khảo sát sự tăng trưởng của tế bào sừng người trong điều kiện in vitro

B GIO DC V O TO
I HC QUC GIA THNH PH H CH MINH
TRNG I HC KHOA HC T NHIấN
KHOA SINH HC




Lấ QUANG HNG



KHO ST S TNG TRNG CA
T BO SNG NGI TRONG IU KIN
IN VITRO








KHểA LUN C NHN KHOA HC
NGNH SINH HC
CHUYấN NGNH SINH HC NG VT




Ngửụứi hửụựng daón khoa hoùc

ThS. TRN Lấ BO H




Thnh ph H Chớ Minh - 2006




Kính trình Quý thy cô trong Hi đng giám kho:

Em xin chân thành cm n quý thy cô đã nghim thu và
to điu kin cho phép em đc trình khóa lun này.



Kính trình thy:

Phó Giáo s Tin s
NGUYN TNG ANH
Trng B môn ng vt – Sinh lý ng vt – HKHTN

Xin cm n tm lòng nhit tình, tn ty ca ngi thy
đáng kính đã dìu dt chúng em trong quá trình hc tp và
gi đây thy li có mt cùng chúng em đ giúp chúng em
bc lên bc thang cui cùng ca đi sinh viên.
Xin thy nhn ni chúng em tt c lòng kính trng và bit
n sâu sc nht.

Kính trình thy:

Thc s
PHAN KIM NGC
Phó B môn ng vt – Sinh lý ng vt – HKHTN

S thành công ca đ tài gn lin vi tm lòng nhit tình,
hng say ca ngi thy đy trách nhim.
Bc trên đng đi, lòng em mãi ngh đn công n ca
ngi thy kính yêu.
Xin cm n thy tht nhiu.




Kính trình cô:

Thc s
TRN LÊ BO HÀ
Ging viên B môn ng vt – Sinh lý ng vt – HKHTN

Kính cm n cô đã tn tình hng dn em hoàn thành
khóa lun tt nghip.
Kinh nghim cô truyn đt, em xin ghi nh.

Em xin chân thành cm n:

C nhân Võ Th Bích Phng
C nhân Phm Vn Phúc
C nhân Nguyn Hunh Trang Thi
C nhân V Tun Trung
B môn ng vt và Sinh lý đng vt – HKHTN

ã to mi điu kin thun li và tn tình giúp đ em
trong thi gian thc hin khóa lun này.



Em xin chân thành cm n:

Bác s LÊ V CHÍ PHC
Ging viên B môn Vi sinh Y hc – TTT&BDCBYT
Bác s LÊ HOÀNG SN
Bác s chuyên khoa 1 – Bnh vin Da liu Tp.HCM
Bác s LÊ ÌNH HIU
Bác s chuyên khoa 1 – Bnh vin Nhân dân 115

ã nhit tình giúp đ em khi thc hin khóa lun tt
nghip.

Em xin gi lòng bit n đn:

• Ban giám hiu Trng H KHTN
• Phòng đào to và các phòng ban
• Cùng tt c các thy cô ging dy ti Khoa
Sinh hc, H KHTN

Nhng ngi đã luôn quan tâm, dìu dt, to mi điu
kin thun li trang b cho chúng em nhng kin thc và
kinh nghim quý báu trong sut bn nm hc qua.
Xin nhn ni em lòng kính trng và cm n sâu sc.




Kính dâng
Cha Meï .

Hình nh đa con ngày nào còn bé bng, gi đã ln khôn
bng s vun đp m hôi, nc mt, tình thng và s che
ch ca cha m.
Hy sinh tt c cuc đi đ nuôi dng con, đi ly nhng
np nhn vi mái tóc bc đ đc nhìn con khôn ln. S
trng thành ca con đã bc đi trên lòng hy sinh ca cha
m.
Không có li bit n nào đ bày t lòng con, ch bit
bc trên đng đi, con mãi khc ghi hai ch HY SINH.

Vi các bn lp SH2002,

Xin cám n bn bè thng yêu đã cùng nhau chia s
nhng vui bun, nhng khó khn và nhng thành qu sut
bn nm hc qua. c bit cám n các bn Hà Thanh Qu,
Võ Lê Thái Hin, Phan Th Phng, Trng Ngc Uyên Dy,
Phm Th Phng và Nguyn Quang Tin đã ht mình đng
viên và giúp đ tôi.
Hãy nhn ni tôi nhng tình cm tt đp và chân thành
nht.

