Nghiên cứu tổng hợp dẫn xuất aryl chitooligosaccharide và đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật gây bệnh cây trồng trong điều kiện in vitro

BAN QUẢN LÝ KHU NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO TP.HCM
TRUNG TÂM NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG NGHIỆP
CÔNG NGHỆ CAO

BÁO CÁO NGHIỆM THU

TÊN

TÀI:

NGHIÊN CỨU T NG H P D N UẤT
AR

-CHITOO IGOSACCHARIDE VÀ ÁNH GIÁ HO T

T NH

HÁNG VI SINH V T GÂ BỆNH CÂ TR NG
TRONG I U

IỆN IN VITRO
CHỦ NHIỆM

Ê S NGỌC

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
THÁNG 12/2015

i

TÀI

TĨM TẮT
Chitooligosacchride (COS) và các dẫn xuất của nó là những chất có khả năng
kháng vi sinh vật, kháng nấm bệnh, kháng viêm, kháng ung thư, kích thích miễn dịch,
ức chế enzyme và chống oxi hóa. Mỗi loại dẫn xuất của COS có khả năng kháng vi
sinh vật khác nhau. Trong nghiên cứu này chúng tôi tiến hành tổng hợp 02 loại dẫn
xuất của COS và đánh giá khả năng kháng trên các chủng vi khuẩn (Ralstonia sp.,
Erwinia carotovora) và chủng nấm (Fusarium oxysporum, Sclerotium sp.). Các thí
nghiệm được tiến hành ở Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Nông nghiệp Công nghệ
cao. Kết quả đã tổng hợp được 02 loại dẫn xuất gồm: dẫn xuất N-Vanilyl-COS
(VCOS) ở điều kiện thích hợp là pH 5,5 nhiệt độ 30oC và nồng độ Vanilyl là 2% được
tổng hợp trong 2 gi và dẫn xuất N-Ben zyl COS (BCOS) ở điều kiện là pH 5,5 nhiệt
độ 30oC và nồng độ Benzyl là 2% được tổng hợp trong 2 gi . Đã xác định được cấu
trúc đặc trưng của các dẫn xuất thông qua các phổ hồng ngoại (IR), phổ cộng hưởng từ
proton (1H-NMR). Hai dẫn xuất VCOS và BCOS đều có khả năng kháng vi sinh vật
gây bệnh tốt hơn COS. Nồng độ ức chế tối thiểu của VCOS và BCOS đối với vi khuẩn
Erwinia carotovora là 20 ppm, vi khuẩn Ralstonia sp là 30 ppm.

ii


ABSTRACT
Chitooligosaccharide (COS) and its derivatives are substances that are resistant
to microbial, anti-fungal, anti-inflammatory, anti-cancer, immune stimulation, enzyme
inhibition and antioxidant. Each of COS’s derivative resistant various microorganisms.
In this study, we prepared 02 categories of derivatives COS and evaluated resistance in
bacteria (Ralstonia sp., Erwinia carotovora) and fungi strains (Fusarium oxysporum,
Sclerotium sp.). The experiments were performed at Research and Development Center
for High-Tech Agriculture. Results were synthesized 02 kinds of derivatives include:

derivatives N-Vanilyl-COS (VCOs) in appropriate conditions are pH 5,5, 30°C and 2%
Vanilyl concentration that was synthesized in 12 hours and N-benzyl COS (bcos)
derivative at pH 5,5, 30°C and the concentration of Benzyl was 2% that was
synthesized in 12 hours. The structure of derivatives was identified through infrared
spectroscopy (IR), proton magnetic resonance spectrum (1H-NMR). VCOS and BCOS
derivatives are resistant pathogenic microorganisms better COS. The minimum
inhibitory concentration of VCOS and BCOS against Erwinia carotovora is 20 ppm,
Ralstonia sp. is 30 ppm.

iii


MỤC ỤC

Trang

TÓM TẮT ........................................................................................................................ii
ABSTRACT ................................................................................................................... iii
MỤC LỤC ...................................................................................................................... iv
DANH S CH C C CHỮ VIẾT TẮT ...........................................................................vii
DANH SÁCH BẢNG .................................................................................................. viii
DANH SÁCH HÌNH........................................................................................................ x
THƠNG TIN ĐỀ TÀI ...................................................................................................... 1
MỞ ĐẦU .......................................................................................................................... 2
Chương : TỔNG QUAN TÀI LIỆU .............................................................................. 4
1.1. Tổng quan về chitosan, chitooligosaccharide ........................................................... 4
1.1.1. Chitosan.................................................................................................................. 4
1.1.1.1.

Vài nét lịch sử nghiên cứu chitosan ................................................................ 4

1.1.1.2.

Cấu tạo chitosan .............................................................................................. 5

1.1.1.3.

Độ deacetyl hóa của chitosan .......................................................................... 5

1.1.2. Chitooligosaccharide .............................................................................................. 6
1.1.2.1.

Giới thiệu về chitooligosaccharide .................................................................. 6

1.1.2.2.

