Khảo sát khả năng kháng oxy hóa và kích thích miễn dịch in vivo của bài thuốc nam địa long

ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM
SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

THÀNH ĐỒN TP. HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO NGHIỆM THU

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG OXI HĨA VÀ KÍCH THÍCH
MIỄN DỊCH IN VIVO CỦA BÀI THUỐC NAM ĐỊA LONG
NGUYỄN THỊ MỸ NƯƠNG

CƠ QUAN CHỦ TRÌ: TRUNG TÂM PHÁT TRIỂN
KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ TRẺ

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
THÁNG 10/ 2016


ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM
SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

THÀNH ĐỒN TP. HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO NGHIỆM THU

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG OXI HĨA VÀ KÍCH THÍCH
MIỄN DỊCH IN VIVO CỦA BÀI THUỐC NAM ĐỊA LONG

CƠ QUAN QUẢN LÝ

CƠ QUAN CHỦ TRÌ

(Ký tên/đóng dấu xác nhận)

(Ký tên/đóng dấu xác nhận)

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
THÁNG 10/ 2016


MỤC LỤC

TÓM TẮT ............................................................................................................ I
ABSTRACT ........................................................................................................ II
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT .................................... III
DANH MỤC CÁC BẢNG .................................................................................IV
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ............................................................. V
LỜI CẢM ƠN ....................................................................................................VI
PHẦN MỞ ĐẦU .................................................................................................. 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ....................................................................... 3
1.1.

Giới thiệu sơ nét về ung thư............................................................................. 3

1.2.

Y học cổ truyền trong điều trị ung thư ............................................................. 4

1.3.

Bài thuốc Nam Địa Long (NDL) ..................................................................... 6

1.4. Nghiên cứu hoạt tính kích thích miễn dịch và kháng oxi hóa dựa trên mơ hình
chuột suy giảm miễn dịch do CY............................................................................... 8
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP ............................................................. 10
2.1.

Chuẩn bị cao chiết bài thuốc .......................................................................... 10

2.2.

Mơ hình động vật .......................................................................................... 11

2.3.

Phương pháp xác định số lượng bạch cầu tổng trong máu chuột .................... 12

2.4.

Phương pháp xác định một số loại bạch cầu trong máu chuột ........................ 12

2.5. Phương pháp xác định phần trăm tế bào bạch cầu lympho TCD4 và TCD8 trong
máu chuột ............................................................................................................... 14
2.6.

Phương pháp xác định lượng cytokine IL-2 và IL-6 trong máu chuột ............ 14

2.7.

Phương pháp xác định nồng độ protein .......................................................... 15

2.8.

Phương pháp xác định mức độ peroxy lipid (TBARS) ................................... 15

2.9.

Phương pháp xác định lượng glutathione (GSH) ........................................... 17

2.10.

Phương pháp xác định mức độ biểu hiện gene ............................................ 18

2.11.

Phương pháp phân tích số liệu.................................................................... 20

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN..................................................................... 22


3.1.

Nội dung 1 – Thu nhận cao chiết bài thuốc .................................................... 22

3.2.

Nội dung 2 – Khảo sát sơ bộ mô hình thử nghiệm ......................................... 22

3.2.1.

Kết quả sự thay đổi trọng lượng chuột ........................................................ 23

3.2.2.

Kết quả sự thay đổi các đặc điểm liên quan đến miễn dịch ......................... 24

3.2.3.

Kết quả sự thay đổi các đặc điểm liên quan đến stress oxi hóa ................... 27

3.3.

Nội dung 3 – Đánh giá sự hồi phục cơ thể ..................................................... 29

3.4.

Nội dung 4 - Khảo sát khả năng kích thích miễn dịch của NDL..................... 30

3.4.1.

Sự thay đổi tỉ lệ trong lượng lách, tuyến ức ................................................ 30

3.4.2.

Sự thay đổi số lượng bạch cầu trong máu chuột ......................................... 31

3.4.3.

Sự thay đổi bạch cầu lympho TCD4 và TCD8 ................................................. 32

3.4.4.

Sự thay đổi cytokine IL-2 và IL-6 .............................................................. 35

3.4.5.

Bàn luận ..................................................................................................... 37

3.5.

Nội dung 5 - Khảo sát khả năng kháng oxi hóa của NDL .............................. 39

3.5.1.

Khảo sát tỉ lệ trọng lượng gan .................................................................... 40

3.5.2.

Sự thay đổi hàm lượng MDA trong gan chuột ............................................ 41

3.5.3.

Sự thay đổi hàm lượng glutathione trong gan chuột.................................... 41

3.5.4.

Sự thay đổi mức độ biểu hiện của enzyme CAT và SOD............................ 42

3.5.5.

Bàn luận ..................................................................................................... 44

CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ ...................................................................... 47
4.1.

Kết luận ......................................................................................................... 47

4.2.

Kiến nghị....................................................................................................... 47

TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................. 48
PHỤ LỤC ........................................................................................................... 53


TĨM TẮT

Y học cổ truyền (YHCT) ở nước ta đóng góp một phần quan trọng trong hệ thống
chăm sóc sức khỏe nhưng còn gặp nhiều hạn chế do thiếu bằng chứng khoa học về
hiệu quả của các sản phẩm YHCT. Bài thuốc Nam địa long (NDL) là bài thuốc gồm:
địa long (Pheretima aspergillum Michaelsen); đậu đen (Vigna unguiculata Walp.);
đậu xanh (Vigna radiata (L.) Wilczek); và bồ ngót (Sauropus androgynus (L) Merr.),
trong dân gian được sử dụng trong điều trị viêm khớp, động kinh, ung thư, … nhưng
chưa có cơng bố nào liên quan đến bài thuốc này. Mục tiêu của nghiên cứu này là
nghiên cứu tác dụng bảo vệ của bài thuốc trên mơ hình chuột tiêm cyclophosphamide
(CY), một chất hóa trị liệu ung thư. Do đó, nghiên cứu khảo sát hai hoạt tính: (1) khả
năng kích thích miễn dịch và (2) kháng oxi hóa trên chuột gây ức chế miễn dịch và
stress oxi hóa.
Kết quả nghiên cứu cho thấy liều CY 150 mg/kg ức chế rõ rệt hệ miễn dịch của chuột
và cảm ứng một số đặc điểm của stress oxi hóa. NDL ngăn chặn sự sụt giảm trọng
lượng cơ thể, cải thiện phần trăm trọng lượng lách, tuyến ức và làm tăng 42 – 44 %

số lượng bạch cầu trong máu, trong đó NDL kích thích tăng sinh 48 – 53 % bạch cầu
lympho, đặc biệt bạch cầu lympho TCD4 (34 – 43 %) và lympho TCD8 (35 – 46%) so
với lô bệnh lý. Tuy nhiên, NDL không làm thay đổi hàm lượng IL-2 và IL-6 đáng kể
trong máu chuột. NDL cũng làm giảm đáng kể mức độ peroxy hóa lipid và ngược lại
cảm ứng tăng mức độ glutathione và tăng sự biểu hiện của gene catalase và
superoxide dimustase đáng kể so với lô bệnh lý. Những kết quả này chứng mình rằng
NDL có khả năng kích thích miễn dịch và kháng oxi hóa trên chuột tiêm CY.