Khóa lun Tt nghip C nhân Khoa hc Mc lc
MUÏC LUÏC

Li cm n i
Mc lc ii
Danh mc hình iii
Danh mc bng iv
Danh mc biu đ v
Các ch vit tt vi

Chng I: T VN  1
Chng II: TNG QUAN TÀI LIU 2
II.1. i cng v da 2
II.1.1. Gii thiu 2
II.1.2. Cu trúc da 4
II.1.2.1 Lp biu bì 5
a Lp gc 5
b Lp si 5
c Lp ht 6

d Lp bóng 6
e Lp sng 6
f Các t bào thuc lp biu bì 6
g Hình thái đin hình ca các t bào biu bì 9
h Mt s cu trúc đc bit ca t bào biu bì 10
II.1.2.2 Lp trung bì 12
II.1.2.3 Màng c bn 12
II.1.2.4 S phân b mch và thn kinh 12
II.1.2.5 Cu trúc ph trên da 13
II.2. i cng v da bao quy đu 15
Lê Quang Hng
Khóa lun Tt nghip C nhân Khoa hc Mc lc
II.2.1. Gii thiu 15
II.2.2. Cu trúc da bao quy đu 16
II.2.2.1 V trí 16
II.2.2.2 Cu trúc 16
II.3. T bào sng 18
II.3.1 Gii thiu 18
II.3.2. C ch bit hóa 18
II.3.2.1 C ch bit hóa t bào gc biu bì 18
II.3.2.2 C ch hóa sng  biu bì da 21
II.3.3. Các phng pháp thu nhn t bào sng 22
II.3.4. Các môi trng nuôi t bào sng 23
II.3.4.1 Môi trng có huyt thanh 23
II.3.4.2 Feeder nguyên bào si 24
II.3.4.3 Môi trng không huyt thanh 25
II.3.4.4 Môi trng b sung nhân t t thc vt 26
II.3.5. Các yu t nh hng lên t bào sng 27
II.3.5.1 Hormone và các nhân t tng trng 27
II.3.5.2 Calcium 27

II.3.6. ng dng ca vic nuôi t bào sng 28
II.3.7. Tình hình nghiên cu trong và ngoài nc 30
Chng III: VT LIU VÀ PHNG PHÁP 31
III.1. Vt liu 31
III.1.1. Dng c 32
III.1.2. Thit b 33
III.1.3. Quy trình chun b dng c 35
III.1.4. Hóa cht 36
III.1.4. Chun b hóa cht 37
III.2. Phng pháp nghiên cu
III.2.1. Thit k nghiên cu 42
III.2.2. i tng nghiên cu 42
Lê Quang Hng
Khóa lun Tt nghip C nhân Khoa hc Mc lc
III.2.3. Ni dung nghiên cu 44
III.2.3.1 Mc tiêu tng quát 44
III.2.3.2 Mc tiêu kho sát 44
III.2.3.3 Trình t thí nghim tng quát 44
III.2.3.3 Các quy trình thí nghim 45
Phng pháp thu nhn lp biu bì 46
Phng pháp nuôi s cp biu bì 47
Phng pháp nuôi th cp t bào sng 48
Phng pháp xác đnh mt đ t bào 48
Phng pháp x lý s liu 49
Chng IV: KT QU VÀ BÀN LUN 49
IV.1. Kt qu thu nhn lp biu bì 49

IV.2. Kt qu xác đnh môi trng ti u cho kh nng bám dính
ca t bào biu bì 55

IV.3. Kt qu nuôi s cp t bào sng 59

IV.4. Kt qu s tng trng ca t bào sng  nuôi th cp 62

Chng V: KT LUN VÀ  NGH 69
V.1. Kt lun 69
V.2.  ngh 70
TÀI LIU THAM KHO 71
PH LC 73



Lê Quang Hng
Khóa lun Tt nghip C nhân Khoa hc Mc lc
DANH MC HÌNH
Hình 2.1 B mt da ngi
Hình 2.2 Cu trúc và thành phn ca da
Hình 2.3 Cu trúc và thành phn ca biu bì
Hình 2.4 Lp biu bì nhum mô hc
Hình 2.5 Hc t bào và t bào sng
Hình 2.6 T bào Merkel và Langerhans
Hình 2.7 Các hình dng ca biu mô da
Hình 2.8 Liên kt cht
Hình 2.9 Th liên kt
Hình 2.10 Khe liên kt
Hình 2.11 Cu trúc lông và các tuyn tit
Hình 2.12 Cu trúc bao quy đu
Hình 2.13 Da bao quy đu tr em
Hình 2.14 T bào gc biu mô nhum hunh quang
Hình 2.15 Quá trình bit hóa t t bào gc thành t bào biu bì