Các phương pháp thu nhận chitooligosaccharide từ chitosan ......................... 8

1.1.3. Một số dẫn xuất của chitosan và chitooligosaccharide .......................................... 9
1.1.3.1.

Dẫn xuất N-alkyl chitosan ............................................................................... 9

1.1.3.2. Dẫn xuất mang điện tích dương cao.................................................................. 10
1.1.3.3. Dẫn xuất acyl chitosan ...................................................................................... 11
1.1.3.4. Dẫn xuất chitosan-sulfate .................................................................................. 14

iv

1.1.3.5. Dẫn xuất carboxyl chitooligosaccharide ........................................................... 15
Chương 2: N I DUNG NGHI N CỨU ........................................................................ 27
2.1. Th i gian và địa điểm nghiên cứu ........................................................................... 27
2.2. Vật liệu nghiên cứu ................................................................................................. 27
2.2. . Đối tượng nghiên cứu........................................................................................... 27
2.2.2. Hóa chất thí nghiệm ............................................................................................. 27
2.2.3. Thiết bị thí nghiệm ............................................................................................... 27
2.3. Nội dung nghiên cứu ............................................................................................... 28
2.3.1. Nội dung 1: Nghiên cứu điều kiện tổng hợp dẫn xuất aryl- COS ......................... 28
2.3. . . Thí nghiệm : Khảo sát ảnh hưởng của pH lên sự tổng hợp dẫn xuất aryl-COS28
2.3.1.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự tổng hợp dẫn xuất arylCOS ................................................................................................................................ 29
2.3.1.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất phản ứng lên sự tổng hợp
dẫn xuất aryl-COS .......................................................................................................... 29
2.3.1.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của th i gian phản ứng lên sự tổng hợp dẫn
xuất aryl-COS................................................................................................................. 30
2.3.2. Nội dung 2: Xác định các đặc trưng cấu trúc của sản phẩm tổng hợp được........ 31
2.3.3. Nội dung 3: Khảo sát khả năng kháng vi sinh vật của COS và dẫn xuất aryl- COS
32
2.3.3.1. Thí nghiệm : Đánh giá khả năng kháng khuẩn của các COS và aryl-COS. Tính
nồng độ ức chế tối thiểu (MIC). ..................................................................................... 32
2.3.3.2. ..Thí nghiệm 2: Đánh giá ảnh hưởng của các COS và aryl-COS lên sự phát triển
sợi nấm.. ......................................................................................................................... 32

v


2.3.3.3. Thí nghiệm 3: Đánh giá ảnh hưởng của COS và aryl-COS lên sự phát triển sinh
khối nấm trong canh trư ng ........................................................................................... 33
2.4. Phương pháp nghiên cứu......................................................................................... 34
Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..................................................................... 36

Chương 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .......................................................................... 52
TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................. 57

vi


DANH SÁCH CÁC CH
VI T TẮT
cs
COS
FTIR
HTCC
pI
DD
EDC
NHS
MIC
GPC
IR
1
H-NMR
VCOS
BCOS
H

VI T TẮT

THU T NG
Cộng sự
Chitooligosacchride

Fourrier Transformation InfraRed
N-(2-hydroxyl) propyl-3-trimethylammonium chitosan chloride
điểm đẳng điện
Deacetylation

1-ethyl-3-dimethylaminopropyl carbodiimide
N-hydroxysuccinimide
nồng độ ức chế tối thiểu
Gel permeation chromatography

phổ hồng ngoại
phổ cộng hưởng từ proton
N-Vanilyl-COS
Benzyl chitooligosaccharide
proton

vii


DANH SÁCH BẢNG
S
1.1

2.1

2.2

2.3

2.4

T

ả

s

u

Hiệu quả kiểm soát bệnh trên cây trồng của oligochitosan (khảo sát tại
Trung Quốc) (Ying và cs, 2010)
Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của pH lên sự tổng hợp dẫn xuất arylCOS
Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự tổng hợp dẫn xuất
aryl-COS
Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất phản ứng lên sự tổng
hợp dẫn xuất aryl-COS
Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của th i gian phản ứng lên sự tổng hợp
dẫn xuất aryl-COS

Trang
7

25

26

27

28

3.1

Hiệu suất thu nhận dẫn xuất VCOS được tổng hợp ở pH khác nhau

32

3.2

Độ thay thế của dẫn xuất VCOS được tổng hợp ở pH khác nhau

33

3.3

Hiệu suất thu nhận dẫn xuất VCOS được tổng hợp ở nhiệt độ khác nhau

34

3.4

Độ thay thế của dẫn xuất VCOS được tổng hợp ở các nhiệt độ khác nhau

34

3.5

3.6

3.7

Hiệu suất thu nhận dẫn xuất VCOS được tổng hợp ở những tỉ lệ
COS:aldehyde khác nhau
Độ thay thế của dẫn xuất VCOS được tổng hợp ở các tỉ lệ COS:aldehyde
khác nhau
Hiệu suất thu nhận dẫn xuất VCOS được tổng hợp ở các th i gian khác
nhau

35

35

36

3.8

Độ thay thế của dẫn xuất VCOS được tổng hợp ở các th i gian khác nhau

36

3.9

Hiệu suất thu nhận dẫn xuất BCOS được tổng hợp ở pH khác nhau

38

viii


3.10

Độ thay thế của dẫn xuất BCOS được tổng hợp ở các pH khác nhau

38

3.11

Hiệu suất thu nhận dẫn xuất BCOS được tổng hợp ở nhiệt độ khác nhau

39

3.12

Độ thay thế của dẫn xuất BCOS được tổng hợp ở các nhiệt độ khác nhau

39

3.13

3.14

3.15
3.16
3.17

Hiệu suất thu nhận dẫn xuất BCOS được tổng hợp ở những tỉ lệ
COS:aldehyde khác nhau
Độ thay thế của dẫn xuất BCOS được tổng hợp ở các tỉ lệ COS:aldehyde
khác nhau
Hiệu suất thu nhận dẫn xuất BCOS được tổng hợp với th i gian khác
nhau