I


ABSTRACT

Traditional medicine plays an integral role in Vietnamese healthcare system but
scientific data limited. In this study, we investigated the protective effect of a
Vietnamese folk medicine formula, Nam Dia Long (NDL) on cyclophosphamide
(CY) – induced immunosuppressive mice. NDL formula include earthworm
(Pheretima aspergillum, 10g), black bean (Vigna unguiculata Walp., 20g), mung
bean (Vigna radiata (L.) Wilczek, 20g) and sweet leaf (Sauropus androgynus (L.)
Merr.), 40g). According to this objective, we have two contents: (1) determination
immunostimulant activity of NDL extract; (2) investigation antioxidant activity of
NDL extract on CY-induced immunosupressive mice.
The result showed a single dose of CY administration (150 mg/kg)

markedly

supressed immune system and induced some biomarkers of oxidative stress. NDL
was against losing body weight, increased spleen index and thymus index, restored
42 – 44 % leukocyte than those of CY control mice. Moreover, administration NDL
significantly increased lymphocyte (48 – 53 %), CD4 T cells (34 – 43 %) and CD8 T

cells (35 – 46 %) than those of immunosuppressive mice by CY. IL-2 and IL-6 were
not restored by NDL extract. NDL significantly decreased malondialdehyde level. In
contrast, NDL increased glutathione and upregulated catalase and superoxide
dimustase. These results suggested NDL improved proliferation of immune cells and
decrease the levels of oxidative stress on CY – induced mice.

II


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

BC: bạch cầu
BSA: Albumin trong huyết thanh bị
C: đối chứng, lơ chuột bình thường
CAT: catalase
CY: cyclophosphamide
CY150: lơ chuột được tiêm CY liều 150 mg/kg thể trọng
CY200: lô chuột được tiêm CY liều 200 mg/kg thể trọng
ĐĐ: đậu đen
ĐL: địa long
ĐX: đậu xanh
GSH: glutathione
Leva: Levamisole
MDA: malondialdehyde
NDL: Nam địa long
Sily: silymarin
SOD: superoxide dismutase
WBC: bạch cầu tổng
YHCT: Y học cổ truyền

III


DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1. Thông số mồi......................................................................................... 19
Bảng 3.1. Trọng lượng chuột (g) ở các lô thử nghiệm ............................................ 23
Bảng 3.2. Phần trăm lách chuột ở các lô thử nghiệm sau 5 và 8 ngày tiêm CY ...... 24
Bảng 3.3. Số lượng bạch cầu tổng ở các lô thử nghiệm sau khi tiêm CY 5 và 8 ngày
.............................................................................................................................. 25
Bảng 3.4. Số lượng các loại bạch cầu (BC) trong máu chuột ở các lô thử nghiệm sau
5 và 8 ngày tiêm CY .............................................................................................. 26
Bảng 3.5. Sự thay đổi % gan, hàm lượng MDA, GSH ở các lô thử nghiệm sau 5 và
8 ngày tiêm CY ..................................................................................................... 27
Bảng 3.6. Sự thay đổi trọng lượng chuột ở các lơ thí nghiệm ................................. 29
Bảng 3.7. Phần trăm lách và tuyến ức ở các lô thử nghiệm .................................... 30
Bảng 3.8. Số lượng một số loại tế bào bạch cầu (BC) trong máu chuột ở các lơ thí
nghiệm .................................................................................................................. 33
Bảng 3.9. Phần trăm tế bào TCD4 và TCD8 ở các lô thử nghiệm .......................... 35
Bảng 3.10. Nồng độ IL-2 và IL-6 trong máu chuột ở các lô thử nghiệm ................ 36
Bảng 3.11. Phần trăm gan, nồng độ MDA và GSH ở các lô thử nghiệm ................ 40
Bảng 3.12. Sự thay đổi biểu hiện gene của các lơ thí nghiệm (n=3) ....................... 44

IV


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 2.1. Các vị thành phần của bài thuốc NDL ................................................... 10
Hình 2.2. Đặc điểm hình thái của các tế bào bạch cầu chuột (đực) quan sát bằng

phương pháp nhuộm Giemsa (100X). .................................................................... 13
Hình 3.1. Trọng lượng chuột ở các lô thử nghiệm sau 5 ngày tiêm CY ................. 24
Hình 3.2. Trọng lượng chuột ở các lô thử nghiệm sau 8 ngày tiêm CY ................. 24
Hình 3.3. Phần trăm trọng lượng lách ở các lô thử nghiệm sau 5 ngày và 8 ngày tiêm
CY. Mỗi điểm đại diện cho giá trị của 1 chuột. ...................................................... 25
Hình 3.4. Bạch cầu tổng số (WBC) trong máu chuột ở các lô thử nghiệm sau 5 và 8
ngày tiêm CY ........................................................................................................ 26
Hình 3.5. Hàm lượng MDA ở các lô thử nghiệm sau 5 và 8 ngày tiêm CY ........... 28
Hình 3.6. Biểu đồ sự thay đổi trọng lượng chuột ở các lơ thí nghiệm .................... 30
Hình 3.7. Phần trăm lách (A) và phần trăm tuyến ức (B) ở các lơ thí nghiệm. ....... 31
Hình 3.8. Số lượng bạch cầu tổng (WBC) ở các lơ thử nghiệm.. ........................... 32
Hình 3.9. Sự thay đổi số lượng bạch cầu lympho ở các lơ thí nghiệm trước và sau khi
tiêm CY.. ............................................................................................................... 34
Hình 3.10. Phần trăm bạch cầu lympho TCD4 và TCD8 trong máu chuột. ................ 35
Hình 3.11. Nồng độ IL-2 trong huyết thanh chuột ở các lơ thí nghiệm. ................. 37
Hình 3.12. Nồng độ IL-6 trong huyết thanh chuột ở các lơ thí nghiệm. ................. 37
Hình 3.13. Phần trăm trọng lượng gan ở các lơ thử nghiệm. ................................. 40
Hình 3.14. Sự thay đổi hàm lượng MDA trong gan chuột ở các lơ thí nghiệm. ..... 41
Hình 3.15. Sự thay đổi hàm lượng MDA trong gan chuột ở các lơ thí nghiệm. .... 42
Hình 3.16. Sự thay đổi biểu hiện CAT ở các lơ thí nghiệm. .................................. 43
Hình 3.17. Sự thay đổi biểu hiện SOD1 ở các lơ thí nghiệm. ................................ 43
Hình 3.18. Sự thay đổi biểu hiện SOD2 ở các lô thí nghiệm. ................................ 43