Hình 2.16 S di chuyn và bit hóa ca t bào sng  biu bì
Hình 2.17 Nguyên bào si chut
Hình 2.18 Chng loét da
Hình 2.19 Gen Math-1 đc chuyn vào t bào sng và biu hin đm cam
Hình 3.1 Các dng c và thit b phòng thí nghim
Hình 3.2 Các hóa cht s dng
Hình 3.3 Quy trình thu nhn lp biu bì
Hình 3.4 Quy trình nuôi s cp biu bì da quy đu ngi
Hình 3.5 Nhum t bào bng Trypan Blue
Hình 4.1 C ch tách lp ca Dispase
Hình 4.2 Bóc lp biu bì ra khi trung bì
Hình 4.3 Biu bì đã tách ri hoàn toàn khi trung bì
Lê Quang Hng
Khóa lun Tt nghip C nhân Khoa hc Mc lc
DANH MC BNG
Bng 4.1 T l % t bào bám sau 24 gi
Bng 4.1 T l % t bào bám sau 48 gi
Bng 4.3 Mt đ t bào trung bình qua các ngày nuôi


DANH MC BIU 
Biu đ 4.1 ng cong tng trng ca t bào sng
Lê Quang Hng
Khóa lun Tt nghip C nhân Khoa hc




CHÖÔNG I
ÑAËT VAÁN ÑEÀ

Lê Quang Hng
Khóa lun Tt nghip C nhân Khoa hc Chng 1 t vn đ
ÑAËT VAÁN ÑEÀ
ghiên cu hình thái, đc dim, chc nng và ng dng ca t bào sng là mt
đ tài thu hút s quan tâm ln ca các nhà khoa hc. T nhng nm 60 th
k XX, các nhà khoa hc đã tách và nuôi th nghim t bào sng thành công.

N
ng dng rng rãi nht và sm nht ca vic nuôi cy t bào sng ngi là
điu tr bng và loét da bng tm t bào sng đng nuôi cy vi lp feeder 3T3
(Clancy và cng s, 1988; Compton và cng s, 1989) và MCDB 153 (Pitelkow và
Scott, 1986). H này cng đc dùng đ gii đáp nhng câu hi liên quan đn da
liu nh chng viêm da tip xúc (Sainte-Matie và cng s, 1998), các bnh viêm da
nh vy nn (Cowan và cng s, 1998). Vic nuôi t bào sng cng đã đc chng
minh là rt có giá tr trong vic nghiên cu s bit hóa biu mô.
T bào sng, chim 95% s t bào trong biu bì, đóng mt vai trò quan
trng trong ngành công ngh sinh hc liên quan đn da. Các nghiên cu v t bào
sng cung cp mt nn tng kin thc rt phong phú v da, là mt phng tin đ
th nghim nhng sn phm tác đng lên da. Bên cnh đó t bào sng trong nuôi
cy còn là ngun thay th da trong điu tr bng hay vt thng mt da. Các nhà
khoa hc đã nuôi thành công t bào sng trên nhiu môi trng khác nhau, đng
thi tìm ra các yu t nh hng đn t bào sng trong nuôi cy in vitro.  Vit
Nam, các nghiên cu c bn cng nh nghiên cu ng dng cha đc phát trin
nhiu.
Nghiên cu ca chúng tôi có mc đích kho sát t bào sng da bao quy đu
ngi v kh nng bám trong giai đon s cp, kh nng tng sinh và đng cong
tng trng ca t bào sng trong điu kin nuôi in vitro. ây s là tin đ cho các
nghiên cu sâu hn v t bào sng trong tng lai  Vit Nam.
Lê Quang Hng Trang 1
Khóa lun Tt nghip C nhân Khoa hc