Độ thay thế của dẫn xuất BCOS được tổng hợp với th i gian khác nhau
Nồng độ ức chế tối thiểu của các COS và aryl-COS lên các chủng vi
khuẩn Erwinia carotovora, Ralstonia sp

40

40

41
41
48

3.18

Hiệu suất kháng nấm của COS ở các nồng độ khác nhau

49

3.19

Hiệu suất kháng nấm của N-Benzyl COS ở các nồng độ khác nhau

50

3.20

Hiệu suất kháng nấm của N-Vanilyl-COS ở các nồng độ khác nhau

50

3.21

Ảnh hưởng của COS và aryl-COS lên sự phát triển sinh khối nấm

51

ix


DANH SÁCH HÌNH
S
1.1

T
Cơng thức cấu tạo Chitin và chitosan

ả

1.2

Phản ứng tổng hợp dẫn xuất N-aryl chitosan (Mrunal R. Thatte, 2004)

10

1.3

Phản ứng tổng hợp dẫn xuất amino-chitosan (V.K. Mourya và cs, 2008)

11

Trang
5

Phản ứng tổng hợp dẫn xuất N-acyl chitosan và O-acyl chitosan (V.K.
1.4

12

Mourya, 2008)

1.5

Phản ứng tổng hợp dẫn xuất O-acyl chitosan (Marguerite Rinaudo, 2006)

13

1.6

Phản ứng tổng hợp dẫn xuất chitosan-sulfate (Inmaculada Aranaz, 2010)

15

Phản ứng tổng hợp dẫn xuất carboxyl chitooligosaccharide (Niranjan
1.7

15

Rajapakse, 2006)

2.1

Nguyên liệu COS

24

3.1

Dẫn xuất VCOS

37

3.2

Dẫn xuất BCOS

42

3.3

Phổ hồng ngoại (IR) của COS (a), N-vanillyl-COS(b)

43

1

Phổ cộng hưởng từ proton ( H-NMR) của COS (a), vanillin (b) và N3.4
3.5
3.6

45

vanillyl-COS (c).
Phổ IR của BCOS

46

1

Phổ H-NMR của BCOS trong CD3COOD

x

47


THÔNG TIN

TÀI

. Tên đề tài dự án: “Nghiên cứu tổng hợp dẫn xuất aryl-chitooligosaccharide và
đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật gây bệnh cây trồng trong điều kiện in vitro”.
2. Chủ nhiệm đề tài dự án: Lê S Ng c
3. Cơ quan chủ trì: Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Nông nghiệp CNC
4. Th i gian thực hiện:

20 5 – 12/2015

5. Kinh phí được duyệt: 147.140.000 đồng.
6. Mục tiêu: Xác định được điều kiện tối ưu để tổng hợp dẫn xuất aryl-COS
nhằm nâng cao hoạt tính kháng vi sinh vật của COS ban đầu.

7. Sản phẩm của đề tài dự án: Hai dẫn xuất aryl-COS

1


MỞ ẦU
Chitosan là hợp chất deacetyl hóa của chitin, một polymer tự nhiên được tạo
thành từ các đơn phân N-acetyl glucosamine, hiện diện trong vỏ của các lồi giáp xác,
cơn trùng và trong vách của tế bào nấm. Chitooligosaccharide (COS) là sản phẩm thủy
phân của chitosan bởi các tác nhân vật lý, sinh h c và hóa h c. COS và các dẫn xuất
của nó có nhiều đặc tính sinh h c và có khả năng ứng dụng rộng rãi trong nhiều l nh
vực khác nhau như là chất kháng vi sinh vật, kháng viêm, kháng ung thư, kích thích
miễn dịch, ức chế enzyme và kháng oxi hóa (Ngo và cs, 2008; 2009). Hiện nay, tại
Việt Nam và thế giới các nhà khoa h c quan tâm đến các chất có nguồn gốc từ tự nhiên
có hoạt tính sinh h c và COS đang là một trong những chất được chú ý vì nó tan trong
nước nên dễ dàng ứng dụng vào hệ thống sống.
Việt nam là một quốc gia nhiệt đới với b biển dài nên có nguồn tài nguyên sinh
vật biển rất phong phú và là nguồn nguyên liệu quý giá đã và đang được con ngư i chú
ý lâu nay. Trong đó, chitin (poly N-acetylglucosamin) được tách chiết từ vỏ tôm, cua,
mai mực, vỏ côn trùng, vách tế bào sợi nấm và chitosan (polyglucosamine), sản phẩm
deacetyl của chitin làm tăng nhóm amino tự do. Đây là các sản phẩm tự nhiên, khơng
độc, an tồn với mơi trư ng và được sử dụng rộng rãi trong y h c, thực phẩm và nông
lâm ngư nghiệp. Chitin, chitosan cùng với các dẫn xuất của chúng có hoạt tính sinh h c
như kháng khuẩn, kháng nấm, chống oxi hóa (Kim và cs, 2006), kích thích và tăng
cư ng hoạt động của hệ thống miễn dịch, ức chế khối u, ung thư, ức chế enzyme như
angiotensin I converting enzyme đóng vai tr trong việc điều h a huyết áp và gây bệnh
cao huyết áp hay myeloperoxidase tạo các chất oxi hóa gây hư hại tế bào

