Máy đọc kết quả điện di bằng tia UV

Cân điện tử

Máy ly tâm thƣờng và ly tâm lạnh

Máy đo pH

Nồi hấp cách thủy 16 oC và 42 oC

Buồng cấy vi khuẩn

Tủ mát (4oC), tủ âm (-20oC) và

Máy vortex

âm sâu (-80oC)

Máy khuấy từ
Máy ủ và máy ủ lắc

3.3.2 Hóa chất

11

agarose type VII

methanol

ampicillin

màng nylon

D-(+)-glucose

Mg2SO4

EDTA

NaOH

ethanol

potassium acetate

ethidium Bromide

sodium acetate

glacial acetic acid

sodium chloride

glucose

SDS

glycerol

tryptone

IPTG

X-gal

isopropanol
3.3.3. Các dung dịch
EtBr: 10 mg/ml in H2O giữ trong môi trƣờng tránh ánh sáng, 4ºC
TE : 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0
Môi trƣờng LB: 170 mM NaCl; 0,5% (w/v) dịch chiết nấm nem và
1% (w/v) peptone, pH 7,5
TAE: 50X TAE (Tris-Acetate-EDTA); 242 g Tris base; 57,1 ml acetic acid
và 100 ml EDTA 0,,5 M
Thêm nƣớc cất 2 lần sao cho dung dịch vừa đủ 1 lít và pH = 8,5.

3.4. Mồi PCR
Mồi PCR đƣợc sử dụng để khuếch đại đoạn gen prion là đoạn oligonucleotide
đƣợc thiết kế dựa theo trình tự đã đƣợc nghiên cứu và ấn bản trên Trung tâm Thông tin
Công nghệ sinh học quốc gia Hoa Kỳ (NCBI), Ngân hàng gen NM_181015. Trình tự
đoạn mồi đƣợc trình bày ở Hình B.2. Mồi đƣợc tổng hợp bởi cơng ty COSMO và kiểm
tra bằng chƣơng trình DNAstart.
3.5. Khuếch đại gen prion từ bộ gen của bò Hàn Quốc bằng kỹ thuật PCR
Kỹ thuật PCR đƣợc sử dụng để khuếch đại đoạn gen prion bằng cách sử dụng

đoạn mồi đặc hiệu. Hỗn hợp phản ứng bao gồm 10 μl chứa 10 pM mồi xuôi và mồi


12

ngƣợc; 100 ng gDNA; 0,4 mM dNTPs; 10X dung dịch đệm PCR, 5 đơn vị Super Taq
DNA polymerase (Super-Bio, Seoul, Hàn Quốc); 25 mM Mg2SO4
Q trình chuẩn hố phản ứng PCR đƣợc thực hiện bằng gradient PCR với nhiệt
độ bắt cặp từ 55 - 60oC. Phản ứng khuếch đại bao gồm biến tính ở 95oC trong 3 phút;
theo sau đó là 30 chu kỳ gồm biến tính 94oC trong 45 giây, ủ bắt cặp ở 58oC trong 30
giây, và kéo dài ở 72oC trong 30 giây; và cuối cùng là một chu kỳ kéo duỗi ở 72oC trong
3 phút.
3.6. Kỹ thuật điện di trên thạch agarose phân tách gen prion
3.6.1. Kiểm tra sản phẩm PCR
Sản phẩm PCR đƣợc điện di trên thạch agarose 0.8%. Dung dịch mẫu bao gồm 5
μl DNA xét nghiệm, 1 μl dung dịch đệm 6X, và thang chuẩn 1 Kb (GeneRulerTM,
Fermentas, Co.) đƣợc sử dụng để xác định độ dài của đoạn gen đƣợc khuếch đại. Điều
kiện của phản ứng điện di là 100V trong 30 phút. Gel điện di sau đó đƣợc nhuộm với
ethidium bromide (EtBr) và đặt trên máy lắc trong 30 phút. Sản phẩm sau khi nhuộm
đƣợc quan sát bằng đèn UV.
3.6.2. Thạch tinh sạch DNA
Để làm thạch tinh sạch DNA, thạch agarose 0,8% đƣợc cho thêm 2,5 μl EtBr trong
quá trình làm nguội. Sau khi cho DNA đã đƣợc trộn với dung dịch đệm 6X và thang
chuẩn cho vào giếng, tiến hành điện di ở 80V trong 10 phút sau đó tăng lên 120V trong
25 phút.
3.7. Tách chiết và tinh sạch DNA
DNA đƣợc tách bằng kỹ thuật điện di. Dƣới đèn UV ta có thể nhận biết đƣợc phần
DNA mong muốn, DNA này sau đó đƣợc cắt ra khỏi gel sao cho lấy đƣợc hết lƣợng
DNA tuy nhiên dính càng ít gel càng tốt. Sau đó, đoạn gel đƣợc tách rửa sử dụng bộ Kit
QUAquick Gel Extraction (Qiagene) theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất và đƣợc trình bày

ở qui trình C.I.


