Nhân dòng gen prion từ giống bò Hanwoo của hàn quốc

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
****0O0****









ĐẶNG QUỐC BẢO





NHÂN DÕNG GEN PRION (PrP) TỪ GIỐNG BÕ
HANWOO (Bos Taurus Coreanae)
CỦA HÀN QUỐC




LUẬN VĂN KỸ SƢ
CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh
-Tháng 9/2006-

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
****0O0****












NHÂN DÕNG GEN PRION (PrP) TỪ GIỐNG BÕ
HANWOO (Bos Taurus Coreanae)
CỦA HÀN QUỐC

LUẬN VĂN KỸ SƢ
CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC



Giáo viên hƣớng dẫn Sinh viên thực hiện
GS.TS. Kwon Moosik ĐẶNG QUỐC BẢO
(Pr PGS.TS Nguyễn Ngọc Tuân KHÓA: 2002 – 2006








Thành phố Hồ Chí Minh
-Tháng 9/2006-




MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING
NONG LAM UNIVERSITY, HCMC
FACULTY OF BIOTECHNOLOGY


GENE CLONING PRION (PrP) FROM KOREAN
BOVINE:
HANWOO (Bos taurus Coreanae)



GRADUATION THESIS
MAJOR: BIOTECHNOLOGY



Professor Student
Ph.D Kwon Moosik DANG QUOC BAO
Dr. Nguyen Ngoc Tuan TERM: 2002 - 2006







HCMC, 09/2006



iii

LỜI CẢM TẠ

Chân thành cảm ơn
Ban giám hiệu Trƣờng Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh.
Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học.
Các Thầy Cô Phòng Quan Hệ Quốc Tế
Các Thầy Khoa Công Nghệ Di Truyền, Đại Học Sungkyunkwan, Hàn Quốc
Đã truyền đạt cho em những kiến thức quý báu và giúp đỡ em trong thời gian
em học tập tại trƣờng.
Đặc biệt xin chân thành cảm ơn sâu sắc đến:
TS. Kwon Moosik- Trƣởng bộ môn Công Nghệ Di Truyền, Đại Học
Sungkyunkwan đã tận tình dạy bảo, hƣớng dẫn, giúp đỡ em trong nghiên
cứu và thực hiện đề tài.
TS. Nguyễn Ngọc Tuân- Trƣởng phòng Sau Đại Học, Đại Học Nông Lâm
đã giúp đỡ rất nhiều và hƣớng dẫn tận tình trong quá trình viết khoá luận.
TS. Trần Thị Dung- Trƣởng bộ môn Công Nghệ Sinh Học trƣờng Đại Học
Nông Lâm đã tạo điều kiện cho em thực hiện đề tài này.
Ths. Kim Yong Hwan và các anh chị trong phòng thí nghiệm Công Nghệ Di
Truyền, Đại Học Sungkyunkwan đã tận tình hƣớng dẫn, chỉ bảo em trong
suốt thời gian em thực hiện khóa luận.
Xin cảm ơn các bạn trong và ngoài lớp đã động viên giúp đỡ tôi trong suốt quá
trình học tập và làm khóa luận tốt nghiệp.
Con xin gửi lòng biết ơn sâu sắc đến bố mẹ, những ngƣời đã sinh thành, nuôi
dƣỡng, dạy dỗ con và luôn bên con trong mọi thời điểm.