, ngoài ra

chúng làm giảm cholesterol và lipid trong máu nhất là các cholesterol xấu (Kim và
Rajapakse, 2005; Tsai và cs, 2002). Hiện nay trên thế giới có khuynh hướng tìm kiếm
các chất có nguồn gốc tự nhiên có hoạt tính chống oxi hóa như peptide,

2


carbohydrate

, đặc biệt chitosan, chitooligosaccharides (COS) và việc tạo nên các dẫn

xuất của chúng hiện đang thu hút nhiều nhà khoa h c nghiên cứu trên thế giới với hoạt
tính kháng khuẩn vẫn c n đang được tiếp tục nghiên cứu trên thế giới. Hiện nay ở Việt
nam nghiên cứu chủ yếu về thu nhận oligoglucosamine, các nghiên cứu ứng dụng của
COS trên đối tượng thực vật và kháng vi sinh vật c n ở quy mơ ph ng thí nghiệm.
Nguyễn Anh Dũng (2003, 2004) nghiên cứu ảnh hưởng của oligoglucosamine
đến kích thích sinh trưởng, tăng năng suất và tăng cư ng khả năng kháng bệnh trên cây
đậu tương, các loại rau như rau cải xanh, đậu cove, cây đậu phụng. Phạm Thị Lệ Hà và
Nguyễn Quốc Hiến (2002) nghiên cứu khả năng kháng nấm gây bệnh phồng lá chè
bằng chitosan chiếu xạ. Nguyễn Anh Dũng và Võ Thị Phương Khanh (2004) nghiên
cứu khả năng kháng nấm Fusarium oxisporum của oligoglucosamine và
oligoglucosamine cải biến là salicyden-oligoglucosamine. Kết quả cho thấy chỉ số
nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của oligoglucosamine là 0, 5 , của oligoglucosamine
cải biến chỉ là 0,02-0,03 . Phạm Thị

nh Hồng và các cộng sự (2008) đã thu nhận

được COS và tạo dẫn xuất glucose-COS, glucosamine-COS với quy mơ ph ng thí
nghiệm thử khả năng kháng khuẩn và bước đầu ứng dụng trong bảo quản thực phẩm
(Vòng và Ngô, 2010).

Các vi sinh vật gây bệnh cây trồng ngày càng phát triển nhiều cơ chế kháng lại
với các thuốc kháng vi sinh hóa h c. Hơn nữa, các thuốc hóa h c gây nhiều ảnh hưởng
trực tiếp lên sức khỏe con ngư i và tác động xấu đến mơi trư ng sống. Vì vậy, trong
nghiên cứu này chúng tôi tổng hợp dẫn xuất aryl của chitooligosacharides (COS) bằng
phương pháp hóa h c nhằm nâng cao hoạt tính kháng vi sinh vật của COS từ đó hướng
đến ứng dụng trên cây trồng.

3


C ươ

1

T NG QUAN TÀI IỆU
1.1. Tổ

qua về c tosa , chitooligosaccharide

1.1.1. Chitosan
1.1.1.1.

Và

Năm 8

ét ịc sử

cứu c tosa

, giáo sư Henri Braconnot thuộc khoa Lịch sử Tự nhiên kiêm giám đốc

vư n thực vật Viện Hàn Lâm Khoa H c Nacy- Pháp đã tìm thấy chitin lần đầu tiên ở
nấm.
Năm 823, Galier đã phân lập được chitin từ côn trùng và g i đó là “chitin”.
Năm 959, giáo sư D. Rouget đã phát hiện ra chitosan, một dạng dẫn xuất deacetyl
của chitin. Từ đó đã có nhiều nghiên cứu cơ bản về chitin và chitosan nhưng những hạn
chế về mặt công nghệ và sự cạnh tranh của vật liệu polymer tổng hợp nên đã cản trở sự
phát triển của các hợp chất sinh h c mới này.
Đến những năm 970, nguồn phế thải hải sản như vỏ tôm, cua, mai mực ngày
càng nhiều. Để tránh tình trạng ơ nhiễm mơi trư ng cũng như để tận dụng nguồn phế
liệu dồi dào này, các nhà khoa h c đã ngh đến việc tận dụng có hiệu quả nguồn
ngun liệu hữu ích này. Chính vì vậy các nghiên cứu về chitin và chitosan ngày càng
nhiều hơn và sâu hơn (Mrunal R. Thatte, 2004).
Từ những năm thập niên 70 của thế kỉ XX, chitosan được ứng dụng rộng rãi trong
nhiều l nh vực quan tr ng của đ i sống con ngư i như thực phẩm, dược phẩm, bảo vệ
môi trư ng, công nghệ sinh h c

Một ví dụ điển hình là loại thuốc chữa thối hóa

khớp làm từ vỏ tơm - glucosamine - đang được sử dụng thịnh hành và thương mại hóa
trên tồn thế giới. Nước Mỹ tiêu thụ hơn

tỷ viên nang glucosamine mỗi năm. Ngư i

ta vẫn đang tích cực nghiên cứu để khám phá thêm nhiều ứng dụng hữu ích của

4

chitosan, đồng th i cải biến chitosan để nâng cao khả năng sử dụng, trong đó có nhiều
dẫn xuất mới có tiềm năng ứng dụng rất cao (Mrunal R. Thatte, 2004).
1.1.1.2.