V


LỜI CẢM ƠN

Đề tài được tài trợ bởi Sở Khoa học và Cơng nghệ TP.HCM (chương trình Vườn ươm
sáng tạo Khoa học và Cơng nghệ trẻ, do Thành Đồn TP.HCM chủ trì). Chúng tơi

cũng chân thành cám ơn dược sĩ Nguyễn Phương Nam và dược sĩ Dương Hồng Tố
Quyên ở Bệnh viện Y học cổ truyền TP.HCM đã hỗ trợ trong việc cung cấp các thành
phần bài thuốc và sắc thuốc. Nhóm tác giả cũng gửi lời cảm ơn đến Khoa Y học cổ
truyền và Phịng thí nghiệm Vi sinh công nghệ Dược, ĐH Y Dược TP HCM đã hỗ
trợ các thiết bị để thực hiện nghiên cứu này. Các tác giả cũng xin gửi lời cảm ơn chân
thành đến PGS.TS Nguyễn Thị Thu Hương, Trung Tâm Sâm và Dược liệu vì những
chia sẻ kinh nghiệm và hỗ trợ hóa chất cho các thử nghiệm ban đầu. Cuối cùng chúng
tôi xin cám ơn các thành viên PTN Sinh học phân tử, Bộ mơn Di truyền đã đóng góp
những ý kiến hữu ích trong q trình thực hiện đề tài.

VI


PHẦN MỞ ĐẦU
1. Tên đề tài/dự án: Khảo sát khả năng kháng oxi hóa và kích thích miễn dịch in
vivo của bài thuốc Nam Địa Long
Chủ nhiệm đề tài/dự án: Nguyễn Thị Mỹ Nương
Cơ quan chủ trì: Trung tâm Phát triển Khoa học và Công nghệ Trẻ
Thời gian thực hiện: 18 tháng, được gia hạn 6 tháng (đến tháng 11/2016)
Kinh phí được duyệt: 80 triệu đồng
Kinh phí đã cấp: 40 triệu đồng theo Thông báo số ..../TB-SKHCN
2. Mục tiêu: mục tiêu tổng quát của hướng nghiên cứu là tìm kiếm các bằng chứng
khoa học cho tác dụng kích thích miễn dịch và kháng oxi hóa của bài thuốc y học
cổ truyền. Mục tiêu cụ thể của đề tài này là xác định tác dụng kích thích miễn dịch
và kháng oxi hóa của bài thuốc Nam Địa Long trên mơ hình chuột nhắt trắng gây
suy giảm miễn dịch bằng cyclophosphamid
3. Nội dung:
TT

Nội dung thực hiện

1

Chuẩn bị cao chiết bài
thuốc:
- Sắc thuốc để thu được cao
chiết nước bài thuốc theo
phương pháp chiết nóng
truyền thống
- Đơng khơ để thu được
dạng bột khơ

Sản phẩm cần đạt

Mức độ
hoàn thành
Thu nhận bột cao chiết Hoàn thành. Thu nhận 30 g
bài thuốc đủ dùng cho cao chiết bài thuốc với các
thí nghiệm (khoảng tiêu chí chất lượng
30g) và đảm bảo một số
tiêu chuẩn bài thuốc: độ
ẩm, hiệu suất chiết,
nhiễm khuẩn (khơng
thuộc nội dung đề tài)

2

Tạo mơ hình chuột cảm ứng Mơ hình chuột được
cyclophosphamide.
tiêm CP phù hợp tiêu chí

Khảo sát sự suy giảm miễn để được sử dụng cho
dịch và kháng oxi hóa khi nghiên cứu: suy giảm
tiêm CP ở các thời điểm 5, 8 miễn dịch và hệ thống
kháng oxi hóa
ngày và cách tiêm CP

Hồn thành. Khảo sát mơ
hình 5 ngày, 8 ngày thử
nghiệm và liều tiêm 150,
200 mg/kg trọng lượng.
Chọn mơ hình: tiêm 150
mg/kg và thời gian 5 ngày

3

Quan sát sự phục hồi cơ thể Kết quả đánh giá khả
Chuột được tiêm CP và cho năng hồi phục cơ thể
uống NDL/silymarin/nước. một cách tương đối của
Sau 5, 8 ngày xác định trọng bài thuốc NDL thông
lượng cơ thể, cơ quan, các qua các chỉ số: trọng

Khảo sát thêm lô chứng
dương levamisole để thấy
rõ tác động tăng cường
miễn dịch. Đề tài chỉ khảo
sát 5 ngày thử nghiệm do
mơ hình đã chọn ở trên.

1

thông số hồng cầu, tiểu cầu lượng cơ thể, cơ quan,
nhằm đánh giá sự hồi phục cơ hồng cầu, tiểu cầu.
thể một cách tương đối sau
khi được uống NDL so với
mẫu đối chứng (uống nước).
4

Khảo sát tác động kích
thích miễn dịch của bài
thuốc
Chuột được tiêm CY và cho
uống NDL/silymarin/nước.
Sau 5, 8 ngày, xác định công
thức bạch cầu và sự biểu hiện
cytokine IL-2, IL-6

5

Khảo sát tác động kháng
oxi hóa của bài thuốc
Chuột được tiêm CY và cho
uống NDL/silymarin/nước.
Sau 5, 8 ngày, xác định chỉ số
peroxide hóa lipid, hàm lượng
glutathione, hoạt tính enzyme
kháng
oxi
hóa
gồm

superoxide dismutase (SOD),
catalase (CAT)

6

Viết báo cáo tổng kết,
nghiệm thu đề tài

Kết quả đánh giá khả
năng kích thích miễn
dịch của bài thuốc NDL
thông qua các chỉ tiêu:
công thức bạch cầu và
mức độ biểu hiện IL2,
IL6

Kết quả đánh giá khả
năng kháng oxi hóa của
bài thuốc NDL thơng
qua các chỉ tiêu: mức độ
peroxide lipid, hàm
lượng glutathione, hoạt
tính enzyme SOD, CAT.

Báo cáo tổng kết, báo
cáo tóm tắt theo quy
định.

2

Khơng khảo sát được chỉ
tiêu hồng cầu và tiểu cầu do
đơn vị phối hợp yêu cầu
lượng máu cao nên nhóm
khơng thực hiện phân tích
huyết học đa thông số bằng
máy.
Khảo sát thêm lô chứng
dương levamisole để thấy
rõ tác động tăng cường
miễn dịch. Khảo sát thêm
sự thay đổi số lượng bạch
cầu TCD4 và TCD8 bằng flow
cytometry để xác định rõ
loại bạch cầu lympho nào
được tăng cường.
Đề tài chỉ khảo sát 5 ngày
thử nghiệm do mơ hình đã
chọn ở trên.
Đề tài chỉ khảo sát 5 ngày
thử nghiệm do mô hình đã
chọn ở trên.