13

Để kiểm tra kết quả sau quá trình tách DNA, 2 μl sản phẩm đƣợc trộn với 3 μl 1X
dung dịch đệm TAE và 1 μl dung dịch đệm 6X, điện di trong thạch agarose 0,8%, dùng
thang chuẩn 1 Kb.

3.8. Sự kết buộc
DNA đƣợc buộc vào véc tơ pGEM-T easy (Promega, Madison, WI, U.S.A.) bằng
enzyme ligase T4 (Promega). Véc tơ pGEM-T easy đƣợc trình bày ở Hình B.3. Hỗn hợp
chứa 1 μl véc tơ pGEM-T easy, 4 μl đoạn DNA cần chèn vào, 5 μl buffer 2X, 1 μl ligase
(T4).
Phản ứng xảy ra ở nhiệt độ 16oC trong 1 giờ hoặc 4oC qua đêm. Sau quá trình kết
buộc, 2 μl sản phẩm đƣợc kiểm tra bằng điện di trong thạch agarose 0,8%, phần còn lại
đƣợc dùng để chuyển vào vi khuẩn E. coli DH5α.
3.9. Biến nạp plasmid vào vi khuẩn E. coli
Plasmid tái tổ hợp đƣợc chuyển vào tế bào E. coli khả biến DH5α để tiến hành
nhân dòng.
E. coli sử dụng cho quá trình biến nạp là chủng E. coli khả nạp DH5α. Véc tơ
pGEM-T easy đã đƣợc gắn đoạn gen prion đƣợc chuyển vào DH5α.
Để nâng cao hiệu suất của quá trình biến nạp 5 μl plasmid đƣợc trộn chung với
100 μl E. coli và đƣợc tiến hành biến nạp trong CaCl2 (Sambrook, Russell et al. 2002).
Hỗn hợp đƣợc lắc nhẹ và đặt vào nƣớc đá trong 30 phút. Sau đó, huyền phù đƣợc sốc
nhiệt trong bồn nƣớc ở 42oC trong 90 giây. Cuối cùng huyễn dịch đƣợc đặt lại trong nƣớc
đá khoảng 2 phút để sốc lạnh. Sau đó 1ml mơi trƣờng LB đƣợc cho vào ống chứa sản
phẩm và nuôi cấy trong máy ủ lắc ở 37oC trong 90 phút. Dung dịch ni cấy sau đó đƣợc
ly tâm 12000 rpm trong 1 phút. Bỏ phần nổi và thêm 100 μl nƣớc tinh khiết vào ống
eppendorf. Sau đó vortex để hồ tan tủa với nƣớc cất hai lần, dung dịch này sau đó đƣợc

dàn lên đĩa LB-Amp+. Để có thể chọn đƣợc véc tơ tái tổ hợp, cho thêm vào mỗi đĩa LB
20 μl X-gal và 34 μl IPTG. Các đĩa này đƣợc ủ ở 37oC trong một đêm...


14

3.10. Chuẩn bị plasmid
Chọn các khuẩn lạc có màu trắng (khuẩn lạc có chứa plasmid tái tổ hợp) và tiếp
tục nuôi cấy trong môi trƣờng LB lỏng (5 ml LB và 5 μl Amp+) ở 37oC trong 12 giờ bằng
máy ủ lắc. Sau q trình ni cấy, 700 μl sản phẩm đƣợc trộn với 300 μl glycerol trữ âm
ở -80oC để phục vụ cho các thí nghiệm sau. Phần cịn lại đƣợc dùng vào việc chuẩn bị
plasmid. Phƣơng pháp tách chiết sử dụng theo Kit tinh sạch plasmid (LaboPassTM) đƣợc
trình bày rõ hơn ở qui trình C.II.
3.11. Giải trình tự
Trƣớc khi mẫu đƣợc gởi đến công ty Macrogen để giải trình tự, DNA tinh khiết
đƣợc cắt bởi EcoR I để kiểm tra plasmid có chứa đúng gen mong muốn hay khơng. Việc
xác định trình tự DNA đƣợc thực hiện bởi công ty Macrogen, sử dụng phƣơng pháp tự
động bằng máy giải mã trình tự gen.