Cấu tạo chitosan

Chitosan là dẫn xuất deacetyl hóa của chitin hay chitosan là dạng có mức acetyl
hóa thấp của chitin. Đơn phân chủ yếu của chitosan là D-glucosamine hay 2-amino-2deoxy- β-D-glucose. Chitosan có các mức độ deacetyl khác nhau, từ 40

đến 98

và

tr ng lượng phân tử của chitosan trong khoảng 5 x 04 đến 2 x 06 Da. Mức độ
deacetyl và mức độ polymer là hai thông số quan tr ng ảnh hưởng đến tr ng lượng
phân tử của chitosan cũng như ảnh hưởng đến các tính chất hóa h c, vật lý, sinh h c
của chitosan. Ngồi ra trình tự nhóm amino và nhóm acetomido, và độ tinh sạch của
chitosan cũng ảnh hưởng đến các tính chất này của chitosan, từ đó cũng ảnh hưởng đến
khả năng ứng dụng của chitosan (Kim và Thomas, 2007; Matsugor và cs, 1998).
.

Hình 1.1. Cơng thức cấu tạo chitosan
Nhóm –NH2 của chitosan đóng vai tr quan tr ng đến đặc tính sinh h c của
chitosan do hình thành các liên kết hydro nội phân giữa các chuỗi polymer và các
phiến của phân tử chitosan (Je và Kim, 2006). Khi thay thế nhóm –NH2 của phân tử
chitosan bằng các nhóm chức hóa h c khác sẽ làm giảm số lượng liên kết hydro tạo ra
khoảng trống cho các phân tử nước đi vào làm hoạt động các nhóm chức ưa nước trong
phân tử chitosan.
1.1.1.3.

ộ deacety

óa của c tosa

5


Độ deacetyl hóa là tỉ lệ nhóm 2-acetylamido-2-deoxy-D-glucopuranose và nhóm
2-amino-2-deoxy-D-glucopyranose. Độ deacetyl hóa đóng vai tr quan tr ng vì nó ảnh
hưởng đến đặc tính lý hóa, sinh h c như khả năng kéo dãn khi tạo màng film, khả năng
kẹp kim loại và khả năng kháng oxy hóa. Độ deacetyl hóa cũng ảnh hưởng đến giá trị
pKa của chitosan, làm cho chitosan có khả năng tan trong acid, thơng thư ng nếu
DD≥40

chitosan có khả năng h a tan trong acid lỗng do sự proton hóa nhóm –NH2

của đơn phân glucosamine của phân tử chitosan gây ra sự phá vỡ liên kết hydrogen nội
phân tử, gây ra sự tác động ở vị trí cation của phân tử chitosan và làm cho phân tử
chitosan có khả năng h a tan do sự tương tác giữa phân tử chitosan với dung môi hay
sự tương tác giữa các phân tử chitosan (Sajomsang và cs, 2009).
1.1.2. Chitooligosaccharide
1.1.2.1.

Gớ t

u về c too

osacc ar de

Chitooligosaccharide (COS) là oligomer có từ 2 đến 0 đơn phân glucosamine,

có tr ng lượng phân tử < 0kDa, được tạo ra do thủy phân từ chitosan bằng phương
pháp hóa h c hoặc bằng enzyme. Độ deacetyl hóa, tr ng lượng phân tử, độ dài polymer
của COS phụ thuộc vào độ deacetyl hóa của chitosan và enzyme sử dụng trong q
trình thủy phân. Khác với chitosan, COS có khả năng tan trong nước do chiều dài mạch
ngắn hơn và nhóm –NH2 tự do trên đơn phân glucosamine. Do tr ng lượng phân tử
thấp và có độ h a tan lớn hơn so với chitosan nên COS có nhiều đặc tính lý hóa, sinh
h c nên được ứng dụng nhiều trong l nh vực như y h c, dược, mỹ phẩm.
Tr ng lượng phân tử của COS đóng vai tr quyết định đến đặc tính sinh h c của
nó vì ảnh hưởng đến khả năng h a tan và khả năng hấp thụ vào tế bào. Có rất nhiều
phương pháp khác nhau xác định tr ng lượng phân tử của COS như phương pháp dùng
sắc kí l c gel, khối phổ MALDI-TOF. Yong Chae và cs (2004) nghiên cứu độ hấp thu
của COS invitro trên d ng tế bào ung thư biểu bì caco-2 và invivo trên chuột bằng cách
cho uống thuốc: so sánh giữa chitosan có tr ng lượng phân tử cao 230 kDa với COS
3,8 kDa thì COS có độ hấp thu cao hơn 23 đến 25 lần. Đánh giá độc tính của COS

6


(MW < 0 kDa) thì hầu như COS khơng gây độc đến d ng tế bào coca-2 (Seiichi
Matsugor và cs, 1998). Ngoài ra COS c n tham gia điều trị các bệnh: viêm loét dạ dày,
bệnh tiêu chảy, bệnh táo bón, chuột rút, đặt biệt có khả năng kết hợp với mangan tham
gia vào quá trình hình thành xương sụn rất tốt. COS c n có khả năng kháng bệnh cho
cây trồng vật nuôi, đồng th i cũng là chất kích thích sinh trưởng rất tốt. COS có khả
năng chống virus, vi khuẩn, nấm mốc, nấm men rất tốt được ứng dụng nhiều trong y
h c và nông nghiệp (kiểm soát bệnh cây trồng).
Bả

1.1. Hiệu quả kiểm soát bệnh trên cây trồng của oligochitosan (khảo sát tại Trung

Quốc) (Ying và cs, 2010)

Cây trồ

oạ

ả ă

k ểm soát

Thuốc lá

Bệnh khảm do virus

76.49 – 87.5

Sâm

Bệnh do virus

>90

Cà chua

Bệnh do virus, héo do vi khuẩn

84.47 –88.24

Tiêu

Bệnh do virus, thán thư

78.58 – 90

Cà tím

Bệnh do virus

93.18 – 100

Cải bắp

Bệnh thối rữa do Erwinia sp.