Thủ Đức, ngày 10 tháng 08 năm 2006

iv
TÓM TẮT

ĐẶNG QUỐC BẢO, Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Tháng 8/2006. ―NHÂN
DÒNG GEN PRION (PrP) TỪ BÒ HANWOO (BOS TAURUS COREANAE) CỦA
HÀN QUỐC‖
Giáo viên hƣớng dẫn
GS. TS. KWON MOOSIK
PGS. TS. NGUYỄN NGỌC TUÂN
BSE là một bệnh truyễn nhiễm do prion, là một trong những bệnh đƣợc quan
tâm trong giới nghiên cứu. Hiện nay các nhà khoa học đang tiến hành nghiên cứu để
có thể tạo ra một bộ kit chẩn đoán sớm bệnh BSE, các nghiên cứu này đều tập trung
nghiên cứu cấu trúc protein PrPsc, dạng protein gây bệnh của prion. Bƣớc đầu trong
nghiên cứu của chúng tôi về protein PrPsc, đã tiến hành nhân dòng và giải trình tự gen
prion.
Tách chiết DNA từ máu của bò Hanwoo và PCR để khuếch đại gen prion. Gen
prion đƣợc khuếch đại có kích thƣớc 651 bp, sau đó đƣợc kết buộc vào véc tơ pGEM-
T easy và chuyển vào vi khuẩn E. coli DH5α. Khuẩn lạc chứa véc tơ tái tổ hợp có màu
trắng trên môi trƣờng LB chuyên biệt (Amp
+
, Xgal, IPTG). Plasmid thu đƣợc sau quá
trình tinh sạch đƣợc giải mã trình tự. Kết quả giải trình tự thành công đã cho thấy sự
giống nhau gần nhƣ hoàn toàn trong trình tự gen prion của bò Hanwoo và bò châu Âu.
Việc thành công trong quá trình nhân dòng sẽ là bƣớc đầu quan trọng cho mục
tiêu cuối cùng trong nghiên cứu của chúng tôi là tạo kit chẩn đoán bệnh BSE.

v
ABSTRACT

Prion — short for proteinaceous infectious particle — is a unique type of
infectious agent, as it is made only of protein. Prion was termed in 1982 by Prusiner,
who was prized Nobel for his research on prion. Bovine spongiform encephalopathy
(BSE) is one of the most notable prion diseases. BSE is not only potential risk on
bovine but also on human. Until now Korea is free from BSE (Tae-Yung Kim et.
al,2005), but the BSE is high risk damage society. The study on BSE is absolutelly
remarkable. As the first step of our prion study, we were attempted cloning full gene
of prion encoding bovine prion protein from Korean bovine. PrP gene was amplified
from genome DNA (gDNA) of Korean bovine by PCR following 2 primers forward
and reverses primer. The recombinant PrP of full sequence cDNA is 651bp long
encoding 217 amino acids. Amplified gene was then transmitted in to pGEM-T easy
vector. Subsequently, recombination vector was transformed into compentent cell E.
coli DH5α. Recombinant plasmid of PrP was then further analyzed through
sequencing.




vi
MỤC LỤC

Lời cảm tạ ................................................................................................................... iii
Tóm tắt ........................................................................................................................ iv

Mục lục ....................................................................................................................... vi
Danh sách các chữ viết tắt .......................................................................................... viii
Danh sách các bảng .................................................................................................... xi
Danh sách các bảng hình ảnh ..................................................................................... x
CHƢƠNG 1: MỞ ĐẦU .............................................................................................. 1
1.1. Đặt vấn đề ............................................................................................................ 1
1.2. Mục tiêu ............................................................................................................... 1
1.3. Yêu cầu ................................................................................................................ 1
CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................... 2
2.1. Prion ..................................................................................................................... 2
2.2. Bệnh não dạng xốp ở bò và các bệnh khác có nguyên nhân do pion .................. 3
2.2.1. Bệnh não dạng xốp ở bò ................................................................................... 3
2.2.2 Các bệnh khác có nguyên nhân do prion ........................................................... 4
2.3. Sự nhân dòng ....................................................................................................... 5
2.3.1. Kỹ thuật PCR .................................................................................................... 5
2.3.2. Kỹ thuật điện di ................................................................................................ 6
2.3.3. Véc tơ plasmid .................................................................................................. 6
2.3.4. Sự kết buộc ....................................................................................................... 7
2.3.5. Biến nạp ở vi khuẩn E. coli .............................................................................. 7
2.3.6. Chọn lọc vi khuẩn đã đƣợc biến nạp ................................................................ 8
2.3.7. Giải trình tự ...................................................................................................... 9
2.3.7.1. Phƣơng pháp Sanger và Coulson ................................................................... 9
2.3.7.2. Phƣơng pháp Maxam – Gilbert ..................................................................... 9
2.3.7.3. Giải trình tự bằng hệ thống tự động .............................................................. 9
CHƢƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................. 10
3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài ................................................................ 10
3.2. Vật liệu ................................................................................................................ 10