Hồn thành


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu sơ nét về ung thư
Ung thư là một trong bốn bệnh dẫn đến nguy cơ tử vong cao, sau bệnh tim mạch,
bệnh hơ hấp mạn tính và tiểu đường. Theo thống kê của WHO, tính đến năm 2012

trên thế giới có đến 14,1 triệu ca ung thư mắc mới và 8,2 triệu người chết do ung thư.
Trong đó, 57 % số ca ung thư mắc mới, 65 % số ca tử vong do ung thư xảy ra ở các
nước ít phát triển [23]. Ở Việt Nam, theo thống kê của WHO năm 2012, 125 nghìn
ca mắc ung thư mới trong năm, chiếm tỉ lệ 140,4/100.000 người/năm, thuộc nhóm có
tỉ lệ mắc ung thư cao thứ 3 thế giới. Số người chết do ung thư là 94,7 nghìn
người/năm, chiếm tỉ lệ 108,7/100.000 người/năm, thuộc nhóm có tỉ lệ tử vong do ung
thư cao thứ 2 thế giới. Ở nam giới, ung thư gan và ung thư phổi chiếm tỉ lệ cao nhất.
Trong khi đó ở phụ nữ ung thư vú là phổ biến nhất.
Hiện nay, phẫu thuật, xạ trị và hóa trị là các phương pháp được sử dụng chủ yếu trong
điều trị ung thư nhằm tiêu diệt hoặc loại bỏ trực tiếp khối u. Phẫu thuật thường hiệu
quả trong loại bỏ các khối u rắn và được phát hiện sớm. Phương pháp xạ trị và hóa
trị ln dẫn đến nhiều tác dụng phụ, làm cơ thể bệnh nhân suy yếu nghiêm trọng, gây
đau đớn, suy nhược… Đặc biệt với liệu pháp hóa học, hầu hết các thuốc kháng ung
thư dùng trong điều trị không phải là thuốc tiêu diệt đặc hiệu tế bào ung thư, mà chủ
yếu tác động tiêu diệt tế bào ung thư dựa trên tác động đến cơ chế phân chia tế bào
do tế bào ung thư phân chia nhanh. Do đó các loại thuốc này cũng làm tổn thương
các tế bào lành đặc biệt là các tế bào tủy xương, tế bào miễn dịch, tế bào niêm mạc
ruột, tế bào tóc, ... Hơn nữa, việc sử dụng hóa trị liệu với những thuốc kháng ung thư
là những chất tinh một thời gian dài có thể dẫn dến hiện tượng kháng thuốc. Chính vì
vậy khuynh hướng nghiên cứu sử dụng phối hợp các loại thuốc, các phương
pháp khác nhau trong điều trị nhằm tạo đa tác động và tác động đa mục tiêu
đang được phát triển, đặc biệt đối với các bệnh mang đa nguyên nhân và lan
rộng như ung thư [29]. Một số liệu pháp khác cũng được phát triển như liệu pháp
miễn dịch, liệu pháp hormone (hormonal therapy), liệu pháp nhắm trúng đích phân
tử (targeted therapy) nhưng chưa được sử dụng rộng rãi, giới hạn ở một vài dạng ung
thư, và có chi phí cao.
3


Bên cạnh đó, các loại thuốc bổ trợ (Complementary and Alternative Medicine) cũng

được quan tâm ở nhiều nước. Thuốc bổ trợ bao gồm các loại thảo dược, dược liệu có
nguồn gốc động vật, … tác dụng hỗ trợ tiêu diệt tế bào ung thư, ít tác dụng phụ, đồng
thời giúp cơ thể tăng cường sức đề kháng. Tuy nhiên, liệu pháp này được sử dụng lâu
đời ở các nước có nền YHCT phát triển như Trung Quốc, Ấn Độ, Nhật Bản, … nhưng
chỉ mới phát triển trong những thập kỷ gần đây ở các quốc gia công nghiệp với nền
y học hiện đại tiên tiến. Nguyên lý tập trung vào con người, bồi bổ cơ thể nâng cao
chất lượng lượng cuộc sống của các loại thuốc này ngày càng được chú trọng, đặc
biệt trong các trường hợp thất bại của các liệu pháp truyền thống của nền y học hiện
đại. Mặt hạn chế của phương pháp này là thiếu các bằng chứng khoa học về mặt
nghiên cứu cũng như lâm sàng về tác dụng và tính an tồn. Do đó nhiều quốc gia
chưa chấp nhận các phương pháp này như những liệu pháp điều trị chính thống.
1.2. Y học cổ truyền trong điều trị ung thư
Bên cạnh Tây Y, từ nhiều năm Y học cổ truyền (YHCT) đã được sử dụng trong điều
trị ung thư ở các nước có nền YHCT phát triển như Trung Quốc, Ấn Độ, Việt
Nam…và trong những năm gần đây YHCT đã được sử dụng rộng rãi hơn với vai trò
hỗ trợ trong điều trị ung thư. Nói chung những thuốc YHCT là những cây, con được
sử dụng làm thuốc nên rất phong phú, ít độc và ít tác dụng phụ. YHCT quan niệm
ung thư xuất phát từ những tổn thương bên trong kết hợp với các yếu tố gây độc bên
ngồi dẫn đến tình trạng mất cân bằng âm dương. Huyết khí trì trệ sinh độc tính làm
rối loạn sự sinh sản bình thường của tế bào, hình thành khối u. Sự điều hịa thống
nhất giữa các phủ tạng dần bị phá vỡ, dẫn đến tử vong. Theo YHCT, ung thư khơng
mang tính cục bộ mà là bệnh toàn thân nhưng biểu hiện ở một số vị trí [3]. Dựa trên
bệnh sinh ung thư, YHCT đề ra nguyên tắc chữa bệnh là bồi dưỡng huyết khí, thanh
nhiệt giải độc, nhuyễn kiên tán kết, trong đó lấy nguyên tắc dưỡng chính khí, bồi bổ
cơ thể là chính.
Dựa vào lý luận trên, bài thuốc cổ truyền là một sự phát triển phù hợp trong quan
niệm cổ điển cũng như trong trị liệu hiện đại với xu hướng kết hợp các dược
chất để tạo hiệu quả phối hợp trong điều trị. Bài thuốc cổ truyền thường gồm nhiều
vị thuốc để tạo ra tác động phối hợp giữa các vị. Như vậy, theo nguyên tắc, sự phối
4