78.62 – 85

Bông cải trắng Bệnh thối đen

63.60 – 64.2

Đậu đũa

Bệnh do virus

31.13 – 58.8

Dưa hấu

Bệnh thối đen, Bệnh do virus

81.71 – 85.40

Dưa lưới

Bệnh phấn trắng

71.34 – 86.26

Táo

Bệnh khảm

76.68 – 93.85

Đậu nành

Bệnh do virus

75.10 – 100

Cây bông

Bệnh héo vàng

85.50 – 87.2

Ngô

Bệnh cháy lá

23.90 – 45.35

Lúa

Bệnh đạo ôn

71.41 – 92.0

Đậu phộng

Bệnh do virus

23.90 – 26.5

7

(%)


1.1.2.2.

Các p ươ

p áp t u

ậ c too

osacc ar de từ c tosa

Hiện nay có nhiều phương pháp để thu nhận COS từ chitosan như: Phương pháp
hóa h c sử dụng acid để thủy phân như HCl, HNO2, acid phosphoric H3PO4 (Hasegawa
và cs, 1993), acid hydrofloric (Defaye và cs, 1994); phương pháp chiếu xạ dùng các

chất phóng xạ để thủy phân (Gomes và cs, 2014); phương pháp sinh h c sử dụng
enzyme để thủy phân Chitin hoặc Chitosan.
 P ươ

p áp óa ọc

Trong phương pháp này, acid được sử dụng để depolymer hóa chitosan. Ngư i
ta có thể sử dụng nhiều loại acid khác nhau như Rupley ( 964) depolymer hóa chitin
bằng acid HCl hoặc Ilina Varlamov và cộng sự đã sữ dụng acid lactic để thủy phân
chitosan. Acid thủy phân bằng cách cắt đứt các liên kết giữa các đơn phân của phân tử
chitosan. Tuy nhiên, thủy phân bằng phương pháp acid có hạn chế gây độc và hiệu suất
thu nhận COS thấp (Kim và Rajapaks, 2005; Xia và cs, 2008).
 P ươ

p áp c

u xạ

Chitosan có thể được phân cắt dựa vào chiếu xạ bằng tia gamma. Chiếu xạ bằng
tia gamma là phương pháp đơn giản và nhanh chóng tác động lên cấu trúc polymer làm
giảm kích thước phân tử của polymer (A. Sionkowska và cs, 20 3). Tùy vào liều chiếu
xạ mà ta thu được các đoạn có kích thước và tr ng lượng phân tử khác nhau. Theo một
số tài liệu nghiên cứu trước đây thì khi ta tăng liều chiếu xạ càng cao thì khối lượng
phân tử chitosan trong dung dịch được chiếu càng giảm, nhưng vẫn giữ được cấu trúc
hóa h c sau khi chiếu. Các phản ứng có thể thực hiện ở nhiệt độ ph ng nên dễ được
kiểm sốt. Các đặc tính của chitosan sau khi chiếu xạ có thể được phân tích dựa vào
phương pháp quang phổ hồng ngoại và phân tích ngun tố. Nhóm amino acid trên các
đơn phân khá ổn định trong khi đó các nhóm C-O-C giảm khi chiếu xạ (Nguyễn Ng c
Duy và cs, 2011).
 P ươ

p áp s

ọc

8


Thủy phân bằng enzyme đặc hiệu: chitosanases là enzyme đặc hiệu cắt đứt liên
kết D-D glycosidic giữa các đơn phân chitosan. Chitosanases được thu nhận từ nhiều
loài vi sinh vật như vi khuẩn, nấm,

. Hiệu quả thủy phân của chitosanases phụ thuộc

vào độ deacetyl hóa và độ đặc hiệu của enzyme với liên kết D-D glucosidis (Xia và cs,
2008).
Thủy phân bằng enzyme không đặc hiệu: do giá thành của enzyme cắt đặc hiệu
phân tử chitosan khá cao nên ngư i ta nghiên cứu sử dụng enzyme không đặc hiệu
carbonhydrate và protease như lysozyme, pectinases, hemicellulase và papain. Tuy
nhiên, hiệu suất quá trình thủy phân của các loại enzyme này tùy thuộc vào tr ng lượng
phân tử và độ deacetyl hóa của phân tử chitosan (Kim và Rajapaks, 2005; Xia và cs,
2008).
1.1.3. Một s d
1.1.3.1.

xuất của c tosa và c too

osacc ar de

D n xuất N-alkyl chitosan

Alkyl hóa chitosan có thể thực hiện theo hai cách, một là: sử dụng dẫn xuất alkyl
halogen trong phản ứng thay thế, hai là: phản ứng khử amin giữa nhóm aldehyde và
keto với nhóm amin của chitosan. Dẫn xuất N-Aryl chitosan cũng là một dạng của dẫn
xuất N-alkyl chitosan. Dẫn xuất N-aryl chitosan được hình thành thơng qua dạng base
Schiff giữa nhóm amino của chitosan với nhóm aldehyde của aldehyde thơm trong mơi
trư ng acid yếu. Sau đó dạng base Schiff này được khử hydro bởi sodium borohydride
hay sodium cyanoborohydride là những chất linh động và có lực khử nhẹ, thuận lợi cho
phản ứng của nhóm aldehyde với nhóm amin của chitosan (Inmaculada và cs, 20 0;
Prashanth và Tharanathan, 2007; Alves và Mano, 2008).