vii
3.3. Dụng cụ và hoá chất ............................................................................................ 10
3.3.1. Dụng cụ............................................................................................................. 10
3.3.2. Hóa chất ............................................................................................................ 10
3.3.3. Các dung dịch ................................................................................................... 11
3.4. Mồi PCR ............................................................................................................. 11
3.5. Khuếch đại gen prion từ bộ gen của bò Hàn Quốc bằng kỹ thuật PCR .............. 11
3.6. Kỹ thuật điện di trên thạch agarose phân tách gen prion ................................... 12
3.6.1. Kiểm tra sản phẩm PCR ................................................................................... 12
3.6.2. Thạch tinh sạch DNA ....................................................................................... 12
3.7. Tách chiết và tinh sạch DNA ............................................................................... 12
3.8. Sự kết buộc .......................................................................................................... 13
3.9. Biến nạp plasmid vào vi khuẩn E. coli ................................................................ 13
3.10. Chuẩn bị plasmid .............................................................................................. 14
3.11. Giải trình tự ....................................................................................................... 14
CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................. 15
4.1. Kết quả ................................................................................................................. 15
4.1.1. Khuếch đại gen prion bằng kỹ thuật PCR ........................................................ 15
4.1.2. Tinh sạch đoạn PCR từ sản phẩm PCR ............................................................ 16
4.1.3. Gắn đoạn DNA vào véc tơ pGEM-T easy ........................................................ 17
4.1.4. Biến nạp vào vi khuẩn E. coli ........................................................................... 17
4.1.5. Giải trình tự sản phẩm ...................................................................................... 18
4.2. Thảo luận ............................................................................................................. 18
CHƢƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .................................................................. 20
5.1. Kết luận................................................................................................................ 20
5.2. Đề nghị ................................................................................................................ 20
TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................................... 21
PHỤ LỤC ................................................................................................................... 23

viii
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Amp ampicillin
BSE Bovine spongiform encephalopathy
(Bệnh viêm não dạng xốp ở bò)
bp base pair (cặp base)
cDNA complementary deoxyribonucleic acid
CJD Creutzfeldt-Jakob disease
dNTP deoxynucleoside triphosphate
DNA deoxyribonucleic acid
E. coli Escherichia coli
EDTA ethylen diamine tetraacetic acid
EtBr ethidium bromide
g gram
gDNA genome DNA (bộ gen)
Kb kilobase
LB Luria-Bertani-medium (môi trƣờng Luria-Bertani)
M molar
MBM meat and bone meal (bột xƣơng thịt)
ml millilitre
μl microlitre
mM millimolar
mRNA messenger ribonucleic acid
NCBI National Center for Biotechnology Information
Trung tâm thông tin công nghệ sinh học quốc gia
OIE The International Office for Epizootic Diseases
Văn phòng quốc tế về bệnh dịch
PrP prion protein

PrPc cellular prion protein
PrPSc scrapie-associated prion protein
Rpm round per minute (vòng/phút)



ix
TE Tris-HCl EDTA
Tris Tris hydroxymethyl aminomethane
TSE Transmissible Spongiform Encephalopathies
UV ultraviolet
V Volt
vCJD variant Creutzfeldt-Jakob disease

x
DANH SÁCH CÁC BẢNG

BẢNG TRANG
Bảng A.1: Các bệnh do prion ............................................................................... 23