hợp của các vị tạo ra hiệu quả đa tác động của bài thuốc như tiêu diệt tế bào ung thư,
giảm tác động lên tế bào thường, tác dụng kích thích miễn dịch, tăng cường khả năng
kháng oxy hóa,…đồng thời tác động quan trọng là giúp bồi bổ cơ thể [30]. Sự phối
hợp là một trong những đặc tính đặc sắc của bài thuốc YHCT.
Trong những thập kỷ vừa qua, một số bài thuốc cổ truyền được sử dụng như là một
liệu pháp hỗ trợ, kết hợp với việc điều trị ung thư bằng hóa trị, xạ trị. Theo cách này,
bài thuốc giúp cải thiện điều kiện sức khỏe chung và chức năng miễn dịch của bệnh
nhân, tăng cường khả năng kháng bệnh và giúp kéo dài thời gian sống của họ. Hơn
nữa, bài thuốc cũng có tác dụng bảo vệ cơ thể chống lại sự suy giảm miễn dịch, giảm
số lượng bạch cầu, suy giảm tủy xương, và giảm cortisol trong huyết tương do hóa
trị và xạ trị [10],[30].
Mặc dù sở hữu nhiều ưu điểm nhưng bài thuốc nói riêng, YHCT nói chung chưa được
thừa nhận rộng rãi bởi những bác sĩ y học hiện đại do nhiều nguyên nhân trong đó
một trong những nguyên nhân nổi trội là thiếu cơ sở khoa học của YHCT, cụ thể là
các bằng chứng khoa học về tính an tồn, hiệu quả điều trị. Nhận thấy tiềm năng cũng
như những thách thức của YHCT, WHO đã đề ra “Chiến lược phát triển YHCT 20022005” và 2014-2023, trong đó phân tích các hạn chế và đề ra các giải pháp nhằm phát
triển YHCT [55],[56]. Trên cơ sở đó, những năm gần đây các nghiên cứu khoa học
trên qui mơ phịng thí nghiệm và lâm sàng về YHCT tăng lên đáng kể, góp phần
chứng minh tác dụng của nhiều vị thuốc, bài thuốc khác nhau trên nhiều bệnh khác
nhau trong đó có ung thư [10],[46]. Bài thuốc ka-mi-kae-kyuk-tang của Hàn Quốc
gồm 10 cây thuốc cho thấy hoạt tính kháng ung thư phổ rộng trên nhiều dịng tế bào
ung thư cũng như trên mơ hình chuột khảm khối u [51]. Các nghiên cứu tiền lâm sàng
cho thấy bài thuốc TJ-41 (còn gọi là Bu-ZhongYi-Qi-Tang ở Trung Quốc; Hochuekki-to ở Nhật và Bojungikki-Tang ở Hàn Quốc) có tác dụng ức chế tăng trưởng tế
bào ung thư thơng qua cảm ứng apoptosis và làm dừng chu trình phân bào, đồng thời
có khả tăng tăng cường miễn dịch. Trong nghiên cứu lâm sàng, TJ-41 giúp làm giảm
độc tính hóa trị, xạ trị, cải thiện chất lượng cuộc sống bệnh nhân [51].
Việt Nam có nguồn dược liệu phong phú cũng như nền YHCT khá phát triển với hơn
30% dân số sử dụng YHCT cho chăm sóc sức khỏe. Tuy nhiên, mặc dù được sử dụng

5


lâu đời nhưng các bài thuốc dân gian/cổ truyền lại thiếu những bằng chứng khoa học
về hiệu quả, cơ chế tác động và tính ổn định [57]. Theo định hướng của WHO cũng
như chính sách Nhà nước kêu gọi “Hiện đại hóa YHCT”, nhóm nghiên cứu tại Phịng
thí nghiệm Sinh học phân tử, Bộ môn Di truyền, trường Đại học Khoa học Tự nhiên
là nhóm nghiên cứu đầu tiên tiến hành các nghiên cứu về các bài thuốc y học cổ
truyền/dân gian bằng các công cụ hiện đại ở cấp độ tế bào và phân tử. Chúng tôi đã
xây dựng thành công các công cụ nhằm nghiên cứu khả năng kháng ung thư ở mức
in vitro của các bài thuốc cổ truyền như phương pháp xác định khả năng tiêu diệt tế
bào ung thư (SRB, MTT), phương pháp khảo sát khả năng cảm ứng apoptosis ở tế
bào ung thư (DNA phân mảnh, nhuộm kép AO/EB, xác định hoạt tính caspase-3), và
khảo sát sự điều hòa biểu hiện gene của tế bào ung thư khi xử lý thuốc (cDNA
microarray, real-time RT PCR). Bên cạnh đó, phương pháp khảo sát sự tăng sinh tế
bào miễn dịch và kháng oxi hóa in vitro (DPPH, DCFH-DA) cũng được phát triển để
khảo sát một số khả năng bổ trợ của bài thuốc [6]. Hơn nữa, nhóm nghiên cứu cũng
đã xây dựng được phương pháp kiểm sốt chất lượng bài thuốc thơng qua “dấu vân
tay hóa học” và “dấu vân tay sinh học” trên bài thuốc Hồng Liên Giải Độc Thang
và hứa hẹn có thể áp dụng phương pháp này cho các bài thuốc khác [5]. Các kết quả
cho thấy một số bài thuốc mà chúng tơi nghiên cứu như Hồng Liên Giải Độc Thang,
Thanh Hao Miết Giáp Thang, Nam Địa Long (NDL) cho những kết quả khả quan
[8],[43],[44].
1.3. Bài thuốc Nam Địa Long (NDL)
Bài thuốc NDL là bài thuốc được giới thiệu bởi lương y Nguyễn An Định, được sử
dụng trong dân gian nước ta nhằm điều trị động kinh, viêm khớp và ung thư nhưng
chưa có nghiên cứu hay cơng bố một cách chính thống nào được thực hiện trên bài
thuốc này. Bài thuốc NDL gồm 4 vị thành phần: địa long (Pheretima aspergillum
Michaelsen): thân khô, 10 g; đậu đen (Vigna unguiculata Walp.): hạt khô, 20 g; đậu
xanh (Vigna radiata (L.) Wilczek): hạt khô, 20 g; và bồ ngót (Sauropus androgynus

(L) Merr.): thân và lá khô, 40 g. Dữ liệu chi tiết về các thành phần bài thuốc được
trình bày ở phụ lục 1.