9


Hình 1.2. Phản ứng tổng hợp dẫn xuất N-aryl chitosan (Thatte, 2004)
1.1.3.2. D n xuất ma

đ

tíc dươ

cao

Khi tính chất mang điện tích dương của chitosan gắn liền với các hoạt tính sinh
h c của nó như: kháng khuẩn, ức chế khối u, kháng viêm thì chúng được ứng dụng
trong nhiều l nh vực như: sự kết dính sinh h c, tăng cư ng sự hấp thu, hiệu quả trong
sự dẫn truyền và phóng thích các phân tử sinh h c thì dẫn xuất mang điện tích dương
của chitosan được quan tâm tổng hợp. Dẫn xuất mang điện tích dương của chitosan
được hình thành giữa chitosan và alkylamino alkyl trong điều kiện kiềm. Dẫn xuất của
N-amino-ethyl, N-dimethylaminoethyl, N-dimethylaminoisopropyl có khả năng ức chế

sự phân bào và ức chế BCE . Những phân tử này có khả năng thâm nhập vào cả những
phân tử kị nước hay ưa nước của lớp biểu mô. Xu và cộng sự tổng hợp dẫn xuất N-(2hydroxyl) propyl-3-trimethylammonium chitosan chloride (HTCC) và dẫn xuất này
được dùng để tạo hạt nano dùng trong dẫn truyền và phóng thích protein tùy thuộc vào
q trình gel hóa với sodium tripolyphosphat (Mourya và cs, 2008).

10


Hình 1.3. Phản ứng tổng hợp dẫn xuất amino-chitosan (V.K. Mourya và cs, 2008)
Dẫn xuất aminoethyl-chitosan, dimethylamino-chitosan, diethylamino-chitosan
được quan tâm tổng hợp vì có nhiều đặc tính sinh h c hữu ích, tùy thuộc vào độ DD
hóa và tr ng lượng phân tử của chitosan đem tạo dẫn xuất. Thư ng dẫn xuất amino của
chitosan có tr ng lượng phân tử thấp có hoạt tính sinh h c cao hơn. Dẫn xuất này được
tổng hợp bằng cách cho aminoalkyl hydrochloride phản ứng với chitosan trong điều
kiện kiềm, ở nhiệt độ 40 oC-65oC, sau đó acid hóa để phản ứng xảy ra với hiệu suất cao
(Mourya và cs, 2008).
Dae-Sung Lee và cs (20

) công bố dẫn xuất aminoethyl-chitosan được tổng hợp

từ chitosan có độ DD 50% và 90% có hoạt tính kháng khuẩn rất mạnh. Dẫn xuất
amioethyl-chitosan được tổng hợp từ chitosan có độ deacetyl hóa 50

ức chế HIV-1

với giá trị IC50 là 7 µg mL.
1.1.3.3. D n xuất acyl chitosan
Quá trình acyl hóa là q trình gắn nhóm acid vào mạch chitosan. So sánh với
q trình alkyl hóa thì q trình acyl hóa linh động hơn, tương tác kị nước có thể hình
thành giữa nhóm carboxyl với nhóm amino, nhóm alcohol hoặc cả hai. Do chitosan có

sẵn nhóm amino nên nên các dẫn xuất acyl chitosan là những dẫn xuất lưỡng tính. Do
có tính chất lưỡng tính nên các phân tử này sẽ có một điểm đẳng điện (pI) tại điểm
đẳng điện này thì các phân tử lưỡng tính đều khơng mang điện tích và khơng h a tan

11


được. Tùy theo vị trí gắn của nhóm carboxyl vào vị trí C2 hay C6 mà ngư i ta sử dụng
các điều kiện phản ứng khác nhau (Aranaz, 2009; Tao Sun, 2006).
N-acyl chitosan được tổng hợp từ anhydrides hay acyl chlorides và lactones cũng như
từ acid, nhóm carboxyl được gắn vào vị trí -NH2 thơng qua chất trung gian là
carbodiimine, thư ng sử dụng 1-ethyl-3-dimethylaminopropyl carbodiimide (EDC),
hoặc EDC và N-hydroxysuccinimide (NHS). Trong phản ứng này EDC có vai tr phản
ứng với acid để hình thành nên nhóm ester có ái lực nhân cao, nhóm ester này sẽ tương
tác với chitosan ở vị trí C2 hay C6.