DANH SÁCH CÁC HÌNH ẢNH

HÌNH TRANG
Hình 4.1: Gradient PCR ........................................................................................ 15
Hình 4.2: PCR gen prion ....................................................................................... 16
Hình 4.3: Thạch elution (tinh sạch) ...................................................................... 16
Hình 4.4: Sản phẩm sau qúa trình tinh sạch ......................................................... 17
Hình 4.5: Véc tơ pGEMT easy và gen PrP đƣợc cắt bởi EcoR I .......................... 18
Hình B.1: Cấu trúc protein PrP và vị trí đoạn mồi trên gen prion ........................ 24
Hình B.2: Mồi thiết kế cho dòng hoá .................................................................... 24
Hình B.3: Bản đồ của véc tơ pGEMT easy ......................................................... 25
Hình B.4: So sánh trình tự gen prion của bò Hanwoo và dòng bò khác ............... 26

1





CHƢƠNG 1: MỞ ĐẦU

1.1. Đặt vấn đề
Trong thời gian gần đây prion trở thành một thuật ngữ rất đƣợc lƣu ý trong giới
khoa học. Prion là một tác nhân gây bệnh mới đƣợc chú ý từ khi gây nên bệnh bò
điên vào thập niên 1980 tại Anh Quốc. Sau khi trở thành đại dịch trên bò, ngƣời ta
còn tìm thấy đƣợc mối liên hệ giữa các tác nhân gây nên bệnh bò điên và bệnh vCDJ
ở ngƣời. Trong suốt vài thập kỷ qua, bệnh bò điên đã gây thiệt hại đáng kể cho nền
chăn nuôi các nƣớc kể cả các nƣớc có phát hiện đại dịch và các nƣớc nhập khẩu thịt.
Các nghiên cứu về prion trong thời gian gần đây rất đƣợc chú ý, trong đó các
nhà nghiên cứu chú trọng hơn vào việc tìm hiểu cơ chế gây bệnh của prion. Ngoài ra
ngƣời ta còn tìm cách nghiên cứu trên protein của chúng để có thể tìm ra phƣơng thức
nhằm xác định bệnh sớm nhất để tránh sự lây lan trên diện rộng có thể xảy ra.
Cùng với các nghiên cứu về prion đã và đang đƣợc triển khai trên thế giới, tại
phòng thí nghiệm công nghệ di truyền thuộc khoa công nghệ di truyền đại học

Sungkyunkwan, Hàn Quốc, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu gen prion của bò
Hanwoo (Hàn Quốc). Trong phạm vi đề tài này, nhƣ là bƣớc đầu trong nghiên cứu của
chúng tôi về prion, đề tài tiến hành nhân dòng và giải mã trình tự của đoạn gen prion
(mã hoá protein prion) nhằm chuẩn bị nguyên liệu cho các nghiên cứu sâu hơn về sau.

1.2. Mục tiêu
Tiến hành nhân dòng và giải trình tự gen prion giải mã protein prion ở giống bò
Hanwoo (Hàn Quốc).

1.3. Yêu cầu
Thiết kế mồi phát hiện gen prion và thực hiện phản ứng PCR
Chuyển gen prion vào véc tơ pGEM-T easy, biến nạp véc tơ tái tổ hợp vào vi
khuẩn E. coli.
Nhân dòng vi khuẩn, thu nhận vector tái tổ hợp và giải trình tự gen
2





CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Prion
Prion - đƣợc viết tắt từ thuật ngữ proteinaceous infectious particle (hạt lây
nhiễm có bản chất protein) là một tác nhân gây bệnh truyền nhiễm đặc biệt, đƣợc cấu
thành từ protein. Bệnh do prion còn đƣợc gọi là các bệnh não dạng xốp truyền nhiễm
(Transmissible Spongiform Encephalopathies: TSE) là các bệnh gây thái hóa thần kinh
ảnh hƣởng trên cả ngƣời và động vật. Một số bệnh đƣợc liệt kê ở Bảng A.1(Prusiner,
1998).
Prion đã đƣợc nghiên cứu cách đây gần một thế kỷ. Vào năm 1930, các nhà