CHÖÔNG II
TOÅNG QUAN TAØI LIEÄU
Lê Quang Hng
Lun vn Tt nghip C nhân Khoa hc Chng II Tng quan tài liu
II.1 I CNG V DA
II.1.1 GII THIU
Da là mt trong nhng c quan ln nht và hot đng nhiu nht  c th
ngi. Là mt h thuc biu mô, cu trúc ca da chuyên bit bao bc và ngn cách
toàn b b mt ca c th ngi vi môi trng t nhiên bên ngoài, gm ba lp cu
trúc chính:
- Lp biu bì (Epidermis)
- Lp trung bì (Dermis)
- Lp h bì (Hypodermis)
-  da còn có các t chc tuyn tit, lông, móng, các th quan.
i vi ngi Vit Nam trng thành, din tích b mt da trung bình là 1,8 m
2
,
chim khong 15-17% trng lng toàn c th. Da có chiu dày khong 0,07-2,5
mm, dày nht  vùng bàn tay, bàn chân và mng nht  vùng mi mt, môi. S dày
mng khác nhau ca da đc gii thích bi các lc tác đng khác nhau ca môi
trng vào tng vùng riêng r trên c th. [1]
V mt mô hc, da có hai ngun gc phát sinh [1]:
- Ngoi phôi bì: bao gm các t bào biu mô nhiu tng thuc lp biu bì
và các t bào biu mô thuc các phn ph ca da.
- Trung phôi bì: gm các t bào và mô liên kt thuc lp trung bì và h bì.

Hình 2.1 B mt da ngi
Lê Quang Hng Trang 2
Lun vn Tt nghip C nhân Khoa hc Chng II Tng quan tài liu




Hình 2.2
Hình 2.2 Cu trúc và thành phn ca da

Lê Quang Hng Trang 3
Lun vn Tt nghip C nhân Khoa hc Chng II Tng quan tài liu
II.1.2 CU TRÚC DA
II.1.2.1 LP BIU BÌ

Biu bì là lp ngoài cùng ca da, tip xúc trc tip vi môi trng ngoài. ây là
hàng rào đu tiên bo v c th, mng, chia thành nm lp nh:
- Lp đáy (tng sinh trng, lp gc)
- Lp si (tng gai, hay lp Malpighi)
- Lp ht (tng ht)
- Lp bóng (tng trong)
- Lp sng (tng sng)
Trong biu mô không có các mch máu và mch bch huyt đin hình. Biu bì
đc nuôi dng nh c ch khuch tán các cht dinh dng t mô liên kt qua
màng đáy.
Xen gia các t bào biu mô có các đu mút tn cùng thn kinh trn, không có
v bc. Chúng chia nhánh nh chy lun trong các khong gian bào và tip xúc vi
các t bào biu mô. Mt s đu mút thn kinh cm giác này khi tip xúc vi t bào
bit hóa thành t bào cm giác ph đóng vai trò nh mt th th xúc giác ca da.

Lp sng
Lp si
Lp ht
Lp đáy
Màng nn
T bào keratinocyte
Langerhans
T bào hc t
Hình 2.3 Cu trúc và thành phn ca lp biu bì
Lê Quang Hng Trang 4
Lun vn Tt nghip C nhân Khoa hc Chng II Tng quan tài liu
a. Lp đáy (Stratum germinativum)
Lp đáy đc to bi mt hàng t bào khi vuông hay tr thp, nm trên đáy
màng, có kh nng phân chia liên tc và di chuyn ra b mt đ thay th dn cho
các t bào già bên trên bong ra, đó là các t bào sng (cha nhiu sng).
Thông thng, trong lp đáy ch có khong 10% là t bào sng, 50% các t bào
khác đang  thi đim giao thi ca sinh trng. 40% còn li là các t bào  hu k
ca gim phân. Các t bào ca lp đáy đc gn kt trên màng c bn nh các phân
t dính fibronectin do nguyên bào si ca lp trung bì tit ra.
Ngoài ra, nm ri rác trong lp đáy còn có các loi t bào khác: hc t bào (tng
hp các protein hc t da), t bào Langerhans và Merkel.
b. Lp si (Stratum spinosum)
Lp si còn đc gi là lp Malpighi  trên lp đáy, chúng là tp hp ca 5-20
tng t bào đa din liên kt cht ch vi nhau nh các cu ni liên bào phân nhánh,
cht ch (khi quan sát vi mu, quan sát thy nhiu si ni gia các t bào, do vy
gi là lp si). Các t bào này tng đi đc trng bi hình đa din và nhân hình
cu. Nhân t bào thng có hình tròn nm gia t bào và bt màu baz khi nhum.