6


Theo các công bố trước đây ĐĐ chứa nhiều các hợp chất carbohydrate (khoảng 60%),
protein (khoảng 25%) và các hợp chất có hoạt tính sinh học như hợp chất phenol,
anthocyanin [28]. Tương tự ĐĐ, hạt ĐX cũng là loại thực phẩm chứa nhiều
carbohydrate và protein. Bên cạnh đó ĐX cịn có các nhân tố ức chế trypsin,
hemagglutinin, tannin và acid phytic. Đặc biệt ĐX còn chứa hàng loạt các hợp chất
phenol và flavonoid với nhiều hoạt tính sinh học khác nhau [54]. BN chứa nhiều hợp
chất phenol, flavonoid, carotenoid và glucoside [14].
Theo YHCT, ĐL có tác dụng thanh nhiệt, trấn kinh, thông kinh mạch, định suyễn, lợi
thủy, dùng trong trị sốt cao bất tỉnh, tê chi, ho và suyễn, phù, vô niệu, cao huyết áp
[1]. Các nghiên cứu trên cao chiết ĐL có tác dụng bảo vệ thần kinh, chống hen suyễn,
chống viêm và có tiềm năng trong tái tạo mơ xương [19],[20],[26],[31],[53]. ĐĐ và
ĐX trong Đơng y có tác dụng thanh nhiệt, giải độc, lợi tiểu, trừ phù thủng do nhiệt
độc, giải độc [1]. ĐĐ và ĐX chứa nhiều chất dinh dưỡng như vitamin, yếu tố vi lượng,
đặc biệt có hàm lượng protein và polysaccharide cao và nhiều hợp chất có hoạt tính
sinh học như flavonoid [15],[54]. Cao chiết ĐĐ và ĐX có hoạt tính kháng tăng sinh
tế bào ung thư và kháng oxi hóa [58]. ĐX là thành phần được nghiên cứu nhiều nhất
trong các thành phần của bài thuốc với nhiều hoạt tính sinh học như kháng oxi hóa,
kháng vi sinh, kháng viêm, chống tiểu đường, chống tăng huyết áp, chống ung thư
[54].
Những thành phần của bài thuốc này đều có thể dễ dàng tìm thấy cũng như ni trồng
ở nước ta nên có thể ổn định và kiểm soát chất lượng nguồn nguyên liệu đầu vào.
Hiện tại nhóm nghiên cứu đã có những khảo sát tác động in vitro bài thuốc bao gồm
tác động gây độc tế bào ung thư, kháng oxi hóa và kích thích miễn dịch. Kết quả cho
thấy cao chiết bài thuốc có khả năng ức chế sự tăng trưởng của các dòng tế bào ung

thư vú MCF-7, ung thư gan gan Hep G2, trong đó NDL đặc biệt nhạy trên MCF-7 và
cho thấy tác dụng ít độc trên tế bào thường fibroblast. NDL tại nồng độ IC50 là 0,63
mg/mL cảm ứng cơ chế chết theo chương trình (apoptosis) ở tế bào MCF-7 [44].
Đồng thời bài thuốc cũng thể hiện khả năng bắt gốc tự do DPPH và giảm gốc oxi hóa
hoạt tính trên mơ hình tế bào. Bài thuốc cũng cho thấy sự kích thích tăng sinh tế bào
lympho máu ngoại vi người 20 – 30 % so với lô đối chứng. Những kết quả ban đầu
7


khả quan này là cơ sở để tiến hành các thử nghiệm in vivo để chứng minh hiệu quả
của bài thuốc.
1.4. Nghiên cứu hoạt tính kích thích miễn dịch và kháng oxi hóa dựa trên mơ
hình chuột suy giảm miễn dịch do CY
Trong đề tài này chúng tôi quan tâm đến một số khả năng hỗ trợ điều trị ung thư của
bài thuốc bao gồm khả năng tăng cường miễn dịch và kháng oxi hóa. Trong điều trị
ung thư nói chung, đặc biệt bằng xạ trị và hóa trị thường dẫn đến làm suy giảm hệ
miễn dịch, giảm sức đề kháng của cơ thể, gây độc một số cơ quan, suy nhược cơ
thể,…, do đó hồi phục cơ thể, tăng sức đề kháng là việc làm cần thiết. Vì vậy trong
đề tài này chúng tôi tiến hành khảo sát khả năng kháng oxi hóa và tăng cường miễn
dịch của bài thuốc NDL trên mơ hình chuột gây suy giảm miễn dịch bằng
cyclophosphmide (CY). CY là thuốc được sử dụng trong hóa trị liệu ung thư và bệnh
tự miễn. Ngồi ra, CY cũng được sử dụng nhằm ức chế miễn dịch trong cấy ghép tủy
xương. Khi đi vào cơ thể CY nhanh chóng được chuyển hóa ở gan tạo thành những
sản phẩm thứ cấp có hoạt tính alkyl hóa cao, tác động đến sự tổng hợp DNA ở những
tế bào đang phân chia. Vì thế CY có khả năng tiêu diệt tế bào ung thư, tuy nhiên cũng
gây độc cho những tế bào thường và làm tổn thương một số cơ quan như gan, lách,
thận.
Bên cạnh đó, CY cịn gây ra trạng thái stress oxi hóa và ức chế hệ miễn dịch [22]. Vì
vậy, những chất có khả năng kháng oxi hóa và kích thích miễn dịch sẽ là những chất
có tiềm năng ngăn chặn những tác dụng phụ của thuốc, bảo vệ tế bào thường mà

không ngăn chặn sự tiêu diệt tế bào ung thư. Mơ hình chuột xử lý CY được sử dụng
cho nhiều nghiên cứu về khả năng tăng cường miễn dịch cũng như kháng oxi hóa của
các hợp chất tự nhiên. Cyclophosphamide cảm ứng gây stress oxi hóa thơng qua làm
gia tăng mức độ peroxy hóa lipid, giảm glutathione, và giảm hoạt tính các enzyme
kháng oxi hóa như superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), glutathione
peroxidase (GPx). Đồng thời CY cịn làm suy giảm hệ miễn dịch trên mơ hình chuột
xử lý CY [18],[22],[32],[52].

8


Tóm lại, nhằm mục đích lâu dài là tìm kiếm bằng chứng khoa học cho hiệu quả
kháng ung thư của bài thuốc, nghiên cứu này tập trung tìm hiểu hiệu quả đa tác
động của một bài thuốc, cụ thể là khảo sát tác động bảo vệ, khả năng kháng oxi
hóa và kích thích miễn dịch của bài thuốc NDL trên mơ hình chuột được tiêm
CY. Theo đó, đề tài thực hiện 5 nội dung:
1. Thu nhận cao chiết bài thuốc
2. Khảo sát sơ bộ mơ hình thử nghiệm
3. Khảo sát tác động hồi phục của cơ thể chuột của NDL trên mơ hình
4. Khảo sát tác động tăng cường miễn dịch của NDL trên mơ hình
5. Khảo sát tác động kháng oxi hóa của NDL trên mơ hình

9


CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP
2.1. Chuẩn bị cao chiết bài thuốc
Bài thuốc NDL gồm thân khô của Địa long (100 g), hạt Đậu đen (200 g), hạt Đậu
xanh (200 g) và thân lá Bồ ngót khơ (400 g). Trong đó, địa long được cung cấp bởi
cơng ty Domesco, các dược liệu còn lại được cung cấp bởi bệnh viện Y học cổ truyền