khoa học đã nhận thấy tỷ lệ mắc bệnh CJD (Creutzfeldt- Jakob) rất cao ở một số gia
đình. Năm 1954 trong khi nghiên cứu bệnh run ngứa trên cừu ở Ireland, Bjorn
Sigurdsson đã đƣa ra khái niệm nhiễm vi rút chậm. Sở dĩ nó đƣợc gọi là vi rút chậm vì
sau khi lây nhiễm cho vật chủ, các triệu chứng bệnh không biểu hiện nhƣ: không sốt,
không có dấu hiệu ung thƣ bạch cầu, không có đáp ứng miễn dịch dịch thể. Ngoài ra
khả năng chịu nhiệt và các tác nhân hoá học khác cho thấy rằng prion có bản chất khác
bản chất của vi rút. Vào năm 1982, căn cứ vào các nghiên cứu trƣớc đó, Prusiner đã
cho rằng có sự tham gia của một loại đại phân tử trong quá trình lây nhiễm và nó có
bản chất protein. Trong cùng nghiên cứu đƣợc đăng trên tạp chí Science vào năm
1982, Prusiner đã đặt tên tác nhân này là prion để phân biệt với các tác nhân lây nhiễm
từ vi rút và thể vi rút (Prusiner, 1982).
Khảo sát trên mRNA của gen prion cho thấy không có sự khác biệt trong trình
tự base của dạng bình thƣờng và các mô bị bệnh run ngứa. Điều này cho thấy cấu trúc
gen không phải là yếu tố quyết định tính lây nhiễm của prion (Chesebro và ctv, 1985).
Gen prion mã hoá protein prion (PrP). Ở động vật có vú, protein prion bình
thƣờng (PrPc) là một loại protein màng của tế bào thần kinh và tế bào đệm của não bộ
và tuỷ sống, ngoài ra chúng còn xuất hiện trên một vài loại mô ngoại vi và bạch cầu.
PrPc vẫn còn một số đặc tính cần đƣợc nghiên cứu thêm (Kang và ctv, 2004). PrPc có
thể chuyển sang dạng PrPsc gây bệnh. PrPc đóng vai trò chính trong cách sinh bệnh và
truyền lây bệnh, nhƣng dạng đột biến PrPsc lại là thành phần chính của các hạt prion
bất thƣờng (Prusiner, 1991). Mặc dù PrPc và PrPsc có cùng trình tự acid amin, chúng
3





có cấu trúc bậc hai khác nhau. Chìa khoá chính để hiểu rõ cơ chế sinh bệnh của prion
là ta phải hiểu rõ sự thay đổi cấu trúc bậc hai từ dạng bình thƣờng PrPc (glycoprotein
bề mặt tế bào) sang dạng đồng phân gây bệnh PrPsc (Hình B.1.A). Khi khảo sát

protein trên các đối tƣợng bị bệnh, ngoại trừ PrPsc đến thời điểm hiện tại, không có
một tác nhân đặc hiệu nào khác đƣợc cho là nguyên nhân gây nên các bệnh viêm não
dạng xốp. Nên các nhà khoa học khẳng định PrPc là nguyên nhân gây nên bệnh viêm
não dạng xốp (Diedrich và ctv, 1993).
PrPc có cấu trúc xoắn anpha (khoảng 40%) và một phần nhỏ dạng bê ta, trong
khi đó PrPsc gây bệnh lại có ít cấu trúc xoắn alpha (30%) nhiều cấu trúc dạng phiến
(khoảng 45%)(Pan và ctv, 1993; Pergami và ctv 1996). Sự khác biệt trong cấu trúc bậc
hai làm tăng tính mẫn cảm với proteinase K (PK), và sự khác biệt trong tính hoà tan
(Corsaro và ctv, 2002).