Hình 2.4 Lp biu bì nhum mô hc
Lê Quang Hng Trang 5

Lun vn Tt nghip C nhân Khoa hc Chng II Tng quan tài liu
c. Lp ht (Stratum granulosum)
Lp ht bao gm t 3-5 lp t bào đa din dp,  trên lp gai. Các t bào này
cha nhiu ht sc t và nhân phân thùy, chúng t cht theo chng trình đ sn
sàng chuyn thành dng t bào sng hóa. Lp ht gm các hàng t bào hình thoi,
trong bào tng có cha rt nhiu các ht keratohyalin bt màu baz khá đm.
d. Lp bóng (Stratum lucidum)
Lp bóng nm phía trên lp ht là mt lp mng và các t bào ca chúng đã có
s bin đi sâu sc v bn cht. T bào tr nên dài hn, dt hn, nhân và tt c các
bào quan b phân gii bin mt dn. Nhìn chung, chúng đã thoái hóa không còn hình
dng t bào. Toàn b lp bóng hoc bt màu vàng cam hoc không bt màu.
e. Lp sng (Stratum corneum)
 mt trên biu bì, t bào bin thành nhng lá sng mng, trong bào tng
cha rt nhiu sng nhm ngn cn s thoát hi nc, cách nhit và nhng nhân t
bt li khác t phía môi trng ngoài xâm nhp vào c th. Nhng lá sng t nhng
t bào đã thoái hóa to nên, bt màu không đng nht. S đi mi hoàn toàn ca lp
biu bì tính t khi sn sinh ra mt t bào gc mi đn khi rng thành vy vào
khang 45 – 75 ngày. Tuy nhiên quá trình này còn ph thuc vào môi trng ni ti
ca mô có thun li hay không bao gm các tín hiu tip xúc đ t bào sao chép và
di chuyn cùng các kích thích hóa hc ca các nhân t tng trng. Có nhiu tín
hiu xut phát t các nhân t ca lp trung bì, đc bit là các protein fibronectin nn
và các hp cht nn khác nh hyaluronic acid.
f. Các t bào thuc lp biu bì
T bào sng
Là nhng t bào có ngun gc t ngoi phôi bì và phân b khp biu bì (chim
95% tng s t bào ca lp biu bì), có hot đng phân bào nh nhng t bào gc
ca ty xng. Trong quá trình bit hoá chúng di chuyn lên phía trên thay cho các
t bào  trên b bong ra, nh đó lp biu bì luôn đc thay mi. Quá trình di chuyn
lên trên ca nhng t bào thng xy ra khong 25-50 ngày [19].
Lê Quang Hng Trang 6

Lun vn Tt nghip C nhân Khoa hc Chng II Tng quan tài liu
T bào melanin (hc t bào)
Là các t bào dng đuôi gai cha các sc t melanin có màu nâu đen đc tìm
thy trong da, mt, tóc. Phân t melanin đc hình thành khi acid amin b oxy hoá.
T bào melanin có ngun gc t mào thn kinh và di chuyn đn lp đáy ca
biu bì trong sut quá trình phát trin bào thai, chúng nm ri rác gia nhng t bào
sng và chim t l rt nh, khong 2% s t bào ca lp biu bì. T bào melanin
giúp hình thành nên màu sc da, hp thu nng lng ca tia UV và bo v da tránh
tác hi ca tia UV [4].



Hc t bào (Melanocyte)








T bào sng đã bit hóa

Hình 2.5 Hc t bào và t bào sng đã bit hóa
T bào Langerhans
Có ngun gc t tu xng, theo máu xâm nhp vào da. Chúng chim t l 2-
8% các t bào biu bì. Langerhans có cu trúc tng t nh t bào bch tut
(Dendritic cell), trong bào tng t bào có cha các si t trung gian vimentin và
các ht hình que gi là các ht ca t bào Langerhans.
Nhng t bào này liên quan đn h thng min dch ca biu bì. Chúng phát

hin, x lý, trình din kháng nguyên l xâm nhp vào biu bì, kích thích gây nên
đáp ng min dch [19].
Lê Quang Hng Trang 7
Lun vn Tt nghip C nhân Khoa hc Chng II Tng quan tài liu
T bào Merkel
Là nhng t bào thn kinh ni tit, chim mt lng nh trong lp đáy biu bì,
khong 1%, liên kt vi nhau bng cu ni gian bào. Chúng tip xúc vi đu cui
dây thn kinh không b myelin hoá và có chc nng nh mt th cm th c hc.
T bào Merkel
T bào Langerhans
Hình 2.6 T bào Merkel và Langerhans
Ngoài ra, trong biu bì còn mt s t bào nh: t bào bch cu trung tính, t bào
bch cu a acid, t bào lympho, hng cu Chúng s xut hin và tng lên trong
trng hp bnh lý [19] .
Lê Quang Hng Trang 8