TP.HCM. Bài thuốc được chiết xuất theo phương pháp truyền thống bằng hệ thống
sắc thuốc tự động của bệnh viện Y học cổ truyền TPHCM. Cụ thể, các nguyên liệu
được cân đủ khối lượng, trộn chung và ngâm trong nước khoảng 20 phút, sau đó đun
3 giờ trong hệ thống sắc thuốc tự động rồi thu dịch chiết có nồng độ 1 g dược liệu
thơ/ml. Nước sắc của bài thuốc được đông khô thành dạng bột và bảo quản ở -70 oC.
Liều sử dụng được tính toán dựa theo liều uống của người và qui đổi thử nghiệm ở
chuột (gấp 12 lần liều trên người). Liều uống trên người là 180 ml nước sắc bài
thuốc/người/57,7 kg (khối lượng trung bình của người châu Á). Hiệu suất đông khô
của nước sắc bài thuốc là 0,032 g/ml nên liều uống trên người qui đổi là 0,1 g bột
đông khơ/kg. Từ đó suy ra liều thử nghiệm trên chuột là 1,2 g/kg. Trong nghiên cứu
này chúng tôi sử dụng 2 liều là 1,2 g/kg thể trọng chuột (NDL1) và 2,4 g/kg thể trọng
chuột (NDL2) [2].

Hình 2.1. Các vị thành phần của bài thuốc NDL
10


2.2. Mơ hình động vật
Chuột nhắt trắng chủng Swiss albino, 22 ± 2 g, 5 - 6 tuần tuổi, giống đực, khỏe mạnh,
do Viện Pasteur TP.HCM cung cấp. Sau khi vận chuyển, chuột được nuôi ổn định
khoảng 7 ngày trước khi tiến hành các thí nghiệm. Chuột được ni trong các lồng
nhựa quan sát 12 giờ chu kỳ sáng/12 giờ chu kỳ tối. Thức ăn cho chuột là cám viên
do Viện Pasteur TP.HCM cung cấp, với thành phần gồm bột gạo, bột bắp và các
vitamin bổ sung.
Thí nghiệm in vivo được bố trí theo hướng dẫn cho thử nghiệm dược lý trên mơ hình
động vật [2], [25]. Levamisole được sử dụng làm đối chứng dương cho thử nghiệm
về miễn dịch [11], trong khi Silymarin được sử dụng làm đối chứng dương cho các
thử nghiệm kháng oxi hóa [23]. Chuột được chia ngẫu nhiên thành 6 lơ, mỗi lơ có 15
chuột như sau: (1) Lơ bình thường (C): chuột khơng tiêm CY và cho uống nước cất;
(2) Lô bệnh lý (CY): chuột tiêm CY, tiêm phúc mạc liều 150 mg/kg thể trọng ngày 1

và cho uống nước cất từ ngày 1 đến ngày 5; (3,4) Lô thử nghiệm (NDL1, NDL2):
chuột tiêm CY ngày 1 và cho uống NDL liều 1,2 g/kg và 2,4 g/kg thể trọng; (5) Lô
đối chứng dương (Leva): chuột tiêm CY ngày 1 và cho uống Levamisol (chế phẩm
Bio-leva của công ty Bio-Pharmachemie) liều 30 mg/kg thể trọng; và (6) Lô đối
chứng dương (Sily): chuột tiêm CY ngày 1 và cho uống Silymarin (Sigma) liều 100
mg/kg thể trọng. Thể tích cho chuột uống khơng q 0,2 mL/10 g thể trọng, thể tích
tiêm CY là 0,1 mL/10g thể trọng chuột. Thời gian cho uống hoặc tiêm được tiến hành
trong khoảng từ 8-10 giờ sáng.
Trước khi tiến hành tạo mô hình (ngày 0) chuột được lấy máu tĩnh mạch đi để xác
định số lượng bạch cầu tổng (WBC) và công thức bạch cầu (bạch cầu lympho, bạch
cầu đơn nhân, bạch cầu trung tính và bạch cầu ưa axit). Chuột được cân mỗi ngày
trước khi cho ăn và uống thuốc. Khoảng 2 giờ sau khi uống thuốc ngày thứ 5, thu các
mẫu và tiến hành thì nghiệm sau:
-

Máu tĩnh mạch đi: xác định trị số WBC, công thức bạch cầu,

-

Máu tim để xác định phần trăm bạch cầu lympho TCD4, TCD8 và lượng cytokine
IL-2 và IL-6.
11


-

Gan, lách và tuyến ức được thu nhận, rửa qua với nước muối sinh lý NaCl 0,9
%, thấm trên giấy thấm và xác định trọng lượng. Phần trăm gan, lách hoặc
tuyến ức là chỉ số giữa trọng lượng lách hoặc tuyến ức chia trọng lượng cơ thể
chuột nhân cho 100.

-

Gan sau khi cân sẽ được cắt 1 mảnh nhỏ khoảng 0,1 g để xác định sự biểu hiện
gene CAT, SOD1 và SOD2.

-

Phần gan còn lại cho vào dung dịch đệm KCl 1,15 % (w/v) với tỉ lệ 1 g gan/10
mL KCl. Sau đó đồng nhất mẫu gan và tiến hành các thí nghiệm xác định hàm
lượng protein tổng, xác định hàm lượng MDA, hàm lượng glutathione.

Chuột được nuôi và thử nghiệm mơ hình tại Khoa Y học cổ truyền, trường Đại học
Y dược TP.HCM. Các thử nghiệm xác định các chỉ số: số lượng bạch cầu, số lượng
bạch cầu TCD4 và TCD8, nồng độ IL-2, IL-6, nồng độ MDA, GSH, sự biểu hiện gene
SOD1, SOD2, và CAT được thực hiện tại Bộ môn Di truyền, trường Đại học Khoa
học Tự nhiên TP.HCM.
2.3. Phương pháp xác định số lượng bạch cầu tổng trong máu chuột
WBC được xác định bằng cách đếm tươi bằng buồng đếm hồng cầu, sau khi đã phá
hồng cầu bằng acid acetic 3 % (v/v). Kết quả số lượng bạch cầu tính theo cơng thức:
Tế bào/mm =

Nx20x10
4

Trong đó: N: số bạch cầu đếm được trong 4 ô; 20: độ pha loãng và 1/10 mm: chiều
cao từ buồng đếm đến lamelle
2.4. Phương pháp xác định một số loại bạch cầu trong máu chuột
Công thức bạch cầu (bạch cầu lympho, bạch cầu đơn nhân, bạch cầu trung tính và
bạch cầu ưa axit) được xác định bằng phương pháp nhuộm Giemsa [48]. Thuốc

nhuộm Giemsa bắt màu lên các hạt nguyên sinh chất. Căn cứ theo sự bắt màu của các
hạt nguyên sinh chất, hình dạng nhân và kích thước tế bào để phân biệt các loại tế
bào bạch cầu.
- Bạch cầu lympho: có hai loại là lympho T và lympho B. Tế bào tròn, nhân
12


hình cầu, nguyên sinh chất hẹp (hình 2.1 – B)
- Bạch cầu Mono: tế bào lớn, trịn, kích thước 20-25 µm, nhân hình bầu dục
hoặc hạt đậu (hình 2.1 – C)
- Bạch cầu trung tính: kích thước 10-15 µm, nhân thắt eo, chia thùy, ngun
sinh chất có hạt trịn 0,2-0,4 µm (hình 2.1 – A)
- Bạch cầu ưa axit: kích thước 10-15 µm, nhân thắt eo, chia thùy. Nguyên sinh
chất có hạt to, trịn đều khoảng 1 µm (hình 2.1 – D)