2.2. Bệnh não dạng xốp ở bò (BSE) và các bệnh khác có nguyên nhân do prion
2.2.1. Bệnh não dạng xốp ở bò
Bệnh não dạng xốp ở bò là một trong những bệnh đáng chú ý nhất trong các
loại bệnh do prion gây ra. Sở dĩ bệnh đƣợc gọi là bệnh não dạng xốp vì khi xét nghiệm
mô học ngƣời ta thấy có các không bào trong chất xám của não trông giống nhƣ san
hô. Bệnh đƣợc gọi là bệnh truyền nhiễm vì chúng có khả năng lây lan trong loài và
giữa các loài với nhau (trích Nguyễn Ngọc Tuân, 2002).
Sau khi lây nhiễm cho bò, thời gian ủ bệnh trung bình khoảng 5 năm. Đó cũng
là lý do bệnh chỉ đƣợc phát hiện sau khi đã trở thành một đại dịch. Ví dụ nhƣ trong
trƣờng hợp của Anh, BSE đã lây nhiễm 160.000 đại gia súc và bò sữa trong suốt thập
niên 1980 cho đến khi chúng đƣợc quan tâm (Anderson và ctv, 1996). Một vài nghiên
cứu đã cho thấy rằng BSE trở thành một đại dịch lớn và lây lan mạnh, nguyên nhân là
do các nhà chăn nuôi sử dụng trực tiếp bột thịt xƣơng (MBM) vào khẩu phần ăn của
bò sữa (Nathanson và ctv, 1997; Wilesmith và ctv, 1991). Bột thịt xƣơng đƣợc chế
biến từ phủ tạng của cừu, bò, heo và gà, phó sản của lò mổ gia súc đƣợc xem nhƣ thức
ăn bổ sung giàu đạm. Trong quá trình chế biến MBM đƣợc xử lý ở nhiệt độ thấp, kết
quả là các tác nhân gây bệnh không đƣợc phá huỷ hoàn toàn. Thật ra prion có bản chất
là protein nên rất khó tiêu diệt bằng các tác nhân vật lý và hoá học. Prion kháng rất
4

mạnh với nhiệt độ, formol, tia cực tím, phần lớn các dung môi nhƣ các chất kiềm, chất
tẩy, muối đậm đặc. Prion có khả năng kháng bức xạ gấp 10 lần vi rút, bị biến tính ở
121
o
C trong một giờ hoặc 240
o
C trong 1 phút (trích Nguyễn Ngọc Tuân, 2002). Vì
nguyên nhân đó, để phòng tránh nguy cơ của prion, MBM đã bị cấm sử dụng làm thức
ăn bổ sung trong chăn nuôi và các nƣớc có gia súc bị lây nhiễm prion đều chọn giải
pháp thiêu hủy thú nghi bệnh. Đối với các nƣớc khác, việc cấm nhập khẩu thịt từ các
nƣớc có dịch là giải pháp tối ƣu.
Sau đợt đại dịch đầu tiên ở Anh Quốc vào năm 1986, BSE đã lan rộng khắp
Châu Âu vào năm 2000. Sau đó, đại dịch lan rộng ra các quốc gia khác nhƣ Nhật Bản
(2001), Israel (2002), Canada (2003), và tại Hoa Kỳ (2003, chỉ tìm thấy ở bò nhập từ
Canada, nên OIE xếp hạng Hoa Kỳ là quốc gia chƣa bị BSE). Ghi nhận đến tháng 2
năm 2005 đã có 189.000 trƣờng hợp lây nhiễm tại 23 quốc gia (không bao gồm Hoa
Kỳ). Đến thời điểm cuối năm 2005 vẫn chƣa có trƣờng hợp BSE nào đƣợc ghi nhận ở
Hàn Quốc (Tae-Yung Kim và ctv, 2005), tuy nhiên vì khả năng lây nhiễm và nguy hại
cho cộng đồng nên BSE vẫn là một nguy cơ đáng đƣợc quan tâm.