Hình 1.4. Phản ứng tổng hợp dẫn xuất N-acyl chitosan và O-acyl chitosan (Mourya,
2008)
Do nhóm amino hoạt động hơn nhóm hydroxyl nên cần phải có các điều kiện để
hạn chế tác động của nhóm -NH2, Sashiwa và cộng sự tổng hợp dẫn xuất O-acetylated
chitosan từ phản ứng giữa chitosan và acetyl chloride trong điều kiện điều kiện nhiệt
độ thấp với chất xúc tác là methanesulfonic. Methanesulfonic có tác dụng proton hóa
hình thành muối với nhóm -NH2 (Mourya, 2008). Ở phương pháp tiếp theo, dẫn xuất
O-acyl được tổng hợp từ phản ứng giữa acid alkanoic với chitosan dưới sự xúc tác của

12


H2SO4. Trong phương pháp cuối cùng nhóm -NH2 của chitosan được N-phthaloyl hóa
để diễn ra phản ứng nhanh ở nhóm -OH ở vị trí C6. Sau đó trityl (triphenylmethylation)

amin hóa ở vị trí C6, tiếp theo loại bỏ nhóm phthalamide bằng hydrazine (NH2-NH2),
đây là bước trung gian tổng hợp các dẫn xuất (Aranaz, 2010).

Hình 1.5. Phản ứng tổng hợp dẫn xuất O-acyl chitosan (Marguerite Rinaudo, 2006)
Đặc biệt dẫn xuất Acyl-chitosan có hoạt tính kháng oxy hóa khá cao, Pasanphan
và cộng sự (20 0) cơng bố chitosan gallate có khả năng kháng gốc tự do DPPH, đạt
87

ở nồng độ 0,23 mg ml.

13


1.1.3.4. D n xuất chitosan-sulfate
Dẫn xuất chitosan-sulfate được tạo ra do phản ứng giữa chitosan với lưu huỳnh
oxide, hoặc acid ví dụ như acid sulfuric đậm đặc, oleum, sulfurtrioxyde,
sulfurtrioxyde/pyridine, sulfurtrioxyde/trimethylamine, sulfur trioxyde/sulfur dioxyde,
chlorosulfonic acid–sulfuric acid. Thông thư ng, ngư i ta sử dụng acid chlorosulfonic
và chất xúc tác là dichloracid acetic, tetrahydrofuran, và fomic acid. Đối với hầu hết
các chất xúc tác, dẫn xuất chitosan sulfate thư ng có hai vị trí thay thế trên phân tử
chitosan: nhóm -NH2 và nhóm -OH ở vị trí carbon số 6. Với N-alkyl chitosan và acyl
chitosan có thể ch n vị trí -NH2 hay vị trí -OH ở carbon số 6 tùy thuộc vào điều kiện
phản ứng. Nhóm chức năng của acid sulfonic được gắn với chitosan qua phản ứng của
chitosan với 5-formyl-2-furansulfonic acid sodium. Dưới điều kiện phản ứng nhẹ có
thể hình thành dạng bazơ schiff tạo thành dẫn xuất N-sulfofurfuryl chitosan sodium.
Nhóm sulfat c n được gắn với phân tử chitosan qua trung gian là các hợp chất hữu cơ
có gắn nhóm sulfat: Ví dụ 4-acetamidobenzene sulfonyl chloride gắn với chitosan ở
nhóm -NH2 hay nhóm -OH ở vị trí C6 (Pasanphan, 2010). Đặc biệt, các dẫn xuất này có
khả năng kháng oxy hóa theo Rongua và cs (2005) tổng hợp dẫn xuất hydroxyethyl
chitosan sulfate có hoạt tính kháng gốc tự do DPPH là 33,78 , ở nồng độ 2,5 mg ml.

Hình 1.6. Phản ứng tổng hợp dẫn xuất chitosan-sulfate (Aranaz, 2010)

14


1.1.3.5. D n xuất carboxyl chitooligosaccharide
Dẫn xuất carboxyl chitooligosaccharide được tạo thành do proton từ nhóm COCH2CH2COO- chuyển đến nhóm nhóm -NH2 ở vị trí C2 của v ng pyranose. Tùy
theo tỉ lệ h a tan của anhydride succinic và aceton mà cho các dẫn xuất khác nhau và
hoạt tính sinh h c khác nhau.

Hình 1.7. Phản ứng tổng hợp dẫn xuất carboxyl chitooligosaccharide (Rajapakse,
2006)
Theo Rajapakse và cs (2006), dẫn xuất này có khả năng kháng oxy hóa bảo vệ
các phân tử sinh h c như lipid, protein màng tế bào trong tế bào RAW264.7 và HL60.
1.2.

Một s ứ

dụ

của c tosa , c too

osacc ar de và các d

xuất

Chitosan, COS và các dẫn xuất đã được chứng minh có các hoạt tính sinh h c
khác nhau như kháng oxy hóa, giảm cholesterol, kháng khuẩn và kháng nấm bên cạnh
đó c n là thành phần của khẩu phần ăn dành cho ngư i giảm cân. Các chức năng này

kết hợp với tính khơng độc, tương thích sinh h c cao và phân hủy tự nhiên đã làm nó
trở thành một polymer có tiềm năng ứng dụng rất lớn. Trong đó ứng dụng khả năng
kháng oxy hóa của COS và các dẫn xuất trong bảo quản thực phẩm được sự quan tâm
của rất nhiều nhà khoa h c.
 Ứ

dụ

tro

ảo quả t ực p ẩm

Sự oxy hóa làm cho thực phẩm giảm chất lượng, làm giảm th i gian bảo quản.
Do đó hoạt tính kháng oxy hóa của COS, chitosan và các dẫn xuất được sử dụng trong

15