Hình 2.2. Đặc điểm hình thái của các tế bào bạch cầu chuột (đực) quan sát bằng
phương pháp nhuộm Giemsa (100X). A - Bạch cầu trung tính, B - Bạch cầu lympho,
C - Bạch cầu đơn nhân, D – Bạch cầu ưa axit, E – Hồng cầu và F – Tiểu cầu [48]
Một giọt máu chuột được đặt trên lame kính và kéo dài thành một vệt mỏng. Khi vết
máu khơ, lame kính được nhúng trong ethanol tuyệt đối trong 3 phút và để khơ tự
nhiên. Sau đó lame kính tiếp tục được ngâm trong thuốc nhuộm Giemsa 3,8 g/L. Sau
45 phút, lame được rửa dưới vòi nước chảy, sau đó để khơ và quan sát dưới kính hiển
vi tại vật kính x100. Phần trăm mỗi loại bạch cầu trong tổng số 100 tế bào bạch cầu
được xác định. Số lượng mỗi loại tế bào bạch cầu bằng phần trăm loại tế bào đó x
WBC.

13


2.5. Phương pháp xác định phần trăm tế bào bạch cầu lympho TCD4 và TCD8

trong máu chuột
Phần trăm số bạch cầu lympho TCD4 và TCD8 trong máu toàn phần được xác định bằng
phương pháp dòng chảy tế bào (flow cytometry) theo khuyến cáo của BD Biosciences
[60]. Qui trình thự hiện như sau:
1. Kháng thể kháng CD4 đánh dấu PE (BD Biosciences) và kháng thể kháng
CD8 đánh dấu FITC (BD Biosciences) được cho vào trong 20 μL máu toàn
phần (nồng độ kháng thể cuối cùng là 10 μg/mL) và ủ 30 phút trong tối.
2. Sau đó hỗn hợp được ủ 10 phút trong tối với dung dịch ly giải hồng cầu.
3. Ly tâm 500 g trong 5 phút và loại bỏ dịch nổi.
4. Tế bào được rửa lại 1 lần với dung dịch PBS.
5. Thêm 1 mL dung dịch paraformaldehyde 1 % (w/v) và phân tích bằng máy
flow cytometer C6 (BD AccuriTM C6 Flow Cytometer). Mẫu không nhuộm
kháng thể được sử dụng để loại trừ tín hiệu nền.
2.6. Phương pháp xác định lượng cytokine IL-2 và IL-6 trong máu chuột
Mẫu máu tim chuột được để lắng, sau đó ly tâm 10.000 rpm trong 10 phút để thu
huyết thanh. Mẫu huyết thanh được bảo quản ở -80oC cho đến khi thử nghiệm. Nồng
độ IL-2 và IL-6 được xác định bằng phương pháp ELISA theo bộ kit Mouse IL-2
ELISA Set và Mouse IL-6 ELISA Set (BD Biosciences). Qui trình thực hiện như sau:
1. Kháng thể bắt giữ (kháng thể kháng IL-2 hoặc IL-6) được cố định trên đĩa
ELISA (ThermoFisher Scientific) qua đêm, 4oC. Sau đó đĩa được rửa 3 lần
với dung dịch rửa với 300 μL/giếng.
2. Khóa giếng bằng dung dịch PBS 10 % FBS (100 μL) trong 1 giờ, sau đó rửa
lại bằng dung dịch rửa.
3. Ủ giếng với 100 μL các mẫu huyết thanh hoặc chất chuẩn (IL-2 hoặc IL-6)
trong 2 h ở nhiệt độ phịng. Sau đó rửa đĩa 5 lần với dung dịch rửa.
4. Ủ giếng với 100 μL dung dịch kháng thể thứ cấp đánh dấu HRP trong 1 giờ ở
nhiệt độ phịng. Sau đó rửa đĩa 7 lần với dung dịch rửa.
5. Ủ giếng với 100 μL dung dịch cơ chất ở nhiệt độ phòng, trong tối
14

6. Thêm vào mỗi giếng 50 μL dung dịch dừng phản ứng và tiến hành đọc đĩa ở
bước sóng 450 nm bằng máy ELISA reader (Synergy HT, Biotek).
7. Nồng độ IL-2 hoặc IL-6 được tính dựa trên đường chuẩn.
2.7. Phương pháp xác định nồng độ protein
Hàm lượng protein trong dịch đồng thể gan được xác định bằng phương pháp
Bradford dựa trên nguyên tắc sự tạo phức của protein với thuốc nhuộm Coomassie
Brillant Blue [13]. Albumin huyết thanh bò (BSA) được sử dụng làm chất chuẩn. Qui
trình được thực hiện như sau:
1. Dựng đường chuẩn BSA cho định lượng protein: từ dung dịch mẹ BSA 2
mg/mL pha loãng trong PBS (-) thành các nồng độ theo bảng sau:
Nồng độ
(μg/mL)
BSA 2 mg/mL
(μl)
PBS (μL)

0

25

50

75

100

125

150

0

12,5

25

37,5

50

62,5

75

1000

987,5

975

962,5

950

937,5

925

2. Pha loãng mẫu cần xác định lượng protein tổng (pha loãng 200 lần).

3. Cho 160 μl dung dịch Bradford 1X vào giếng, cho 40 μl mẫu/giếng.
4. Lắc 3 phút, đo mật độ quang ở 595 nm bằng máy ELISA reader (Synergy HT,
Biotek).
5. Nồng độ protein được tính tốn dựa trên đường chuẩn BSA.
2.8. Phương pháp xác định mức độ peroxy lipid
Malonyl dialdehyd (MDA) được sinh ra trong quá trình peroxy hóa lipid màng tế bào.
Ở trạng thái bình thường, màng tế bào vẫn có một lượng MDA nhất định, khi q
trình peroxy hóa lipid xảy ra làm thay đổi cấu trúc màng và chức năng sinh lý của
chúng. Do đó sự oxy hóa màng tế bào được đo bằng lượng MDA. Khi cho phản ứng
với acid thiobarbituric, một phân tử MDA phản ứng với hai phân tử acid
thiobarbituric tạo phức màu hồng hấp thu cực đại ở bước sóng 532 nm. Phản ứng

15