2.2.2 Các bệnh khác có nguyên nhân do prion
BSE không chỉ là mối nguy cho bò mà còn có tiềm năng gây nguy hiểm cho
ngƣời. Ngƣời ta tin rằng có mối liên quan đến BSE, bệnh vCJD (Creutzfeldt-Jakob
biến thể) đƣợc phát hiện đầu tiên vào tháng 3 năm 1996 tại Anh Quốc. Khác với CJD
thể bình thƣờng, vCJD biến thể lây nhiễm trên các bệnh nhân trẻ (trung bình 29 so với
65 tuổi), thời gian ủ bệnh cũng lâu hơn (14 tháng so với 4 tháng rƣỡi trong trƣờng hợp

CJD). Khi quan sát những điểm tƣơng đồng trong các tác nhân gây bệnh vCJD và BSE
và sự tƣơng đồng trong cách lây truyền của các tác nhân gây bệnh có thể giúp ta đƣa ra
kết luận rằng vCJD và BSE có cùng tác nhân gây bệnh (WHO, 2002).
Trong thực tế và thực nghiệm, ngƣời ta quan sát đƣợc prion còn có khả năng
gây bệnh trên chuột nhắt, chuột cống, chồn, mèo, cừu, nai, dê và một vài loài linh
trƣởng khác (Bảng A.1).



5






2.3. Sự nhân dòng
Khoá luận này là bƣớc đầu trong quá trình nghiên cứu của nhóm nghiên cứu tại
Hàn Quốc với mục tiêu thực hiện nhân dòng và giải mã đoạn gen của prion trên giống
bò Hanwoo (Bos taurus coreanae) của Hàn Quốc.
Gen prion đƣợc khuếch đại từ bộ gen (gDNA) của bò Hàn Quốc bởi kỹ thuật
PCR nhờ vào 2 đoạn mồi: mồi xuôi và mồi ngƣợc (Hình B.2). Sản phẩm khuếch đại có
651 cặp base (bp) mã hoá 217 acid amin. Sau đó, đoạn gen đƣợc khuếch đại này đƣợc
chuyển vào véc tơ pGEM-T easy. Véc tơ chứa đoạn gen mong muốn đƣợc chuyển vào
vi khuẩn E. coli. Sản phẩm PrP tái tổ hợp này đƣợc dùng để giải trình tự và là vật liệu
cho các nghiên cứu sau này.

2.3.1. Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reacton)
Kỹ thuật PCR đƣợc sử dụng để khuếch đại một đoạn DNA đã đƣợc biết trƣớc
trình tự.

Phản ứng PCR phụ thuộc vào khả năng tách đôi của mạch đơn DNA và bắt cặp
bổ sung trong điều kiện thí nghiệm đƣợc kiểm soát (in vitro). Nhân tố thứ hai ảnh
hƣởng đến phản ứng PCR là đoạn mồi (primer), đoạn oligonucleotide có độ dài
khoảng 18 - 20 base. Hai đoạn mồi này bắt cặp bổ sung với đoạn DNA cần khuếch đại
đã đƣợc biến tính. Nhiệt độ ủ bắt cặp từ 50 – 60
o
C. Đoạn mồi sau khi bắt cặp với DNA
mẫu đƣợc tiếp tục kéo dài nhờ vào các deoxynucleotide (dNTPs) và DNA polymerase
chịu nhiệt có trong hỗn hợp phản ứng. Enzyme này đƣợc gọi là Taq polymerase,
enzyme này vẫn có khả năng giữ hoạt tính ở 95
o
C trong quá trình duỗi DNA và 72
o
C
trong quá trình kéo dài chuỗi. Khi phản ứng kết thúc, hỗn hợp đƣợc nâng lên 95
o
C để
tách đoạn DNA mạch đôi mới. Sau đó nhiệt độ lại đƣợc hạ thấp xuống và bắt đầu một
chu kỳ mới vì các đoạn mồi vẫn còn trong hỗn hợp. Các chu kỳ đƣợc lặp lại sẽ nhanh
chóng khuếch đại đoạn gen mong muốn. Ở mỗi chu kỳ, số lƣợng DNA đƣợc tăng gấp
đôi. Vì thế trong một thời gian ngắn chỉ khoảng hơn 20 chu kỳ, đoạn DNA mong
muốn đƣợc tăng lên hàng triệu lần trong khi đoạn DNA gốc vẫn không đƣợc nhân lên.
(Sandy Primrose và ctv, 2004)